CN118267523A - 一种动物源性生物材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物源性生物材料的改性处理方法及其改性后的制品。本发明的改性处理方法包括：1)将动物源性生物材料暴露于戊二醛中进行交联；2)采用双端带有氨基的亲水聚合物对交联后的动物源性生物材料进行修饰处理；3)随后将其与N‑羟基琥珀酰亚胺(‑NHS)修饰化肝素进行反应，于4℃‑37℃条件下反应4‑24h。通过上述方式，本发明能够同时提高动物源性生物材料的抗钙化性能和抗凝活性。

Description

一种动物源性生物材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别是涉及一种改性动物源性生物材料的制备方法和改性动物源性生物材料。

背景技术

动物源性生物材料是指用于制备各类生物制品所涉及的直接来源于动物的组织、器官、细胞、血液、体液或经分离提取的衍生物，而生物瓣膜材料也来源于此，例如可以为猪心包膜、马心包膜、牛心包膜、主动脉瓣膜、小肠粘膜下层等，并通常通过去细胞和去脂处理。

人工瓣膜是血管植入物，因此需要具有良好的血液相容性。对于介入生物心脏瓣膜，心脏内血液流速快，生物瓣膜的血液相容性相对较好，因此形成血栓的概率小，介入生物瓣膜一般无需长期服用抗凝药。尽管传统上生物瓣膜被认为是抗凝的一个很好选择，但近年来的数据分析显示，与人工生物瓣膜相关的血栓形成发生率较高，尤其是随着经导管主动脉瓣置换术的出现，生物瓣膜血栓形成是导致急性或慢性生物瓣膜变性的主要原因。生物瓣膜的血栓原性仍然是需要解决的问题。瓣膜的凝血问题，是除去钙化、免疫排斥反应之外，导致生物瓣膜失效的重要因素。然而，目前尚没有一种能够很好地克服生物瓣膜的血栓原性同时具有良好的抗钙化效果的人工心脏瓣膜材料问世。

CN115252901A公开了一种改性动物源性生物材料的制备方法和改性动物源性生物材料，该方法包括：提供修饰生物瓣膜材料和末端醛基化肝素，修饰生物瓣膜材料包括生物瓣膜材料及与生物瓣膜材料连接的亲水性聚合物链段，亲水性聚合物链段的末端具有氨基；使修饰生物瓣膜材料与末端醛基化肝素进行还原胺化反应，得到改性生物瓣膜材料。但是该方案中，末端醛基化的肝素会对肝素本身的活性造成至少50％的损伤。

CN111658824A公开了一种瓣膜材料及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：对动物源生物瓣膜材料首先进行戊二醛交联处理；然后将处理后的瓣膜材料浸入含有胺基化合物的封闭液中处理0.5-6h；然后瓣膜材料放入含有抗凝剂和交联剂的反应液中；最后对瓣膜材料进行清洗，制得，将瓣膜材料保存于戊二醛或异丙醇/丙三醇的混合溶剂中。但是该方案中所公开的胺基化合物上携带有至少三个伯氨基基团，例如聚乙烯亚胺、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、多聚赖氨酸、多聚精氨酸，但是一方面这类多氨基化合物一般都携带正电荷，而血液中的蛋白质等一般都带负电荷，因此会有吸附蛋白质的可能性。另外一方面，天然的大分子物质具有结构异质化的问题，聚乙烯亚胺也有较大的生物毒性。此外，抗凝剂的接枝需要抗凝剂和交联剂同时的参与，在实际生产应用方面较为繁琐，同时接枝效率不太稳定。

CN111569152A公开了一种兼具抗凝血和抗钙化性能的生物瓣膜及其制备方法。其在戊二醛对生物瓣膜进行交联处理前和/或后采用含有胺基基团的功能分子对生物瓣膜进行至少一次的功能修饰处理。例如采用了氨基肝素、壳聚糖类肝素进行醛基分子的屏蔽。

