CN1185337C - 黑曲霉菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉菌株(Aspergillus niger)及其用途。该菌株在察氏培养基上生长，形成的菌落特征为菌落大小10～12天达75～80μm，菌落高度1.3～1.5μm。菌落正面颜色为白—淡黄—浅棕—褐黑色，菌落边缘圆形、整齐，菌落背面颜色为无色部分浅黄色，有同心圆褶皱2～3圈，辐射状褶皱7～10条，菌丝绒毛状，较紧密，少量絮状菌丝，菌落中部黑色，中层棕褐色，呈同心圆纹饰，无渗出液，无气味。本发明具有以下几方面优点：(1)通用性强；(2)酶谱广、活性高、耐热性能好；(3)显著提高经济效益、生态效益；(4)安全无毒；(5)价廉。所产酶酶活高，其原料主要为普通农副产物，简单易得，而且微生物产酶传代性能好，适合大规模工业化生产。

Description

黑曲霉菌株及其用途

                        技术领域

本发明涉及微生物及其用途，尤其涉及一种黑曲霉菌株(Aspergillusniger)及其用途。

                        背景技术

国际上近20年来，北欧和北美一些国家对大麦中β-葡聚糖及其抗营养作用进行了大量研究，并利用添加外源性β-葡聚糖酶提高大麦饲用价值，改善畜禽的生产性能。近年来国外一些厂商已开发出酶制剂产品，并开始进入国内市场。为了尽快发展我国饲料添加剂工业，充分开发我国大麦饲料资源，迅速自行开发大麦型饲粮用酶制剂。首要的工作就是进行产酶菌种选育，其目标是产高酶活β-葡聚糖酶，并兼顾其他酶种形成优化多酶系，要求所产β-葡聚糖酶可以耐80℃以上高温，且最适pH值在4～6之间，以适应饲料工业和动物营养过程的需要。因此急需开发高效、低廉的饲用复合酶制剂为我国解决能量饲料资源开辟一条道路。

                        发明内容

本发明的目的是提供一种黑曲霉菌株(Aspergillus niger)及其用途。

该菌株在察氏培养基上生长，形成的菌落特征为菌落大小10～12天达75～80μm，菌落高度1.3～1.5μm。菌落正面颜色为白—淡黄—浅棕—褐黑色，菌落边缘圆形、整齐，菌落背面颜色为无色部分浅黄色，有同心圆褶皱2～3圈，辐射状褶皱7～10条，菌丝绒毛状，较紧密，少量絮状菌丝，菌落中部黑色，中层棕褐色，呈同心圆纹饰，无渗出液，无气味。

该菌株用于生产β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶。

本发明具有以下几方面优点：

(1)通用性强

可及时补充动物肠道内源消化酶的不足，有效降解饲料原料中所含的抗营养因子，促进动物对饲料养分的吸收利用。广泛适用于各类畜禽、水产养殖。

(2)酶谱广、活性高、耐热性能好

该菌种一次发酵同时产生β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶，酶活在查新检索范围内为最高，同时其酶学特性(适宜pH和温度)与动物消化道环境基本相吻合，发挥较高的活力。固体酶制剂在80℃处理10min酶活力仍保持80％以上，在室温条件下保存半年酶活还残存90％以上，说明稳定性较好、耐热性能好。

(3)显著提高经济效益、生态效益

对仔猪的多点对比试验表明此复合酶可使日增重提高8～20％，饲料转化率提高4～15％。提高胴体等级和畜蛋商品性；减少腹泻，提高成活率，并使个体生长均匀；降低粪便中有机物的排出量，控制污染，保护环境。

(4)安全无毒

用纯天然原料培养，经微生物发酵精制而成，绝不含毒素、激素等不良因子。

(5)价廉

所产酶酶活高，其原料主要为普通农副产物，简单易得，而且微生物产酶传代性能好，适合大规模工业化生产。

该菌种一次发酵同时产生β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶，酶活在查新检索范围内为最高，同时其酶学特性(适宜pH和温度)与动物消化道环境基本相吻合，发挥较高的活力。固体酶制剂在80℃处理10min酶活力仍保持80％以上，在室温条件下保存半年酶活还残存90％以上，说明稳定性较好、耐热性能好。

