CN118256338A - 一种数字法全自动分子诊断微流控芯片及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种数字法全自动分子诊断微流控芯片及其使用方法，所述微流控芯片包括下盖和上盖，下盖和上盖密封固定连接，下盖上设有样本处理模块和扩增反应模块，其中，样本处理模块包括依次连通的样本室、混液室、第一废液池，以及与混液室和第一废液池分别连通的绝对定量室，且在混液室与第一废液池之间设有第一流道开关；扩增反应模块包括依次连通的相对定量室、试剂混匀池、反应检测池和第二废液池，其中相对定量室与混液室和第一废液池分别连通，且在相对定量室和混液室之间设有第二流道开关，反应检测池通过上表面能形成微反应单元的超导热嵌件与下盖注塑成型为一体构成。在上盖上设有若干开口，分别与样本室、混液室、试剂混匀池、废液池等对应连通。该微流控芯片具有成本低廉、操作简便、检测迅速精准等优势，有利于在分子诊断领域进行规模化、商业化的推广应用。

Description

一种数字法全自动分子诊断微流控芯片及其使用方法

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种数字法全自动分子诊断微流控芯片及其使用方法。

背景技术

近年来，数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术在产前诊断、肿瘤筛查、液体活检等疾病领域进行了广泛的应用，是一种十分有前景的数字法分子诊断技术。dPCR与传统荧光定量PCR不同，其无需依赖标准曲线和参考基因，而是直接检测目标序列的拷贝数，检测极限可达单拷贝，是一种核酸分子绝对定量技术，具有高灵敏度、绝对定量、高稳定性、可重复性的优势。dPCR的检测过程主要包括核酸提取、反应混合液分散、扩增反应及信号读取，传统的dPCR在上述每一步中都必须依赖专门且价格昂贵的仪器设备，整个实验过程需要在洁净的环境中通过人工完成，不仅步骤繁琐、实验耗时长，且由于是人为操作，样本容易受污染和产生操作误差，导致最终的检测数据的准确性较差。

因此，研发一种可以集样品的制备、反应液分散、反应扩增和荧光检测于一体的dPCR检测平台，使检测成本降低、检测速度加快、工作流程简化，并且使整个运作流程都在密闭空间进行，既不污染环境，待测样本又不被环境污染，进而使dPCR检测结果更具有可信度，同时也便于此技术路线更趋于规模化、商业化运作，是分子诊断领域期待已久的拓展平台，也是当前此领域亟需解决的问题。

微流控(microfluidics)技术的快速发展使上述问题的解决成为可能，其具有将生物、化学等实验室的基本功能诸如样品制备、分散、反应和检测等集成到一块几平方厘米的微流控芯片上的能力，在辅助设备的操控下可实现全自动完成分析过程。微流控芯片具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，使原本需要在专门的实验室才能完成的dPCR检测过程在任何地方都可以完成。目前，比较有代表性的有美国伯乐公司的QX-200数字PCR***，但是该***的集成度不够，液滴需要在不同仪器之间进行转移；其随后发布的数字PCR一体机***QX ONE将数字PCR的液滴制备及反应环节集成到一个***中，但是该***不具备核酸提取功能，且价格十分昂贵。另外具有代表性的还有赛默飞公司的QuantStudio 3D数字PCR***，该***同样没有将核酸提取和反应混合物的制备集成到***用芯片上。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种利用微流控技术，将核酸提取、反应混合液的制备、反应混合液的分散、目标序列的扩增、荧光信号的读取集为一体的数字法全自动分子诊断微流控芯片及其使用方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种数字法全自动分子诊断微流控芯片，包括下盖和上盖，所述上盖紧贴在所述下盖表面，所述下盖和上盖之间密封固定连接，所述下盖上设有样本处理模块和扩增反应模块，所述样本处理模块包括样本室、混液室、绝对定量室和第一废液池，其中，所述样本室、混液室和第一废液池依次连通，且在所述混液室和第一废液池之间设有第一流道开关，所述绝对定量室分别与所述混液室和第一废液池相连通；

