CN1202864C - Cd40:cd154结合阻断物在制备预防逆适应性免疫应答,特别是移植物排斥反应的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本文公布的组合物和方法依赖这样一个发现：对组织移植物的排斥可单用CD40:CD154结合阻断抑制物，或联合应用其它免疫调节剂或免疫抑制剂进行抑制。一种有利的协同性联合包括CD40:CD154结合阻断物和CD28信号传导阻断物。CD40:CD154结合阻断物的一个实例为抗CD154单克隆抗体，如具有5c8单克隆抗体的抗原特异性结合特征的抗体。CD28信号传导阻断物的一个实例为CTLA4-Ig融合蛋白。所公布的组合物和方法出乎意料地可用于延长受体内移植组织的存活时间，逆转急性移植排斥反应，并减少移植组织衰竭的免疫学并发症。

Description

CD40：CD154结合阻断物在制备预防逆适应 性免疫应答，特别是移植物排斥反应的药物中的用途
相关申请
这是1998年5月12日提交(档案号A053P；邮件快递标号EM046582947US)的，作为1997年5月17日提交的美国临时申请流水号60/046,791和1997年6月11日提交的美国临时申请流水号60/049,389的部分继续申请的美国临时专利申请的部分继续申请。前面三份临时申请的所有教导均列入本文作为参考。
发明领域
本发明主要涉及对不希望的免疫应答、特别是逆适应性T淋巴细胞介导的免疫应答的抑制。本发明尤其涉及对由免疫***引起的在移植受体体内对移植组织或器官的排斥作用进行预防、治疗、抑制或逆转。
发明背景
在遗传上不相同的个体之间进行器官移植无一例外地将导致通过T细胞依赖性机制对移植器官产生免疫学排斥，除非通过施用抑制T细胞功能的药物而使排斥过程受阻止。数例美国专利公布了对抑制移植物排斥反应的这类免疫抑制药物的应用，包括美国专利号5,104,858；5,008,246知5,068,323。其它常规药物述于Suthanthiran等(1994)，331 新英 格兰医学杂志(New Eng.Med.J.)365-376。钙调磷酸酶抑制物和糖皮质激素均用于临床，并均可阻止T细胞介导的活化细胞因子，特别是IL-2的释放。但用这两类传统药物进行的治疗其效果仍不理想。两类药物均通过破坏经由T细胞抗原受体(TCR)这种T细胞抗原特异性的唯一媒介的信号传导而发挥作用，并且不加选择地作用于所有T细胞。除此之外，这些药物的效应并不持久，以致于暂停治疗常导致失去移植物。故为了维持移植物的有活力、有功能地整合，移植受体必需承受长期、非特异性免疫抑制的后果。这些后果包括感染和恶性化的危险增加，以及费用昂贵并有毒性。
相应地便出现了对移植受体进行改良的或更有效的免疫抑制或免疫调节治疗的需求。尤其是需要对无需使全部T细胞受到免疫抑制的治疗方法，即不会使移植受体轻易地发生恶性化和机会感染的治疗方法。更重要的是，需要有对比现有治疗用药物毒性更小的治疗。相似地，需要有能促进移植物的持久、功能性整合，即坚持至治疗过程终止之后的整合的治疗方法。
发明概述
本发明的目标是提供无需使全部T细胞受到免疫抑制便可减小逆适应性T细胞应答的免疫调节剂。另一目标是提供能促进组织移植物在受体体内功能性整合的免疫调节剂。另一目标是提供能抑制对移植组织的免疫学排斥反应的免疫调节剂。又一目标是提供能阻断共同刺激信号向活化T细胞传递的免疫调节剂。一个特别目标是提供用于治疗方法中，尤其用于缓解或推迟对移植组织的免疫学排斥的治疗方法中的CD40：CD154结合阻断物。又一特别目标是提供减小逆适应性T细胞介导的免疫应答的药物组合物及治疗方案，这基本上靠联合运用CD40：CD154结合阻断物及另一种免疫抑制剂或免疫调节剂达到的。故本发明的一个特殊目标是提供以联合运用CD40：CD154结合阻断物及能封锁经由CD28的共同刺激的药物为基础的药物组合物及治疗方案。本发明的一个更通用目标是提供抑制、缓解、减弱、推迟或逆转移植组织衰竭或对移植组织的急性排斥的药物组合物及治疗方案。本发明的另一通用目标是通过提供允许同种异体组织或异种组织向受体体内功能性整合的免疫调节组合物而改进组织移植物的可用性。一个更深入的通用目标是预防、缓解、减小或治疗由逆适应性免疫应答，包括T淋巴细胞介导的自身免疫病(如，胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化症之类)及***反应性疾病引起的疾病状态。
本发明依赖这样一个发现，即单独应用CD40：CD154结合阻断物或与另一种免疫调节剂联合使用，可在不需要对受体免疫***进行全面抑制的情况下，减小、抑制、预防、推迟或逆转受体对移植组织的逆适应性免疫***排斥作用。
本发明相应地提供用于对移植组织受体进行免疫调节治疗的方法和组合物。第一个方法通过用CD40：CD154(CD40L)结合阻断物治疗移植受体而抑制移植受体对组织移植物的排斥。该结合阻断物可以是能阻断共同刺激分子(这里为CD40配体，亦在本文中称作5c8抗原、CD40L、CD154，领域内亦称gP39)与其相对应或相关受体(此处为CD40)结合的任何药物。优选地，此结合阻断物为抗CD40L化合物，即能结合CD40L(CD154)并因此能封闭、干扰或破坏CD40L结合CD40的能力的化合物。抗CD40L化合物的一个实例为单克隆抗体，尤其是具有美国专利5,474,771(其教导已列入本文作为参考)公布的5c8抗体的抗原特异性结合特点的抗体。
第二个方法通过用CD40：CD154结合阻断物，优选用抗CD40L单克隆抗体，治疗移植受体而延长组织移植物在受体体内的存活时间。第三个方法通过用CD40：CD154结合阻断物，优选用抗CD40L单克隆抗体治疗移植受体而减轻移植组织衰竭的免疫学并发症。即，该方法将抑制、阻碍、缓解或可测性减弱这类免疫学并发症。具体地说，该方法可避免或缓解诸如间质纤维样变性、慢性移植物动脉粥样硬化、脉管炎之类并发症。
