CN118286231A

CN118286231A - 一种药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用

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Publication number: CN118286231A
Application number: CN202410170903.8A
Authority: CN
Inventors: 张聪聪; 马亮亮; 刘玉璐; 冯源; 吴楠; 张颖慧; 王家一
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2024-02-06
Filing date: 2024-02-06
Publication date: 2024-07-05

Abstract

本发明提供了一种药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用，该药物组合物包括科罗索酸和隐丹参酮。本发明证实了科罗索酸和隐丹参酮联用可以发挥协同作用，显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移，促进肝癌细胞的凋亡，并降低肝癌细胞中促癌基因YAP的表达，从而发挥抗肝癌作用；动物实验表明，科罗索酸和隐丹参酮联用可以显著抑制荷瘤大鼠肿瘤体积的增长，降低肿瘤组织中YAP的表达。本发明为临床肝癌药物开发提供了新的思路。

Description

一种药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种主要的全球性恶性肿瘤，占原发性肝癌的75％～85％，我国的肝癌患者数量约占全球肝癌患者的一半以上，是肝癌负担最重的国家之一。虽然随着诊断和治疗程序方面的进展，大多数癌症患者的存活率稳步提高，但肺癌患者死亡率仍然居高不下，缺乏强有力的治疗药物，因此，急需寻找有效的肺癌治疗药物。

中医中药在肝癌治疗方面有着丰富的临床和科研经验，并且在控制病情、延长生存期等方面具有独特的优势。中医认为肝癌的发病与气滞、血瘀、湿热等病理因素有关，治疗应该从扶正祛邪、标本兼治的角度出发。猫人参是临床上抗癌散结的常用药之一，味苦、涩、性凉，归肝、脾、胃、膀胱经，具有清热解毒、消肿散疖、祛风除湿的功效，近年来仍为华东地区治疗各类消化道肿瘤的习用中草药，是目前该地区抗肿瘤处方中最常用的品种之一，并多为何任、唐福安等名老中医所运用。科罗索酸(CorosolicAcid，CA)是猫人参的有效成分之一，分子式为C₃₀H₄₈O₄，分子量为472.7，CA对某些人类肿瘤细胞株具有细胞毒作用，能够降低肿瘤细胞存活率、诱导肿瘤细胞凋亡。由于CA在癌细胞中的多靶向活性，CA在单独给药时即可发挥抗癌作用，在与化疗药物同时给药时可发生协同作用。此外，CA还可作为预防和治疗非酒精性脂肪肝(已更名为代谢相关脂肪性肝病)相关肝细胞癌的药物。天然药物丹参长期用于中医临床，且丹参含有脂溶性二萜和水溶性酚酸，以及黄酮类和三萜类，而隐丹参酮(Cryptotanshinone，CT)是丹参中的亲脂成分，且大多数丹参提取物在体内和体外都表现出一定的药用效果。特别是最近的研究发现，隐丹参酮不仅具有预防缺血、动脉粥样硬化和阿尔兹海默症的潜力，而且还有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肥胖和抗癌等特性。

中国人民解放军海军军医大学的2011年硕士论文“科罗索酸对SMMC-7721细胞生长抑制作用的研究与其作用机制的探讨”明确了CA对SMMC-7721的凋亡诱导作用，证实了科罗索酸通过调控Bax和Bcl促进肝癌细胞凋亡，并且CA抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的生长。

期刊文献《世界科学技术-中医药现代化》2022第9期的“猫眼草中科罗索酸对肝癌SMMC-7721细胞作用的研究”表明CA主要通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期两个机制发挥抗肿瘤作用，是通过调控Bax/Bcl-2的表达来抑制肿瘤细胞的生长，是一种线粒体膜损伤导致的内源性路径调节。

期刊文献《现代预防医学》2021年第13期的“隐丹参酮对人肝癌HepG2细胞自噬及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响”表明了CT可显著抑制肝癌细胞HepG2的细胞活力，可诱导HepG2细胞自噬，其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

然而目前未见科罗索酸和隐丹参酮联合抗肝癌的报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用，该药物组合物包括科罗索酸和隐丹参酮。