但是类似于这样的肝素大分子物质，其结构上所携带的氨基数量相对较少，且活性较差，因此实验的用量大大提高，反应时间也较长，不利于产业化发展。另外，对瓣膜修饰的过程中可能会对功能性分子的活性产生一定影响。此外，通过功能分子结构上所带的氨基进行直接的化学键合反应，会导致功能分子部分的功能性位点屏蔽，其在表面暴露的功能性位点就会减少，影响其生物学功能。

发明内容

发明要解决的问题

本发明提供一种提高植介入型生物材料抗钙化抗凝血性能的处理方法及其生物材料。所述处理方法可以使生物材料在具有抗钙化功能的同时，兼有良好的抗蛋白吸附以及抗凝血性能，同时可以最大限度保留肝素本身的抗凝活性。

用于解决问题的方案

本发明提供了如下技术方案：

【1】一种动物源性生物材料的改性处理方法。包括以下步骤：

1)将动物源性生物材料暴露于戊二醛中进行交联；

2)将交联后的动物源性生物材料置于双端氨基的亲水聚合物溶液中，在还原剂的作用下，于20～37℃及pH为3～7条件下进行共价反应，利用所述亲水性聚合物的末端氨基与所述动物源性生物材料表面的醛基共价反应，得到醛基屏蔽的动物源性生物材料。

3)将步骤2)中处理后的动物源性生物材料与N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰化肝素进行反应，于4℃-37℃条件下交联处理4-24h。

【2】根据【1】所述的改性处理方法，双端氨基的亲水聚合物，其中间链段为直链亲水性链段，可以为PEG链段、PEO-PPO-PEO链段，其分子量为200-20000。

【3】根据【1】或【2】所述的改性处理方法，步骤(2)中将双端氨基的亲水性物质配制成溶液，浓度为0.5mg/ml-20mg/ml，优选为1mg/ml-10mg/ml；其中溶剂为缓冲溶液或者纯水溶液。

【4】根据【1】所述的改性处理方法，在步骤(2)中可加入还原剂氰基硼氢化钠加速反应。

【5】根据【1】-【4】任一方案所述的改性处理方法，步骤(3)中将-NHS修饰化肝素配制成溶液，浓度为0.5mg/ml-20mg/ml，优选为1mg/ml-10mg/ml。

【6】根据【5】所述的改性处理方法，步骤(3)中反应液中的溶剂包括磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、HEPES或硼酸盐缓冲液中的至少一种。

【7】根据【5】所述的改性处理方法，步骤(3)中反应pH值为7.2-9。

【8】根据【1】-【7】任一方案所述的改性处理方法，在步骤(1)中，对戊二醛进行加热处理，温度为40-90摄氏度。

【9】根据【1】所述的改性处理方法，在步骤(3)处理后，还包括对动物源性生物材料进行混合溶液清洗处理，该混合溶液至少包括甲醛、吐温和乙醇。

【10】根据【1】所述的改性处理方法，在对动物源性生物材料进行处理最后，还包括对生物材料进行脱水处理(乙醇和吐温)。

【11】根据【1】所述的改性处理方法，在进行步骤(2)和/或步骤(3)处理之前，还包括对动物源性生物材料进行清洗处理。

【12】一种根据【1】-【11】中任一项所述的改性处理方法所制备的改性动物源性生物材料，其中，所述改性动物源性生物材料包括动物源性生物材料及与动物源性生物材料连接的改性修饰结构；所述改性修饰结构包括亲水性聚合物链段和与亲水性聚合物链段共价连接的肝素；所述肝素与所述亲水性聚合物链段以酰胺键键合。

发明的效果

N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰化肝素通过肝素上的-NHS部分与亲水聚合物链段末端的氨基反应，实现肝素化学接枝到材料表面。并且利用预先-NHS修饰的肝素，可以提高反应的活性和稳定性，使涂层更加牢固，同时最大限度保留肝素的生物活性。肝素作为抗凝血剂，主要通过与凝血因子XIa，IXa，Xa，和IIa(凝血酶)反应，从而干扰凝血级联反应。在整个凝血过程中，肝素作为一种催化剂可与抗凝血酶、凝血因子Xa及其它因子结合，当与抗凝血酶结合之后，肝素构象的变化会加速凝血酶-抗凝血酶(TAT)和Xa-抗凝血酶复合物的产生，从而导致凝血因子失活，肝素分子也可以变成自由状态继续重复这个过程。

