CN1205738A - 具长半衰期的ob蛋白质衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肥胖蛋白质OB的长半衰期衍生物。更具体地,本发明涉及OB蛋白质－免疫球蛋白嵌合体和聚乙二醇(PEG)－OB衍生物,与相应的天然OB蛋白相比,它们具有更长的半衰期。本发明还涉及通过使用这种长半衰期的OB蛋白衍生物,而减少食欲和/或体重的方法以及治疗其它生理症状的方法。

Description

具长半衰期的OB蛋白质衍生物

发明领域

本发明涉及半衰期长的OB蛋白质衍生物。更具体地，本发明涉及OB蛋白质-免疫球蛋白嵌合体、其他半衰期长的OB蛋白质衍生物、以及含有这些衍生物的组合物和施用这些衍生物的方法。本发明还涉及一种通过施用半衰期长的OB蛋白质的变异蛋白(如OB蛋白质-免疫球蛋白嵌合体)而治疗肥胖的方法。

发明背景

肥胖症是最常见的营养失调，根据最近的流行病学研究的结果，它影响着约1／3的全美国20岁以上人口。Kuczmarski等人，J．Am．Med．Assoc．272，25-11(1994)。肥胖症导致各种不同的严重健康问题，其中包括心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、胰岛素抗药性、高血压、高甘油三酯血症、血脂蛋白异常和某些形式的癌症。Pi-Sunyer，F．X．，Anns．Int．Med．119，655-60(1993)；Colfitz，G．A．，Am．J．ClinNutr．55 503S-507S(1992)。已表明，单基因突变(肥胖症或“ob”突变)会在小鼠中导致肥胖症和Ⅱ型糖尿病。Friedam．Genomics 11，1054-1062(1991)。Zhang等人，自然372，425-431(1994)最近已报道了对小鼠ob基因及其人同源物进行的克隆和测序工作，并且揭示，ob基因产物可作为脂肪组织信号途径中的一部分而发挥作用，它调节身体脂肪贮存的多少。在20多年前进行的异种共生(parabiosis)试验预测，含有2个突变型ob基因拷贝的遗传性肥胖小鼠(ob／ob小鼠)不会产生调节食物摄入饱胀因子(satiety factor)，而糖尿病(db／db)小鼠产生但是不作出应答的饱胀因子。Coleman和Hummal，Am．J．Physiol．217，1298-1304(1969)；Coleman，Diabetol 9，294-98(1973)。3个独立研究小组最近的报道表明，每天注射重组的OB蛋白质可抑制食物摄入并可减少过肥的ob／ob小鼠的体重和脂肪，但是对db／db小鼠无作用(Pelleymounter等人，科学，269，540-43[1995]；Halaas等人，科学，269，543-46[1995]；Campfield等人，科学，269，546-549[1995])，这暗示OB蛋白质是正如早期交叉循环研究中所提出的饱胀因子。这些最早的研究结果留下了许多未解之谜，并且也表现出许多未解决的矛盾之处。例如，报道说，尽管每天注射OB蛋白质对食物摄入和体重的影响，在瘦小鼠中是适度的，但是在这些报道中的一篇报道(Halaas等人，同上)中，用畜体组成分析表明身体脂肪有显著下降，而在另一篇报道(Pelleymounter等人，同上)中却没有该现象，虽然体重同样下降了。此外，Pelleymounter等人(同上)观察到，出于某些未知的原因，用剂量为0．1mg／kg／天的OB蛋白质进行处理的ob／ob小鼠，事实上体重增加了17．13％，而接受剂量为1mg／kg／天的OB的小鼠中，体重下降相当普通。OB蛋白质的受体尚没有被鉴别出。尽管在目前还不能排除外周受体的存在，但是最近的报道，即在具有下丘脑病变的小鼠脂肪组织中ob基因的更高表达并不导致瘦肉表型，暗示OB蛋白并不直接作用于脂肪细胞。Maffei等人，美国科学院院报(Proc．Natl．Acad．Sci．)，92，6957-60(1995)。研究者暗示，至少有一种OB受***于脑中。leptin受体(OB-R)的鉴别和表达克隆工作由Tartaglia等人，细胞，83，1263-71(1995)。Cioffi等人，自然，2，585-89(1996)描述了leptin受体的各种同种型。在PCT申请出版物No．WO 96／08510，(1996年3月21日出版)中描述了一种人血细胞生成素(hematopoetin)受体。一种OB蛋白质受体公开于Tartaglia，等人，细胞，83，1263-71(1995)。

发明概述

本发明基于这样的观察结果：即当OB蛋白质以连续皮下输注(infusion)形式给药时，与相同剂量以每天皮下注射方式给药相比，会明显更有效地降低体重和脂肪组织重量。本发明还基于一个出乎意料的发现：与天然的人OB相比，嵌合蛋白(其中OB多肽融合于免疫球蛋白的恒定区)明显能更有效力地减少体重和脂肪贮存，这时的条件是两种蛋白质每天皮下注射给药一次。后一观察结果特别令人吃惊，因为OB蛋白质-免疫球蛋白嵌合体的分子量大，所以预期不能通过脑血屏障达到据信位于脑中的OB受体。

一方面，本发明涉及半衰期长的OB蛋白质衍生物，它能够减少受处理个体的体重和／或食物摄入。本发明还涉及含有这些衍生物的组合物，以及为了减少体重和／或食物摄入而进行的施用。

另一方面，本发明涉及一类嵌合的多肽，该多肽包括与免疫球蛋白序列相连的、能够结合天然OB受体的OB蛋白质氨基酸序列(简称为OB-免疫球蛋白嵌合体或免疫粘附素)。在一具体例子中，嵌合的多肽是能够结合天然OB受体的OB氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区序列相连的形成的融合蛋白。本发明嵌合体的OB部分宜具有足够的、来自天然OB蛋白质的氨基酸序列，从而保留能与天然OB受体结合并能通过天然OB受体传递信号的能力。最佳地，当施用于肥胖者或非人的对象时，OB蛋白质保留能降低体重的能力。较佳地，OB多肽是人的，而且融合较佳地是与免疫球蛋白重链恒定区序列融合。在一个具体例子中，2个OB多肽-免疫球蛋白重链融合蛋白的缔合(如通过二硫键而共价连接起来)导致形成了同二聚体型的免疫球蛋白样的结构。免疫球蛋白轻链还可进一步地与二硫键连接的二聚体中的一个或两个OB-免疫球蛋白嵌合体缔合，从而形成同三聚体或同四聚体结构。

本发明还涉及编码本发明嵌合多肽链的核酸、含有编码这些分子的DNA的表达载体、转化的宿主细胞、以及通过培养转化的宿主细胞而产生这些分子的方法。

尽管本发明的长半衰期的衍生物对于减少体重和／或食物摄入特别有用，但是它们一般可被用于治疗与OB基因的表达或功能异常有关的病症，和／或引起OB受体介导的生物反应。因此，本发明的OB衍生物可用于治疗食欲过盛(bulemia)、降低胰岛素水平(如在Ⅰ型或Ⅱ糖尿病人中)、以及作为表达OB受体的各种细胞类型的促***原。所有这些以及有关的应用都在本发明的范围之内。

另一实施例中，本发明还涉及使用OB蛋白-免疫球蛋白嵌合体来纯化OB受体。

附图简述

图1，上方--以连续皮下输注方式或每天皮下注射方式，用鼠OB蛋白处理瘦型雌性小鼠。显示的数据是以克表示的每组的平均体重，n=4只小鼠／点。

图1下方--显示了腹膜后脂肪垫的平均重量。连续地皮下输注OB蛋白质也能比每天皮下注射更有效地降低脂肪组织的重量。

图2上方--用人OB蛋白(hOB)或用人OB-IgG-1融合蛋白(hOB-IgG-1)处理肥胖的雌性ob／ob小鼠。显示的数据是，以克表示的，每个处理组中从试验第一天至最后一天期间体重的平均变化值，其中n=3只小鼠／数据柱，但是hOB 0．19mg／kg／天的注射组中n=4而PBS注射组中n=1。

图2下方-显示的数据是每个处理组在6个24小时的试验期间内的平均食物摄入量，以克／小鼠／天表示，n=1头／数据柱。

图3上方和下方--用hOB或hOB-IgG-1，通过每天皮下注射7天而处理肥胖的雌性ob／ob小鼠。数据如图2那样进行描述，对所有的处理组n都是4只小鼠。

图4上方--用人蛋白(hOB)或用PEG-hOB处理肥胖的雌性ob／ob小鼠。显示的数据是，以克表示的，每个处理组中从试验第一天至最后一天期间体重的平均变化值，其中n=3-4只小鼠／数据柱，但是对于PBS注射组，n=1。物质是每天皮下注射的。“PEF1X”和“PEG2X”指制备分子时PEG试剂对蛋白质的比例。

图4下方-显示的数据是每个处理组在6个24小时的试验期间内的平均食物摄入量，以克／小鼠／天表示，n=3-4头／数据柱。

图5--用hOB-IgG融合蛋白、天然hOB或hCD4-IgG，通过每天皮下注射7天而处理肥胖的(ob／ob)雌性小鼠。对于所有的处理组，n=6只，但是对于3．8mg／kg／天的hOB组，n=2。同样观察到，在减少体重(上图和中图)和食物摄入方面，融合蛋白比天然hOB蛋白更有效。

图6--实施例1中人OB-IgG-1嵌合体的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

发明详述

A．定义

术语“肥胖”指与具有过多身体脂肪有关的身体过重的状况。对于某个个体而言，合适的体重取决于许多因素，其中包括性别、高度、年龄、总的身体构造等。这些相同的因素也用于确定个体是否被认为肥胖。确定给定个体的最佳体重，是一般医师能够做到的。

术语“长半衰期”及其语法上的变化形式，当与OB衍生物一起使用时，指与相应的天然OB蛋白质相比，OB衍生物具有更长的血浆半衰期和／或更慢的清除情况。长半衰期衍生物宜具有比天然OB蛋白质长至少1．5倍的半衰期；较佳地比天然OB蛋白质长至少2倍的半衰期；更佳地比天然OB蛋白质长至少3倍的半衰期。较佳地，天然OB蛋白质是待治疗的个体的蛋白质。

术语“OB”、“OB多肽”、“OB蛋白质”及其语法上的变化形式可互换使用，它们指“天然的”或“天然序列的”OB蛋白质(也被称为“leptin”)及其功能衍生物。OB多肽具有典型的细胞因子结构特征，即由一种细胞群释放并且作为细胞间中介体作用于其他细胞的多肽，比如生长激素、***、白细胞介素、胰岛素、糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)；促甲状腺素(TSH)；肿瘤坏死因子-α和β(TNA-α和TNF-β)；神经生长因子如NGF-β、PDGF；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；***-1和-2(IgF-1和IgF-2)；***；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素(IFN)如IFN-α，IFN-β和IFN-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8；以及其他多肽因子。