故前述的方法均对移植组织之急和/或慢性排斥反应的治疗有效，可作预防性使用，用于术后治疗，或在受体有生之年的任何时期逆转或阻止移植物排斥反应。一个方法实例涉及在术后第2、4、6、8、12、16和28天时施用CD40：CD154结合阻断物。更常见为，本文所述方法涉及在跨越至少两或三周的时间段内以所需间隔(每天一次、一周两次、一周一次或两周一次)施用该结合阻断物。用药时间表可根据需要调整，以便使逆适应性免疫应答指标(indicia)、尤其是移植物排斥指标产生可测性减少。本发明治疗方案可在移植物排斥反应的后续发作中重复进行。在以抗CD40L单克隆抗体作结合阻断物的实施方案中，阻断物的施药剂量介于约5mg/kg体重和约20mg/kg体重之间。
为便于治疗，CD40：CD154结合阻断物可配制成药物组合物，其中有治疗有效量的结合阻断物分散于药学上可接受的载体中。在某些实施方案中，药物组合物也可包含治疗有效量的另一种免疫抑制或免疫调节化合物，它们有但不限于：阻断经由CD28的T细胞共同刺激信号传导的药物(如CTLA4Ig)；阻断钙调磷酸酶信号传递的药物(如环孢菌素，大环内酯如曾名为FK506的藤霉素)；皮质类固醇；或抗增殖剂(如硫唑嘌呤)。其它适于与该CD40：CD154结合阻断物配合使用的治疗有效性化合物包括西洛霉素(sirolimus)(曾名为纳巴霉素)、霉酚酸莫非替克(mycophenolate mofetil，MMF)、咪唑立宾(mizoribine)、脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)、布瑞喹那钠(brequinar sodium)、来氟米物(leflunomide)、阿扎斯哌然(azaspirane)等等。
本发明的方法及组合物适用于所有类型的移植程序。故本发明适用于移植受体(接受宿主)为哺乳动物，优选为灵长类，更优选为人类的情况下。移植物供体可以是与移植受体为同一***发育物种的非同系成员(即提供同种异体移植组织的同种异体供体)，或是不同***发育物种的成员(即提供异种移植组织的异种移植供体)。如果用异种供体作为移植组织的来源，优选地该供体与受体具MHC相对相容性；如狒狒或黑猩猩将优选作为向人类提供移植组织的供体。本发明可用于促进任何机体组织或器官类型的移植，不必考虑提供的(移植)组织是完整器官，还是器官或组织的部分，或是分离的细胞。适宜组织的非限制性实例有肾脏、肝脏、心脏、胰脏(如胰岛)、皮肤、血管、神经、骨、软骨之类的哺乳动物机体组织。
如本文所公布，本发明原理经相关的临床前模型中的检验而证明有效。一个CD40：CD154结合阻断物的实例(抗CD40L单克隆抗体5c8)已单独及与其它免疫调节剂实例(CD28结合阻断物CTLA4-Ig；霉酚酸莫非替克；藤霉素)一起在恒河猴体外外周血白细胞上及在用初级脉管化肾脏同种异体移植物移植的恒河猴体内进行了检验。
本发明的前述及其它目标、特点和优点以及发明本身，将通过以下优选实施方案的描述而得到更全面理解。
发明详述
过去20多年累积的资料证实T细胞的活化需要TCR介导的信号，还需要同时传递的共同刺激信号。如，在针对蛋白质抗原的应答中，B淋巴细胞产生抗体需要与T淋巴细胞的特异性、共同刺激性相互作用。这种B细胞/T细胞相互作用通过除TCR参与之外还有多个受体-配体结合事件而介导完成。这些另外的结合事件包括B细胞上的CD40与T细胞上的CD154(CD40L)结合。人CD40是表达在成熟B细胞、以及巨噬细胞和活化内皮细胞上的一种50 KD的细胞表面蛋白质。CD40属于涉及细胞程序性死亡的受体类群，其中包括Fas/CD95和肿瘤坏死因子(TNF)α受体。人CD154(CD40L)是与暂时性基本表达在活化T细胞上的TNFα同源的一种32 KD II型膜糖蛋白。CD40：CD154的结合已显示是所有依赖T细胞的抗体应答所必需的。具体地说，CD40：CD154结合提供了抗凋亡和/或淋巴因子刺激性信号。
另一种重要的共同刺激信号由T细胞上的CD28与抗原呈递细胞(APC)和可能还有实质细胞上的相应受体CD80(B7-1)或CD86(B7-2)结合而产生。明显地，CD80和/或CD86的表达由CD40与CD154结合产生的信号刺激而上调。进一步研究显示T细胞分子CTLA4(CD152)似乎下调共同刺激和TCR介导的活化，至少部分原因是CTLA4与CD28竞争CD80/CD86，并只向TCR信号传导复合体传送一个独特的负信号。
CD40：CD154结合在促进T细胞依赖性生物学应答中的重要性在缺乏功能性CD154的人体内X连锁的超IgM综合征(X-HIGM)的病情发展中显得尤为重要。这些病人有正常的或较高的IgM水平，但不能产生IgG、IgA或IgE抗体。被感染者出现反复发作(有时是严重)的细菌感染(最常见肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的感染)和某些不太常见的寄生虫感染，并且淋巴瘤和腹部癌症的发生率增加。这些病症的临床表现可通过静脉内免疫球蛋白取代疗法而得到控制。
X-HIGM的影响在CD154编码基因为零合基因的动物(基因敲除动物)中得到模拟。用零合子进行的研究证实，尽管B细胞无需CD40L：CD154结合就能产生IgM，但它们不能进行类别转换，或在亲和性成熟之后不能正常存活。缺乏功能性CD40：CD154相互作用时，***的生发中心不能正确发育，记忆B细胞的发育受损。这些缺陷造成再次(成熟)抗体应答的严重减弱或完全缺乏。