进一步地，上述药物组合物由科罗索酸和隐丹参酮组成。

进一步地，在该药物组合物中，科罗索酸和隐丹参酮的质量比为1～100:1，优选为2～4：1，更优选为3.5：1。

进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步地，上述药学上可接受的载体或赋形剂选自稀释剂，崩解剂，润滑剂，填充剂，粘合剂中的一种或多种。

本发明的第二方面是提供一种治疗肝癌的药物组合物，其包括科罗索酸和隐丹参酮。

进一步地，上述药物组合物由科罗索酸和隐丹参酮组成。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明证实了科罗索酸和隐丹参酮联用可以发挥协同作用，显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移，促进肝癌细胞的凋亡，并降低肝癌细胞中促癌基因YAP的表达，从而发挥抗肝癌作用；动物实验表明，科罗索酸和隐丹参酮联用可以显著抑制荷瘤大鼠肿瘤体积的增长，降低肿瘤组织中YAP的表达。本发明为临床肝癌药物开发提供了新的思路。

附图说明

图1显示了CCK8增殖实验结果以表明各组药物对肝癌细胞Bel-7404增殖的影响；

图2显示了DMSO处理组与药物组合物处理组(CA+CT(3.5：1))24小时后细胞Bel-7404的光学显微镜图片(图a-图b)及相对细胞数的变化情况(图c)；

图3通过免疫荧光染色结果显示药物组合物处理组(CA+CT(3.5：1))与DMSO处理组细胞Bel-7404中Cleaved Caspase Substrate的表达情况；

图4显示了用划痕实验检测药物组合物处理肝癌细胞Bel-7404后，不同时间点细胞迁移的变化；

图5显示了各处理组细胞中YAP的表达水平。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1药物组合物对肝癌细胞的抑制作用

一、实验方法

1.细胞培养：人肝癌细胞Bel-7404和Bel-7402用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，于37℃、5％CO₂，95％饱和湿度的培养箱中培养，在整个实验过程中使用的肝癌细胞Bel-7404和Bel-7402均处于对数生长期。Bel-7404和Bel-7402均培养2-3天后进行常规消化，使用胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25％)后传代。

2.配制科罗索酸和隐丹参酮储备液：科罗索酸是白色结晶状，隐丹参酮是黄色结晶状，宝藿苷I为黄色针状结晶，均用二甲亚砜(DMSO)溶解，配成10mM储备液，经0.22μm滤器过滤，置于-20℃避光储存备用。

3.CCK8实验：准备96孔板，将消化好的肝癌细胞Bel-7404和Bel-7402重悬计数，吸取5×10³个对数生长期的肝癌细胞Bel-7404或Bel-7402，将其接种到准备好的96孔板中，每孔加入100μl完全培养基，并设置3个复孔，留1空白孔做空白对照，于6h之后观察Bel-7404和Bel-7402细胞状态，待两株肝癌细胞完全贴壁后，对照组更换为100μl含有二甲亚砜的新鲜完全培养基，加药处理组包括：CA组更换为含有4.0μg/ml科罗索酸的培养基；CT组更换为含有4.0μg/ml隐丹参酮的培养基；BHS I组更换为含有4.0μg/ml宝藿苷I(BHSI)的培养基；CA+CT(2：1)组更换为含有2.67μg/ml科罗索酸+1.33μg/ml隐丹参酮的培养基；CA+CT(3：1)组更换为含有3.0μg/ml科罗索酸+1.0μg/ml隐丹参酮的培养基；CA+CT(3.5：1)组更换为含有3.11μg/ml科罗索酸+0.89μg/ml隐丹参酮的培养基；CA+CT(4：1)组更换为含有3.2μg/ml科罗索酸+0.8μg/ml隐丹参酮的培养基；CA+BHSI(3.5：1)组更换为含有3.11μg/ml科罗索酸+0.89μg/ml宝藿苷I的培养基；CA+BHSI(4：1)组更换为含有3.2μg/ml科罗索酸+0.8μg/ml宝藿苷I的培养基。24h后，弃掉培养基，1ml磷酸缓冲盐溶液清洗三遍，更换为含有10％CCK8试剂的新鲜培养基，培养1-4h，待培养基颜色变为黄色时，取出两株肺癌细胞，用酶标仪读取在波长为450nm处的吸光度值，根据吸光度值计算细胞活性。细胞活性％＝(处理组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。本实验至少重复3次。