术语“天然的”和“天然序列的”OB多肽指来自任何动物物种(如人、鼠、兔、牛、羊、鸡、猪、马等)的、天然存在的OB多肽，其中包括目前已知的或未来可能被鉴别出的、天然存在的等位基因、缺失、取代和／或***变异体，只要它们保留结合于OB受体以及较佳地通过OB受体传递信号的能力。因此，天然的人OB多肽包括图6中所示的氨基酸序列中从N端至167位之间的氨基酸序列(还可参见SEQ ID NO：2和Zhang等人，(同上)中的图6)，以及该蛋白质的目前已知的或未来可能被鉴别出的、天然存在的变异蛋白。类似地，“天然的”或“天然序列的”鼠OB多肽具有Zhang等人，(同上)的图6中所示的氨基酸序列，以及该蛋白质的目前已知的或未来可能被鉴别出的、天然存在的变异蛋白。该定义具体地包括在氨基酸49位(采用Zhang等人(同上)的氨基酸编号)有或没有谷氨酰胺的变异蛋白。“天然的”或“天然序列的”OB多肽包括具有或不具有起始的N端甲硫氨酸(Met)、具有或不具有天然信号序列的天然蛋白，无论其处于单体形式还是二聚体形式。本领域中已知的天然的人和鼠OB多肽长167个氨基酸，含有2个保守半胱氨酸，并且具有分泌型蛋白质的特征。该多肽大多是亲水的，其预计的信号序列切割位点是21位(采用Zhang等人(同上)的氨基酸编号)。人和鼠序列之间的全序列同源性约为84％。这2种蛋白质在成熟蛋白质的N端区域具有更广的相同性，其中仅有的4个保守的和3个非保守的取代位于信号肽切割位点和117位保守半胱氨酸之间。单体形式的OB蛋白质的分子量约为16千道尔顿。

天然多肽的“功能衍生物”是具有与天然多肽共同的定性生物特性的化合物。OB多肽的功能衍生物是具有与天然(人的或非人的)OB多肽共同的定性生物特性的化合物。“功能衍生物”包括(但并不限于)：任何动物物种(包括人)的天然多肽片段、以及天然(人的和非人的)多肽和其片段的衍生物，只要它们具有与相应天然多肽相同的生物活性。

“片段”包括在成熟的天然OB多肽序列中的区域。优选的OB多肽片段包括成熟蛋白质的C末端，而且可在N端和其他对于受体结合和／或结构完整性不需要的分子部分具有较小的缺失。

术语“衍生物”被用于定义氨基酸序列变异体，以及天然多肽的共价修饰形式；而术语“变异体(变异蛋白)”指该定义中的氨基酸序列变异体。

在定义“功能衍生物”的上下文中的“生物特性”被定义为：或者(1)与天然多肽(即任何物种的天然OB多肽)的至少一个表位发生免疫交叉反应，或者(2)定性地具有与天然多肽相同的至少一种粘附、调控或效应子功能。

较佳地，功能衍生物是与天然多肽相比具有至少约65％氨基酸序列相同，较佳地约75％氨基酸序列相同，更佳地至少约85％氨基酸序列相同，最佳地至少约95％氨基酸序列相同的多肽。在本发明上下文中，天然序列的人OB多肽的功能衍生物优选地与天然OB蛋白具有至少约95％氨基酸序列相同，而且在人体中是非免疫原性的。

氨基酸序列的相同性或同源性在此处被定义为：在候选序列中，与相应的天然多肽序列中残基相同的氨基酸残基的百分比，其中将两个序列对齐排列并引入空隙(如果需要)，从而实现最大百分比的同源性，并且保守性取代不认为是序列相同性的一种。N端和C端的延伸部分或***都不认为会降低相同性或同源性。

如本文所用，免疫交叉反应意指，候选(多)肽能够竞争性地抑制相应天然多肽的定性的生物活性，该天然多肽具有与针对已知活性分子而产生的多克隆抗体或抗血清进行反应的活性。这些抗体和抗血清是以常规方式，通过将已知的天然OB蛋白质和Freud氏完全佐剂皮下注射入动物(如羊和兔)，然后用Freud氏不完全佐剂进行加强腹腔内注射或皮下注射而制得的。

术语“分离的OB多肽”及其语法上的变化形式都指从存在于人、其他动物、或其他可分离出该多肽来源中混杂多肽中分离出的OB多肽(如上所定义)。

一般，术语“氨基酸序列变异体”指与参照多肽(如天然序列)相比，在氨基酸序列上有某些差异的分子。氨基酸改变可以是在天然氨基酸序列中的取代、***、缺失或这些变化的任何所需的组合形式。

取代变异体是在天然序列中有至少一个氨基酸残基被去除并且在相同位置上***不同氨基酸的变异蛋白。取代可以是单取代，其中分子中仅一个氨基酸被取代；也可以是多取代，其中在同一分子中有2个或多个氨基酸被取代。

***变异体是在天然氨基酸序列中紧挨着特定位置处的氨基酸而***一个或多个氨基酸。紧挨着某氨基酸意指，连接于该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。

缺失变异体是在天然氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被去除的变异体。一般，缺失变异体在分子特定区域缺失一个或2个氨基酸。

“共价衍生物”包括天然多肽或其片段与有机蛋白衍生剂(derivatizing agent)或非有机蛋白衍生剂形成的修饰形式，以及翻译后的修饰形式。共价修饰形式一般是通过将靶氨基酸残基与有机衍生剂反应而引入(其中该衍生剂能够与选定的位点或末端残基反应)，或者通过利用在选定的重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰机制而引入。某些翻译后修饰形式是重组宿主细胞对所表达的多肽作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基通常在翻译后被脱去氨基，分别形成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基。或者，这些残基在微酸的条件下脱去氨基。这2种残基的任何一种形式都可存在于本发明的OB-免疫球蛋白嵌合体中。其他的翻译后修饰形式包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基、酪氨酸或苏氨酰基上羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链上α-氨基的甲基化[T．E．Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W．H．Freeman & Co．，San Francisco，pp．79-86(1983)]。

术语“编码……的DNA序列”、“编码……的DNA”和“编码……的核酸”指沿着脱氧核酸核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽链的氨基酸顺序。这样，DNA序列便编码了氨基酸序列。

术语“可复制的表达载体”和“表达载体”指一种DNA，它通常是双链的而且其中可***一段外源DNA。外源DNA被定义为外来的DNA，它是并不天然存在于宿主细胞中的DNA。载体被用于将外源或外来DNA运送到合适的宿主细胞中。一旦位于宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA进行复制，从而可以产生多个拷贝的载体及其***的(外源)DNA。此外，载体含有用于将外源DNA翻译成多肽的必要元件。这样，便可以快速地合成许多由外源DNA所编码的多肽分子。

术语“调控序列”指，在特定宿主生物中表达可操作地连接着的编码序列时所需的DNA序列。适用于原核生物的调控序列包括例如：启动子、可有可无的操纵子序列、核糖体结合位点、以及其他目前认识还不深的序列。已知真核细胞会利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

当核酸被放置，从而与另一核酸序列有功能上联系时，那么该核酸就是“可操作地连于…(或连接的)”。例如，前序列(presequence)或分泌前导序列的DNA是可操作地连于多肽DNA的，如果它以参与多肽分泌的前蛋白(preprotein)形式表达的话；启动子或增强子是可操作地连于编码序列的，如果它的影响序列转录的话；核糖体结合位点是可操作地连于编码序列的，如果它位置有助于翻译。一般，“可操作地连于”意指被连接的DNA序列是毗连的(或邻接的)，而在分泌前导序列的情况下是毗连的和处于阅读相(read phase)的。然而，增强子不必是毗连的。连接可通过在方便的限制性位点处进行连接而实现。如果不存在这样的位点，那么可以根据常规操作使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

在本发明的上下文中，词语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，而且所用这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的(宿主)细胞”包括原代的对象细胞以及由其衍生而得的培养物，而不论传代次数。还应理解，因为故意的或非故意的突变，所有的子代可能其DNA内容并不完全相同。具有与筛选最初转化细胞时相同的功能或生物活性的突变子代被包括在内。在需要明确指定的情况下，会在上下文中加以说明。

天然免疫球蛋白一般是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，它由2条相同的轻链(L)和2条相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键而连于重链，而在不同的免疫球蛋白同种型(isotype)的重链之间，二硫键的数目是不同的。每一重链和轻链也有规则地间隔的链内二硫键。每条重链在一端有可变区(V_H)，然后是多个恒定区。每条轻链在一端有可变区(V_L)，在另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对应，而轻链可变区与重链的可变区相对应。据信，有特定的氨基酸残基在轻链可变区和重链可变区之间形成界面(Clothia等人J．Mol．Biol．186：651-663[1985]；Novotny和Haber，美国科学院院报(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)，82：4592-4596[1985])。

根据它们重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同的类别。有5种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中某些还可被进一步划分为亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgA-1和IgA-2是IgA的单体亚类，而IgA通常是二聚体或更高的多聚体的形式。在肠胃(gut)中的免疫细胞主要产生多聚体型的IgA(也称为聚-IgA，其中包括二聚体和更高的多聚体)。这种聚-IgA含有二硫键连接的多肽(被称为“连接”链或“J”链)，而且可以与具有5个亚基并含有J链的多聚体型IgM(poly-IgM)一起被运送通过腺上皮。

杂交宜在“严紧条件”下进行，严紧条件意味着(1)洗涤时采用高温度和低离子强度，如0．015M氯化钠／0．0015M柠檬酸钠／0．1％十二烷基磺酸钠，50℃，或者(2)在杂交期间采用变性剂如甲酰胺，如50％(体积／体积)甲酰胺和0．1％牛血清白蛋白／0．1％聚蔗糖(Ficoll)／0．1％聚乙烯吡咯烷酮／50nM磷酸钠缓冲液(pH6．5)以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃。另一例子是使用50％甲酰胺、5×SSC(0．75M氯化钠、0．075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6／8)，0．1％焦磷酸钠、5×Denhartdt＇s溶液、超声波处理过的鲑精DNA(50微克／毫升)、0．1％SDS、和10％葡聚糖硫酸酯，42℃；并于42℃，在0．2×SSC和0．1％SDS中进行洗涤。

B．OB蛋白-免疫球蛋白嵌合体(免疫粘附素)

免疫粘附素(immunoadhesin)是嵌合的、类似抗体的分子，它将结合蛋白(通常是受体、细胞粘附分子或配体)的功能结构域与免疫球蛋白序列相合并。这种类型融合蛋白的最常见例子是，将免疫球蛋白(Ig)的绞链区和Fc区，与识别特异性配体的细胞表面受体的结构域相结合。这种类型的分子被称为“免疫粘附素”，因为它同时具有“免疫”和“粘附”功能；其他经常使用的名称是“Ig-嵌合体”、“Ig-”或“Fc-融合蛋白”、或“受体-球蛋白”。