伴有X-HIGH的个体和CD154零合子还有细胞免疫的缺陷。这些缺陷表现在增加了卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、荚膜组织孢浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)以及慢性兰伯氏贾第鞭毛虫(Giardia lambli)感染的发生率。鼠零合子不能抗利什曼原虫感染。这些受细胞介导的缺陷中很多可通过施用IL-12或IFNγ而逆转。这些资料证实了以下观点：即CD40：CD154的结合启动了I型T辅助细胞发生应答。进一步的支持来自以下观察所得：即巨噬细胞活化在CD154缺陷体系中也是缺陷的，而对小鼠施用抗CD40L抗体可减弱它们清除肺囊虫感染的能力。阻碍CD40：CD154的结合将削弱巨噬细胞产生一氧化氮的能力，而一氧化氮介导着巨噬细胞的多种促炎活性。但应注意到，缺乏功能性CD154的哺乳动物(包括人类)发生病毒感染或脓毒的机率并不明显。
一些临床前研究证实，CD40：CD154结合阻断剂可作为免疫调节剂。在鼠中，抗CD154的抗体在体外和体内均可阻断针对外来抗原的初次和再次免疫应答。抗CD154的抗体引起小鼠和猴生发中心的退化，这与在CD154免疫缺陷中获得的资料一致。对三月龄的易患狠疮的小鼠施用三剂抗CD154抗体，基本上降低了抗双链DNA和核小体的滴度，推迟了严重肾炎的发生，并减少了死亡率。而且，对5至7月龄有严重肾炎的小鼠施用抗CD154抗体显示能稳定或甚至逆转肾病。CD154抗体与小的静止期同种异体淋巴细胞一起给予时可使小鼠胰岛自体移植物无限期存活。在其它动物模型中，对CD40：CD154结合进行干扰已被证实能减轻自身免疫病(如多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠病)、移植物排斥反应(心脏同种异体移植、移植物抗宿主病)和氯化汞诱导的肾小球肾炎(由体液和细胞机制共同介导产生)的症状。
对啮齿动物的其它研究显示，通过干扰CD80/CD86与其T细胞对应受体CD28和CTLA4的结合，可阻止T细胞活化，并延长啮齿动物同种异体移植物的存活时间。这些研究包括应用CD80/CD86特异性融合蛋白CTLA4-Ig作为CD28信号传导的阻断物。其它研究已证实CD80/CD86的上调可通过应用CD40：CD154结合阻断物(如单克隆抗体MRI)而阻止。两类免疫调节剂的有效似乎均依赖于TCR的参与。故这些制剂能够调节T细胞依赖性生物学过程的特异性，而不是依赖对所有T细胞进行免疫抑制。在移植排斥反应的啮齿动物模型体内应用这些制剂的研究已产生惊人的结果(包括对完全不匹配的皮肤移植物的接受)，这是应用目前可行的免疫抑制法无法获得的一个结果。
但应注意，以前报道的啮齿动物体内移植物长期存活的所有研究，当在其它哺乳动物(尤其是灵长类)中检验时均告失败，或产生无法接受的毒性。
相比之下，在此公布的本发明原理验证研究表明，单独应用CD40：CD154结合阻断物，或联合另一种免疫调节剂或免疫抑制剂(如CD28信号传导阻断物)使用时，可促进异种(MHC不匹配的)供体组织在灵长类受体内长期、无排斥性整合。令人鼓舞的是本文公布的治疗方法相当简单(包括通过标准的外周静脉导管施用治疗剂)并很易被受体接受。这完全相反于为使移植物在灵长类被长期接受而用的其它治疗方案(它们要求电离辐射、施用供体来源的骨髓、并进行重要的周期性免疫抑制)。本文所述研究中治疗的动物未见经抗CD3抗体治疗后通常能观察到的T细胞活化或细胞因子释放的征兆，延长存活期也不会有机会感染的明显代价。此外，这些研究期间未见外周血的血液学参数有任何改变。长期存活时并不发生任何淋巴细胞亚群的明显清除或全体退化，也没有失去体外T细胞应答性。故所观察到的效应不太可能是由于抗体或融合蛋白调理后T细胞毁灭造成的。这些结论仍有争议。恒河猴远交系中的成功暗示同种异体移植(或甚至异种移植)整合可用这种或相当的治疗方法在人体内实现。
下述选择性联合治疗中的机制及每种制剂的相对作用仍不清楚。CD40：CD154阻断单独使用获得成功暗示，在维持排斥应答中任何基本的共同刺激性信号传导都不及CD80/CD86的上调重要。确实，抗CD154抗体单独施用时导致完全无排斥的存活，而CD28阻断物(CTLA4-Ig)的效果则较为短暂。已知CD154表达在非髓样细胞(包括血管内皮和平滑肌)上，而CD80可诱导产生在成纤维细胞和肝细胞上，因此，在产生对抗供体组织的反应中非T细胞事件可能比较关键。通过在移植时避免免疫***接触重要实质粘附和共同刺激信号，可预防对移植物的识别和破坏。供体实质诱导的活化作用与淋巴样细胞诱导的活化作用之间的区别可解释在移植物行使正常功能的情况下还发现了可维持对供体淋巴细胞的体外反应性这一现象，以及为什么MLR反应性与临床移植结果之间一般很少有关联性。尽管如此，共同刺激阻断剂CTLA4-Ig和人源化5c8(抗人CD154)的效应显示无论在体外或体内均有协同性。可能CTLA4-Ig可确保逃避了人源化5c8对CD40：CD154结合的阻断效应的CD80/CD86表达受到对抗。此时，需要一定的时间发动对逃避了初始阻断效应的少数细胞的有效急性排斥反应。
由于这一策略可成功逆转已有的经活检证实的排斥反应，表明排斥过程应通过连续共同刺激维持，而不是一个一旦启动便持续直至效应细胞耗尽或不能提供TCR信号传导为止的过程。就目的论而言，人体可通过易于控制的炎症反应而受到最好照顾。故在没有攻击指令时，就退却到默许水平。这一点支持以下观点：利用免疫***的天然下调倾向将比全体免疫抑制更为优越。
以下讨论举例说明了本发明实施内容及实施环境，并提供了涉及本发明特殊实施方案的原理论证性研究。
受体宿主
