CN118267387A - 联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。本发明首先发现Cpd‑63能够抑制肝癌细胞增殖作用和迁移、侵袭活性，并进一步将索拉非尼和Cpd‑63联用，能够对肝癌细胞增殖产生协同抑制效果，因此可以作为联用药物组合物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中应用，具有临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
背景技术
原发性肝癌(PLC)是全球最常见的诊断癌症之一，也是癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌(HCC)约占所有原发性肝癌病例的75-85％。其发病机制是极其复杂的，可以有多种原因，包括慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、接触黄曲霉毒素B1、酒精性和非酒精性脂肪性疾病等。尽管最近的研究发现了许多影响肝癌发展的基因和途径，但治疗和患者预后仍不能令人满意。
虽然已经进行了许多试验来治疗晚期HCC患者，但全身治疗，包括索拉非尼、来伐替尼或阿替唑珠单抗加贝伐珠单抗，是主要的治疗选择。索拉非尼的总有效率仅为2％，索拉非尼组的总中位生存期仅为10.7个月。伦伐替尼和阿替唑珠单抗联合贝伐珠单抗的疗效仍远未令人满意，尽管它略好于索拉非尼。这种情况突出了需要更多的治疗方法来提高HCC治疗的临床效益。
因此，有必要开发一种新的用于预防和/或治疗肝癌的药物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用，本申请发现通过索拉非尼和Cpd-63的药物联用，能够实现协同预防和/或治疗肝癌的药效。
本发明是这样实现的：
在本发明的第一方面，提供了联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用，所述联用药物组合物含有索拉非尼和Cpd-63，所述Cpd-63的结构式为：
进一步地，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移。
进一步地，所述索拉非尼与Cpd-63的质量比为1：1-4。优选地，所述索拉非尼与Cpd-63的质量比为1：1。
作为一种具体的实施方式，所述索拉非尼与所述Cpd-63的用药剂量均为10-50mg/kg，优选为30mg/kg。
进一步地，所述索拉非尼的应用浓度为1μM-50μM，所述Cpd-63的应用浓度为1μM-50μM。
在本发明的第二方面，提供了一种用于预防和/或治疗肝癌的药物，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物含有索拉非尼和Cpd-63，所述Cpd-63的结构式为：
进一步地，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物中含有效量的索拉非尼以及有效量的Cpd-63。
进一步地，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物含有药学上可接受的载体和/或辅料。所述辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的一种。
进一步地，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物的剂型选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂和分散剂中的一种。
在本发明的第三方面，提供了Cpd-63在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明通过大量的实验数据证明，Cpd-63能够抑制肝癌增殖活性。并进一步通过将索拉非尼和Cpd-63联用，能够对肝癌细胞产生协同抑制效果，也就是说，两药联用时对肝癌细胞的抑制作用强于两药单独使用时所发挥的抑制作用之和。因此可以作为联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中应用。
附图说明
图1为实施例1中单药Cpd-52和Cpd-63单药对不同肝癌细胞系的细胞的CCK8试验结果；其中，图1A为Cpd-52的结构式，图1B为Cpd-52对不同肝癌细胞系的细胞的CCK8试验结果；图1C为Cpd-63的结构式，图1D为Cpd-63对不同肝癌细胞系的细胞的CCK8试验结果；
图2为实施例2中单药Cpd-52和单药Cpd-63对肝癌细胞迁移和侵袭的影响的试验结果；其中，图2A为划痕实验结果，图2B为Transwell实验结果。
图3为实施例3中裸鼠体内治疗实验的结果；其中，图3A为裸鼠皮下瘤及治疗实验流程，图3B为肿瘤大小，图3C肿瘤体积和重量，图3D为Ki67增殖指标免疫组化染色，图3E为裸鼠尾静脉注射肝癌肺转移模型及治疗流程图，图3F为裸鼠活体成像结果，图3G为裸鼠肺组织HE染色结果及转移灶计数和大小统计。
图4为实施例4中Cpd-63、索拉非尼及其联用组对细胞生长情况测试结果；
图5为实施例4中Cpd-63、索拉非尼及其联用组对不同肝癌细胞系的细胞的CCK8试验结果；
图6为实施例4中联合指数分析结果；
图7为实施例5中单药Cpd-63、索拉非尼及其联用组对肝癌细胞迁移和侵袭的影响的试验结果；其中，图7A为划痕实验结果，图7B为Transwell实验结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