目前为止，在本领域中已报道了50种以上的免疫粘附素。在文献中已报道的免疫粘附素包括：融合T细胞受体(Gascoigne等人，美国科学院院报84：2936-2940[1987))；CD4(Capan等人，自然337：525-531[1989]；Traunecker等人，自然339：68-70[1989]；Zettmeissl等人，DNA细胞生物学USA 9：347-353[1990]；和Byrn等人，自然344：667-670[1990])；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等人，J．Cell．Biol．110：2221-2229[1990]；和Watson等人，自然349：164-167[1991])；E-选择蛋白(Mulligan等人，免疫学杂志(J．Immunol．)151，6410-17[1993]；Jacob等人，生物化学，34，1210-1217[1995])；P-选择蛋白(Mulligan等人，同上；Hollenbaugh等人，生物化学，34，5678-84[1995])；ICAM-1(Staunton等人，J．Exp．Med．176，1471-1476[1992]；Martin等人，J．Virol．67，3561-68[1993]；Roep等人，柳叶刀(Lancet)343，1590-93[1994])；ICAM-2(Damle等人，免疫学杂志(J．Immunol．)148，665-71[1992])；ICAM-3(Holness等人，生物化学杂志(J．Biol．Chem．)270，877-84[1995])；LFA-3(Kanner等人，免疫学杂志(J．Immunol．)148，2-23-29[1992])；L1糖蛋白(Doherty等人，Neuron 14，57-66[1995])；TNF-R1(Ashkenazi等人，美国科学院院报88：10535-10539[1991]；Lesslauer等人，欧洲免疫学杂志(Eur．J．Immunnl．)21：2883-2886[1991]；和Peppel等人，J．Exp．Med．174：1483-1489[1991])；TNF-R2(Zack等人，美国科学院院报90，2335-39[1993]；Wooley等人，免疫学杂志(J．Immunol．)151，6602-07[1993])；CD44(Aruffo等人，细胞61：1303-1313[1990])；CD28和B7(Linsley等人，J．Exp．Med．173：721-730[1991])；CTLA-4(Lisley等人，J．Exp．Med．174：561-569[1991])；CD22(Stamenkovic等人，细胞66：1133-1144[1991])；NP受体(Bennett等人，J．Biol．Chem．266：23060-23067[1991])；IgE受体α(Ridgway和Gorman，J．Cell．Biol．115，摘要．1448[1991])；HGF受体(Mark M．R．等人，1992，生物化学杂志(J．Biol．Chem．)，提交的)；干扰素γ Rα-和β-链(Marsters等人，美国科学院院报92，5401-05[1995])；trk-A、-B和-C(Shelton等人，J．Neurosci．15，477-91[1995])；IL-2(Landolfi，免疫学杂志(J．Immunol．)146，915-919[1991])；IL-10(Zheng等人，免疫学杂志，154，5590-5600[1995])。

最简单和最直接的免疫粘附素设计，是将“粘附素”蛋白质的结合区域与免疫球蛋白转录的绞链区和Fc区结合在一起。一般，当制备本发明的OB-免疫球蛋白嵌合体时，将编码所需OB多肽的核酸融合于编码免疫球蛋白恒定区序列N末端的核酸的C末端，然而也可以融合于N末端。典型地，在这种融合方式中，所编码的嵌合多肽会保留至少有功能活性的、免疫球蛋白转录恒定区的绞链区、CH2区和CH3区。融合还可连于恒定区Fc部分的C末端、或刚好在转录重链CH1或轻链的相应区域的N末端处进行融合。进行融合的确切位点并不重要；具体的位点是众所周知的并且可以选择，以优化OB-免疫球蛋白嵌合体的生物活性、分泌或结合特性。

在一个优选例子中，将天然的成熟OB多肽序列融合于抗体C末端部分(尤其是Fc区)的N末端，该C末端部分具有免疫球蛋白如IgG-1的效应子功能。可以将整个重链恒定区融合于OB序列。然而，更佳的是，用于融合的是从刚好位于木瓜蛋白酶酶切位点(该位点在化学上定义了IgG Fc；即残基216，将重链恒定区的第一个残基定为残基114[Kobet等人，同上]，或其他免疫球蛋白的类似位点)上游的绞链区开始的序列。在一个特别优选的例子中，OB多肽序列被融合于IgG-1、IgG-2或IgG-3重链的绞链区以及CH2和CH3，或者CH1、绞链区、CH2和CH3区。融合的确切位置并不重要，并且可通过常规的试验方法确定最佳位置。

在某些例子中，OB-免疫球蛋白被装配成多聚体形式，尤其是同二聚体或同四聚体(WO 91／08298)。一般，这些装配的免疫球蛋白会具有已知的单元结构。一种基本的4链结构单元是IgG、IgD、和IgE存在的形式。4链单元在分子量更大的免疫球蛋白中会重复；IgM一般是由二硫键维持在一起的4种基本单元构成的五聚体。IgA球蛋白以及偶尔IgG球蛋白也可以多聚体形式存在于血清中。在多聚体情况下，4种单元中的每一种可以相同或不同。

在此处范围内的、各种代表性的、装配的OB-免疫球蛋白嵌合体被示意性地如下表示：

(a)AC_L-AC_L；

(b)AC_H-[AC_H，AC_L-AC_H，AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H]；

(c)AC_L-AC_H-[AC_L-AC_H，AC_L-V_HC_H， V_LC_L-AC_H，或V_LC_L-V_HC_H]；

(d)AC_L-V_HC_H-[AC_H，或AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H]；

(e)V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H]；和

(f)[A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H]₂，

其中，每个A表示相同或不同的OB多肽氨基酸序列；

V_L是免疫球蛋白轻链可变区；

V_H是免疫球蛋白重链可变区；

C_L，是免疫球蛋白轻链恒定区；

C_H是免疫球蛋白重链恒定区；

n是大于1的整数；

Y是共价交联剂的残基。

为了简洁起见，上述结构中仅显示了关键特征，它们没有显示免疫球蛋白的连接(J)区或其他的区域，也没有显示二硫键。然而，当为了结合活性而需要这些区域时，它们应被构建并处于它们在免疫球蛋白分子中所处的常规位置。

或者，可将OB氨基酸序列***免疫球蛋白重链和轻链之间，这样便获得了具有嵌合重链的免疫球蛋白。在这种情况下，OB多肽序列就被融合于免疫球蛋白每个臂中免疫球蛋白重链的3＇端，或者在绞链和CH2区之间，或者在CH2和CH3区之间。类似的构建物已由Hoogenboom，H．R．等人，分子免疫学28：1027-1037(1991)报道过。

尽管在本发明的免疫粘附素中并不要求存在免疫球蛋白轻链，但是可以存在免疫球蛋白轻链，它或者共价地连于OB蛋白-免疫球蛋白重链融合多肽，或者直接融合于OB多肽。在前一种情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA一般与编码OB-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。一旦分泌，杂合体的重链和轻链会共价缔合，从而形成免疫球蛋白样(immunoglobulin-like)的结构，它含有2个由二硫键连接的免疫球蛋白重链-轻链对。适用于制备这种结构物的方法公开于例如美国专利No．4，816，567(1989年3月28日授权)。

在一个优选例子中，用于构建本发明的免疫粘附素的免疫球蛋白序列来自IgG免疫球蛋白重链恒定区。对于人的免疫粘附素，优选使用人的IgG-1和IgG-3免疫球蛋白序列。使用IgG-1的一个主要优点是，IgG-1免疫粘附素可以有效地在固定化的蛋白质A上被纯化。相反，IgG-3的纯化需要蛋白质G(一种多用途性较差的介质)。但是，当选择用于特定的免疫粘附素构建中的Ig融合配对物时，应考虑免疫球蛋白的其他结构和功能特性。例如，IgG-3的绞链更长和更柔韧，所以它可容纳更大的“粘附素”结构域，而这些“粘附素”结构域在融合于IgG-1时，可能不能正常地折叠或发挥功能。基于IgG的可能的免疫粘附素结构示于图3a-c。尽管IgG免疫粘附素一般是一价或二价的，但是其他Ig亚型如IgA和IgM会分别产生由基本的Ig同二聚体单元构成的二聚体的或五聚体的结构。典型的基于IgM的多聚体型免疫粘附素示于图3d。多聚体型免疫粘附素的优点在于，与基于IgG的对应免疫粘附素相比，它们能够以更大的亲和力结合各自的靶目标。已报道的这种结构的例子是CD4-IgM(Traunecker等人，同上)；ICAM-IgM(Martin等人，病毒学杂志(J．Virol．)67，3561-68[1993])；和CD2-IgM(Arulanandam等人，J．Exp．Med．177，1439-50[1993])。

对于设计用于体内的OB-Ig免疫粘附素，药物动力学性质和Fc区导致的效应子功能也是重要的。尽管IgG-1、IgG-2和IgG-4都有21天的体内半衰期，但是它们激活补体***的有关能力却不相同。IgG-4不激活补体，而与IgG-1相比，IgG-2激活补体的能力非常弱。此外，与IgG-1不同，IgG-2不结合单核细胞或嗜中性白细胞上的Fc受体。尽管IgG-3对于补体激活是最佳的，但是其体内半衰期约为其他IgG同种型的1／3。对于用于人体治疗的免疫粘附素的另一重要考虑因素是，某一同种型的同种异型(allotypic)变体的数目。一般，优选的是按血清学上划分时同种异型较少的IgG同种型。例如，IgG-1仅有4种血清学同种异型位点，其中2种(Glm和2)位于Fc区；而且这些位点中的一个即Glm是非免疫原性的。与之相反，IgG-3有12种血清学的同种异型，所有的都位于Fc区；这些位点中仅有3个(G3m5、11和21)具有一个非免疫原性的同种异型。这样，γ3免疫粘附素潜在的免疫原性就大于γl免疫粘附素。

在设计本发明的OB-Ig免疫粘附素时，对于分子的受体结合、结构完整性(如适当的折叠)和／或生物活性等而言不需要的区域可以被删去。在这种结构中，重要的是，将融合连接处置于位于结构域之间的残基处，从而避免错误的折叠。至于亲代免疫球蛋白，一种有用的接点是正好位于绞链区中半胱氨酸的上游，该半胱氨酸在两个重链之间形成二硫键。在一种经常使用的设计中，将对应于分子的“粘附素”(OB)部分的C末端残基的密码子，正好置于编码IgG1绞链区的序列DKTHTCPPCP的密码子上游。

最方便的是，通过将编码处于阅读框的OB部分的cDNA序列融合于Ig的cDNA序列，从而构建OB-Ig免疫粘附素。然而，还可以融合于基因组Ig片段(参见例如Gascoigne等人，美国科学院院报84，2936-2940[1987]；Aruffo等人，细胞，61：1303-1313[1990]；和Stamenkovic等人，细胞66：1133-1144[1991])。后一种类型的融合需要存在Ig调控序列以便表达。可以根据出版的序列，从来自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库中，通过杂交或聚合酶链反应(PCR)技术分离出编码IgG重链恒定区的cDNA。例如，鼠OB cDNA可通过PCR法从鼠脂肪组织cDNA文库(Clontech)中获得，其中可使用基于Zhang等人的序列而设计引物。可以用类似的方式获得人OB cDNA。或者，可将鼠OB基因用作探针，从例如Zhang等人描述的λgtⅡ文库中分离出人脂肪组织的cDNA克隆(Clontech)。编码免疫粘附素的“粘附素”和Ig部分的cDNA被串联式地***质粒载体中，该质粒载体在选定的宿主细胞中指导有效的表达。对于在哺乳动物细胞中进行表达，优选的是基于pRK5的载体(Schall等人，细胞61，361-370[1990])、pRK7载体和基于CDM8的载体(Seed，自然，329，840[1989])。(除了在ClaⅠ和HindⅢ之间的多接头中内切核酸酶限制性位点的次序相反之外，pRK7与pRK5是相同的。请参见1992年1月28日授权的美国专利No．5，108，901)。可用寡核苷酸介导的缺失诱变法(Zolier和Smith，《核酸研究》(Nucleic．Acids Res．)10，6487[1982]；Capon等人，自然337，525-531[1989])，通过去除位于设计的连接密码子之间的多余序列，从而形成确切的接界(junction)。可使用合成的寡核苷酸，其中该寡核苷酸的每一半与所需接界的一侧序列互补；而且较佳地这些寡核苷酸是36-48聚体。或者，用PCR技术将分子的两部分与合适的载体按阅读框连接在一起。