本发明可用于对组织移植物的任何哺乳动物受体，或需要组织移植物的任何哺乳动物进行治疗或预防。优选地，受体(本文亦称受体宿主，或简称宿主)为灵长类，更优选为高等灵长类，最优选为人类。在其它实施方案中，受体可以是另一种需要组织移植的哺乳动物，尤其是有重要商业用途的哺乳动物，或宠物或其它有价值的动物，如濒危物种的成员。故受体宿主还包括，但不限于绵羊、马、牛、山羊、猪、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠和小鼠。
供体或移植组织
本发明可用于任何类型组织的移植或移植过程，尤其是供体(移植的)组织发生衰竭或被受体宿主的免疫***排斥、或存在这类危险性的操作中。本发明尤其可用于供体组织与受体组织不相容的情况中。故除了自体的或同源的供体组织之外，本发明还可用同种异体或甚至异种的供体组织。该供体组织可通过常规方法得自志愿者或其它活的供体，或得自尸体供体。优选地，供体与受体的组织相容性在可接受水平。故当受体为人时，自体和同种异体供体组织为优选。但供体组织可得自异种动物(此时它称为异种移植物)，如非人灵长类(如黑猩猩或狒狒)，或相对可相容的其它哺乳动物(如猪)。
在一些实施方案中，供体组织包含器官或部分机体。在其它实施方案中，供体组织包括供体器官或组织的一部分或活检标本。在另外的实施方案中，供体组织包含细胞，尤其是分离的或悬浮的细胞，包括取自或切自供体宿主的细胞，维持在原代培养中的细胞，或永生化的细胞系。供体组织还可选择地包括携有外源遗传物质的细胞，如已经遗传改造而包含产生对受体有治疗价值的多肽所必需遗传物质的转染或转化的宿主细胞(或衍生自已经上述改造的始祖细胞的细胞)。在又另外的实施方案中，供体组织可衍生自己经遗传改造而包含可在某些或全部机体组织中产生对受体有治疗价值的多肽所必需遗传物质的转基因哺乳动物。对受体有治疗价值的多肽实例有：激素，如胰岛素或生长激素；细胞因子；生长及分化因子；酶；结构蛋白；等等。
故由前述，很明显本发明可用于如下实体器官移植物：移植的肾、肝、胰、肺、心脏等等。相似地，本发明可用前述各器官的一个部分，也可用于其它组织类型，特别是肾、肝、胰(尤其是胰岛)、呼吸道、心脏、皮肤、脉管、神经、骨、骨髓、软骨、肌腱、韧带、肌肉、脂肪、***、胃肠道、上皮、内皮、***等。而且，本发明可用于含多种组织类型的躯体部分，如用于眼、耳、鼻、手指或足趾、关节、血管、神经、肌肉、四肢或其它躯体部分的更换或其它外科改变或重建中。在另外的实施方案中，本发明可用于细胞制备物或悬浮液，其导入受体的全身或局部。例如，分离的、悬浮的或分散的细胞可静脉注入或埋入所希望的位置(如骨髓腔、肝脏、肾囊内或关节囊内)或肌肉注射或局部用于受伤部位。细胞实例包括外周血细胞、骨髓或它的任何造血成分、间充质干细胞、肌卫星细胞、肝细胞、激素生产细胞或神经内分泌细胞、成纤维细胞、神经嵴细胞、内皮细胞等等。在某些实施方案中，细胞均能有丝***并产生供体源的新组织。在另外的实施方案中，细胞不能有丝***，但产生或表达对受体有治疗价值的多肽或其它产物。
CD40：CD154阻断物实例
可用于本发明之方法的治疗性化合物包括任何可阻断细胞表面CD40(如B细胞上)与表达在活化T细胞表面上的CD40L(CD154)相互作用的化合物。具体涉及的CD40：CD154结合阻断物化合物，如抗CD40L化合物，包括多克隆抗体和单克隆抗体(mAb)，以及抗体衍生物如嵌合分子、人源化分子、有减低的效应物功能的分子、双特异性分子及抗体的偶联物。在一个优选实施方案中，该抗体是5c8(由美国专利号5,474,771所述，该文献全文引入本文作为参考)。在一个当前极为优选的实施方案中，该抗体为人源化5c8。其它已知抗CD154抗体包括抗体ImxM90，ImxM91和ImxM92(得自Immunex)，由Ancell公司提供的商品化抗CD40L mAb(克隆24-31，产品目录号353-020，Bayport，MN)，及由Genzyme公司提供的商品化抗CD40L mAb(剑桥，MA，产品目录号80-3703-01)。其它商品化产品还有PharMingen公司的抗CD40L mAb(圣迭哥，产品目录号33580D)。另有很多抗CD40L抗体已经生产并被鉴定(见，如，Bristol-Myers Squibb的WO 96/23071，其说明书已引入本文作为参考)。
本发明还包括其它类型的抗CD40L分子，如完整Fab片段，F(ab′)2化合物，VH区，FV区，单链抗体(见，如WO 96/23071)，多肽，多肽的融合构建体，CD40的融合体(如已引入本文作为参考的Hollenbaugh等，免疫学方法杂志188：1-7，1995中的CD40Ig)，以及小分子化合物如小的半肽化合物或非肽化合物，以上所有分子均能封闭或阻碍CD40：CD154的结合。有关设计、筛选和优化小分子的程序提供在专利申请PCT/US96/10664(1996年6月21日提交，其说明书引入本文作为参考)中。
抗体的各种形式也可用标准的重组DNA技术生产(Winter和Milstein，自然349：293-99，1991)。例如，可构建成“嵌合”抗体，其中动物抗体的抗原结合区与人类恒定区相连(最初衍生自非人类清乳动物的抗体，其中应用重组DNA技术使绞链区和重链恒定区和/或轻连恒定区的全部或部分被人类免疫球蛋白轻链或重链的相应区所取代)(见，如Cabilly等，美国专利号4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报81：6851-55，1984)。嵌合抗体应用于人类临床治疗时可减少由动物抗体所引起的免疫原性应答。