附图说明

图1为对比例1、实施例1和实施例2的vankossa染色图。

图2为实施例1和实施例2的PTT检测时间图。

图3为实施例1和对比例3的抗蛋白吸附图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

应当理解，在本申请说明书和附加的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。

本说明书中，所提及的“一个或一些具体/优选实施方式/方案”、“另一个或另一些具体/优选实施方式/方案”、“一个或另一个实施方式/方案”、“一个或另一个技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。

本发明的说明书和权利要求书的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或***、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

在本发明中术语“功能化”和相关术语包括：处理材料以改变其表面性能以满足用于特定应用的特定要求的过程，或者，通过向聚合物添加基团来提供其通常没有的功能的过程。

一种动物源性生物材料的改性处理方法。其特征在于，包括以下步骤：

S1：将动物源性生物材料暴露于戊二醛中进行交联。

生物瓣膜一般是由动物源性的生物材料而来，例如可以为猪心包膜、马心包膜、牛心包膜、主动脉瓣膜、小肠粘膜下层、鱼鳔等，在此不做具体限定。因此，本申请中的“动物源性生物材料”可以是本领域技术人员所了解的动物源性生物原材料例如牛心包、猪心包、猪主动脉瓣膜、小肠粘膜下层以及血管、皮肤、脑组织、韧带和腱等，也可以是由上述动物源性生物材料制成的人工心脏瓣膜例如主动脉瓣、二尖瓣、肺动脉瓣和三尖瓣等，或是组织移植物、血管假体和移植物、眼眶植入物覆盖物以及其它。

动物源性生物材料需要具有一定的机械强度，原始材料例如牛心包力学性能不佳，植入体内后耐久性不好，因此需要交联处理。目前为止，戊二醛的交联处理依然是对动物源性生物材料例如生物瓣膜等改性的黄金法则。通过戊二醛处理生物材料，具有快速、柔性、降低免疫原性和能与常见氨基酸残基固定的优势，所以目前大部分生物心瓣膜多使用戊二醛进行固定来降低免疫原性。

S2：将交联后的动物源性生物材料置于双端氨基的亲水聚合物溶液中，在还原剂的作用下，于20～37℃及pH为3～7条件下进行共价反应，利用所述亲水性聚合物的末端氨基与所述动物源性生物材料表面的醛基共价反应，得到醛基屏蔽的动物源性生物材料。

但通过戊二醛处理的动物源性生物材料非常容易钙化。这会导致组织弹性韧性以及机械强度都发生很大改变，进而失去组织植入后应有的功能。通过对传统戊二醛交联方法进行改进，可有效缓解动物源性生物的钙化程度。

本发明的发明人在之前的研究中发现，双端氨基的亲水聚合物可以与醛基进行反应，从而将动物源性生物材料表面暴露的醛基位点屏蔽。在本发明的一个优选实施方式中，双端带有氨基的亲水聚合物，其中间链段为直链亲水性链段，优选为聚乙二醇(PEG)链段、聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PEO-PPO-PEO)链段，优选亲水中间链段的分子量为200-20000，进一步优选的，分子量为500-2000，例如500、1000、1500、2000。以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。