免疫粘附素可在多种宿主细胞中有效地表达，其中包括骨髓瘤细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴COS细胞、人胚胎肾293细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞。在这些***中，免疫粘附素多肽被装配和分泌入细胞培养基中。还可以作为宿主使用的是酵母如酿酒酵母、巴士德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)等，以及细菌细胞，尤其是大肠杆菌。OB-免疫球蛋白嵌合体可以在酵母中表达，比如用类似于下述文献中所述的表达OB蛋白的方法：Leiber等人，Crit．Res．Food Sci．Nutr．33，351(1993)；Friedman和Leibel，细胞69，217(1992)；以及Beavis和Chait，美国科学院院报87，6873(1990)。这样，编码序列可以被亚克隆入酵母质粒，如酵母表达质粒pPIC．9(Invitrogen)。该载体指导将异源蛋白质从酵母中分泌到培养基中。根据Halaas等人(同上)，在用载体转化的酿酒酵母中，鼠和人OB基因的表达产生了一种分泌的16千道尔顿蛋白质，这是未经加工的、缺乏信号序列的OB蛋白。在大肠杆菌中表达鼠或人的OB-免疫球蛋白嵌合体，可以用例如类似于Halaas等人(同上)所述的程序进行。通过使用T7大肠杆菌RNA聚合酶***，可将鼠和人OB-免疫球蛋白嵌合体的编码序列亚克隆入PET15b表达载体(Novagen)中，然后在大肠杆菌(BL21(DE3)pIYsS)中表达。或者，可以通过将阅读框正确的编码序列和大肠杆菌热稳定的肠毒素Ⅱ的分泌序列，***大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的下游(Chang等人，基因55，189-96[1987])，而在大肠杆菌中表达融合蛋白。

用于表达OB-Ig免疫粘附素的宿主细胞系的选择，主要取决于表达载体。另一考虑因素是所需要的蛋白质数量。用瞬时转染常可产生毫克级数量。例如，通过改进的磷酸钙法，用腺病毒EIA转化的293人胚肾细胞系可以用基于pRK5和pRK7的载体进行瞬时转染，从而有效地表达免疫粘附素。该方法在实施例中有阐述。基于CDM8的载体，可用于通过DEAE-葡聚糖法(Aruffo等人，细胞61：1303-1313[1990]；和Zettmeissl等人，DNA细胞生物学(US)9：347-353[1990])转染COS细胞。如果需要更多数量的蛋白质，那么可在稳定转染宿主细胞系之后表达免疫粘附素。例如，在编码二氢叶酸还原酶(DHFR)并赋予G418抗性的额外质粒存在下，将基于pRK5或pRK7的载体引入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在培养物中选择出对G418有抗性的克隆。在存在水平逐渐上升的DHFR抑制剂氨甲蝶呤下，使这些克隆生长，并选择克隆，这样编码DHFR和免疫粘附素序列的基因拷贝数目便一起增加了。如果免疫粘附素在N-端含有疏水的前导序列，那么它可能被转染的细胞所加工和分泌。结构更复杂的免疫粘附素的表达会需要非常合适的宿主细胞。例如，诸如轻链或J链之类的元件可由某些骨髓瘤或杂交瘤宿主细胞所提供[Gascoigne等人，1987，同上；和Martin等人，病毒学杂志67：3561-3568(1993)]。

具有更复杂的寡聚体结构的免疫粘附素的表达，会需要非常合适的宿主细胞。例如，诸如轻链或J链之类的元件可由某些骨髓瘤或杂交瘤宿主细胞所提供[Gascoigne等人，1987，同上；和Martin等人，病毒学杂志67：3561-3568(1993)]。

免疫粘附素可方便地用亲和色谱进行纯化。蛋白质A作为亲和配体的合适性，取决于在嵌合体中所用的免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白质A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的免疫粘附素(Lindmark等人，J．Immunol．Meth．62：1-13[1983])。蛋白质G被推荐用于所有小鼠的同种型和人的γ3(Guss等人，欧洲分子生物学协会杂志5：15671575[1986])。至于亲和配体所附着的基质，最常见的是琼脂糖，但是其他的基质也是可行的。与琼脂糖相比，机械上稳定的基质如受控的多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流速和更短的处理时间。使免疫粘附素结合于蛋白质A或G亲和柱的条件，完全由Fc区的性质(即其种类和同种型)所决定。一般而言，当选择了合适的配体时，便可与未处理的培养液中直接发生有效的结合。免疫粘附素的一种区别性特征是，对于人γ1分子，对蛋白质A的结合能力相对于相同Fc型的抗体而言有些下降。结合的免疫粘附素可有效地或者在酸性pH(大于或等于3．0)被洗脱，或者在适度地含有离液序列高的盐的中性pH缓冲液中被洗脱。该亲和色谱步骤能使免疫粘附素制剂的纯度大于95％。

还可以使用本领域已知的其他方法来纯化免疫粘附素，以代替在蛋白质A或G上进行的亲和色谱，或者作为亲和色谱的额外纯化方法。在亲硫凝胶色谱[Hutchens和Porath，分析生物化学(Anal．Biochem．)159，217-226(1986)]和固定化金属螯合色谱[Al-Mashikhi和Makai，J．Dairy Sci．71，1756-1763(1988)]中，免疫粘附素的行为类似于抗体。然而，与抗体相反，它们在离子交换柱上的行为不仅受其等电点支配，而且还受到电荷偶极的支配。因为其嵌合本质，所以在分子中可能有电荷偶极。电荷的微不均一性(microheterogeneity)也可以是免疫粘附素的一个因素，其中分子的粘附素部分是糖基化的而且含有唾液酸。在实施例中描述了一种具体的纯化方案。

用目前所产生的众多免疫粘附素所获得的结果显示，将粘附素部分融合于Fc区通常不会扰乱各结构域的折叠。粘附素和免疫球蛋白区两者似乎都正确地折叠，而且Fc区保留了许多抗体特有的效应子功能，如结合于Fc受体。

一般性地适用于构建、表达和纯化免疫粘附素的方法，在例如美国专利No．5，225，538(1993年7月6日授权)和5，455，165(1995年10月30日)中有描述，这些文献的公开内容在此引用作为参考。免疫粘附素的构建、表达、纯化以及各种免疫粘附素的设计，还描述于Ashkenazi和Chamow，Methods in Enzymology 8，104-115(1995)以及Peach和Linsley，Methods in Enzymology 8，116-123(1995)的综述性文章中，这2篇文献以及在本文中引用的文献的公开内容，在此引用作为参考。

C．其他长半衰期的OB衍生物

其他具有比天然分子更长半衰期的OB蛋白衍生物，包括共价地连于非蛋白质聚合物的OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合体。非蛋白质聚合物通常是亲水的合成聚合物，即原本在自然界没有的聚合物。然而，也可使用自然界存在的和用重组方法或体外方法生产出的聚合物，以及从天然来源中分离出的聚合物。亲水的聚乙烯基聚合物在本发明范围之内，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是，聚亚烷基醚(polyalkylene ether)如聚乙二醇(PEG)；聚氧烷烯(polyelkyene)如聚氧乙烯、聚氧丙烯、和聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；carbomer；支链或直链的多糖，该多糖具有糖单体如D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-***糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(如聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，其中包括同多糖(homopolysaccharide)和异多糖如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、葡聚糖硫酸酯、葡聚糖、糊精、糖元或酸性粘多糖的多糖亚基，如透明质酸；糖醇的聚合物如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或类肝素。在交联之前的聚合物不必是水溶性的，但是优选地是水溶性的，而且最终的偶联物必须是水溶性的。此外，聚合物在偶联形式下不应是高度免疫原性，而且也不应具有与静脉内输液或注射不相容的浓度，如果准备采用这些途径给药的话。

较佳地，聚合物仅含有一个活性基团。这有助于避免蛋白质分子的交联。然而，通过优化反应条件以减少交联、或者通过凝胶过滤或层析筛(chromatographicsieve)来纯化产物，从而回收基本均质的衍生物都在本发明范围之内。

聚合物的分子量宜在约100-500，000之间，更佳地约为1，000-20，000。选定的分子量取决于聚合物的性质和取代的程度。一般，如果聚合物的亲水性更大以及取代程度更大，那么就可采用较低的分子量。最佳的分子量可用常规实验加以确定。

聚合物一般通过多官能交联剂而共价地连于OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合体，其中该交联剂可与聚合物以及待交联的OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合体的一个或多个氨基酸残基或糖基反应。但是，通过将衍生聚合物(derivatized polymer)与杂合分子(hybrid)反应(反之亦然)而直接交联聚合物也在本发明范围之内。

在OB蛋白或OB-Ig上的共价偶联位点包括：N端氨基酸和在赖氨酸残基上的ε-氨基、以及其他的氨基、亚氨基、羧基、巯基、巯基或其他的亲水基团。可以不使用多官能(通常为双官能)的交联剂，而将聚合物直接共价连于杂合分子。共价地连于氨基可以用已知的基于下列物质的化学方法而完成：氰尿酰氯、羰基二咪唑(carbonyl diimidazole)、醛反应基团(PEG醇盐加溴代乙醛的二乙基乙缩醛；PEG加DMSO和乙酸酐，或PEG氯化物加4-羟基苯甲醛的酚盐，琥珀酰亚胺基(succinimidyl)活性酯、活化的二硫代碳酸酯PEG、2，4，5-三氯苯基氯甲酸酯(2，4，5-trichlorophenylcloroformate)或者对-硝基苯基氯甲酸酯激活的PEG)。可通过用碳化二亚胺偶联PEG-胺而衍生得到羧基。

可用化学物质如偏高碘酸盐，或者用酶如葡萄糖或半乳糖氧化酶(两者都产生碳水化合物的醛衍生物)，通过氧化反应而将聚合物偶联于寡糖基团上，然后按Heitzmann等人美国科学院院报，71，3537-41(1974)或Bayer等人，Methods inEnzymology 62，310(1979)中所述的相同方式，与酰肼或氨基衍生聚合物反应，以便用生物素或抗生物素蛋白标记寡糖。此外，目前已用于连接寡糖的其他化学和酶学方法是特别有利的，因为一般除了用于衍生的氨基酸位点之外很少有改变，而且这样产生的寡糖一般更为均一。在聚合物衍生反应之前，还可任选地对寡糖取代基进行修饰，如通过酶消化(例如用神经氨酸酶)而去除糖。