此外，可合成重组“人源化”抗体。人源化抗体是最初来自非人类哺乳动物，但其中已应用重组DNA技术将非抗原结合所必需的部分或全部氨基酸替换成人免疫球蛋白轻链或重链相应区氨基酸的抗体。即，它们是包含尽可能多的人免疫球蛋白序列，但其中已***负责特异性抗原结合的区域的嵌合体(见，如PCT专利申请WO 94/04679)。动物用所希望的抗原免疫，分离相应抗体并分出负责特异性抗原结合的可变区序列部分。然后将此动物源性抗原结合区克隆进已缺失抗原结合区的人源抗体基因的适当位置。人源化抗体可使应用于人类治疗的抗体中所用异源(种间)序列最少化，从而很少引起不需要的免疫应答。灵长类化的抗体可类似于此产生。
本发明的另一个实施方案包括可产生于非人类哺乳动物(如携带一个或多个人免疫球蛋白转基因的转基因动物)中的人类抗体的应用。这些动物可作为杂交瘤生产的脾细胞来源，如U.S.5,569,825所示。
抗体片段和单价抗体也可用于本发明的方法和组合物中。单价抗体包含结合了另一种重链的Fc(或主干)区的重链/轻链二聚体。“Fab区”指大体上等价于或类似于含重链Y分枝区部分的序列及完整轻链的那些链部分，它们聚集在一起(成为聚集物)则显示有抗体活性。Fab蛋白包括一条重链和一条轻链的聚集物(通常称Fab′)，也包括对应于抗体Y两个分支片段的四聚体(通常称F(ab)2)，其中任何一个分支片段均共价或非共价聚集，从而能与某种特殊抗原或抗原家族选择性反应。
此外，标准的重组DNA技术可用于改变重组抗体对它们的抗原的结合亲和力，方法是改变抗原结合位点附近的氨基酸残基。人源化抗体的抗原结合亲和力可通过基于分子模拟的诱变技术而提高(Queen等，美国国家科学院学报86：10029-33，1989；PCT专利申请WO94/04679)。根据所靶向组织类型或所设想治疗时间表的不同，有可能需要使抗体与CD40L的亲和力提高或降低。这一点可应用噬菌体展示技术来进行(见，如，Winter等，免疫学年鉴12：433-455，1994；和Schier等，分子生物学杂志255：28-43，1996，全文引入本文作为参考)。例如，进行半预防性治疗时，用固定水平的对CD40L亲和力降低的抗体治疗病人比较有利。相似地，对CD40L亲和力提高的抗体对短期治疗比较有利。
给药途径
本发明的化合物可用医学上可接受的任何方式给药。根据具体情况的不同，可选用局部或全身用药。优选化合物经非胃肠道途径给药，如静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、眼窝内、心室内、腹膜内、包膜下、颅内、脊柱内、或鼻内注射、输入或吸入。化合物亦可通过在供体组织植入前或后向受体植入输入泵，或生物相容性或生物可蚀性缓释植入物而给药。或者，本发明的特定化合物，或它们的配制物，可适合于口服或肠道给药。还有本发明的其它化合物可适合于局部给药。
总而言之，本发明的化合物将施用于受体。但化合物也可施用于供体，或供体组织。例如，本发明之化合物可包含在将供体组织整合进受体之前保存或运输供体组织的灌流液或保存液中。
治疗的剂量和频率
施用于免疫综合性疾病患者的任何特殊化合物的剂量及用药频率是组织移植领域的一般执业者如外科移植大夫的技术和临床判断范围之内。通过涉及深入但却是常规的对化合物最佳用药参数进行测定的临床前及临床试验研究可确立总剂量和用药方案。即使在提出了这些建议之后，执业者还经常基于不同考虑，如病人的年龄、病情、体重、性别及同时参与治疗的其它药物，而改变不同受体的给药剂量。确定用于抑制移植排斥反应的每种抗CD40L化合物的最佳剂量和用药方案对于药学和医学领域的技术人员而言属于常规程序。
通常，用药频率由主治医师或类似的熟练执业者确定，并有可能包含较高用药频率阶段(如每天或每周一次)与较低用药频率阶段(如每月或更长时间一次)的交替给药方案。
为举例说明抗CD40L化合物的用药思想，给出下述抗CD40L mAb的一些用药策略实例。用药量可根据其它类型的抗CD40L化合物而很容易作出调整。通常，单次剂量在约0.05和约50mg/kg病人体重之间，最常见1-20mg/kg范围内。紧急情况下治疗时，如移植前或移植时，或在有移植物排斥反应已经开始的征兆时，抗体的有效剂量范围从约1mg/kg体重至约20mg/kg体重，在约1至5天的时间内每天用药，优选静脉内施用大药丸。相同的剂量和用药时间表可用于移植物维持方案中的移植时期，维持期内静脉或肌肉内施用约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重的抗体，针对任意部位，治疗间隔从一周至3个月不等。慢性治疗也可执行维持方案，其中抗体经静脉或肌肉内途径施用，剂量从约0.1mg/kg体重至20mg/kg体重，用药间隔时间从约1周至约3个月不等。此外，慢性治疗可采用不连续的静脉内药丸方案，其中施用的抗体在约1.0mg/kg体重和约100mg/kg体重之间，连续治疗的间隔时间从1个月至6个月不等。除了不连续的药丸方案外，其它所有方案的用药也可采用口服、肺内、鼻内或皮下途径。
根据本发明抑制移植物排斥反应的另一可互换实施方案，抗体的有效率可因为连续用药或与传统的抗排斥治疗剂或药物(如皮质类固醇或免疫抑制剂)联合应用而提高。或者，这些抗体可偶联至传统的药剂上。这将有利于使传统药剂的用量少于传统剂量，如比单用时少用约50％的传统剂量。相应地，可避免发生与该传统药剂相关的很多付作用。
根据本发明对移植物排斥反应进行治疗的联合治疗法包括应用抗CD40L抗体的同时还应用靶向B细胞的药剂如抗CD19、抗CD-28或抗CD20抗体(未偶联的或放射标记的)、IL-14拮抗物、LJP394(LaJollaPharmaceutical受体封闭物)、IR-1116(Takeda小分子)和抗Ig独特型单克隆抗体。或者，联合用药可包括靶向T细胞/B细胞的药剂：如CTLA4Ig、IL-2拮抗物、IL-4拮抗物、IL-6拮抗物、受体拮抗物、抗CD80/CD86单克隆抗体、TNF、LFA1/ICAM拮抗物、VLA4/VCAM拮抗物、brequinar和IL-2毒素偶联物(如DAB)、强的松、抗CD3 MAb(OKT3)、霉酚酸莫非替克(MMF)、环磷酰胺，及其它免疫抑制剂如钙调磷酸酶信号传导阻断剂(包括但不限于藤霉素(FK506))。联合用药也可包括靶向T细胞的药物如CD4拮抗物、CD2拮抗物及IL-12。