4.划痕实验：准备6孔板，在背面均匀的画出3条横线，确保每一条横线都划过六孔板的孔，将消化好的肝癌细胞Bel-7404和Bel-7402重悬计数，按照5×10⁴/cm²的细胞密度吸取细胞重悬液，并将细胞接种于6孔板中，放置培养箱中培养，待细胞融合率达到90％时，用200μl枪头垂直于之前所画的六孔板背部的横线在孔内划线。吸取1ml 1×磷酸缓冲盐溶液于六孔板中，反复三遍，以清洗脱落的细胞，将对照组的培养基更换为2ml含有DMSO的新鲜完全培养基，加药处理组的培养基更换为2ml含有3.11μg/ml科罗索酸+0.89μg/ml隐丹参酮的完全培养基，继续放置于培养箱中培养。按照0h、24h时间点，根据所划线的区域选取在同一视野下的肝癌细胞进行拍照，Image J图像处理软件对划痕进行分析，计算迁移率。迁移率＝划痕0小时伤痕面积/划痕24小时伤痕面积。

5.实时荧光定量PCR检测基因拷贝数：

5.1收集细胞：

(1)准备六孔板，将处于对数生长期的肝癌细胞Bel-7404和Bel-7402以每个孔5×10⁵的密度接种于6孔板中。

(2)将孔板放置于培养箱中，等待细胞贴壁。

(3)对照组更换培养基为含有2mlDMSO的新鲜培养基，加药处理组更换为含有3.11μg/ml科罗索酸+0.89μg/ml隐丹参酮的2ml培养基。

(4)24h后，弃培养基，用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞。

(5)0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞。

(6)细胞以1000×rpm离心5分钟，收集细胞。

5.2提取细胞总RNA：

(1)将细胞收集到1.5ml离心管中，向每个离心管中加入1ml Trizol，吹打混匀，室温静置5分钟。

(2)向每个离心管中加入200μl氯仿，震荡混匀30秒。

(3)4℃、12000×g离心20min。

(4)吸取上清转移至新的离心管中。

(5)加入与所吸取的上清等体积的异丙醇，上下轻柔颠倒EP管

(6)-20℃静置20min。

(7)4℃、12000×g离心10min，弃上清。

(8)加入无水乙醇清洗，再4℃、12000×g离心10min。

(9)弃去无水乙醇，室温风干沉淀。

(10)加入适量体积的DEPC水，使用分光光度计测定RNA的浓度和A260/280值，然后置于-80℃保存备用。

5.3逆转录合成cDNA：

(1)5×Prime Script RT Master Mix反转录试剂，配制20μl反应体系，根据所测定的RNA浓度，取总RNA 1000ng，5×qRT super-Mix 4μl，然后无酶超纯水补至20μl。

(2)将样品置于PCR仪中进行反转录程序，条件为(37℃15min；87℃5s；4℃∞)。

5.4实时荧光定量PCR：

(1)取上下游引物各1μl(引物序列见下表1)，2×SYBR Green Mix 10μl，cDNA 2μl，无酶去离子水6μl配制体系并加入到无酶八联管中，每个样品均需要设置三个复孔；

(2)将样品放置于荧光定量PCR仪中反应，条件为：95℃-30s；95℃-5s，60℃-45s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环。

(3)根据循环数(CT)值进行数据分析。

表1实时荧光定量PCR引物序列

引物名称	序列	SEQ ID NO.
			GAPDH-F	ATCATCCCTGCCTCTACTGG	1
GAPDH-R	GTCAGGTCCACCACTGACAC	2
			YAP-F	TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA	3
YAP-R	TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT	4

6.免疫荧光实验：

(1)准备24孔板中，用镊子将玻片铺入24孔板；

(2)细胞计数，每孔加入1×10³个处于对数生长期的肝癌细胞，后加入200μl完全培养基，培养箱中培养，放置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度培养箱中培养。