聚合物会具有与氨基酸侧链、或待连接多糖的N末端或C末端直接反应的基团，或者该基团可与多官能交联剂反应。一般，具有这样反应基团的聚合物已知可用于制备固定化蛋白质。为了在此处使用这些化学方法，人们应使用目前蛋白质固定化中所用的水溶性聚合物，或用与蛋白固定化同样方式衍生后不溶的聚合物。溴化氰激活反应是一种特别有用的方法，可用于交联多糖。

对于起始聚合物的“水溶性”指，用于偶联反应的该聚合物或其反应性中间体是充分溶解于水的，从而参与衍生反应。

对于聚合物偶联体的“水溶性”指，该偶联体在生理流体如血液中是可溶的。

用这种聚合物进行替代(substitution)的程度取决于：蛋白质上活性位点的数目、使用的是全长蛋白质还是蛋白质片段、蛋白质是否是与异源蛋白质的融合蛋白(如OB-免疫球蛋白嵌合体)、分子量、亲水性和蛋白质的其他特性，以及所选定的蛋白质具体衍生位点。一般，偶联体含有约1-1O个聚合物分子，尽管任何异源序列可用数目几乎不受限制的聚合物分子进行替代，只要所需的活性大体上没有被有害地影响。交联的最佳程度可由实验模型(matrix)容易地确定，其中改变时间、温度和其他反应条件以改变替代程度，随后测定偶联物按所需方式发挥功能的能力。

聚合物(如PEG)可用已有的各种不同方法进行交联，以便用非蛋白的聚合物如PEG来共价修饰蛋白质。但是，某些这样的方法对于此处的目的并不是优选的。氰尿酰氯(cyanuronic chloride)化学法会导致许多副反应，其中包括蛋白质交联。此外，它特别容易使含有巯基的蛋白质失活。羰基二咪唑法(Beauchamp等人，AnalBiochem．131，25-33[1983])需要高pH(＞8．5)，这会使蛋白质失活。此外，因为“活化的PEG”中间体能与水反应，所以相对于蛋白质而言，需要按摩尔计非常大过量的“活化PEG”。羰基二咪唑法所需要的高浓度PEG，还会导致纯化问题，因为会对凝胶过滤色谱和亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography)都产生不利影响。另外，高浓度的“活化PEG”会使蛋白质沉淀，这一问题本身早就被注意到了(Davis，美国专利No．4，179，337)。另一方面，醛法(Royer，美国专利No．4，002，531)是更有效的，因为它仅需要40倍摩尔过量的PEG和1-2小时的保温。但是，Royer所建议的用于制备PEG醛的二氧化锰是有问题的，“因为PEG有明显的与以金属为基础(metal-based)的氧化剂形成复合物的倾向”。(Harris等人，J Polym．Sci．Polym．Chem．Ed 22，341-52[1984])。使用Moffatt氧化法(采用DMSO和酸酐)可避免该问题。此外，Royer所建议的硼氢化钠必须在高pH下使用，而且它有较强的还原二硫键的倾向。与之相反，优选的是氰基硼氢化钠，它在中性pH下是有效的而且还原二硫键的倾向非常弱。

用于修饰本发明的OB蛋白或OB-Ig嵌合体的、官能化的(functionalized)PEG聚合物，可从Shearwater Polymers，Inc．(Huntsville，AL)获得。这些市售的PEG衍生物包括(但并不限于)：氨基PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG的琥珀酰亚胺基碳酸酯、氨基酸PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG-氧羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG-tresylate、PEG-缩水甘油基醚、PEG-醛、PEG-乙烯砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-二硫化邻吡啶(orthopyridyl-disulfide)、杂官能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷、和PEGphospholide。取决于蛋白质、所需的PEG化程度、和所采用的PEG衍生物等因素，对这些PEG衍生物进行偶联的反应条件可有所不同。在选择PEG衍生物中涉及的一些因素包括：所需的连接位点(赖氨酸或半胱氨酸)，衍生物的水解稳定性和反应性，连接的稳定性、毒性和免疫原性，适合分析的程度等。使用任一具体衍生物的具体说明可从制造商处获得。

本发明的长半衰期的偶联物可从未反应的原料中，通过凝胶过滤而分离出。用相同方式，可将不同种类的偶联物相互纯化开。聚合物还可以是水不溶性的，如作为亲水凝胶。

偶联物还可用离子交换色谱法进行纯化。亲电活化的众多PEG的化学性质，会导致PEG化产物氨基酸电荷的减少。因此，可使用高分辨率的离子交换色谱法来分离游离的和偶联的蛋白质，并且可用于分辨PEG化程度不同的种类。事实上，因为未反应氨基酸的离子特性不同，所以分辨不同种类(如含有一个或两个PEG基的种类)也是可能的。

D．OB-免疫球蛋白嵌合体和其他长半衰期衍生物的用途

本发明的OB-免疫球蛋白嵌合体和其他长半衰期衍生物，可用于减少体重，尤其是用于治疗肥胖症和其他与OB基因的表达或功能异常有关的症状。我们的研究表明，OB-免疫球蛋白嵌合体和其他长半衰期衍生物(如PEG化的OB)，可减少食物摄入并增加受治疗动物的能量消耗，因而对于减少肥胖和正常对象的体重非常有效。出于测试目的，可将本发明的分子溶解在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7．4)中，然后通过静脉内或皮下注射或输液而进行施用。

本发明的长时间发挥作用的OB-衍生物，还可用于治疗其他代谢疾病如糖尿病和食欲过盛。已表明，本发明的OB蛋白可降低动物中胰岛素水平，而且能够用于降低病人中过高的胰岛素水平。在肥胖病人和非肥胖病人(如Ⅰ型或Ⅱ糖尿病)中，胰岛素水平的下降可恢复或改善这些病人的胰岛素敏感度。

此外，长半衰期的OB衍生物还可用于治疗肾疾病、高血压、和肺功能失常如肺气肿。OB蛋白还可在具有受体的组织中，作为这些细胞的生长因子而导致有丝***反应。

将具有所需纯度的活性组份与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington＇s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A．，Ed．[1980])，以冻干剂或水溶液形式进行混合，可以制得本发明的的治疗制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂，对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸的缓冲液；抗氧化剂如维生素C；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；和／或非离子型表面活性剂如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。

活性成分还可被包于制备的微囊中，例如通过团聚技术或通过界面聚合作用(如分别采用羟甲基纤维素，或明胶-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)，包于胶体药物输送***中(如脂质体、白蛋白微球、微乳状液、纳米级颗粒和纳米级微囊)，或包于粗乳状液中。这些技术公开于Remington＇s Pharmaceutical Sciences，同上。

用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过用灭菌过滤膜过滤而实现，这可在冻干和重新组成(reconstitution)之前或之后进行。

治疗性的组合物一般被置于具有无菌入口的容器中，如具有可被皮下注射器针头穿刺的塞头的小瓶或静脉溶液包(intravenous solution bag)。

给药途径可根据已知的方法，如静脉内、腹膜内等途径的注射或输注。缓释制剂也是可行的。缓释制剂的合适例子包括半渗透性基质，该基质为成形制品，如膜或微囊。缓释基质的例子包括：聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利No．3，773，919、EP 58，481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙基酯的共聚物(U．Sidman等人，1983，“Biopolymer”22(1)：547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯(R．Langer等人，1981，＂J．Biomed．Mater．Res＂．15：167-277和R．Langer，1982，＂Chem．Tech．＂12：98-105)、乙烯-乙烯基乙酸酯(R．Langer等人，同上)、或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP133，988A)。缓释组合物还包括脂质体。含有本发明范围内分子的脂质体可用已知的方法制备：DE 3，218，121A；Epstein等人，1985，美国科学院院报82：3688-3692；Hwang等人，1980，美国科学院院报77：4030-4034；EP 52322A；EP36676A；EP 88046A；EP143949A；EP 142，641A；日本专利申请83-118008；美国专利No．4，485，045和4，544，545；和EP 102，324A。一般，脂质体是小型的(约200-800埃)单层类型，其中脂类含量大于约30mol％胆固醇，为了最佳治疗效果可调节选定的比例。

本发明分子在治疗中所用的有效量取决于例如，治疗目的、给药途径和病人的状况。因此，治疗专家有必要测定剂量的效价并按需要对给药途径进行修改，以便获得最佳的治疗效果。一种典型的日剂量约为1微克／千克至10毫克／千克或更高，这取决于上述的因素。典型地，临床医师会施用本发明的分子，直至到达可实现所需生物效果的剂量。治疗的进程可方便地用常规分析方法加以监视。如果治疗目的是减少体重，那么治疗一般继续到达到所需的体重为止。

本发明的OB蛋白-免疫球蛋白的非治疗用途包括：将它们用于OB受体的鉴别和纯化。在下面的参考实施例描述了施用OB蛋白-免疫粘附素对OB受体进行鉴别和表达克隆。

下面通过不起限制作用的实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

OB-免疫粘附素的表达

用蛋白质工程技术，以具有IgG-1的绞链区、CH2和CH3区的融合蛋白形式，表达人OB蛋白。用人IgG-1的Fc区克隆，制备编码人OB蛋白和IgG-1Fc区的嵌合体的DNA构建物。人OB cDNA是用PCR法，从人脂肪细胞双链cDNA(Clontech Buick-Clone cDNA产物)中获得的。IgG-1 cDNA的来源是质粒pBSSK-CH₂CH₃。嵌合体含有全长OB蛋白(图5中氨基酸1-167)和从216位的天冬氨酸开始并结束于441位氨基酸的人IgG-1序列的编码序列(将114位氨基酸作为重链恒定区的第一个氨基酸(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest第4版[1987])，该天冬氨酸是在重链-轻链结合中涉及的半胱氨酸残基后的IgG-1绞链区的第一个残基。在OB和IgG-1编码序列之间***了编码3个氨基酸(Gly Val Thr)的密码子。如果需要，这个短的接头序列可以被方便地去除(例如通过定点缺失诱变法)，从而产生OB蛋白和IgG-1绞链区编码序列之间精确的连接。可将OB-IgG-1免疫粘附素的编码序列亚克隆入基于pRK5载体pRK5tk-neo(它含有供选择的新霉素标记基因)中，以便用硫酸钙技术(Suva等人，科学237，893-896[1987])在293细胞中进行瞬时表达。在含有10％FBS和2mM L-Gln的HAM＇s：低葡萄糖DMEM培养基(50∶50)中培养293细胞。为了纯化OB-IgG-1，在转染后那一天将细胞换到没有血清的生产培养基PS24中，并在3天后收获培养基。对培养基进行过滤。