亲水性链段一方面可以通过端氨基屏蔽醛基位点；另一方面，亲水性聚合物链段具有良好的亲水性和生物相容性，将其共价连接至动物源性生物材料中，能够减少蛋白质的吸附，进一步提高材料的生物相容性，减少感染、凝血的发生；此外，直链性的亲水性聚合物链段的引入，可以在动物源性生物材料与抗凝物质肝素之间形成间隔臂，提供柔性链段，在生理环境中更好地暴露肝素的抗凝活性位点。在其中优选聚乙二醇(PEG/PEO)链段和聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PEO-PPO-PEO)链段。PEG无毒、惰性，已被证明具有优异的亲水性和生物相容性，在医疗行业广泛使用。研究表明PEG的蛋白排斥性在一定分子量范围内随分子量的增加而增加，因此优选分子量为200-2000，降低分子量过低或过高带来的负面影响。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)中可将双端带有氨基的亲水性物质配制成溶液，浓度为0.5mg/ml-20mg/ml，优选为1mg/ml-10mg/ml；其中溶剂为缓冲溶液或者纯水溶液；其中溶液可用盐酸调整pH为弱酸性。

在本发明的一个优选实施方式中，在步骤(2)中可加入还原剂氰基硼氢化钠加速反应的进程。

S3：将步骤2)中处理后的动物源性生物材料与N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰化肝素进行反应，于4℃-37℃条件下交联处理4-24h。

N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰化肝素结构为：

肝素上的-NHS修饰基团可以与亲水聚合物的另一末端氨基发生反应。通过活性酯部分实现氨基与羧基之间的化学键合，从而将肝素共价接枝到改性表面。区别于另一种化学改性方案：即目前常用的末端醛基化的肝素接枝，本发明的-NHS修饰更为简单，反应选择性高不会影响其他基团，且避免了末端醛基化过程中对肝素的活性造成损伤。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中可将-NHS修饰化肝素配制成溶液，浓度为0.5mg/ml-20mg/ml，优选为1mg/ml-10mg/ml。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(3)中反应液中的溶剂包括磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、HEPES或硼酸盐缓冲液中的至少一种。反应pH值为7.2-9。

在本发明的一个优选实施方式中，在步骤(1)中，对戊二醛进行加热处理，温度为40-90摄氏度。温和的热处理步骤可以除去戊二醛固定后的不稳定的戊二醛部分，进一步减少钙化的发生。

在本发明的一个优选实施方式中，在步骤(3)处理后，还包括对动物源性生物材料进行混合溶液清洗处理，该混合溶液至少包括甲醛、吐温和乙醇。使用酒精和表面活性剂能够洗涤从心包组织的细胞成分中提取天然存在的磷脂，提升动物源性生物组织抗钙化的能力，促进耐久度的提高。

在本发明的一个优选实施方式中，在对动物源性生物材料进行处理最后，还包括利用乙醇和吐温对生物材料进行脱水处理。

在本发明的一个优选实施方式中，可选的在每个步骤操作之前，或在进行步骤(2)和/或步骤(3)处理之前，还包括对动物源性生物材料进行清洗处理。所述清洗过程可以包括本领域常规的浸泡、振荡、化学/生物试剂处理等造成去细胞化，从而减少免疫或抗原结合位点和潜在的结合位点。

本方法采用双端带有氨基的亲水聚合物进行修饰处理，随后将其与N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰化肝素进行反应，将肝素修饰到材料表面。该方法实现生物材料在具有抗钙化功能的同时，兼有良好的抗蛋白吸附以及抗凝血性能。

其中，采用双端带有氨基的亲水聚合物作为介导层，利用氨基和醛基的反应屏蔽掉生物材料表面醛基，减少钙结晶位点，降低钙化发生率。并且亲水性聚合物能够减少蛋白质的吸附，进一步提高材料的生物相容性，减少感染、凝血的发生。另一方面，可提供活性锚点，便于后续功能性物质肝素的化学接枝，提高材料的抗凝血性能。PEG类聚合物结构和分子量确定可调，可重复性好，适于工业化生产。