为维持移植物的整合，或在对急性移植物排斥反应进行抑制后的一个阶段内，若有必要则单独或与传统的抗排斥剂联合施用维持剂量的抗CD40L抗体。随后，可降低用药剂量和/或频率。当不再有移植物排斥的表现时，可停止治疗，但仍严密监控有关移植物排斥反应的任何征兆。在其它由普通执业者确定的治疗中，治疗可以是偶尔为之，如间隔4周或更长时间一次。但受体将需要在较长时期内接受间断性治疗以防止病情复发。
配方
通常，本发明的化合物悬浮、溶解或分散于药学可接受的载体或赋形剂中。所得药物组合物对受体的体内稳态，尤其电解质平衡没有负面影响。故一个载体实例包含生理盐水(0.15M NaCl，pH7.0-7.4)。其它可接受的载体为领域内熟知并描述在，如，Remington制药学，Gennaro编，Mack Publishing公司，1990。可接受的载体可包括生物相容性、惰性或生物可吸收性盐，缓冲剂，寡糖或多糖，聚合物，粘度改善剂，防腐剂之类。
本发明的方法中所用抗CD40L化合物以药学有效性或治疗有效性剂量施用，该剂量足以对有可能发生或已经发生移植物排斥反应的受体产生可检测的，优选较有利的医疗效应。较有利医疗效包括防止、推迟或减少受体病情的恶化，或对改善受体病情有可以检测的效果。如在一例肾同种异体移植或异种移植中，肾功能及健康状况可用一项或多项常规实验室检验进行监控，这些检测是测量血或尿中相关物质的浓度，其它尿特征，或各种物质从血向尿中清除的速率。由这些检测测得的参数，可被医生单独或综合用于评估肾功能或肾损害。这些参数的实例有尿素、肌酸酐或蛋白质的血液浓度；蛋白质或各种血细胞如红细胞或白细胞的尿浓度；尿的比重；尿量；菊粉、肌酸酐、尿素或对氨基马尿酸的清除速率；以及是否有高血压或水肿。
作为本发明方法的临床应用特例，在肾移植受体体内，手术前后或出现移植物排斥征兆后施用抗CD40L MAb(如hu5c8)。急性肾同种异体移植物排斥反应可有多种表现，包括血清肌酸酐或血尿氮的增加，尿***的减少、蛋白尿和/或血尿的加重，或其它移植物排斥反应的表现。免疫调节治疗的剂量和时间进程应足以使这些表现中的一个或多个产生临床有利的改变。本文中的原则论证性研究中给出了一个时间进程和剂量安排的实例。但最起码，治疗应涉及静脉内施用多达50mg/kg的CD40：CD154结合阻断物(例如hu5c8药丸，初次治疗后两周内或直至移植物排斥或衰竭的指征有预期的有利变化之前，要采取相应的后续用药方案(如每天静脉或皮下注射)。
另一个实例是，对于有其它器官排斥的受体，可以类似于上述的形式施用抗CD40L化合物。例如，肝移植的急性排斥导致黄疸(高胆红素血症)、肝炎(转氨酶水平升高)、凝血病和脑病。
评估CD40：CD154阻断物治疗方案的临床前模型***
用于检验CD40：CD154阻断化合物(如抗CD40L化合物，如mAb5c8)疗效的模型***优选实例为灵长类肾同种异体移植模型，其描述见此前相关美国临时申请流水号60/049,389(06/11/97)及Kirk等(1997)，94美国国家科学院学报8789-8794，其教导引入本文作参考。此恒河猴模型已多次显示可对免疫操作进行严格检验：它对同种异体移植物功能的极微小改变，或对受体伤口恢复和免疫***功能的负面效应极其敏感。此外，它与人类肾移植有显著生物学相似性。具体地说，编码MHC蛋白的基因在恒河猴和人之间高度保守，而且恒河猴模型对血管化器官的排斥反应与临床所见极其类似。
该模型***适于评估含肾组织的移植物。领域内已认可的其它临床前模型(尤其是灵长类)均适用于评估其它移植组织类型如肝、心脏、肺、胰脏、胰岛、皮肤、外周或中枢神经，或其它组织或器官类型的移植效力。
材料和方法
药物
人CTLA4-Ig和对照融合蛋白-IgG1如前述制备并载于GeneticsInstitute，Cambridge，MA的溶液中。抗CD40配体的抗体(人源化5c8)如前述制备并载于Biogen公司，Cambridge，MA的溶液中。仓鼠抗小鼠CD28单克隆抗体PV-1(IgG1，克隆G62)从杂交瘤培养物上清中纯化并用作独特型单克隆抗体对照。
MHC定型和供体/受体选择
供体-受体对和提供第三方细胞的动物根据MHC I类和II类遗传性不相同原则进行选择。I类不一致性由前述单向等电聚集确定。II类不一致性根据单向混合淋巴细胞反应(MLR)的结果确定。此外，动物的DRB位点经变性梯度凝胶电泳和对DRB第二个外显子的直接测序(如前述)检验证实各不相同。体外针对所有供体-受体对证实受体对供体的强烈T细胞应答。此研究中所述实验按“实验动物的护理和应用”实验动物资源研究所，国家研究会(National Research Council)，DHHS，Pub.No.NIH 86-23(1985)所列举的原则进行。
体外细胞分析
单向MLR在移植前的所有动物身上以及移植100天后仍存活并无排斥反应的动物身上进行。每只动物针对所有可能的供体进行检验以确定移植的最佳反应对。将反应细胞(3×105)与辐射刺激细胞(1×105)在37℃温育5天。细胞用3H-胸苷作脉冲标记，根据3H-胸苷的掺入监控其增殖。用伴刀豆球蛋白A(25mcg/ml)多克隆刺激作阳性对照。刺激指标在对自身反应性(所有例子中均接近本底掺入量)进行标准化后计算。为进行体外剂量反应研究，将CTLA4-Ig或人源化5c8在第1天以100mcg/ml-0.01mcg/ml的浓度加入MLR。联合处理的方式是改变CTLA4-Ig的浓度而将人源化5c8的浓度稳定在50mcg/ml。
