CN118308342A - 纤维二糖差向异构酶突变体及其在乳果糖生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纤维二糖差向异构酶突变体及其在乳果糖生产中的应用，属于生物酶工程技术领域。本发明在SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶的基础上进行定点饱和突变和迭代饱和突变，获得了催化能力提高的纤维二糖差向异构酶突变体。本发明构建的突变体S173Y/S192A/Y193G比酶活力提高了2.00倍，达到14.18U/mg。在20U/mL加酶量、pH 7.5、75℃的催化条件下，可以催化500g/L的乳糖生成372.15g/L的乳果糖，转化率达74.43％，转化率提高了9.53％，有工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及纤维二糖差向异构酶突变体及其在乳果糖生产中的应用，属于生物酶工程技术领域。
背景技术
乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)是由半乳糖和果糖通过β-1,4糖苷键生成的还原型二糖，和乳糖是同分异构体。乳果糖有多种生理功能，如治疗便秘、肝性脑病和抗内毒素等作用；有益生元特性，可以调节肠道菌群；可作为甜味剂和功能性食品添加剂用于食品工业；在动物饲料中添加乳果糖，有增强动物对肠道菌群抵抗力的作用。因此，乳果糖有广泛的应用前景且需求量巨大。
乳果糖的制备方式主要包括化学异构和酶催化两种方式。化学法生产乳果糖的方法大致可分为三种：碱性催化、复合催化和电化学异构。目前，乳果糖的工业化生产是化学法生产的，通过Lobry de Bruyn-Alberda van Ekenstein(LA)重排，使乳糖在高温和碱性条件下发生异构化生成乳果糖，但该方法存在缺点，如反应条件复杂、副产物多、分离纯化困难。生物法生产乳果糖主要是通过一些生物催化剂实现乳果糖的合成。生产乳果糖的酶主要有β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖差向异构酶。前两者生产乳果糖的转化率较低，且需添加底物果糖，产物分离复杂，不适用于工业化生产，而部分嗜热来源的纤维二糖差向异构酶，能催化乳糖发生异构化反应生成乳果糖且转化率较高，是生物酶法产业化制备乳果糖的潜在方向。纤维二糖差向异构酶作为一种重要的生物催化剂，对推进乳果糖产业化生产有很大的研究价值和市场潜力，且反应条件温和，绿色环保。但是它的催化效率与实际应用的要求还存在差异，阻碍了其在大规模生产中的应用。非理性设计借助蛋白质的序列、结构、催化机制和高通量筛选方法等信息的基础上，对目标酶的再设计。通过对筛选出的特定的氨基酸位点进行定点突变、饱和突变和组合突变，构建“小而精”的突变文库，增加了有益突变的概率，极大地降低了工作量，广泛应用于酶分子的改造。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种提高酶活力和酶催化效率提高的突变体。
本发明的目的是提供一种纤维二糖差向异构酶突变体，所述的突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶第173位、第189位、第192位、第193位、第244位、第251位、第311位中的一个或多个氨基酸进行突变。
在一种实施方式中，所述突变是将第173位丝氨酸突变为苏氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第189位缬氨酸突变为甲硫氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第189位缬氨酸突变为亮氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第192位丝氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第193位酪氨酸突变为色氨酸、缬氨酸、甘氨酸或丙氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第244位丝氨酸突变为谷氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第251位丙氨酸突变为谷氨酰胺。
在一种实施方式中，所述突变是将第311位丙氨酸突变为丝氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第173位丝氨酸突变为半胱氨酸，并将第193位酪氨酸突变为甘氨酸。
在一种实施方式中，所述突变是将第173位丝氨酸突变为半胱氨酸，并将第192位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第193位酪氨酸突变为甘氨酸。