本发明还提供了一种改性动物源性生物材料，采用上述任一所述的改性处理方法制备得到。本申请中的“动物源性生物材料”可以是本领域技术人员所了解的动物源性生物原材料例如牛心包、猪心包、猪主动脉瓣膜、小肠粘膜下层以及血管、皮肤、脑组织、韧带和腱等，也可以是由上述动物源性生物材料制成的人工心脏瓣膜例如主动脉瓣、二尖瓣、肺动脉瓣和三尖瓣等，或是组织移植物、血管假体和移植物、眼眶植入物覆盖物以及其它。其中，所述改性动物源性生物材料包括动物源性生物材料及与动物源性生物材料连接的改性修饰结构；所述改性修饰结构包括亲水性聚合物链段和与亲水性聚合物链段共价连接的肝素；所述肝素与所述亲水性聚合物链段以酰胺键键合。

上述改性动物源性生物材料兼具抗钙化性能和抗凝血性能。

参照上述实施内容，为了使本申请的技术方案更加具体清楚、易于理解，现对本申请技术方案进行举例，但是需要说明的是，本申请所要保护的内容不限于以下实施例。

制备例

N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰化肝素的制备方法

1.将100mg肝素在含有100mg EDC的100mL蒸馏水中进行活化，大约30min。

2.加入100mg HNS，用0.1N的盐酸调节溶液的pH值为5，使反应物充分溶解形成均一的反应体系，随后在37℃反应12h。

3.用0.5N的NaOH溶液将体系的pH值调到8。

4.待产物充分析出后装入透析袋中，在蒸馏水中透析5d，在此期间每隔6h更换一次蒸馏水，透析结束后收集产物冷冻干燥。

实施例1

一种动物源性生物材料的改性处理方法，其包含以下步骤：

1.初步交联：将牛心包膜清洗干净之后，在0.3wt％的戊二醛溶液中浸泡交联3d。

2.戊二醛交联：配制戊二醛溶液(1.8％，PH7.4)缓冲液(PBS/HEPES)，并在50～90℃加热7d至PH＝6.0。将上述预加热的戊二醛溶剂中固体过滤掉后，加入初步交联过的组织，在50℃，60rpm环境中震荡反应7d。然后乙醇清洗。

3.亲水聚合物修饰：配制2mg/mL的NH2-PEG-NH2(分子量600)+0.1mg/mL氰基硼氢化钠+NaCl 0.15M，PH调节到5。将上述修饰后的牛心包膜放入溶液中，摇床37℃，60rpm条件下，反应4h。

4.肝素修饰：配制2mg/mL肝素钠+0.1mg/mL氰基硼氢化钠+0.15M NaCl，PH调节到5。将上述修饰后的牛心包膜放入溶液中，摇床37℃，60rpm条件下反应4h。

5.清洗及干燥处理：配制FET溶液：4％甲醛+22％乙醇+12％吐温80+62％PBS，将上述修饰后的牛心包膜浸泡反应3min，用于去除多余磷脂。然后将牛心包膜放入甘油/乙醇(75％/25％)溶液中，震荡1h，去除过量甘油，干燥。

实施例2

步骤同实施例1，区别仅在于将实施例1中第3步的NH2-PEG-NH2替换为PEO-PPO-PEO(Mn＝8700)。

对比例1

步骤同实施例1，区别在于缺少步骤3的亲水聚合物修饰过程。

对比例2

步骤同实施例1，区别仅在于将步骤3中NH2-PEG-NH2替换为多聚赖氨酸。

性能测试

1)抗钙化测试：

选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，每只45-50g，通过腹腔注射剂量为1mL/1kg的3％戊巴比妥钠溶液麻醉。在大鼠背部做两个外科切口，在两侧创建两个真皮下袋。每个袋中放置一块相同大小的样品材料，两个袋中包含相同的样本材料。随后用外科钉封闭切口。3星期后，将样本连同纤维囊一起取出，一半的移植组织保存下来进行组织学检查：将从动物中取出的补片进行病理切片处理，Vankossa染色观察钙化情况。动物组织切片处理方案按照HE染色切片制备方法进行。染色剂换成银染试剂。另一半冷冻以进行钙含量分析。