                          附图说明

附图是由黑曲霉菌株发酵生产饲用复合酶制剂的工艺流程图。

                        具体实施方式

1、黑曲霉G-415菌株的选育流程：出发菌株→斜面培养(28℃，2～3d)→孢子悬浮液，NTG处理(2、4、6、8、10min)→终止诱变→稀释涂皿(28℃，4～5d)→挑菌、斜面培养(28℃，4～5d)→初筛(摇瓶，28℃，50h)→筛选菌株→选定一株为进一步诱变的出发菌株→斜面培养→孢子悬浮液→60Coγ射线辐照(0rad、3万rad、5万rad、7.5万rad、10万rad、15万rad)→孢子液涂皿培养→挑菌、斜面培养(28℃，4～5d)→初筛、复筛(摇瓶，28℃，50h)→酶活测定→获得优良产酶菌株→砂土管保藏。

2、黑曲霉G-415菌株的特征：

1)形态特征：G-415菌株经鉴定为黑曲霉，其特征为该菌株在察氏培养基上生长，形成的菌落大小10～12天达75～80μm，菌落高度1.3～1.5μm。菌落正面颜色为白—淡黄—浅棕—褐黑色，菌落边缘圆形、整齐，菌落背面颜色为无色部分浅黄色，有同心圆褶皱2～3圈，辐射状褶皱7～10条，菌丝绒毛状，较紧密，少量絮状菌丝，菌落中部黑色，中层棕褐色，呈同心圆纹饰，无渗出液，无气味。

黑曲霉G-415菌株，分类命名为Aspergillus niger，已于2002年4月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No.M202018。

2)培养特性：G-415菌株在察氏琼脂上28℃培养，菌落生长较快，培养10～12天，几乎长满整个平皿。

3、黑曲霉G-415菌株的生理特性：

1)碳氮源对产酶的影响

可选用麸皮、玉米粉、米糠作为合适的碳源，添加大麦粉对产酶有明显的抑制作用，而三种低碳化合物葡萄糖、甘油、甘露醇则不利于产酶。豆粕、蚕蛹粉、鱼粉是较合适的氮源，而蛋白胨、酵母膏则抑制其产酶。

2)无机盐对产酶的影响

硝酸盐类和硫酸铵有利于产酶，而氯化铵则抑制其产酶，磷酸盐对产酶有一定的促进作用。

3)培养基pH对产酶的影响

黑曲霉G-415菌株在偏酸性培养基上产较高酶活，其初始pH以5.5～6.5为宜。

4)培养温度对产酶的影响

黑曲霉G-415菌株在28～30℃培养为好。低于25℃培养生长缓慢，高于32℃培养发酵周期明显缩短，随之产酶量也急剧下降。

5)发酵时间对产酶的影响

在优化培养条件下，一般接种16h后，开始产生白色菌丝，36h后产酶量快速增长，发酵至48～52h达到产酶高峰。

4、黑曲霉G-415菌株的生化特性

1)温度对酶活力的影响

其适宜作用温度范围40～50℃，而以45℃最合适，低于35℃或高于55℃酶活急骤下降。

2)pH对酶活力的影响

最适反应pH范围为4.5～5.0。结果该酶在室温下与pH4～6缓冲液作用4h，酶活力均保存95％以上，表明该酶在pH4～6范围内稳定。

3)酶的热稳定性

该酶在50℃下基本稳定，处理60min酶活力还残存80％；超过60℃酶迅速失活。30min后酶活力只残存37％，处理60min基本失活，随着温度升高，失活率继续上升，在70℃和80℃下处理10min残余酶活力分别为41％和20％。

5、黑曲霉G-415菌株的产酶特性：该菌种一次发酵同时产生β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶等。