本发明的第二个目的是提供编码所述纤维二糖差向异构酶突变体的基因。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因S173T的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因V189M的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因V189L的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因S192A的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因S192G的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因Y193W的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因Y193V的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因Y193G的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因Y193A的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因S244E的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因A251Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因A311S的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因S173C/Y193G的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体基因S173C/S192A/Y193G的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的重组质粒。
本发明的第四个目的是提供表达所述纤维二糖差向异构酶突变体的重组微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物为细菌或真菌。
在一种实施方式中，所述重组微生物是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体，表达SEQ ID NO.4～17任一所示的纤维二糖差向异构酶突变体。
为本发明的第五个目的是提供上述纤维二糖差向异构酶突变体、基因、表达载体或宿主细胞在制备乳果糖中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是以乳糖为底物，将所述纤维二糖差向异构酶与乳糖接触，酶催化生产乳果糖。
在一种实施方式中，所述纤维二糖差向异构酶突变体的添加量≥20U/g底物。
在一种实施方式中，所述乳糖在反应体系中的浓度≥100g/L。
在一种实施方式中，所述反应体系的pH为7～9。
在一种实施方式中，反应温度为75～85℃。
在一种实施方式中，所述应用是将所述纤维二糖差向异构酶突变体或所述重组微生物细胞添加至反应体系中。
有益效果：
本发明通过定点饱和突变和迭代饱和突变技术获得了酶活力和催化效率提高的纤维二糖差向异构酶。通过对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶M5进行3D结构同源建模，经可视化软件分析，选取活性位点周围范围内氨基酸残基，确定了32个关键氨基酸残基位点，对这些关键氨基酸残基位点进行定点饱和突变，获得了12个酶活力提高的突变体，分别为S173T、V189M、V189L、S192A、S192G、Y193W、Y193V、Y193G、Y193A、S244E、A251Q、A311S，比酶活力分别提高了1.27、1.28、1.25、1.23、1.14、1.29、1.21、1.62、1.26、1.25、1.19、1.35倍。在定点饱和突变的基础上进行迭代饱和突变，筛选到两株酶活力提高的突变体S173/Y193G和S173Y/S192A/Y193G，其比酶活力分别为12.11U/mg和14.18U/mg，分别提高了1.71倍和2.00倍。其中突变体S173C/S192A/Y193G的Km值显著下降，kcat/Km值提高了1.36倍，由5.81L·mol-1·min-1提高到7.88L·mol-1·min-1，催化效率提高显著。
本发明还将突变体用于催化乳糖生产乳果糖，突变体S173C/S192A/Y193G可以催化500g/L的乳糖生成372.15g/L的乳果糖，转化率达74.43％，与初始酶相比，乳果糖的转化率提高了9.53％。
附图说明
图1为定点饱和突变筛选得到的酶活力提高的突变体。
图2为迭代饱和突变筛选得到的酶活力提高的突变体。
图3为温度对M5和S173C/S192A/Y193G制备乳果糖的影响。
图4为pH对M5和S173C/S192A/Y193G制备乳果糖的影响。
图5为底物浓度对M5和S173C/S192A/Y193G制备乳果糖的影响。
图6为加酶量对M5和S173C/S192A/Y193G制备乳果糖的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
比酶活的检测方法：用50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)配制584mM/L乳糖溶液，取500μL乳糖溶液和500μL 0.5mg/mL纯酶液混合，80℃反应5min，煮沸10min终止反应，高效液相色谱法(HPLC)测乳果糖含量。酶活力定义单位为：在上述条件下催化底物乳糖每分钟产生1μmol乳果糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。
HPLC检测方法：HPLC***利用Aglient 1260高效液相色谱仪配备了示差折光检测器和Shodex Asahipak NH2P-50 4E色谱柱，用于检测乳果糖含量。流动相为：乙腈:水(75:25)；进样量为10μL，柱温为30℃，流速为0.8mL/min。
实施例1定点突变构建出发酶纤维二糖差向异构酶M5
