CN117778174A - 一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片及其测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微流控芯片技术领域，具体涉及一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片及其测试方法。本发明设计的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，将分子、生化、免疫检测项目集中于同一块芯片上，实现单样本多靶标的联合检测。该芯片克服了现有分子、生化、免疫检测方法需要专业人员操作、耗费时间长、成本高的缺点。该芯片兼具样本前处理、通用试剂定量分配、特异性试剂不干扰添加等基本操作，具有尺寸小、检测通量高、低损耗、可一次检测多项目、单样本多靶标检测等的优点，易于实现设备的微型化和自动化，从而降低检测成本。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，具体涉及一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片及其测试方法。
背景技术
分子诊断是医院检验学科的重要分支。目前，荧光定量PCR扩增技术是最广泛应用的分子诊断技术。然而，实时荧光定量PCR耗时较长、设备要求严格，并且操作要求高。此外，PCR过程中可能会产生气溶胶污染，对实验结果造成影响。同时，荧光定量PCR只能对样本进行单一靶标的检测，可能会漏检感染性疾病。使用微流控技术结合CRISPR检测技术可以解决上述问题。这种技术可以节省小型医院的检测成本和患者样本的检测时间，实现对单个样本进行多个靶标的检测，从而辅助医生更好地判断病情。
大型医院通常使用化学发光免疫分析仪进行免疫学相关疾病的检测。然而，这些设备体积庞大、价格昂贵、检测项目单一，这导致小型医院和急诊等由于成本和场地的限制，限制了小型医院或急诊检验科的使用，从而延误了患者的诊断和治疗。利用微流控技术进行检测是一种替代方法。微流控技术结合光激化学发光技术可以节省小型医院的检测成本和患者样本的检测时间。光激化学发光（Light initiated chemiluminescence assay，LICA）是一种均相免洗的新型化学发光技术。它主要依赖于供体微球和受体微球的相互作用，当抗体和抗原结合时，这两个微球会相互接近，形成能量传递链。在受到680nm激光激发后，供体微球内部的光敏剂将周围环境中的氧气转化为活跃的单体氧，单体氧在200nm范围内扩散至受体微球表面，引发一系列级联放大的化学发光反应，最终使受体微球上的发光材料产生615nm的荧光信号。LICA技术具有明显的优势：反应均一充分，结果重复性好；操作简便，检测速度快；具有较高的灵敏度和较宽的检测范围；很少受到血红蛋白、胆红素等杂质对检测信号的干扰，几乎不产生非特异性荧光，因此具有较好的检测特异性。
医院生化检测通常使用大型生化分析仪，其中最广泛应用的是自动生化分析仪。然而，自动生化分析仪设备庞大、操作复杂，价格昂贵，限制了小型医院或实验室的使用。利用微流控技术实现生化试剂的定量顺序释放可以显著降低生化诊断仪器的需求。这种技术可以解决生化检测耗时长、成本高和设备复杂等问题。通过微流控芯片和精确控制微小流体流动，可以实现生化试剂的精确定量释放，从而提高检测效率和准确性。微流控技术的应用可以简化检测流程，减少设备需求，并降低成本。因此，利用微流控技术可以有效解决生化诊断中的时间、成本和设备复杂性等问题。
微流控技术是利用微米尺度的微管道操控微升级体积流体的技术。离心式微流控芯片的主要优点是通过调节旋转频率可以轻松调节离心力的大小，从而精确控制从纳升到数百微升的液体，实现试剂的定向分配。然而目前现有的离心式微流控芯片，在流体控制精度方面，仍然面临挑战。需要采用复杂的几何设计和表面涂层技术，才能保证微阀门和微泵的制造精度和稳定性。在某些情况下，由于纳米制造技术的限制，微阀门的封闭性能可能受到微观尺度的表面粗糙度或材料的变化而影响，从而导致流体控制的误差。微阀门在快速响应和准确控制上存在不足，导致不稳定的诊断结果。尽管纳米压印技术可以实现高分辨率的芯片制造，纳米技术和自组装等复杂制造工艺依然可能导致生产成本高昂、生产过程不稳定、设备庞大，限制了大规模生产的可行性，一些新型材料的制备和应用也可能受到技术成本的制约。同时，当前单样本多靶标、单设备多项目仪器缺乏。现有的检测设备多数只能实现单靶标检测，且需要机械臂带动进行加样移液，导致仪器体积庞大，只能在大型检测实验室进行操作。设计一个集分子、生化和免疫诊断于一体的离心微流控芯片，实现多个应用的兼容，一般需要不同的微通道结构和流体控制参数，微流控芯片在多样品处理时需要更频繁的清洗和维护，导致成本的增加及潜在的交叉污染。