在过滤后的、含有重组人OB-IgG-1的293细胞上清液(400毫升)中，加入1mM苯甲基磺酰基氟化物和2微克／毫升抑蛋白酶肽(aprotinin)。在4℃，将该材料上样于在100mM HEPES(pH8．0)中平衡过的1×4．5厘米蛋白质A琼脂糖柱(Pierce目录#20365)。流速为75毫升／小时。一旦将样品上样后，用平衡缓冲液洗涤柱，直到A₂₈₀达到基线水平。用流速为15毫升／小时的3．5M氯化镁+2％甘油(未缓冲过的)洗脱OB-IgG-1蛋白。收集洗脱液，并偶尔将其混入10毫升100mMHEPES(pH8)中以便将氯化镁浓度降低约一半并使pH上升。洗脱出的蛋白质接着被透析到磷酸盐缓冲液中，浓缩，无菌过滤然后储藏在4℃或冰冻储藏在-70℃。这种方法制备的OB-IgG-1免疫粘附素，经SDS-PAGE测定，纯度大于90％。

实施例2

动物研究A．材料和方法

OB蛋白质的产生--通过PCR法，使用基于Zhang等人(同上)的序列的引物，从脂肪细胞cDNA库中获得鼠OB cDNA。通过将处于阅读框的OB编码序列和大肠杆菌热稳定的肠毒素Ⅱ分泌序列，***大肠杆菌碱性磷酸酶启动子下游，在大肠杆菌中表达成熟的OB蛋白(氨基酸22-167)。Chang等人，基因，55 189-96(1987)。在细胞裂解后，在25mM DTT存在下，将不溶性组份增溶(solubilize)在8M尿素缓冲液(pH8．35)中。还原后的OB蛋白，用分子排阻层析和反向HPLC进行纯化，然后在谷胱甘肽存在下再次进行折叠。再折叠后的OB蛋白用反向HPLC进行纯化，然后用SDS-PAGE及氨基酸和质谱分析法进行分析。

PEG-hOB的制备--通过将反向色谱纯化的hOB与公称分子量为10kD的PEG丙酸的琥珀酸酰亚胺基衍生物(SPA-PEG)(可从Shearwater Polymers，Inc．，Huntsville，AL获得)反应，制备人OB蛋白质的PEG衍生物。在用反向色谱纯化hOB蛋白之后，将在0．1％三氟乙酸和约40％乙腈中的约1-2毫克／毫升的蛋白质溶液，用1／3至1／2体积的0．2M硼酸盐缓冲液稀释，并用NaOH将pH调节至8．5。将SPA-PEG加入反应混合物中，使蛋白质对SPA-PEG的摩尔比为1∶1和1∶2，然后在室温下保温混合物1小时。在反应和用凝胶电泳或离子交换色谱法纯化之后，让样品对磷酸盐缓冲液进行全面地透析，然后通过在0．22微米滤膜上过滤而灭菌。将样品在4℃下储藏。在这些条件下，蛋白质与SPA-PEG摩尔比为1∶1时所形成的PEG-hOB，主要由连有一个10kD PEG分子构成，同时有少量含2个PEG的种类。摩尔比为1∶2的反应所形成的PEG-hOB，用SDS凝胶电泳测定表明，主要由几乎等量的连有2个和3个PEG的hOB所构成。在两个反应中，还都检测到少量未反应的蛋白质。如果需要，这些未反应的蛋白质可通过凝胶过滤或离子交换步骤而有效去除。人OB蛋白的PEG衍生物还可大体上按EP372，752(1990年6月13日出版)中所述的醛法而制备。

动物研究--所有涉及动物的操作都得到Genentech＇s研究所动物养护和使用委员会(Genentech＇s Institutional Aminal Care and Use Committee)审查和批准。从Jackson Labs(Bar Harbor，ME)购买7-8周大小的、遗传上肥胖的C57B1／6J-ob／ob(ob／ob)雌性小鼠。从Harlan Sprague Dawley(Hollister，CA)购买具有相同遗传背景(C57B1／6)的瘦型雌小鼠。将小鼠分成3-6组，饲养在控制温度、湿度和光的(光照从6点至18点)的鼠群室(colony room)中，并可随意地饮水和食用标准的鼠食(Purina 5010：Purina Mills，Richmond，IN)。

在无菌条件下按照制造商的说明，将无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中纯化的重组OB蛋白质(100微克／千克／天)，或仅PBS注入小型渗透泵(Alzet 2002型；Alza Corp．，Palo Alto，CA)中，然后在植入小鼠之前，在无菌盐水中于室温下保温过夜。小鼠用***／甲苯噻嗪麻醉，将小型渗透泵植入在中肩胛区域的皮下。每天，将纯化的重组OB蛋白、hOB-IgG-1融合蛋白或PBS皮下注射入清醒小鼠的中肩胛区域。注射是在灯熄灭后1小时内进行的。每只小鼠的体重(精确到0．1克)和每个笼子中食品斗中含有的食物重量(精确到0．1克)，每1到2天在灯熄灭后1小时内作记录。数据以平均值±SEM表示。动物的数目如下面及附图说明中所述。

B．连续皮下输注OB蛋白所获得的结果

以连续皮下输注方式或每天皮下注射方式，用鼠OB蛋白处理瘦型雌小鼠。结果示于图1。上图显示，与每天以皮下注射方式施用相同剂量相比，以连续输注方式施用时OB蛋白能明显更有效地降低体重。下图显示了OB蛋白在降低脂肪组织重量的能力方面有同样的差别。

C．用OB-IgG-1嵌合体获得的结果

用人OB蛋白或用人OB-IgG-1嵌合体处理肥胖的雌性ob／ob小鼠。数据示于图2。上图中的数据显示，当两种蛋白都类似地通过皮下输注方式给药时，hOB-IgG-1融合蛋白与天然hOB蛋白相比更能够降低体重。应注意到，如果数据被转化为摩尔数量的话，能力的增加就更显著，因为仅约1／3部分的OB-IgG-1嵌合体来自OB蛋白。数据还证实了前面的观察结果，即在降低体重方面，连续皮下输注(泵)hOB蛋白比每天皮下注射更有效。

在图2下图中所示的数据显示，hOB-IgG-1融合蛋白能显著减少食物摄入。该结果是出乎意料的，因为人们认为融合蛋白太大了，以致于不能通过脑血屏障去发挥其功效。

以每天皮下注射方式，用hOB或hOB-IgG-1嵌合体处理肥胖(ob／ob)雌性小鼠7天。图3所示的数据再次显示，嵌合体能比天然hOB蛋白更有效地降低体重(上图)和食物摄入(下图)。

在另一试验中，以每天皮下注射方式，用hOB-IgG-1融合蛋白、天然hOB或hCD4-IgG-1(对照)处理肥胖(ob／ob)雌性小鼠7天。图5所示的数据证实，hOB-IgG-1融合蛋白能比天然hOB蛋白更有效地降低体重(上图和中图)和食物摄入(下图)。

D．用PEG-hOB获得的结果

用人OB蛋白或人OB的PEG衍生物处理肥胖的雌性ob／ob小鼠。数据示于图4。上图中的数据显示，当两种蛋白都类似地通过皮下输注方式给药时，PEG-hOB与天然hOB蛋白相比更能够降低体重。

图4下图中的数据显示，与未修饰的天然hOB蛋白相比，PEG-hOB蛋白明显能更有效地减少食物摄入。

参考实施例

OB受体的鉴别和克隆

用实施例1中的OB蛋白-免疫粘附素来检测OB受体并进行表达克隆。

首先，为了鉴别出受体源，通过流式细胞计量术，用1微克／毫升OB-IgG-1筛选数个细胞系。检测***由偶联有二级抗体及随后的链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白构成，该***可使信号大为放大并且可检测表达少量受体的细胞。发现2个细胞系，人胚肾293细胞和人肺A549细胞与OB-IgG-1结合，但是不与Flt-4对照免疫粘附素结合。OB-IgG-1特异性地结合于细胞，还可通过添加过量的细菌表达的人OB蛋白而加以证实。添加10微克／毫升的人OB可完全阻断OB-IgG-1结合于293细胞。

为了分离出编码OB受体的cDNA，用约10⁵克隆的、pRK5B中的寡聚dT引导合成的293细胞cDNA库的集合体(pool)，来瞬时转化COSN细胞。在与OB-IgG-1一起温育之后，通过将转染细胞在涂有抗-人Fc抗体的平板上筛选而富集转染细胞。在3轮富集之后，30个集合体中一个会有OB-IgG-1介导的COSN细胞粘附于结合平板的情况，该粘附可被人OB蛋白所竞争。在10-20个集合体中，转染用第3轮中随机挑选出cDNA克隆。在分析完10个中的一个集合体(该集合体通过筛选而被评为阳性)之后，最终鉴别出了各克隆。

序列分析揭示出一个约5300bp的克隆，其开放阅读框编码896个氨基酸的蛋白质。其序列对应于Ⅰ型跨膜蛋白，具有长22个氨基酸的信号肽、819个氨基酸的胞外结合域、21个氨基酸的跨膜结合域和34个氨基酸短的胞内结合域。发现该序列基本上与Tartaglia等人(同上)鉴别和分离出的人OB受体一致，而且与1996年1月11日申请的未审定申请No．08，585，005中公开的人受体序列相同。

尽管本发明用实施例的形式加以阐述，但是本发明的范围并不限于实施例。应理解，在本发明的总体构思之下可以作其他的改动和修改。所有的这些改动形式都在本发明范围之内。

所有在说明书(包括实施例)中提及的文献，以及在此处提及的文献都明确地在此引用作为参考。

                          序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：Genentech，Inc．

  De Sauvage，Frederic J．

  Levin，Nancy：

  Vandlen，Richard L．(ⅱ)发明名称：OB蛋白质衍生物(ⅲ)序列数目：2(ⅳ)通信地址：

(A)收信人：Genentech，Inc．

(B)街道：460 Point San Bruno Blvd

(C)城市：South San Francisco

(D)州：California

(E)国家：USA

(F)邮编：94080(ⅴ)计算机可读形式：

(A)记录介质类型：3．5英寸，1．44Mb软盘

(B)计算机：IBM PC兼型

(C)操作***：PC-DOS／MS-DOS

(D)软件：WinPatin(Genentech)(ⅵ)本申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：19日-12月-1996