外周血淋巴细胞表型分析在移植前以及药物治疗期间和之后分阶段进行。试验评估了用磷酸盐缓冲液和1％胎牛血清稀释的肝素化全血共0.2ml。FITC标记的T11，B1(Coulter)和FN18(Dr.David M.Neville，Jr.惠赠)单克隆抗体分别用于评估CD2阳性细胞(T细胞/NK细胞)、CD20阳性细胞(B细胞)、及CD3阳性细胞(T细胞)的百分率。血中红细胞在染色后经ACK裂解液(0.15M NH4Cl，1.0mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA，pH7.3)处理后从制剂中除去。细胞马上或在1％多聚甲醛中固定后经流式细胞仪计数。流式细胞仪计数在Becton DickinsonFACSCAN上进行。
肾同种异体移植
肾同种异体移植如前述进行。简短而言，远交系幼龄(1至3岁)恒河猴(猴免疫缺陷病毒、猴逆转录病毒和乙型疱疹病毒血清阴性)得自灵长类动物中心(Wisconsin大学)或LABS(Yemassee，SC)。全过程在使用***(肌内注射1mg/kg)、甲苯噻嗪(肌内注射1mg/kg)及氟烷(1％吸入)作一般性麻醉的情况下完成。移植在由上述MHC分析所确定的遗传上相区别的供体-受体对之间进行。动物在器官收获和植入期间被肝素化(100单位/kg)。同种异体移植物的植入采用标准微脉管技术在供体肾动脉和受体主动脉末端之间以及供体肾静脉与受体腔静脉之间产生末端侧接吻合。然后施初级输尿管膀胱吻合术。闭合之前完成内部双侧肾切除术。
动物经静脉内液体处理近36小时，直至口腔吸收适量为止。甲氧苄氨嘧啶-磺胺(Trimethaprim-sulfa)施用3天以进行术后抗生素预防。每只动物手术当天接受81mg阿斯匹林。密切关注是否需要镇痛，镇痛的维持为肌内注射环丁甲二羟吗喃。动物每周称体重。7至10天后皮肤拆线。静脉内施用CTLA4-Ig和/或人源化5c8，其剂量和用药安排根据对相应药物的累积经验进行变化。不再施用其它免疫药物。每隔一天测定血清肌酸酐，和全血电解质Na+，K+，Ca2+，以及血红蛋白，直至它们的水平达到稳定，然后每周测一次。
病理学分析
用20号针头核心装置(Biopty-Cut，Bard)对疑有排斥反应的动物进行活检。在冰冻的或***固定的组织上用苏木素和伊红进行标准染色，以证实对排斥反应的诊断。无尿时或体重比移植前减少15％(根据AAALAC标准)时将动物处死。所有动物死亡时接受全面的大致观察和组织病理学评估。
结果
CTLA4-Ig和人源化5c8均以剂量依赖形式抑制了恒河猴的MLR。但CTLA4-Ig作为单独用药物比人源化5c8在阻止T细胞增殖方面更有效。胸苷掺入量的显著减少在CTLA4-Ig浓度为0.1mcg/ml时可观察到，浓度更高时获得更进一步的抑制。当人源化5c8浓度为0.01mcg/ml时增殖略有减少，但浓度增加并未使抑制作用实质性加强。当同时检验二者时，两种药物一起对增殖的抑制比每个药物单用更有效约100倍。对3只未接受任何处理的动物分别重复剂量应答研究，得到相同结果。故CTLA4-Ig和人源化5c8可协同防止体内对同种异体移植物的排斥反应。
共完成12例肾同种异体移植。4只动物在无任何免疫学干扰的情况下接受移植。这些动物在第5，7，7和8天内发生排斥。对它们的肾进行组织学检查，发现有以间质渗出和管状淋巴细胞浸润为特征的急性细胞排斥反应，并伴有水肿和细胞坏死。一只动物在移植当时便开始接受为期5天的CTLA4-Ig(10mg/kg/d)，其移植物存活期延长至20天。移植失败是由于与对照动物中所见几乎没有区别的细胞排斥反应。一只动物在移植当天用CTLA4-Ig 20mg/kg处理，然后接受为期12天的每隔一天10mg/kg处理，移植物存活时间延长至30天。同样，移植失败是由于急性细胞排斥反应。根据前面已发表的对大鼠异位心脏同种异体移植模型所作研究，上述两只动物在移植当时接受供体特异性淋巴节衍生的淋巴细胞(108)的输液。
两只动物单用人源化5c8处理。它们均在手术当天开始每隔一天接受20mg/kg，持续至术后14天(共8剂)。两只动物无排斥反应的存活期延长，只是在术后第二和第四周内有短暂的肌酸酐水平升高。两只动物在术后95-100天期间发生排斥。对每只动物进行活检以证实诊断。两只动物随后再用7剂人源化5c8处理(20mg/kg；一只动物每隔一天一次，另一只动物每天一次)，它们均恢复了正常的移植物功能，没有可察觉的副效应。它们保持活性及较佳状态超过150天(移植后)。
两只动物移植后各接受20mg/kg CTLA4-Ig和人源化5c8。同样，每种药从术后当天开始每隔一天给一次，持续至术后14天。一只动物在术后32天发生排斥。另一只保持无排斥状态直至100天，但象那些只用人源化5c8处理的动物一样，排斥在100天时发生。相似地，活检显示有急性细胞排斥反应。重复最初的CTLA4-Ig和人源化5c8给药方案，动物的肌酸酐水平回复至基线值(1.0)。如此处理后的MLR分析显示了反应力的供体特异性丧失。第三者应答性仍保持着。移植后165天，根据实验程序的要求，处死体重损失的动物。此时移植物功能正常。尸检中发现动物有志贺氏菌和弯曲杆菌小肠结肠炎(恒河猴的常见感染)。此病在最初的灵长类群落已感染了很多动物，包括一些未接受治疗的动物。未见其它病理学异常；具体地说，没有淋巴细胞增生性疾病或机会感染的表现。就组织学而言，移植物在小间隙中有隔离的淋巴细胞网，但未见血管浸润、肾小球损伤或实质坏死。
象只接受人源化5c8治疗的动物一样，这两只动物在术后第4周内有暂时性肌酸酐增多及移植物体积增大。推测这种移植物肿胀反映了第二轮淋巴细胞浸润，因此改变用药时间表，使两种药物均在手术当天及术后2，4，6，8，12，16和28天给予。