1)其适宜作用温度范围40～50℃，最适反应pH范围为4.5～5.0，固体酶制剂在80℃处理10min酶活力仍保持80％以上，在室温条件下保存半年酶活还残存90％以上，酶制剂稳定性较好。

2)经浙江省医学科学院小鼠急性毒性试验表明，该酶对ICR灌胃LD50均大于5000mg/kg体重，属实际无毒类，饲用卫生安全。

6、黑曲霉G-415菌株以麸皮为主要原料发酵生产β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶的固体发酵方法为：

1)一级种子：从原始菌种接种至试管察氏培养基，28～30℃培养4～5d；

2)二级种子：从一级种子接种至三角瓶固体培养基，28～30℃培养2～3d，加无菌水后制成孢子悬浮液；

3)发酵：发酵培养基由麸皮、豆粕、无机盐和产酶促进剂并加水100％组成，pH自然，0.1Mpa灭菌30～40min。冷却后按培养基的量接入0.1～0.2％孢子悬浮液，于发酵室内温度保持在28～32℃，相对湿度保持在85％以上条件下，培养48～52h出曲；

4)后处理：发酵产物经在40～45℃下烘干，粉碎，加入载体，混合后包装。

实施例1：饲用β-葡聚糖酶制剂的制备

菌种：黑曲霉G-415菌株。

培养基：发酵培养基含麸皮、豆粕、无机盐和产酶促进剂并加水100％、pH自然。

浅盘发酵培养：将发酵原材料按培养基配方比例充分拌和均匀后，及时调节温、湿度。在28℃，相对湿度90％条件下，培养52h出曲，并经低温烘干粉碎即得饲用复合酶制剂。连续进行4批曲发酵试验，β-葡聚糖酶活力平均为54326u/g，最高达6.2万u/g。

实施例2：饲用β-葡聚糖酶制剂的制备

菌种：黑曲霉G-415菌株。

培养基：发酵培养基含麸皮、豆粕、无机盐和产酶促进剂并加水100％、pH自然。

浅盘发酵培养：将发酵原材料按培养基配方比例充分拌和均匀后，及时调节温、湿度。在30℃，相对湿度85％条件下，培养48h出曲，并经低温烘干粉碎即得饲用复合酶制剂。连续进行3批曲发酵试验，β-葡聚糖酶活力平均为55789u/g。

实施例3：饲用复合酶制剂的生产应用

采用2种酶制剂进行试验：(1)酶F：由芬兰国际饲料有限公司提供，为大麦型猪饲粮专用，含β-葡聚糖酶和其他酶类，添加量0.15％；(2)酶Z：本项目组研制的大麦型猪饲粮专用复合酶，含β-葡聚糖酶不低于2.5万u/g，并含其他酶类，添加量0.15％。

试验1在永康生态综合养殖场进行，用杜大长生长肥育猪80头，按2饲粮×4重复×10头设计，两组饲粮分别为大麦型(含大麦46.6％)不加酶饲粮和加酶饲粮。两组饲粮基础配方一致。饲粮料型为颗粒料。试验猪体重47kg左右开始，试验期36天。测定日增重、料重比，计算生物学综合评定值BE，BE(％)＝(待评组日增重/对照组日增重)/2+(对照组料重比/待评组料重比)/2。以下试验BE值计算同此。

试验2在浙江省农科院实验牧场进行，用杜洛克小母猪45头，按3饲粮×15头设计，3组饲粮分别为大麦型(含大麦60％)不加酶饲粮和加酶F饲粮、加酶Z饲粮。3组饲粮基础配方一致。饲粮料型为粉料。试验猪体重40kg左右开始，试验期30天。试验测定项目同于试验1。

试验3在浙江华农公司猪场进行，用杜浙生长肥育猪108头，按3处理×3重复×12头设计，试验分两期，试验分两期，3组饲粮分别为大麦型(含大麦60％)不加酶饲粮和加酶饲粮。3组饲粮前期(22kg～60kg体重)和后期(60kg体重之后)，饲粮料型为粉料。试验猪体重22kg左右开始，试验期96天。试验测定项目同于试验1。