(C)分类：(ⅶ)在先申请资料：

(A)申请号：08／667184

(B)申请日：20日-6月-1996(ⅶ)在先申请资料：

(A)申请号：08／579494

(B)申请日：27日-12月-1995(ⅷ)律师／代理人信息：

(A)姓名：Dreger，Ginger R．

(B)登记号：33，055

(C)参考／案卷号：985P2PCT(ⅸ)通讯信息：

(A)电话：415／225-3216

(B)传真：415／952-9881

(C)电传：910／371-7168(2)SEQ ID NO：1的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：7127碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：TTCGAGCTCG  CCCGACATTG  ATTATTGACT  AGTTATTAAT  AGTAATCAAT   50TACGGGGTCA  TTAGTTCATA  GCCCATATAT  GGAGTTCCGC  GTTACATAAC  100TTACGGTAAA  TGGCCCGCCT  GGCTGACCGC  CCAACGACCC  CCGCCCATTG  150ACGTCAATAA  TGACGTATGT  TCCCATAGTA  ACGCCAATAG  GGACTTTCCA  200TTGACGTCAA  TGGGTGGAGT  ATTTACGGTA  AACTGCCCAC  TTGGCAGTAC  250ATCAAGTGTA  TCATATGCCA  AGTACGCCCC  CTATTGACGT  CAATGACGGT  300AAATGGCCCG  CCTGGCATTA  TGCCCAGTAC  ATGACCTTAT  GGGACTTTCC  350TACTTGGCAG  TACATCTACG  TATTAGTCAT  CGCTATTACC  ATGGTGATGC  400GGTTTTGGCA  GTACATCAAT  GGGCGTGGAT  AGCGGTTTGA  CTCACGGGGA  450TTTCCAAGTC  TCCACCCCAT  TGACGTCAAT  GGGAGTTTGT  TTTGGCACCA  500AAATCAACGG  GACTTTCCAA  AATGTCGTAA  CAACTCCGCC  CCATTGACGC  550AAATGGGCGG  TAGGCGTGTA  CGGTGGGAGG  TCTATATAAG  CAGAGCTCGT  600TTAGTGAACC  GTCAGATCGC  CTGGAGACGC  CATCCACGCT  GTTTTGACCT  650CCATAGAAGA  CACCGGGACC  GATCCAGCCT  CCGCGGCCGG  GAACGGTGCA  700TTGGAACGCG  GATTCCCCGT  GCCAAGAGTG  ACGTAAGTAC  CGCCTATAGA  750GTCTATAGGC  CCACCCCCTT  GGCTTCGTTA  GAACGCGGCT  ACAATTAATA  800CATAACCTTA  TGTATCATAC  ACATACGATT  TAGGTGACAC  TATAGAATAA  850CATCCACTTT  GCCTTTCTCT  CCACAGGTGT  CCACTCCCAG  GTCCAACTGC  900ACCTCGGTTC  TATCGATATG  CATTGGGGAA  CCCTGTGCGG  ATTCTTGTGG   950CTTTGGCCCT  ATCTTTTCTA  TGTCCAAGCT  GTGCCCATCC  AAAAAGTCCA  1000AGATGACACC  AAAACCCTCA  TCAAGACAAT  TGTCACCAGG  ATCAATGACA  1050TTTCACACAC  GCAGTCAGTC  TCCTCCAAAC  AGAAAGTCAC  CGGTTTGGAC  1100TTCATTCCTG  GGCTCCACCC  CATCCTGACC  TTATCCAAGA  TGGACCAGAC  1150ACTGGCAGTC  TACCAACAGA  TCCTCACCAG  TATGCCTTCC  AGAAACGTGA  1200TCCAAATATC  CAACGACCTG  GAGAACCTCC  GGGATCTTCT  TCACGTGCTG  1250GCCTTCTCTA  AGAGCTGCCA  CTTGCCCTGG  GCCAGTGGCC  TGGAGACCTT  1300GGACAGCCTG  GGGGGTGTCC  TGGAAGCTTC  AGGCTACTCC  ACAGAGGTGG  1350TGGCCCTGAG  CAGGCTGCAG  GGGTCTCTGC  AGGACATGCT  GTGGCAGCTG  1400GACCTCAGCC  CTGGGTGCGG  GGTCACCGAC  AAAACTCACA  CATGCCCACC  1450GTGCCCAGCA  CCTGAACTCC  TGGGGGGACC  GTCAGTCTTC  CTCTTCCCCC  1500CAAAACCCAA  GGACACCCTC  ATGATCTCCC  GGACCCCTGA  GGTCACATGC  1550GTGGTGGTGG  ACGTGAGCCA  CGAAGACCCT  GAGGTCAAGT  TCAACTGGTA  1600CGTGGACGGC  GTGGAGGTGC  ATAATGCCAA  GACAAAGCCG  CGGGAGGAGC  1650AGTACAACAG  CACGTACCGT  GTGGTCAGCG  TCCTCACCGT  CCTGCACCAG  1700GACTGGCTGA  ATGGCAAGGA  GTACAAGTGC  AAGGTCTCCA  ACAAAGCCCT  1750CCCAGCCCCC  ATCGAGAAAA  CCATCTCCAA  AGCCAAAGGG  CAGCCCCGAG  1800AACCACAGGT  GTACACCCTG  CCCCCATCCC  GGGAAGAGAT  GACCAAGAAC  1850CAGGTCAGCC  TGACCTGCCT  GGTCAAAGGC  TTCTATCCCA  GCGACATCGC  1900CGTGGAGTGG  GAGAGCAATG  GGCAGCCGGA  GAACAACTAC  AAGACCACGC  1950CTCCCGTGCT  GGACTCCGAC  GGCTCCTTCT  TCCTCTACAG  CAAGCTCACC  2000GTGGACAAGA  GCAGGTGGCA  GCAGGGGAAC  GTCTTCTCAT  GCTCCGTGAT  2050GCATGAGGCT  CTGCACAACC  ACTACACGCA  GAAGAGCCTC  TCCCTGTCTC  2100CGGGTAAATG  AGTGCGACGG  CCCTAGAGTC  GACCTGCAGA  AGCTTCTAGA  2150GTCGACCTGC  AGAAGCTTGG  CCGCCATGGC  CCAACTTGTT  TATTGCAGCT  2200TATAATGGTT  ACAAATAAAG  CAATAGCATC  ACAAATTTCA  CAAATAAAGC  2250ATTTTTTTCA  CTGCATTCTA  GTTGTGGTTT  GTCCAAACTC  ATCAATGTAT  2300CTTATCATGT  CTGGATCGAT  CGGGAATTAA  TTCGGCGCAG  CACCATGGCC  2350TGAAATAACC  TCTGAAAGAG  GAACTTGGTT  AGGTACCTTC  TGAGGCGGAA  2400AGAACCAGCT  GTGGAATGTG  TGTCAGTTAG  GGTGTGGAAA  GTCCCCAGGC  2450TCCCCAGCAG  GCAGAAGTAT  GCAAAGCATG  CATCTCAATT  AGTCAGCAAC  2500CAGGTGTGGA  AAGTCCCCAG  GCTCCCCAGC  AGGCAGAAGT  ATGCAAAGCA  2550TGCATCTCAA  TTAGTCAGCA  ACCATAGTCC  CGCCCCTAAC  TCCGCCCATC  2600CCGCCCCTAA  CTCCGCCCAG  TTCCGCCCAT  TCTCCGCCCC  ATGGCTGACT  2650AATTTTTTTT  ATTTATGCAG  AGGCCGAGGC  CGCCTCGGCC  TCTGAGCTAT  2700TCCAGAAGTA  GTGAGGAGGC  TTTTTTGGAG  GCCTAGGCTT  TTGCAAAAAG  2750CTGTTAATTC  GAACACGCAG  ATGCAGTCGG  GGCGGCGCGG  TCCCAGGTCC  2800ACTTCGCATA  TTAAGGTGAC  GCGTGTGGCC  TCGAACACCG  AGCGACCCTG  2850CAGCGACCCG  CTTAACAGCG  TCAACAGCGT  GCCGCAGATC  TGATCAAGAG  2900ACAGGATGAG  GATCGTTTCG  CATGATTGAA  CAAGATGGAT  TGCACGCAGG  2950TTCTCCGGCC  GCTTGGGTGG  AGAGGCTATT  CGGCTATGAC  TGGGCACAAC  3000AGACAATCGG  CTGCTCTGAT  GCCGCCGTGT  TCCGGCTGTC  AGCGCAGGGG  3050CGCCCGGTTC  TTTTTGTCAA  GACCGACCTG  TCCGGTGCCC  TGAATGAACT  3100GCAGGACGAG  GCAGCGCGGC  TATCGTGGCT  GGCCACGACG  GGCGTTCCTT  3150GCGCAGCTGT  GCTCGACGTT  GTCACTGAAG  CGGGAAGGGA  CTGGCTGCTA  3200TTGGGCGAAG  TGCCGGGGCA  GGATCTCCTG  TCATCTCACC  TTGCTCCTGC  3250CGAGAAAGTA  TCCATCATGG  CTGATGCAAT  GCGGCGGCTG  CATACGCTTG  3300ATCCGGCTAC  CTGCCCATTC  GACCACCAAG  CGAAACATCG  CATCGAGCGA  3350GCACGTACTC  GGATGGAAGC  CGGTCTTGTC  GATCAGGATG  ATCTGGACGA  3400AGAGCATCAG  GGGCTCGCGC  CAGCCGAACT  GTTCGCCAGG  CTCAAGGCGC  3450GCATGCCCGA  CGGCGAGGAT  CTCGTCGTGA  CCCATGGCGA  TGCCTGCTTG  3500CCGAATATCA  TGGTGGAAAA  TGGCCGCTTT  TCTGGATTCA  TCGACTGTGG  3550CCGGCTGGGT  GTGGCGGACC  GCTATCAGGA  CATAGCGTTG  GCTACCCGTG  3600ATATTGCTGA  AGAGCTTGGC  GGCGAATGGG  CTGACCGCTT  CCTCGTGCTT  3650TACGGTATCG  CCGCTCCCGA  TTCGCAGCGC  ATCGCCTTCT  ATCGCCTTCT  3700TGACGAGTTC  TTCTGAGCGG  GACTCTGGGG  TTCGAAATGA  CCGACCAAGC  3750GACGCCCAAC  CTGCCATCAC  GAGATTTCGA  TTCCACCGCC  GCCTTCTATG  3800AAAGGTTGGG  CTTCGGAATC  GTTTTCCGGG  ACGCCGGCTG  GATGATCCTC  3850CAGCGCGGGG  ATCTCATGCT  GGAGTTCTTC  GCCCACCCCG  GGAGATGGGG  3900GAGGCTAACT  GAAACACGGA  AGGAGACAAT  ACCGGAAGGA  ACCCGCGCTA  3950TGACGGCAAT  AAAAAGACAG  AATAAAACGC  ACGGGTGTTG  GGTCGTTTGT  4000TCATAAACGC  GGGGTTCGGT  CCCAGGGCTG  GCACTCTGTC  GATACCCCAC  4050CGAGACCCCA  TTGGGGCCAA  TACGCCCGCG  TTTCTTCCTT  TTCCCCACCC  4100CAACCCCCAA  GTTCGGGTGA  AGGCCCAGGG  CTCGCAGCCA  ACGTCGGGGC  4150GGCAAGCCCG  CCATAGCCAC  GGGCCCCGTG  GGTTAGGGAC  GGGGTCCCCC  4200ATGGGGAATG  GTTTATGGTT  CGTGGGGGTT  ATTCTTTTGG  GCGTTGCGTG  4250GGGTCAGGTC  CACGACTGGA  CTGAGCAGAC  AGACCCATGG  TTTTTGGATG  4300GCCTGGGCAT  GGACCGCATG  TACTGGCGCG  ACACGAACAC  CGGGCGTCTG  4350TGGCTGCCAA  ACACCCCCGA  CCCCCAAAAA  CCACCGCGCG  GATTTCTGGC  4400GCCGCCGGAC  GAACTAAACC  TGACTACGGC  ATCTCTGCCC  CTTCTTCGCT  4450GGTACGAGGA  GCGCTTTTGT  TTTGTATTGG  TCACCACGGC  CGAGTTTCCG  4500CGGGACCCCG  GCCAGGGCAC  CTGTCCTACG  AGTTGCATGA  TAAAGAAGAC  4550AGTCATAAGT  GCGGCGACGA  TAGTCATGCC  CCGCGCCCAC  CGGAAGGAGC  4600TGACTGGGTT  GAAGGCTCTC  AAGGGCATCG  GTCGAGCGGC  CGCATCAAAG  4650CAACCATAGT  ACGCGCCCTG  TAGCGGCGCA  TTAAGCGCGG  CGGGTGTGGT  4700GGTTACGCGC  AGCGTGACCG  CTACACTTGC  CAGCGCCCTA  GCGCCCGCTC  4750CTTTCGCTTT  CTTCCCTTCC  TTTCTCGCCA  CGTTCGCCGG  CTTTCCCCGT  4800CAAGCTCTAA  ATCGGGGGCT  CCCTTTAGGG  TTCCGATTTA  GTGCTTTACG  4850GCACCTCGAC  CCCAAAAAAC  TTGATTTGGG  TGATGGTTCA  CGTAGTGGGC  4900CATCGCCCTG  ATAGACGGTT  TTTCGCCCTT  TGACGTTGGA  GTCCACGTTC  4950TTTAATAGTG  GACTCTTGTT  CCAAACTGGA  ACAACACTCA  ACCCTATCTC  5000GGGCTATTCT  TTTGATTTAT  AAGGGATTTT  GCCGATTTCG  GCCTATTGGT  5050TAAAAAATGA  GCTGATTTAA  CAAAAATTTA  ACGCGAATTT  TAACAAAATA  5100TTAACGTTTA  CAATTTTATG  GTGCAGGCCT  CGTGATACGC  CTATTTTTAT  5150AGGTTAATGT  CATGATAATA  ATGGTTTCTT  AGACGTCAGG  TGGCACTTTT  5200CGGGGAAATG  TGCGCGGAAC  CCCTATTTGT  TTATTTTTCT  AAATACATTC  5250AAATATGTAT  CCGCTCATGA  GACAATAACC  CTGATAAATG  CTTCAATAAT  5300ATTGAAAAAG  GAAGAGTATG  AGTATTCAAC  ATTTCCGTGT  CGCCCTTATT  5350CCCTTTTTTG  CGGCATTTTG  CCTTCCTGTT  TTTGCTCACC  CAGAAACGCT  5400GGTGAAAGTA  AAAGATGCTG  AAGATCAGTT  GGGTGCACGA  GTGGGTTACA  5450TCGAACTGGA  TCTCAACAGC  GGTAAGATCC  TTGAGAGTTT  TCGCCCCGAA  5500GAACGTTTTC  CAATGATGAG  CACTTTTAAA  GTTCTGCTAT  GTGGCGCGGT  5550ATTATCCCGT  GATGACGCCG  GGCAAGAGCA  ACTCGGTCGC  CGCATACACT  5600ATTCTCAGAA  TGACTTGGTT  GAGTACTCAC  CAGTCACAGA  AAAGCATCTT  5650ACGGATGGCA  TGACAGTAAG  AGAATTATGC  AGTGCTGCCA  TAACCATGAG  5700TGATAACACT  GCGGCCAACT  TACTTCTGAC  AACGATCGGA  GGACCGAAGG  5750AGCTAACCGC  TTTTTTGCAC  AACATGGGGG  ATCATGTAAC  TCGCCTTGAT  5800CGTTGGGAAC  CGGAGCTGAA  TGAAGCCATA  CCAAACGACG  AGCGTGACAC  5850CACGATGCCA  GCAGCAATGG  CAACAACGTT  GCGCAAACTA  TTAACTGGCG  5900AACTACTTAC  TCTAGCTTCC  CGGCAACAAT  TAATAGACTG  GATGGAGGCG  5950GATAAAGTTG  CAGGACCACT  TCTGCGCTCG  GCCCTTCCGG  CTGGCTGGTT  6000TATTGCTGAT  AAATCTGGAG  CCGGTGAGCG  TGGGTCTCGC  GGTATCATTG  6050CAGCACTGGG  GCCAGATGGT  AAGCCCTCCC  GTATCGTAGT  TATCTACACG  6100ACGGGGAGTC  AGGCAACTAT  GGATGAACGA  AATAGACAGA  TCGCTGAGAT  6150AGGTGCCTCA  CTGATTAAGC  ATTGGTAACT  GTCAGACCAA  GTTTACTCAT  6200ATATACTTTA  GATTGATTTA  AAACTTCATT  TTTAATTTAA  AAGGATCTAG  6250GTGAAGATCC  TTTTTGATAA  TCTCATGACC  AAAATCCCTT  AACGTGAGTT  6300TTCGTTCCAC  TGAGCGTCAG  ACCCCGTAGA  AAAGATCAAA  GGATCTTCTT  6350GAGATCCTTT  TTTTCTGCGC  GTAATCTGCT  GCTTGCAAAC  AAAAAAACCA  6400CCGCTACCAG  CGGTGGTTTG  TTTGCCGGAT  CAAGAGCTAC  CAACTCTTTT  6450TCCGAAGGTA  ACTGGCTTCA  GCAGAGCGCA  GATACCAAAT  ACTGTCCTTC  6500TAGTGTAGCC  GTAGTTAGGC  CACCACTTCA  AGAACTCTGT  AGCACCGCCT  6550ACATACCTCG  CTCTGCTAAT  CCTGTTACCA  GTGGCTGCTG  CCAGTGGCGA  6600TAAGTCGTGT  CTTACCGGGT  TGGACTCAAG  ACGATAGTTA  CCGGATAAGG  6650CGCAGCGGTC  GGGCTGAACG  GGGGGTTCGT  GCACACAGCC  CAGCTTGGAG  6700CGAACGACCT  ACACCGAACT  GAGATACCTA  CAGCGTGAGC  ATTGAGAAAG  6750CGCCACGCTT  CCCGAAGGGA  GAAAGGCGGA  CAGGTATCCG  GTAAGCGGCA  6800GGGTCGGAAC  AGGAGAGCGC  ACGAGGGAGC  TTCCAGGGGG  AAACGCCTGG  6850TATCTTTATA  GTCCTGTCGG  GTTTCGCCAC  CTCTGACTTG  AGCGTCGATT  6900TTTGTGATGC  TCGTCAGGGG  GGCGGAGCCT  ATGGAAAAAC  GCCAGCTGGC  6950ACGACAGGTT  TCCCGACTGG  AAAGCGGGCA  GTGAGCGCAA  CGCAATTAAT  7000GTGAGTTACC  TCACTCATTA  GGCACCCCAG  GCTTTACACT  TTATGCTTCC  7050GGCTCGTATG  TTGTGTGGAA  TTGTGAGCGG  ATAACAATTT  CACACAGGAA  7100ACAGCTATGA  CCATGATTAC  GAATTAA  7127(2) SEQ ID NO：2的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：397氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr1               5                  10                  15Leu Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp20                  25                  30Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Ash Asp Ile35                  40                  45Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu50                  55                  60Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met65                  70                  75Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro80                  85                  90Ser Arg Ash Val Ile Gln Ile Ser ASh Asp Leu Glu Asn Leu Arg95                 100                 105Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro110                 115                 120Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu125                 130                 135Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu140                 145                 150Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro155                 160                 165Gly Cys Gly Val Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro170                 175                 180Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro185                 190                 195Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr200                 205                 210Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe215                 220                 225Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys230                 235                 240Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val245                 250                 255Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys260                 265                 270Cys Lys Val Ser Ash Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr275                 280                 285Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr290                 295                 300Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu305                 310                 315Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu320                 325                 330Trp Glu Ser Ash Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro335                 340                 345Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu350                 355                 360Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys365                 370                 375Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ash His Tyr Thr Gln Lys Ser380                 385                 390Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys395     397