为了解决本发明的技术问题，本发明的总体思路如下：
Cpd-63，所述Cpd-63的结构式为：
Cpd-63为N-[5-(苯氧甲基)-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺衍生物，文献Identification of N-(5-(phenoxymethyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)acetamidederivatives as novel protein tyrosine phosphatase epsilon inhibitorsexhibiting anti-osteoclastic activity中发现了Cpd-63具有抗破骨细胞活性。
本申请通过实验发现Cpd-63能够抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移。
进一步地，将索拉非尼和Cpd-63联用，发现能够对肝癌细胞增殖产生协同抑制效果。Cpd-63可以提高索拉非尼的体外反应。
这些结果表明，Cpd-63可能是HCC治疗的一种潜在的治疗方法。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用进行详细说明。
本文所述的“联用”或“联合治疗组”等指的是两种或两种以上活性物质可以各自作为单一制剂同时地、或各自作为单一制剂以任何顺序依次地施用于受试者。
本文所述的“有效量”指的是包含足以预防或治疗医学病症的症状或疾病的量。在用于特定患者或医学受试者以后，可以产生以下变化：待治疗的病症、患者/受试者的总体健康情况得到改善。有效量还可以是至避免显著副作用或毒性作用的最大剂量以下的剂量方案。
本发明实施例的Cpd-63、Cpd-52通过药明康德公司合成。
实施例1、单药Cpd-52和单药Cpd-63对肝癌细胞增殖的影响
1、采用CCK8方法检测不同浓度单药Cpd-52(1μM、5μM、10μM、25μM、50μM)和单药Cpd-63(1μM、5μM、10μM、25μM、50μM)分别对不同肝癌细胞系(HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、HLF、MHCC-97H、HCC-LM3)增殖的影响，具体步骤为：
将处于指数级增长期的细胞用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到96孔培养板中(3000个/孔)。在培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，分别单独加入上述不同浓度的Cpd-52和Cpd-63，分别作用72h后终止培养，每孔加入10μl CCK8(5mg/mL)，37℃避光孵育1h，在酶标仪450nm波长下测定细胞光密度值，并按照下式计算细胞生存率：
生存率％＝【(实验组数值-空白组数值)÷(对照组数值-空白组数值)】×100％。
结果如图1所示，人肝癌细胞系中，Cpd-52单药和Cpd-63单药均显现出一定的抑制肝癌细胞增殖活性的作用，且随着药物浓度的增加，上述肝癌细胞系的细胞活性逐渐下降，且Cpd-63单药的效果好于Cpd-52单药。
实施例2、单药Cpd-52和单药Cpd-63对肝癌细胞迁移、侵袭的影响
1、划痕愈合实验
通过在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，然后在不同时间观察划痕“愈合”的情况评价肿瘤细胞迁移能力，具体步骤如下：将处于对数生长期人肝癌细胞系MHCC-97H以2.0×10 5个细胞数接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；待细胞密度达到80％后，用枪头在每个孔正中央由上到下划一道1cm左右的划痕，将培养液弃掉后，用PBS清洗3次，放入倒置显微镜进行拍照；将PBS弃掉后，分别用单药Cpd-52(10μM)和单药Cpd-63(10μM)处理人肝癌细胞系MHCC-97H，在培养箱中培养24h；弃掉上清后，用PBS洗涤2次后，放入倒置显微镜再次进行拍照，该实验重复三次。结果如图2A所示。
2、Transwell实验：
分别用0.01％ DMSO、单药Cpd-52和单药Cpd-63处理MHCC-97H细胞24小时，然后进行细胞迁移和侵袭试验。
将800μL含有10％胎牛血清的培养基添加到下室，并将100μL无血清培养基中的5x104细胞等分接种到上室。在37℃下孵育24小时后，用棉签从上表面刮去细胞膜，去除未迁移或未被入侵的细胞。过滤器下表面的细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15min，并在室温下用0.1％结晶紫染色1小时。在光学显微镜下计数细胞数。每个实验至少重复三次。
结果如图2所示，可知单药Cpd-52和单药Cpd-63，特别是Cpd-63，能显著抑制MHCC-97H细胞的迁移和侵袭。
实施例3、Cpd-63单药抑制肝癌裸鼠皮下瘤生长和肺转移
1、建立裸鼠肝癌皮下瘤模型
共使用20只雄性BALB/c裸鼠(5周龄)，每只裸鼠皮下注射100万个HCC-LM3细胞。两周后后分别给予对照溶剂、Cpd-52(30mg/kg/day)、Cpd-63(30mg/kg/day)、索拉非尼(30mg/kg/day)进行灌胃治疗4周，停药两周后处死裸鼠，解剖并完整取出肿瘤后进行拍照，同时称量裸鼠体重、肿瘤质量及体积。