2)抗凝血测试：

按照国家标准GBT14233.2中部分凝血激活酶时间(PTT)试验的方式进行操作。其中阴性为高密度聚乙烯材料，阳性为玻璃材料。

3)抗蛋白质吸附测试：

采用Elisa方法，对各样品进行IgG蛋白的吸附测试。

从图1可知，对比例1相对于实施例1和2来说，具有较为明显的黑色钙结节，表明其未经亲水链段改性的情况下，其抗钙化的效果远远不足。由图2可知，实施例1和实施例2的PTT时间均达到了检测限300秒，证明由于肝素的引入，抗凝活性大大增强。由图3可知，对比例3虽然也采取了末端氨基的多聚赖氨酸，但是由于其多氨基的存在，其抗蛋白吸附能力不强，而蛋白吸附会引起植入材料的一系列生物安全性问题。由此证明，本发明通过双端氨基的亲水性聚合物接枝，进而修饰-NHS肝素的方法，能够达到兼具抗钙化及抗凝血的效果。

惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例而已，举凡熟悉此项技艺的专业人士在了解本发明的技术手段之后，自然能依据实际的需要，在本发明的教导下加以变化。因此凡依本发明申请专利范围所作的同等变化与修饰，曾应仍属本发明专利涵盖的范围内。

Claims (12)

1.一种动物源性生物材料的改性处理方法。其特征在于，包括以下步骤：

1)将动物源性生物材料暴露于戊二醛中进行交联；

2)将交联后的动物源性生物材料置于双端氨基的亲水聚合物溶液中，在还原剂的作用下，于20～37℃及pH为3～7条件下进行共价反应，利用所述亲水性聚合物的末端氨基与所述动物源性生物材料表面的醛基共价反应，得到醛基屏蔽的动物源性生物材料。

3)将步骤2)中处理后的动物源性生物材料与N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰化肝素进行反应，于4℃-37℃条件下反应4-24h。

2.根据权利要求1所述的改性处理方法，其特征在于，双端氨基的亲水聚合物，其中间链段为直链亲水性链段，选自PEG和PEO-PPO-PEO的至少一种，所述双端氨基的亲水聚合物分子量为200-20000。

3.根据权利要求1或2所述的改性处理方法，其特征在于，步骤(2)中将双端氨基的亲水性物质配制成溶液，浓度为0.5mg/ml-20mg/ml，优选为1mg/ml-10mg/ml；其中溶剂为缓冲溶液或者纯水溶液。

4.根据权利要求1所述的改性处理方法，其特征在于，在步骤(2)中加入还原剂氰基硼氢化钠。

5.根据权利要求1-4任一项所述的改性处理方法，其特征在于，步骤(3)中将-NHS修饰化肝素配制成溶液，浓度为0.5mg/ml-20mg/ml，优选为1mg/ml-10mg/ml。

6.根据权利要求5所述的改性处理方法，其特征在于，步骤(3)中反应液中的溶剂包括磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、HEPES或硼酸盐缓冲液中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的改性处理方法，其特征在于，步骤(3)中反应pH值为7.2-9。

8.根据权利要求1-7任一项所述的改性处理方法，其特征在于，在步骤(1)中，对戊二醛进行加热处理，温度为40-90摄氏度。

9.根据权利要求1所述的改性处理方法，其特征在于，在步骤(3)处理后，还包括对动物源性生物材料进行混合溶液清洗处理，该混合溶液至少包括甲醛、吐温和乙醇。

10.根据权利要求1所述的改性处理方法，其特征在于，在对动物源性生物材料进行处理最后，还包括用乙醇和吐温的混合溶液对生物材料进行脱水处理。

11.根据权利要求1所述的改性处理方法，其特征在于，在进行步骤(2)和/或步骤(3)处理之前，还包括对动物源性生物材料进行清洗处理。

12.一种根据权利要求1-11中任一项所述的改性处理方法所制备的改性动物源性生物材料，其特征在于，所述改性动物源性生物材料包括动物源性生物材料及与动物源性生物材料连接的改性修饰结构；所述改性修饰结构包括亲水性聚合物链段和与亲水性聚合物链段共价连接的肝素；所述肝素与所述亲水性聚合物链段以酰胺键键合。