两只动物用这一修改后方案进行治疗。均表现为无排斥的存活，无疾病或肾功能的改变，此状态维持了150天以上。无排斥存活100天后，重复对供体细胞和第三方细胞进行MLR。未见体外反应性有何改变。无排斥存活150天后重复这些研究得到相同结果。两只动物均保持了对供体和第三方细胞的强有力体外应答，但却不能排斥它们的同种异体移植物。无一动物显示所用治疗方法存在毒性。具体地说，没有发现发烧、厌食症、血液动力学异常，也没发生机会感染。动物以标准条件饲养并允许与群体内其它动物接触。它们保持正常体重。实验室化学和血液学参数如血红蛋白和白细胞计数一直正常。表达CD2，CD3和CD20的细胞的百分率未受任何治疗方案的影响。具体地说，任何动物在治疗期间或之后都未见T细胞计数的减少。
用灵长类肾同种异体移植模型***进行进一步临床前研究
随后用上述灵长类肾同种异体移植***检验各种其它和/或更精确的治疗方案，即只用人源化mAb 5c8进行治疗，或联合另一种治疗剂，如CTLA4-Ig、MMF、藤霉素、皮质类固醇或它们的混合物进行治疗。
对灵长类肾同种异体移植的单剂治疗
两只动物接受了5c8单剂治疗，治疗的诱导和维持方案如下：诱导治疗包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用20mg/kg 5c8，其中第0天为施行同种异体肾移植术的当天。维持治疗包括从研究的第28天开始每月施用20mg/kg 5c8。接受治疗的动物分别在研究的第170天和163天监控其淋巴细胞亚群计数和/或血清肌酸酐水平，显示它们保持了对移植物基本无排斥的状态。
另两只动物接受5c8单剂治疗的标准诱导方案和低剂量维持方案如下：诱导治疗包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用20mg/kg 5c8(第0天为肾同种异体移植术当天)。维持方案包括从研究的第28天开始每月施用10mg/kg 5c8。接受治疗的动物分别在研究的149天和148天保持了对移植物的基本无排斥状态。
又有两只动物接受了用低剂量诱导方案和低剂量维持方案进行的5c8单剂治疗，如下：诱导治疗包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用10mg/kg 5c8(第0天为肾同种异体移植术当天)。维持方案包括从研究的第28天开始每月施用10mg/kg 5c8。接受治疗的动物保持对移植物的基本无排斥分别至研究的第38天和9天。
还有两只动物接受了用更低剂量诱导治疗并用更低剂量维持方案的5c8单剂治疗，如下：诱导治疗包括在研究的第-1，0，3，10和18天施用5mg/kg 5c8(第0天为肾同种异体移植术当天)。维持方案包括自研究的第28天开始每月施用5mg/kg 5c8。接受治疗的动物在研究的第7-10天对肾移植物发生排斥。
对灵长类体内肾同种异体移植物的联合治疗
所有动物都接受用上述标准的20mg/kg诱导及20mg/kg维持方案进行的5c8治疗，与此同时还联合其它免疫抑制治疗方案，如下：三只动物接受包括治疗有效量的皮质类固醇(如6甲氢化强的松龙，采用为期5天的诱导治疗)和霉酚酸莫非替克(MMF；20mg/kg po BID)的联合治疗。这些动物分别将对移植物的基本无排斥状态保持到研究的第143天，81天和80天。相比之下，一只用相似剂量MMF和糖皮质激素治疗但未接受5c8治疗的动物在研究的第7天对肾移植物产生排斥。
另两只动物接受了包括治疗有效剂量(1.5-2mg/kg po BID，targettrough 10ng/ml)的免疫抑制剂藤霉素(以前称FK506)的联合治疗。受治动物保持基本无移植物排斥反应分别直至研究的31和36天。
又有两只动物接受了包括治疗有效剂量的CTLA4-Ig的联合治疗。它们分别保持基本无移植物排斥反应的状态至研究的122和3天。
根据临床前模型研究所得出的结论
综合上述结果，说明用CD40：CD154结合阻断物人源化5c8单独诱导移植物的整合可导致同种异体移植组织长期存活。人源化5c8的效应与CD28信号传导阻断物CTLA4-Ig的效应有联合协同性，而且与一些已知的免疫抑制剂和/或免疫调节剂相容。
等价内容
本发明可以在不脱离其精神或基本特征的前体下实施其它特殊形式。故前述实施方案均应看作对本文公布的发明的举例说明，而非限制。因而本发明的范围由所附权利要求书说明，而不是由前面的描述说明，而且权利要求书含义及范围内的变化均涵盖于本文中。

Claims (6)

1.抗CD40L单克隆抗体或其Fab片段、F(ab′)2化合物、VH区，Fv区或单链抗体在制备用于抑制人类移植受体对组织移植物的排斥反应的药物中的用途，该药物配制成0.05mg/kg到50mg/kg患者体重的给药剂量，其中所述移植组织由分离或悬浮的细胞组成。
2.权利要求1的用途，其中该单克隆抗体具有ATCC录入号HB10916产生的5c8抗体的抗原特异性结合特征。
3.权利要求1的用途，其中该移植组织为该人的同种异体组织；或为该人的异种组织。
4.权利要求1的用途，其中所述分离或悬浮的细胞选自以下组合：(a)外周血细胞；和(b)骨髓细胞或其任何造血成分。
5.权利要求1的用途，其中所述药物通过选自下组的方式施用于该人类移植受体：(a)非胃肠道途径；(b)生物相容性或生物可蚀性缓释植入；(c)灌注泵植入；(d)口腔或肠道给药；及(e)局部给药。
6.权利要求1的用途，其中所述药物在该移植组织植入该人类移植受体之前施用于供体或移植组织。
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