所述扩增反应模块包括依次连通的相对定量室、试剂混匀池、反应检测池和第二废液池，其中，所述相对定量室分别与所述混液室和第一废液池相连通，且在所述相对定量室和混液室之间设有第二流道开关，所述反应检测池通过上表面能形成微反应单元的超导热嵌件与下盖注塑成型为一体构成；

所述上盖上设有开口，所述开口包括样本液加入口、裂解液加入口、加压口、洗涤液加入口、磁珠加入口、洗脱液加入口、混液室加压排气口、混匀池加压排气口、第一废液池排气口以及第二废液池排气口，其中，所述样本液加入口、裂解液加入口、加压口分别与所述样本室连通，所述洗涤液加入口、磁珠加入口、洗脱液加入口和混液室加压排气口分别与所述混液室连通，所述洗脱液加入口还与所述绝对定量室连通，且所述绝对定量室位于所述混液室与洗脱液加入口之间，所述混匀池加压排气口、第一废液池排气口、第二废液池排气口分别与所述试剂混匀池、第一废液池、第二废液池对应连通；

在与所述反应检测池位置对应的上盖上还设有透明视窗，用于读取扩增反应结束后的信号。

在本发明的一个优选实施方式中，所述超导热嵌件的导热系数大于5，在所述超导热嵌件的上表面进行亲水性或疏水性修饰。

在本发明的一个优选实施方式中，所述样本室内设有裂解吸释件，所述裂解吸释件用于吸释待测样本和裂解液，使两者充分接触裂解。

在本发明的一个优选实施方式中，所述上盖和下盖的材质均为高分子材料，所述高分子材料选自聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料中的一种或者几种的组合，且所述上盖为透明。

在本发明的一个优选实施方式中，所述上盖包括上盖板和中间密封件，所述中间密封件安装在所述上盖板和下盖之间，所述中间密封件上设有与所述开口对应的通孔以及与所述反应检测池和透明视窗位置相对应的视窗孔位，还设有与所述下盖相应位置相配合的第一流道开关和第二流道开关。

在本发明的一个优选实施方式中，所述中间密封件为软胶膜，所述软胶膜的材质为软体材料。

在本发明的一个优选实施方式中，所述超导热嵌件上表面形成的微反应单元为蜂窝状的微小孔，所述微小孔的数量大于8000个，所述微小孔的深度大于0.01μm，所述微小孔的体积小于0.15nL，所述微小孔的形状为六边形、正方形、圆形或三角形。

在本发明的一个优选实施方式中，所述超导热嵌件上表面形成的微反应单元为通过液滴生成技术形成的微液滴，所述微液滴的数量大于10000个，所述微液滴的体积小于0.15nL。

在本发明的一个优选实施方式中，在所述反应检测池与试剂混匀池、第二废液池之间分别设有流道塞子。

本发明另一方面还提供了一种上述微流控芯片的使用方法，包括以下步骤：

步骤1，向样本室中加入待测样本和裂解液，对待测样本进行裂解；

步骤2，将裂解后的待测样本液压入混液室，采用磁珠法对待测样本进行目的片段的提取；

步骤3，基于预实验，通过绝对定量室控制洗脱目的片段的洗脱液体积，获得已知浓度的含有目的片段的待测液体；

步骤4，将含有目的片段的待测液体依次压入相对定量室和试剂混匀池，与试剂混匀池中的诊断试剂混匀获得反应混合液；

步骤5，将试剂混匀池中的反应混合液压入反应检测池超导热嵌件的微反应单元中并进行加热扩增反应，反应结束后通过透明视窗读取荧光信号，进行统计分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的数字法全自动分子诊断微流控芯片将dPCR检测的整个操作过程，包括核酸提取、反应混合液制备、反应混合液分散、目标序列扩增、荧光信号读取，集成在一张芯片上，技术人员只需将待测样本加入芯片，再将芯片放入辅助设备中即可，后续工作流程全部由辅助设备全自动完成，无需繁琐且具有挑战性的实验操作。使用本发明的技术，第一，可以节约时间，快速获得检测结果；第二，可以避免人为操作造成的实验误差，使检测结果更精确；第三，整个检测过程在封闭的芯片中完成，样本不易受污染，也不会污染环境，原本需要在专门的实验室才能完成的检测过程在任何地方都可以完成；第四，样本和试剂的需求量少，由于微流控芯片的体积小，所需样本量和试剂量也大大减少，一方面对于珍贵或难以获取的样本尤为重要，另一方面试剂量的减少降低了检测成本。