由天霖生物科技有限公司合成来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的纤维二糖差向异构酶基因CsCE(GenBank No.DI217126)，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，基因表达质粒为pET28a(+)。将纤维二糖差向异构酶基因CsCE连接至载体pET28a的酶切位点Nco I和BamH I之间，获得重组质粒pET28a-CsCE。
以重组质粒pET28a-CsCE为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，用全质粒PCR技术，依次对R5M、A12S、I52V、F231L、K328I进行定点突变，经测序验证后获得重组质粒pET28a-M5。纤维二糖差向异构酶基因M5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，以SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶作为出发酶进行突变。将重组质粒pET28a-M5转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌E.coli BL21(DE3)pET28a-M5。PCR扩增体系参考表1。PCR扩增程序为：98℃3min；98℃15s、55℃30s、72℃6.5min(30个循环)；72℃10min。
表1PCR扩增体系
实施例2纤维二糖差向异构酶的表达
重组菌E.coli BL21(DE3)pET28a-M5含有纤维二糖差向异构酶基因M5，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将重组菌E.coli BL21(DE3)pET28a-M5接种到含50μg·mL-1的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h。按2％接种量转接于含50μg·mL-1的卡那霉素的TB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，25℃诱导表达24h。
发酵结束后，采用6,000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤细胞2次，将菌体浓缩5倍悬浮于50mMTris-HCl(pH＝7.5)。将收集到的菌体经洗涤悬浮处理后，采用超声波破碎仪(UCD-650B)超声破碎30min(变幅杆6，功率比20％，工作2s，停止4s)，12,000rpm离心5min，收集上清液，即粗酶液。利用蛋白纯化柱(Ni2+柱)对含有HIS标签的粗酶液进行纯化，获得目的蛋白。
实施例3定点饱和突变体文库的构建及高催化活力突变体的筛选
对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶进行3D结构同源建模，通过Pymol软件分析，选取活性位点周围范围内氨基酸残基，确定了32个关键氨基酸残基位点，对这些关键氨基酸残基位点进行定点饱和突变。
设计NNK简并引物，以pET28a-M5为模板，在上述32个关键氨基酸残基位点进行定点饱和突变，构建了32个突变体文库。将上述构建的突变体的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种于96深孔板中，37℃、220rpm培养8h。将100μL培养液转移到800μL含有50μg/mL卡那霉素的液体TB培养基，25℃、220rpm培养24h得到发酵培养液。统一OD600后，离心机收集菌体，加入50μL含10mg/mL的溶菌酶的50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)，37℃孵育1h，-80℃下冷冻30min，如此反复冻融三次。4,500rpm离心20min，收集上清液，加入50μL200g/L的乳糖溶液反应5min。加入280μL 75％的硫酸溶液，震荡混匀，放置46℃反应5min后，加入20μL显色剂，在46℃放置70min，冷却至室温于518nm处检测吸光度，筛选酶活力提高的突变体并提质粒测序。将初筛获得的突变体用摇瓶发酵复筛，发酵结束收集菌体，菌体破壁后，用镍柱纯化突变体酶，测量突变体的比酶活力。
通过定点饱和突变筛选获得了13个酶活力提高的突变体，分别为S173T、V189M、V189L、S192A、S192G、Y193W、Y193V、Y193G、Y193A、S244E、A251Q、A311S，比酶活力分别提高了1.27、1.28、1.25、1.23、1.14、1.29、1.21、1.62、1.26、1.25、1.19、1.35倍。
表2定点饱和突变筛选得到的突变体的比酶活
实施例4迭代饱和突变提高酶的催化活力和催化效率
定点饱和突变获得的突变体对应的氨基酸位点为Y193、S173、V189、S192、S244、A251、A311。以Y193G为出发酶，在氨基酸位点S173、V189、S192、S244、A251、A311进行迭代饱和突变。用NNK简并引物构建S173、V189、S192、S244、A251、A311位点的迭代饱和突变体的文库，突变体的筛选方法同实施例3。如图2所示，筛选到两株酶活力提高的突变体S173/Y193G和S173Y/S192A/Y193G，其比酶活力分别为12.11U/mg和14.18U/mg，分别提高了1.71倍和2.00倍。
表3迭代饱和突变筛选得到的突变体的比酶活