结果如图3中所示，其中，图3B中示出了采用Cpd-52单药、Cpd-63单药、索拉非尼单药后裸鼠皮下肿瘤大小，可以看出，索拉非尼和Cpd-63单药、Cpd-52均可显著抑制皮下瘤的生长；与对照组相比，Cpd-52治疗组和Cpd-63治疗组的肿瘤体积和重量明显下降。在相同剂量(30mg/kg/day)下，Cpd-52或Cpd-63的效果均不低于索拉非尼。
2、建立裸鼠尾静脉注射肝癌肺转移模型
共使用15只雄性BALB/c裸鼠(5周龄)，每只裸鼠尾静脉注射100万HCC-LM3-Luc细胞，两周后后分别给予对照溶剂、Cpd-63(30mg/kg/day)、索拉非尼(30mg/kg/day)进行灌胃治疗4周，停药两周后进行活体成像检测肺转移情况，后处死小鼠分离并固定肺组织，测量肺转移结节数量和大小。
如图3F所示，活体成像荧光信号的分析显示，Cpd-63处理组的荧光强度明显低于对照组。Cpd-63处理组和索拉非尼处理组之间的生物发光方面没有显著差异。如图3G所示，Cpd-63处理组的肺结节数量和大小显著小于对照组。
总之，这些结果证明了Cpd-63在体内能有效地抑制HCC的生长和转移。
实施例4、Cpd-63与索拉非尼联用对肝癌细胞增殖的影响
1、采用细胞克隆实验检测索拉非尼、Cpd-63及其联用组对不同肝癌细胞生长的影响
将处于指数级增长期的MHCC-97H，用胰酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种到6孔培养板中，单药组每孔接种1500个细胞，联用组每孔接种2500个细胞；在培养箱中培养24h后，分别加入10μM Cpd-63单药、10μM索拉非尼单药及联用组，作用14天后终止培养，弃掉上清培养液，用PBS冲洗一次，加入0.25％结晶紫溶液，静置15min后用流水冲洗，待干拍照，然后进行克隆计数分析。
结果见图4，可以看出，Cpd-63和索拉非尼联合使用能更有效地抑制MHCC-97H细胞的集落形成。索拉非尼与Cpd-63药物联用可协同抑制肝癌细胞生长。
2、采用CCK8方法检测Cpd-63单药(浓度为10μM)、索拉非尼单药(浓度为10μM)、Cpd-63与索拉非尼联用组(Cpd-63、索拉非尼浓度均为10μM)对肝癌细胞系MHCC-97H和HCC-LM3增殖的影响。
结果如图5所示，索拉非尼与Cpd-63药物联用48h可协同抑制肝癌细胞的增殖，Cpd-63显著促进了索拉非尼对细胞活性的抑制作用。
3、同时，对上述试验结果进行了联合指数分析，其中联合指数(CI)即两种药物抑制浓度的分式之和，其计算公式为CI＝C 50A/IC 50A+C 50B/IC 50B；
式中，C 50A和C 50B分别指A、B两种药物联用达到50％抑制时的药物浓度，IC 50A和IC 50B分别指单用某一药物达到50％抑制时的药物浓度。
当CI＜1时，则两药联用具有协同作用；当CI＝1时，则两药联用具有相加作用；当CI＞1时，则两药联用具有拮抗作用。
Cpd-63与索拉非尼联合治疗组48h后的联合指数分析结果如图6所示，可以看出，Cpd-63与索拉非尼联用后，其CI均＜1，说明Cpd-63与索拉非尼联用后具有明显的协同效应，能够更好的抑制肝癌细胞的增殖。
实施例5、Cpd-63与索拉非尼联用对肝癌细胞迁移和侵袭的影响
我们对MHCC-97H细胞进行了Transwell试验和划痕愈合试验，以研究联合治疗的抗迁移作用。实验步骤同实施例2，Cpd-63单药、索拉非尼单药、联合治疗组剂量均为10μM。结果如图7所示，联合治疗组对MHCC-97H细胞的迁移和侵袭的抑制作用明显强于Cpd-63或索拉非尼治疗组。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.联用药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用，其特征在于，所述联用药物组合物含有索拉非尼和Cpd-63，所述Cpd-63的结构式为：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与转移。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述索拉非尼与Cpd-63的质量比为1：1-4。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述索拉非尼的应用浓度为1μM-50μM，所述Cpd-63的应用浓度为1μM-50μM。
5.一种用于预防和/或治疗肝癌的药物，其特征在于，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物含有索拉非尼和Cpd-63，所述Cpd-63的结构式为：
6.根据权利要求5所述的用于预防和/或治疗肝癌的药物，其特征在于，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物中含有效量的索拉非尼以及有效量的Cpd-63。
7.根据权利要求5所述的用于预防和/或治疗肝癌的药物，其特征在于，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物含有药学上可接受的载体和/或辅料。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗肝癌的药物的剂型选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂和分散剂中的一种。
9.Cpd-63在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
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