(2)由于数字法分子诊断的原理是将待测试剂分割成若干微小的反应单元，每个单元包含或不包含目标序列，从而实现对目标序列的绝对定量，因此微反应单元越多，检测的灵敏度和精度越高。本发明提供的数字法全自动分子诊断微流控芯片，其反应检测池中的微反应单元可达上万个，进一步提高了检测的灵敏度和精度。

(3)本发明首次将多种不同形式微反应单元生成(蜂窝状微小孔、微液滴)的嵌入式超导热体与高分子材料的嵌入组合注塑工艺用于数字法全自动分子诊断微流控芯片上，超导热体可以迅速将温度传递给反应混合液，一方面节约了扩增时间，另一方面保证了扩增温度的精确性，从而进一步提高了检测结果的准确性。

(4)本发明提供的数字法全自动分子诊断微流控芯片可以通过流水线实现大规模生产，同时其辅助设备不需要依赖昂贵的进口设备，可以大大降低检测成本。

附图说明

图1为实施例1的微流控芯片结构示意图；

图2为实施例1的微流控芯片正面示意图；

图3为实施例1的微流控芯片侧面示意图；

图4为实施例1的微流控芯片组装结构示意图；

图5为实施例2的微流控芯片结构示意图。

图中：1、下盖；11、样本室；12、混液室；13、第一废液池；14、绝对定量室；15、相对定量室；16、试剂混匀池；17、反应检测池；170、超导热嵌件；171、微小孔；172、微液滴；18、第二废液池；19、感应器；2、上盖；201、上盖板；202、中间密封件；2021、视窗孔位；21、样本液加入口；22、裂解液加入口；23、加压口；24、洗涤液加入口；25、磁珠加入口；26、洗脱液加入口；27、混液室加压排气口；28、混匀池加压排气口；29、第一废液池排气口；210、第二废液池排气口；211、透明视窗；212、避空孔；301、第一流道开关；302、第二流道开关；303、流道塞子。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更加清楚完整，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，都属于本发明保护的范围。

需要理解的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，一体地连接，也可以是可拆卸连接；可以是两个元件内部的连通；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种数字法全自动分子诊断微流控芯片，结构如图1-4所示，包括下盖1和上盖2，上盖2紧贴在下盖1表面，下盖1和上盖2之间密封固定连接，具体可以是通过本领域中常规的粘接、焊接、键合或者嵌合方式连接在一起。其中，下盖1和上盖2的材质均为高分子材料，可以是聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料(ABS)中的一种或者几种的组合，需要特别说明的是，为了实现荧光检测的目的，上盖2须采用高透光材质，而下盖1则没有特别的限定。

如图1所示，本实施例中，在下盖1上设有样本处理模块和扩增反应模块，样本处理模块和扩增反应模块的功能实现均需要下盖1和上盖2的相互配合。样本处理模块包括开设在下盖1上的样本室11、混液室12、绝对定量室14和第一废液池13，其中，样本室11、混液室12和第一废液池13依次通过微流道相连通，且在混液室12和第一废液池13之间的微流道上设有第一流道开关301，绝对定量室14一端与混液室12通过微流道连通，另一端与第一废液池13通过微流道连通。