试验4在临安正兴牧业有限公司进行，用杜长嘉生长肥育猪64头，按2饲粮×2重复×16头设计，两组饲粮分别为大麦型(含大麦60％)不加酶饲粮和加酶饲粮，两组饲粮基础配方一致。饲粮料型为粉料。试验猪体重40kg以上开始，试验期35天。试验测定项目同于试验1。

                    表  酶制剂用于生长肥育猪大麦型饲粮的试验结果

                              始重(kg)            末重(kg)              日增重(g)            料重比                     BE(％)

试验1
						大麦型未加酶	46.8±1.2	72.6±1.1	720±23	3.37	100
大麦型加酶Z	48.1±3.7	75.2±1.3	753±73	3.28	104
						试验2
大麦型未加酶	43.9±1.3	63.6±2.9	655±62	3.32±0.12	100
						大麦型加酶F	39.8±1.2	59.2±4.0	650±94	3.21±0.37	101
大麦型加酶Z	41.3±2.0	62.0±1.8	692±26	3.28±0.17	103
						试验3
大麦型未加酶	21.9±0.2	87.5±1.9	683±20	3.30±0.05	100
						大麦型加酶F	22.1±0.5	90.6±1.6	713±14	3.11±0.01	105
大麦型加酶Z	22.5±0.2	91.8±2.2	722±21	3.10±0.05	106
						试验4
大麦型未加酶	40.8±1.3	63.7±4.5	657±30	3.42±0.44	100
						大麦型加酶Z	47.7±2.4	73.1±3.8	726±8	3.42±0.02	105

酶制剂用于生长肥育猪大麦型饲粮的4次试验的结果见表，从4次试验结果看，大麦型饲粮添加以β-葡聚糖酶为优势的复合酶都有正效应，生物学综合评定值BE提高幅度为1～6％，尤其是试验3，可能是试验猪开始月龄较小，加酶效应就更明显。另外，从试验2和试验3看，酶Z的效果似乎比酶F更佳，表明本项目研制的酶制剂与国际市场中代表性同类产品相比已具备先进性。

Claims (4)

1.一种黑曲霉菌株G-415(Aspergillus niger)，其特征在于保藏号为CCTCCNO：M202018的菌株在察氏培养基上生长，形成的菌落大小10～20天达75～80微米，菌落高度1.3～1.5微米，菌落正面颜色为白一淡黄—浅棕—褐黑色，菌落边缘圆形、整齐，菌落背面颜色为无色部分浅黄色，有同心圆褶皱2～3圈，辐射状褶皱7～10条，菌丝绒毛状，较紧密，少量絮状菌丝，菌落中部黑色，中层棕褐色，呈同心圆纹饰，无渗出液，无气味。

2.根据权利要求1所述的一种黑曲霉菌株，其特征在于生长温度为28～30℃，pH为5.5～6.5。

3.一种黑曲霉菌株G-415(Aspergillus niger)，保藏号为CCTCC NO：M202018菌株的用途，其特征在于用于生产β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶。

4.根据权利要求3所述的一种黑曲霉菌株G-415(Aspergillus niger)，保藏号为CCTCC NO：M202018菌株的用途，其特征在于以麸皮为主要原料生产β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶的固体发酵方法为：

1)一级种子：从原始菌种接种至试管察氏培养基，28～30℃培养4～5天；

2)二级种子：从一级种子接种至三角瓶固体培养基，28～30℃培养2～3天，加无菌水后制成孢子悬浮液；

3)发酵：发酵培养基由麸皮、豆粕、无机盐和产酶促进剂并加水100％组成，pH自然，0.1Mpa灭菌30～40分钟，冷却后按培养基的量接入0.1～0.2％孢子悬浮液，于发酵室内温度保持在28～30℃，相对湿度保持在85～90％条件下，培养48～52小时出曲；

4)后处理：发酵产物经在40～45℃下烘干，粉碎，加入载体，混合后包装。

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