(3)细胞贴壁后，对照组更换为200μl含有DMSO的新鲜完全培养基，加药处理组更换为含有3.11μg/ml科罗索酸+0.89μg/ml隐丹参酮的培养基500μl。

(4)24h后吸掉培养基，1×磷酸缓冲盐溶液清洗清洗细胞3次，每次5min；

(5)每孔加入4％多聚甲醛固定细胞，静置20min；

(6)弃去甲醛，用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞三次，每次5min；

(7)每孔加入200μl封闭液室温封闭1小时(封闭液配方：1.5ml FBS，0.5ml Goat-serμm，50μl TritonX-100，用PBS缓冲液配至50ml)。

(8)结束后每孔200μl加入一抗，一抗稀释比例按抗体说明书，4℃孵育过夜；(9)用1×磷酸缓冲盐溶液清洗细胞3次，每次5min；

(10)每孔加入200μl二抗(二抗用封闭液稀释，一般1：500)，室温闭光孵育1h。

(11)吸掉二抗，1×磷酸缓冲盐溶液清洗细胞3次，每次5min；

(12)每孔加入200μl DAPI，静置20min；

(13)弃掉DAPI，1×磷酸缓冲盐溶液清洗细胞3次，每次5min；

(14)抗荧光淬灭封片剂封片；

(15)镜检拍照。

二、实验结果

1.各组药物对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

用科罗索酸、隐丹参酮、宝藿苷I或它们的组合物处理肝癌细胞，通过CCK8实验检测各组药物对肝癌细胞增殖的影响。结果如图1所示，CA+CT(3.5:1)组细胞活性最小，科罗索酸和隐丹参酮表现出协同抑制的作用。

用科罗索酸和隐丹参酮处理肝癌细胞，通过细胞功能实验检测科罗索酸和隐丹参酮对肝癌细胞增殖、迁移、凋亡的变化。由图2可以看出药物组合物对肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用。由图3可见药物组合物处理后Cleaved Caspase Substrate表达明显增多，说明细胞凋亡增加。由图4可以看出药物组合物对细胞迁移具有明显的抑制作用。用药物组合物处理肝癌细胞，通过实时荧光定量PCR法检测药物组合物处理后肝癌细胞中RNA的变化，尤其是YAP的变化情况，从而从RNA层面检测药物组合物处理后肝癌细胞中YAP的变化情况。结果见图5，药物组合物处理组YAP表达水平显著降低。

实施例2药物组合物对大鼠移植性肝癌的抑制作用

一、实验材料和方法

1.实验动物与主要试剂

8周大的雄性SD大鼠，体重为180-220g，购自上海斯莱克动物有限公司；Walker-256皮下荷瘤大鼠购自中国科学院上海实验动物中心。科罗索酸(CA)、隐丹参酮(CT)、宝藿苷I(BHS I)购自美国Sigma公司。其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。逆转录试剂盒、荧光定量realtime RT-PCR试剂盒购自TakaRa公司。紫外分光光度计购自上海谱元仪器有限公司，7500型快速实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

2.实验方法

2.1大鼠移植瘤模型的制备：

首先，将皮下荷瘤大鼠进行断颈处死，对瘤体部分进行局部消毒，取出皮下瘤体，将边缘呈鱼肉样并且无出血无坏死的肿瘤组织，切成1mm³大小的瘤块，以备种植使用。在进行移植前，使用20％乌拉坦注射液以0.5ml/100g的剂量对SD大鼠进行腹腔注射麻醉。切口处去除毛发并进行消毒，在上腹约1.5-2cm处作正中切口，使肝左叶暴露出来，眼科剪刺破肝包膜，在包膜下作0.5-1cm的隧道，将备好的瘤组织块用眼科镊植入，并确保瘤组织没有退出且没有出血，立即关闭腹部切口。

2.2动物分组将SD大鼠随机分为两组，其中假手术组6只，其余大鼠做种植肝癌手术，术后将存活大鼠再随机分组，组别包括假手术组、模型组、CA组、CT组、BHSI组、CA+CT(2：1)组、CA+CT(3：1)组、CA+CT(3.5：1)组、CA+CT(4：1)组、CA+BHS I(3.5：1)组、CA+BHS I(4：1)组，每组6只。假手术组只手术，不移植肿瘤组织；其余各组均移植肿瘤组织，同时给予相应药物灌胃，药物使用大豆油溶解，给药剂量为药物活性成分总量50mg/kg，给药体积50ml，每天灌胃一次。各组动物于移植术后12天处死，分离肿瘤组织和正常肝组织备用。