扩增反应模块包括开设在下盖1上的相对定量室15、试剂混匀池16、反应检测池17和第二废液池18，相对定量室15、试剂混匀池16、反应检测池17和第二废液池18通过微流道依次相连通，其中，反应检测池17通过上表面能形成微反应单元的超导热嵌件170与下盖1注塑成型为一体构成，相对定量室15一端与混液室12通过微流道连通，另一端与第一废液池13通过微流道连通，且在相对定量室15和混液室12之间的微流道上设有第二流道开关302。需要说明的是，反应检测池17的数量没有特别的限定，至少为一个，具体的数量可根据检测需要以及芯片尺寸进行调整，如两个、三个、四个、八个等，相应地，试剂混匀池16和相对定量室15的数量依反应检测池17进行调整，与其保持一致，在本实施例的芯片结构中分别设有四个反应检测池17、试剂混匀池16和相对定量室15。此外，上述微流道均为开设在下盖1表面的细孔道，该细孔道在上盖2的覆盖下，形成密封的微流道空间。需要指出的是，各结构的具***置可根据实际需要进行调整，没有特别的限定。

如图1-2所示，在上盖2上设有若干开口，包括样本液加入口21、裂解液加入口22、加压口23、洗涤液加入口24、磁珠加入口25、洗脱液加入口26、混液室加压排气口27、混匀池加压排气口28、第一废液池排气口29以及第二废液池排气口210，其中，样本液加入口21、裂解液加入口22、加压口23分别与样本室11连通；洗涤液加入口24、磁珠加入口25、洗脱液加入口26和混液室加压排气口27分别与混液室12连通，洗脱液加入口26还与绝对定量室14连通，且绝对定量室14位于混液室12与洗脱液加入口26之间；混匀池加压排气口28、第一废液池排气口29和第二废液池排气口210分别与试剂混匀池16、第一废液池13、第二废液池18对应连通。上述开口的具体数量和位置可根据需要进行调整，且其功能也可根据需要调整为加液口、加压口、排气口或者几种功能的组合。此外，在与下盖1反应检测池17位置对应的上盖2上还设有透明视窗211，以便用于读取反应结束后的信号。

值得注意的是，结合图1-4，在本实施例中，上盖2由上盖板201和中间密封件202组成，通过中间密封件202实现对下盖1上各凹槽(如样本室11、混液室12、第一废液池13等)和微流道的密封，使之与外界空气隔绝。中间密封件202安装在上盖板201与下盖1之间，其上设有相应于上盖板201上各开口(如样本液加入口21、裂解液加入口22、加压口23等)的通孔，以及与下盖1反应检测池17和上盖板201透明视窗211位置相对应的视窗孔位2021。需要说明的是，第一流道开关301和第二流道开关302均由下盖1与中间密封件202组构而成，如图1和图4所示，下盖1上的微流道在相应位置处设有断开点，而中间密封件202的相应位置处设有与断开点相配合的开关结构，从而构成对微流道进行控制的开关元件。此外，上盖板201上还设有与第一流道开关301和第二流道开关302位置相对应的避空孔212。本实施例中，中间密封件202为软胶膜，其材质为软体材料，不限于硅胶。在其他实施例中，上盖板201和中间密封件202可以是不可分割的一体化结构，此时，上盖2在与下盖1凹槽和微流道的对应位置处均设有硅胶等软体材料，其目的是形成密封空间，阻断与外界联系。

具体地，样本室11用于收集待测样本并对待测样本进行裂解，待测样本可以是全血样本、咽试液等。样本室11内设有裂解吸释棉，裂解吸释棉具有亲水作用，用于吸收待测样本和裂解液，使得待测样本与裂解液充分接触裂解。如图1和图2所示，在与样本室11位置对应的上盖2上设有样本液加入口21，可通过样本液加入口21向样本室11中加入待测样本。在上盖2上还设有裂解液加入口22和加压口23，分别通过微流道与样本室11相连通，加压口23的作用在于通过压力驱动将样本室11内裂解的样本液压入混液室12中，以进行下一步的目的片段提取工作。