以不同浓度的乳糖(50mM-980mM)为底物，通过测定反应生成乳果糖的量，计算纤维二糖差向异构酶的比酶活力。通过GraphPad软件的Michaelis-Menten模型进行非线性拟合，获得Km和kcat值。突变体S173C/S192A/Y193G的Km值显著降低。kcat/Km值由对照的5.81L·mol-1·min-1提高到7.88L·mol-1·min-1，提高了1.36倍。
表4突变体的酶动力学参数
实施例5突变体的生物催化
利用纤维二糖差向异构酶M5及其突变体S173C/S192A/Y193G催化生产乳果糖。首先对酶的催化条件进行了优化。
测定温度对乳果糖转化率的影响，在催化反应体系为1mL。加酶量为40U/mL，底物浓度为500g/L，pH为7.5的条件下，分别测定了温度为70℃、75℃、80℃、85℃时，催化反应5h的乳果糖的转化率。如图3所示，M5在温度为80℃时，乳果糖的产量最高，达到316.30g/L，转化率为63.26％；S173C/S192A/Y193G在75℃时，乳果糖的产量达到355.60g/L，转化率为71.12％。
测定pH对乳果糖转化率的影响。在催化反应体系为1mL，加酶量为40U/mL，底物浓度为500g/L的条件下，分别测定了在pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0时，催化反应5h的乳果糖的转化率。由于缓冲液缓冲范围的差异，采用三种缓冲液用于不同pH下酶活力的测定，由于缓冲液中不同离子的影响，酶在不同缓冲液的乳果糖转化率测定结果有偏差。如图4所示，M5催化生产乳果糖的最适pH是8.0，乳果糖产量达到324.90g/L，转化率为64.98％；突变体S173C/S192A/Y193G生成乳果糖的最适pH是7.5，乳果糖产量达到366.90g/L，转化率为73.38％。由于pH 8.5-9.0的缓冲液中含有硼酸，能与产物乳果糖结合形成复合物，使化学平衡向乳果糖合成的方向进行，从而使得乳果糖转化率显著增加。但由于硼酸和乳果糖的分离比较困难，且成本较高，不适用于乳果糖大规模生产的应用。
测定底物浓度对乳果糖转化率的影响。在温度和pH优化结果的基础上，加酶量40U/mL的条件下，分别测定了在乳糖浓度为100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L时，催化反应5h的乳果糖的转化率。如图5所示，在底物浓度达到500g/L时，M5和S173C/S192A/Y193G的转化率达到最大，分别为64.98％和74.46％。
测定加酶量对乳果糖转化率的影响。在温度、pH和底物浓度优化结果的基础上，分别测定了酶添加量在5U/mL、10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL时，催化反应的乳果糖的转化率。如图6所示，在M5和S173C/S192A/Y193G的添加量为20U/mL时，既实现了酶的高效利用，又保证了乳果糖的转化率。M5的乳果糖产量为324.5g/L，乳果糖转化率为64.90％；S173C/S192A/Y193G的乳果糖产量为372.15g/L，乳果糖转化率为74.43％。与对照酶M5相比较，突变体S173C/S192A/Y193G的转化率提高了9.53％。
表5突变体催化乳糖的转化率
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的出发酶的基础上具有如下突变：
将第173位丝氨酸突变为苏氨酸；
或将第189位缬氨酸突变为甲硫氨酸；
或将第189位缬氨酸突变为亮氨酸；
或将第192位丝氨酸突变为丙氨酸；
或将第192位丝氨酸突变为甘氨酸；
或将第193位酪氨酸突变为色氨酸；
或将第193位酪氨酸突变为缬氨酸；
或将第193位酪氨酸突变为甘氨酸；
或将第193位酪氨酸突变为丙氨酸；
或将第244位丝氨酸突变为谷氨酸；
或将第251位丙氨酸突变为谷氨酰胺；
或将第311位丙氨酸突变为丝氨酸；
或将第193位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第173位丝氨酸突变为半胱氨酸；
或将第193位酪氨酸突变为甘氨酸，并将第173位丝氨酸突变为半胱氨酸，并将第192位丝氨酸突变为丙氨酸。
2.编码权利要求1所述的纤维二糖差向异构酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.4～17任一所示。
4.携带权利要求2或3所述的基因的重组质粒。
5.表达权利要求1所述的纤维二糖差向异构酶突变体的微生物细胞。
6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物为细菌或真菌。
7.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体，表达权利要求1所述的纤维二糖差向异构酶突变体。
8.权利要求1所述的纤维二糖差向异构酶突变体，权利要求2或3所述的基因，权利要求4所述的重组质粒，权利要求5～6任一所述的微生物细胞，或权利要求7所述的重组大肠杆菌在制备乳果糖的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以乳糖为底物，应用权利要求1所述的纤维二糖差向异构酶突变体或权利要求5～6任一所述的微生物细胞或权利要求7所述的重组大肠杆菌催化生产乳果糖。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述乳糖在反应体系中的浓度≥100g/L；
反应体系的pH为7～9；反应温度为75～85℃。
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