2.3肿瘤体积的测定

分离肿瘤组织，测量肿瘤最大径和与最大径垂直的最宽径。肿瘤体积

＝a×b²/2，a为肿瘤最大径，b为最大径垂直的最宽径。

2.4HMGB1、VEGF表达的检测取50-100mg肿瘤组织，Trizol法提取总RNA，使用逆转录试剂盒转录得到cDNA，通过实时荧光定量PCR检测HMGB1、VEGF的表达量：取上下游引物各1μl(引物序列见下表2)，2×SYBR Green Mix 10μl，cDNA 2μl，无酶去离子水6μl配制体系并加入到无酶八联管中，每个样品均需要设置三个复孔；将样品放置于荧光定量PCR仪中反应，条件为：95℃-30s；95℃-5s，60℃-45s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环。根据循环数(CT)值进行数据分析。

表2实时荧光定量PCR引物序列

引物名称	序列	SEQ ID NO.
			GAPDH-F	AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC	5
GAPDH-R	TCCACCACCCTGTTGCTGTA	6
			HMGB1-F	GTAATGCCTTTGCCCTTCTAT	7
HMGB1-R	TATCCGCTTTCCTTGTATCTG	8
			VEGF-F	TGGACTTGAGTTGGGAGGAG	9
VEGF-R	GGATGGGTTTGTCGTGTTTC	10

2.5数据处理

数据以均数±标准差表示，应用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计学处理，统计学方法采用χ²检验，当P<0.05时认为有统计学意义。

二、实验结果

1.各组荷瘤大鼠肿瘤体积

各组瘤大鼠肿瘤体积测定结果见表3，从表中可以看出，各组药物均具有显著的抑瘤作用，荷瘤大鼠肿瘤体积与模型组相比均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。其中，CA+CT(3.5：1)组抑瘤率最高，为93.98％，并且与其他组荷瘤大鼠肿瘤体积相比具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。CA、CT、BHS I三种药物相比较，抑瘤作用的大小顺序为：CA>BHS I>CT。然而从结果可以看出，CA、CT联用可以发挥显著的协同作用，CA和BHS I之间不具有协同作用。因此，针对肝癌药物的开发，CA、CT联用是一种较为有效的治疗方案。

表3各组荷瘤大鼠肿瘤体积

注：与模型组相比较，*P<0.05，**P<0.01；与CA+CT(3.5:1)组相比较，#P<0.05，##P<0.01

2.各组荷瘤大鼠肿瘤组织HMGB1、VEGF的表达量

根据表4中的检测结果，可以观察到各组荷瘤大鼠肿瘤组织中HMGB1和VEGF的表达量。结果显示，模型组荷瘤大鼠的肿瘤组织中HMGB1和VEGF的表达量明显增加。相比之下，各用药组的肿瘤组织中HMGB1和VEGF的表达量均显著降低，表明各种药物能够有效下调肿瘤组织中HMGB1和VEGF的表达水平

表4各组荷瘤大鼠肿瘤组织HMGB1、VEGF表达量

注：与模型组相比较，*P<0.05，**P<0.01；与CA+CT(3.5:1)组相比较，#P<0.05，##P<0.01以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括科罗索酸和隐丹参酮。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物由科罗索酸和隐丹参酮组成。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在所述药物组合物中，科罗索酸和隐丹参酮的质量比为1～100:1，优选为2～4：1，更优选为3.5：1。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自稀释剂，崩解剂，润滑剂，填充剂，粘合剂中的一种或多种。

6.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，包括科罗索酸和隐丹参酮。

7.根据权利要求6所述的药学组合物，其特征在于，由科罗索酸和隐丹参酮组成。

8.根据权利要求6所述的药学组合物，其特征在于，在所述药物组合物中，科罗索酸和隐丹参酮的质量比为1～100:1，优选为2～4：1，更优选为3.5：1。