进一步地，混液室12与样本室11通过微流道连通，混液室12用于对待测样本进一步裂解，并对裂解后的样本液进行目的片段的提取。本实施例中，在混液室12中采用磁珠法对待测样本进行目的片段的提取，结合图1、图2和图4，在上盖2上分别设有与混液室12连通的洗涤液加入口24、磁珠加入口25和洗脱液加入口26，且这三个加样口与同一条微流道连通，其中洗脱液加入口26位于最上游，其他两个加样口的位置没有特殊要求，同时该洗脱液加入口26是多功能孔，既可以加液，也可以切换为加压口或排气口。在其他一些实施例中，洗涤液加入口24、磁珠加入口25也可以与混液室12单独连通。此外，在混液室12中还设置有电磁铁，电磁铁通电后可以对磁珠进行吸附，便于后续的洗涤、洗脱操作，电磁铁可以设置在混液室12的外底部，也可以设置在外侧壁，位置没有特殊要求。如图1-2所示，在上盖2上还设有混液室加压排气口27，其作用是对混液室12内加压，通过压力驱动液体的流动。

需要理解的是，如图1所示，将绝对定量室14设于混液室12和洗脱液加入口26之间，设置绝对定量室14的目的在于，基于预实验精确控制洗脱磁珠上吸附的目的片段的洗脱液体积，以便使得到的待测液体中目的片段的浓度可知，因此，绝对定量室14的容积是确定的。同时，绝对定量室14还通过微流道与第一废液池13连通，用于将多余的洗脱液排入第一废液池13中。

进一步地，如图1所示，第一废液池13与混液室12通过微流道连通，在该微流道上设有第一流道开关301，用于控制两者之间的连通或关闭。第一废液池13用于收集混液室12中目的片段提取过程中产生的废液，值得注意的是，在本实施例中，将第一废液池13设计为多阶梯形式，如图4所示，第一废液池13由三个依次相连通的一级废液池、二级废液池和三级废液池组成，其中，在二级废液池的两侧边处开设有下凹的连通豁口，以避免操作中废液从排气口溢出。在其他实施例中，也可以根据需要只保留一级废液池和二级废液池。

由于不同诊断试剂需要的核酸模板量各有差异，因此在混液室12与试剂混匀池16之间设有相对定量室15，相对定量室15的容积依据诊断试剂的要求以及待测液体中目的片段的浓度设定。如图1所示，本实施例中的四个相对定量室15的结构和大小均相同，依次连通，且位于一端的相对定量室15通过微流道与混液室12连通，在该微流道上设有第二流道开关302，用于控制两者之间的连通或关闭，位于另一端的相对定量室15通过微流道与第一废液池13连通，该结构使含有目的片段的待测液体从混液室12依次流入相对定量室15，直至填满最后一个相对定量室15，多余的液体排入第一废液池13。

进一步地，如图1所示，本实施例中，位于相对定量室15和反应检测池17之间的试剂混匀池16用于在扩增检测之前将含有目的片段的待测液体和诊断试剂进行混匀。在与试剂混匀池16位置对应的上盖2上设有混匀池加压排气口28，其同样是一个多功能孔，既可以加液，又可以加压和排气。本实施例中的诊断试剂是预埋在试剂混匀池16中的冻干球，诊断试剂也可以在检测过程中通过混匀池加压排气口28加入。

进一步地，反应检测池17用于目标序列的扩增和荧光信号的读取，如图1所示，本实施例中，反应检测池17通过对应的微流道与试剂混匀池16连通，通过对混匀池加压排气口28加压，使含有目的片段的待测液体与诊断试剂混匀得到的反应混合液进入对应的反应检测池17中。结合图1和图4，本实施例中超导热嵌件170上表面形成的微反应单元为蜂窝状的微小孔171，数量大于8000个，深度大于0.01μm，每个微小孔171的体积小于0.15nL。微小孔171的形状没有限制，可以是六边形、正方形、圆形、三角形等。扩增时，超导热嵌件170可以迅速将温度传递给反应混合液，提高扩增速度和精度。作为优选，超导热嵌件170的导热系数大于5。