Claims (27)

1．一种长半衰期的OB蛋白衍生物，其特征在于，它保留天然OB蛋白的生物特性。

2．如权利要求1所述的长半衰期的衍生物，其特征在于，它能够减少受处理个体的体重和／或食物摄入。

3．如权利要求1所述的衍生物，其特征在于，它是天然人OB蛋白的衍生物。

4．如权利要求1所述的衍生物，其特征在于，它是OB-免疫球蛋白嵌合体。

5．如权利要求1所述的衍生物，其特征在于，它是用非蛋白质聚合物修饰的天然OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合体。

6．如权利要求4所述的衍生物，其特征在于，非蛋白质聚合物是聚乙二醇(PEG)。

7．一种用于治疗与OB基因功能或表达异常有关病症，或者用于引发OB受体介导的生物反应的组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1所述的OB衍生物。

8．如权利要求7所述的组合物，其特征在于，它能有效地减少体重和／或食欲。

9．如权利要求7所述的组合物，其特征在于，它能有效地使升高的胰岛素水平降低。

10．一种治疗与OB基因功能或表达异常有关病症，或者引发OB受体介导的生物反应的方法，其特征在于，它包括：向待治疗的个体施用权利要求1所述的衍生物。

11．如权利要求10所述的方法，其特征在于，待治疗的病症选自下组：肥胖、食欲过盛和Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病。

12．一种引发对象减少体重或丧失食欲的方法，其特征在于，它包括：向该对象施用有效量的权利要求1所述的衍生物。

13．一种嵌合多肽，其特征在于，它包含连接于免疫球蛋白序列的、能够结合天然OB受体的OB蛋白氨基酸序列。

14．如权利要求13所述的嵌合多肽，其特征在于，该免疫球蛋白序列是恒定区序列。

15．如权利要求14所述的嵌合多肽，其特征在于，该OB蛋白是人的。

16．如权利要求15所述的嵌合多肽，其特征在于，两个OB多肽-IgG重链融合蛋白，通过至少一个二硫键而相互连接在一起，从而形成同二聚体型的免疫球蛋白样结构。

17．如权利要求16所述的嵌合多肽，其特征在于，至少一个该OB多肽-IgG重链融合蛋白是与免疫球蛋白轻链缔合的。

18．一种分离的核酸序列，其特征在于，它编码OB蛋白-免疫球蛋白融合蛋白。

19．一种可复制的表达载体，其特征在于，它含有权利要求18所述的核酸。

20．一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求19所述的可复制的表达载体所转化。

21．一种方法，其特征在于，该方法包括：培养权利要求16所述的宿主细胞，从而表达编码OB蛋白-免疫球蛋白融合蛋白的核酸。

22．如权利要求21所述的方法，其特征在于，该宿主细胞被编码至少2个OB蛋白-免疫球蛋白融合蛋白的核酸共转化。

23．如权利要求22所述的方法，其特征在于，该细胞还被编码至少一个免疫球蛋白轻链的核酸所转化。

24．一种治疗与OB基因功能或表达异常有关病症，或者引发OB受体介导的生物反应的方法，其特征在于，它包括：向病人施用治疗有效量的权利要求13所述的嵌合多肽。

25．如权利要求20所述的方法，其特征在于，该病症选自下组：肥胖、食欲过盛和Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病。

26．一种治疗肥胖的组合物，其特征在于，它含有：有效量的权利要求13所述的嵌合多肽和药学上可接受的载体。

27．一种诱导表达OB受体的细胞生长的方法，其特征在于，将该细胞与权利要求1所述的OB衍生物接触。

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