需要特别说明的是，由于蜂窝状的微小孔171经过亲水性修饰，当反应混合液从试剂混匀池16经微流道流入反应检测池17后，可以将每一个微小孔171都填满，多余的反应混合液最后经微流道流入第二废液池18。可以为每一个反应检测池17配备一个废液池，在其他实施例中，多个反应检测池17也可以共用一个废液池。

本实施例的数字法全自动分子诊断微流控芯片的工作流程及原理如下：

(1)将待测样本液从样本液加入口21滴入样本室11中的裂解吸释棉上，随后，将芯片***辅助设备的芯片口，芯片上设有感应器19，可以帮助确定芯片是否放置到位，芯片的试剂混匀池16中预埋有诊断试剂冻干球，辅助设备盖好盖进行运行，之后的程序均在辅助设备的控制下自动进行；

(2)从裂解液加入口22加入规定体积的裂解液，辅助设备提供振动功能约2秒后，对加压口23加压，把裂解的样本液压入混液室12；此过程中裂解液首先流入样本室11的裂解吸释棉上与样本接触，振动功能可以使裂解液对样本进行充***解；

(3)从磁珠加入口25加入规定量的磁珠液，辅助设备提供振动功能约2秒后，给位于混液室12外底部的电磁铁通电，打开电磁铁功能约2秒后关闭振动功能；此过程中，磁珠液流入混液室12中，振动功能可以使磁珠充分吸附裂解的样本液中的目的片段，电磁铁功能将磁珠吸附在混液室12底部；

(4)打开第一流道开关301和第一废液池排气口29，第二流道开关302处于关闭状态，对加压口23加压，将混液室12中的废液经废液专用的微流道压入到第一废液池13中，待废液排干净后，关闭电磁铁功能，释放磁珠；

(5)从洗涤液加入口24加入规定体积的洗涤液，辅助设备提供振动功能约2秒后打开电磁铁功能，约2秒后再关闭振动功能；此过程中，洗涤液流入混液室12，振动功能可以使洗涤液对带有目的片段的磁珠进行充分洗涤，电磁铁功能将磁珠再次吸附在混液室12底部；

(6)给加压口23加压，将混液室12中的废液再次经废液专用的微流道压入第一废液池13中，待废液排干净后，关闭电磁铁功能释放磁珠，同时关闭第一流道开关301和第一废液池排气口29；

(7)打开混液室加压排气口27的排气阀，再将洗脱液加入口26切换为气体加入状态，通过洗脱液加入口26给微流道加压，将微流道中的残留液体清除到混液室12中；之后，打开电磁铁功能，关闭混液室加压排气口27的排气阀，再打开第一流道开关301和第一废液池排气口29，给加压口23加压，将残留液体经废液专用的微流道排入第一废液池13，关闭电磁铁功能；

(8)关闭第一流道开关301，第一废液池排气口29仍为排气状态，将洗脱液加入口26切换为液体加入状态，加入大于规定量的洗脱液到绝对定量室14，多余的洗脱液经绝对定量室14上方的微流道流入第一废液池13中；

(9)将洗脱液加入口26切换为气体加入状态，通过洗脱液加入口26给微流道加压，将微流道中的残留液体全部压入第一废液池13中；

(10)打开混液室加压排气口27的排气阀，关闭第一废液池排气口29，通过给洗脱液加入口26加压，将绝对定量室14中的洗脱液全部压入混液室12中，设备振动功能打开约2秒后，打开电磁铁功能，约2秒后关闭振动功能；此过程中，振动功能使磁珠吸附的目的片段被洗脱液充分洗脱下来，电磁铁功能将磁珠吸附在混液室12底部；

(11)打开第一废液池排气口29和第二流道开关302，将混液室加压排气口27切换为气体加压状态，将洗脱下来的含有目的片段的待测液体经提纯液专用的微流道且经过四个相对定量室15后流入第一废液池13中，并将微流道中的残留液体全部清除干净；

(12)关闭第一废液池排气口29，首先打开相对定量室15与混液室12连通一端的试剂混匀池16上的混匀池加压排气口28，通过给混液室加压排气口27加压，将相对定量室15中的全部含有目的片段的待测液体压入与之对应的试剂混匀池16；随后，关闭该混匀池加压排气口28，依次打开下一个混匀池加压排气口28，将对应的相对定量室15中的全部含有目的片段的待测液体压入试剂混匀池16，依次操作，直至将所有相对定量室15中的全部含有目的片段的待测液体压入相应的试剂混匀池16，之后关闭所有的混匀池加压排气口28和第二流道开关302；打开振动模式，促使芯片振动，让目的片段与诊断试剂充分混匀，形成反应混合液；

(13)打开第二废液池排气口210，将混匀池加压排气口28切换为气体加压状态，给试剂混匀池16加压，将试剂混匀池16中的反应混合液顺着微流道流入对应的反应检测池17，由于反应检测池17上的蜂窝状微小孔171经过亲水性修饰，因此反应混合液流经反应检测池17后可以将每一个微小孔171都填满，多余的反应混合液经微流道排入第二废液池18中；

(14)由辅助设备提供循环扩增反应所需的温度条件，完成所有的循环扩增反应，随后再由辅助设备通过透明视窗211读取反应检测池17内的荧光信息，进行分析处理；反应所需的循环次数按照诊断试剂所规定的要求设定，待反应结束后，芯片自动弹出。

实施例2

如图1-5所示，本实施例提供的数字法全自动分子诊断微流控芯片的结构与实施例1基本相同，区别在于，本实施例中反应检测池17的超导热嵌件170上表面为光洁镜面，并做疏水性修饰，其上的微反应单元为通过阶梯乳化技术(Assembled Step EmulsificationDevice for Multiplex Droplet Digital PCR[J].Analytical Chemistry,2019,91(3).DOI:10.1021/acs.analchem.8b04313.)生成的微液滴172，每个反应检测池17中的微液滴172数量大于10000个，单个微液滴172体积小于0.15nL。具体地，在反应检测池17的超导热嵌件170周边设有形成微液滴的结构，当试剂混匀池16中水相的反应混合液流入反应检测池17超导热嵌件170上表面的油相时，会不断生成独立的油包水微液滴172球体，故在芯片封装时需将油相预置在反应检测池17的超导热嵌件170上表面，同时，多余的水相反应混合液经微流道排入第二废液池18。需要说明的是，超导热嵌件170上表面与上盖2配合形成腔体，腔体的空间距离(超导热嵌件170上表面与上盖2下表面之间)须不大于所形成微液滴172的直径的1/5，其目的在于防止微液滴172在形成过程中产生堆叠造成检测误差。此外，反应检测池17与第二废液池18之间的微流道的宽度也应小于微液滴172的直径的1/3，避免微液滴172大量流失。进一步地，为了保证芯片在储存和运输过程中油相不会外溢，在反应检测池17两端的微流道上均设有流道塞子303。

相应地，本实施例的数字法全自动分子诊断微流控芯片的工作流程及原理与实施例1基本相同，区别在于反应混合液的分散方式不同，即辅助设备首先打开流道塞子303，反应混合液经微流道被压入反应检测池17时，利用阶梯乳化技术形成数万个含有一份或不含有目的片段的微液滴172，多余的水相反应混合液排入第二废液池18，之后再进行扩增反应和荧光信号读取。

Claims (10)

1.一种数字法全自动分子诊断微流控芯片，包括下盖(1)和上盖(2)，所述上盖(2)紧贴在所述下盖(1)表面，所述下盖(1)和上盖(2)之间密封固定连接，其特征在于，所述下盖(1)上设有样本处理模块和扩增反应模块，所述样本处理模块包括样本室(11)、混液室(12)、绝对定量室(14)和第一废液池(13)，其中，所述样本室(11)、混液室(12)和第一废液池(13)依次连通，且在所述混液室(12)和第一废液池(13)之间设有第一流道开关(301)，所述绝对定量室(14)分别与所述混液室(12)和第一废液池(13)相连通；

所述扩增反应模块包括依次连通的相对定量室(15)、试剂混匀池(16)、反应检测池(17)和第二废液池(18)，其中，所述相对定量室(15)分别与所述混液室(12)和第一废液池(13)相连通，且在所述相对定量室(15)和混液室(12)之间设有第二流道开关(302)，所述反应检测池(17)通过上表面能形成微反应单元的超导热嵌件(170)与下盖(1)注塑成型为一体构成；

所述上盖(2)上设有开口，所述开口包括样本液加入口(21)、裂解液加入口(22)、加压口(23)、洗涤液加入口(24)、磁珠加入口(25)、洗脱液加入口(26)、混液室加压排气口(27)、混匀池加压排气口(28)、第一废液池排气口(29)以及第二废液池排气口(210)，其中，所述样本液加入口(21)、裂解液加入口(22)、加压口(23)分别与所述样本室(11)连通，所述洗涤液加入口(24)、磁珠加入口(25)、洗脱液加入口(26)和混液室加压排气口(27)分别与所述混液室(12)连通，所述洗脱液加入口(26)还与所述绝对定量室(14)连通，且所述绝对定量室(14)位于所述混液室(12)与洗脱液加入口(26)之间，所述混匀池加压排气口(28)、第一废液池排气口(29)、第二废液池排气口(210)分别与所述试剂混匀池(16)、第一废液池(13)、第二废液池(18)对应连通；

在与所述反应检测池(17)位置对应的上盖(2)上还设有透明视窗(211)，用于读取扩增反应结束后的信号。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述超导热嵌件(170)的导热系数大于5，在所述超导热嵌件(170)的上表面进行亲水性或疏水性修饰。

3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述样本室(11)内设有裂解吸释件，所述裂解吸释件用于吸释待测样本和裂解液，使两者充分接触裂解。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述上盖(2)和下盖(1)的材质均为高分子材料，所述高分子材料选自聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料中的一种或者几种的组合，且所述上盖(2)为透明。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述上盖(2)包括上盖板(201)和中间密封件(202)，所述中间密封件(202)安装在所述上盖板(201)和下盖(1)之间，所述中间密封件(202)上设有与所述开口对应的通孔以及与所述反应检测池(17)和透明视窗(211)位置相对应的视窗孔位(2021)，还设有与所述下盖(1)相应位置相配合的第一流道开关(301)和第二流道开关(302)。

6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述中间密封件(202)为软胶膜，所述软胶膜的材质为软体材料。

7.根据权利要求1-6任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述超导热嵌件(170)上表面形成的微反应单元为蜂窝状的微小孔(171)，所述微小孔(171)的数量大于8000个，所述微小孔(171)的深度大于0.01μm，所述微小孔(171)的体积小于0.15nL，所述微小孔(171)的形状为六边形、正方形、圆形或三角形。

8.根据权利要求1-6任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述超导热嵌件(170)上表面形成的微反应单元为通过液滴生成技术形成的微液滴(172)，所述微液滴(172)的数量大于10000个，所述微液滴(172)的体积小于0.15nL。

9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，在所述反应检测池(17)与试剂混匀池(16)、第二废液池(18)之间分别设有流道塞子(303)。

10.一种权利要求1-9任一项所述的微流控芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，向样本室(11)中加入待测样本和裂解液，对待测样本进行裂解；

步骤2，将裂解后的待测样本液压入混液室(12)，采用磁珠法对待测样本进行目的片段的提取；

步骤3，基于预实验，通过绝对定量室(14)控制洗脱目的片段的洗脱液体积，获得已知浓度的含有目的片段的待测液体；

步骤4，将含有目的片段的待测液体依次压入相对定量室(15)和试剂混匀池(16)，与试剂混匀池(16)中的诊断试剂混匀获得反应混合液；

步骤5，将试剂混匀池(16)中的反应混合液压入反应检测池(17)超导热嵌件(170)的微反应单元中并进行加热扩增反应，反应结束后通过透明视窗(211)读取荧光信号，进行统计分析。