现有的用于病原体分子诊断的微流控芯片如公开号为CN202211683291.X的中国专利公开所述整体外观和立体结构包括，旋钮、上盖子、检测窗口、固定底座、减震垫、电机、转盘、控制板、电源开关、加热膜。其中仪器的组成：电机固定在固定底座上，固定底座下方贴有减震垫，固定底座上设有透明检测窗口；但是，上述专利公开的离心式微流控芯片无法实现微流控芯片中流体的多步顺序释放及同时兼容多项目检测。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片及其测试方法。本发明设计一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，将分子、生化、免疫检测项目集中于同一块芯片上，实现单样本多靶标的联合检测。该芯片克服了现有分子、生化、免疫检测方法需要专业人员操作、耗费时间长、成本高的缺点。通过不同的离心转速实现试剂的按需顺序释放和高通量定量分配，使其易于自动化和小型化，满足临床小样本急诊、小型医院的分子、生化、免疫多种应用场景诊断需求。该芯片兼具样本前处理、通用试剂定量分配、特异性试剂不干扰添加等基本操作，具有尺寸小、检测通量高、低损耗、可一次检测多项目、单样本多靶标检测等的优点，易于实现设备的微型化和自动化，从而降低检测成本。在基层医院和急诊检验领域，该技术有着巨大的应用前景，尤其在传染病检测方面有着重要意义。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，包括多个微流控芯片单元，所述微流控芯片单元包括：
弧形定量分配通道单元1，所述弧形定量分配通道单元1包括分配通道101，分配通道101外侧设置有定量腔组件；分配通道101两端分别设有暂存腔103和废液腔104，废液腔104的端部设置有透气孔105；其中，定量腔组件包括第一定量腔109和多个第二定量腔102，第一定量腔109的端部设置有第一顶部连接微孔106，第二定量腔102的端部设置有第二顶部连接微孔107，第二定量腔102的靠近分配通道的端部设置有底部连接微孔108；
加样单元2，设置在弧形定量分配通道单元1内侧靠近暂存腔103，与分配通道101相连接；所述加样单元2包括上清虹吸腔201，上清虹吸腔201靠近分配通道101一端设置有沉淀处理腔202，且上清虹吸腔201与沉淀处理腔202一体成型；上清虹吸腔201远离分配通道101一端设置有加样孔203；靠近沉淀处理腔202的上清虹吸腔201上设置有加样单元虹吸阀204；
通用试剂定量分配单元3，设置在靠近加样单元2一侧，与分配通道101相连接；所述通用试剂定量分配单元3包含通用试剂暂存腔301，通用试剂暂存腔301靠近分配通道101一端设置有通用试剂定量分配单元虹吸阀302，通用试剂暂存腔301远离分配通道101一端设置有加液孔303；
选择性试剂溶液定量存放单元4，设置在与加样单元2同侧，从靠近暂存腔103的第二个定量腔102开始一一对应，与底部连接微孔108连接；所述选择性试剂溶液定量存放单元4包含选择性试剂室401，选择性试剂室401远离分配通道101一端设置有选择性试剂溶液定量存放单元加液孔402，选择性试剂室401靠近分配通道101一端设置有选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403；
混合反应单元5，设置在与定量腔组件同侧，与顶部透气微孔106、107相连接，与定量腔组件一一对应；所述混合反应单元5包含壶型反应室501，含壶型反应室501一端设置有混合反应单元加样孔502和混合反应单元虹吸阀503。
进一步地，所述分配通道101、加样单元虹吸阀204、通用试剂定量分配单元虹吸阀302、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403和混合反应单元虹吸阀503的内壁设置有亲水性涂层。
进一步地，所述废液腔104为椭圆型。
进一步地，所述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，包括下底A、虹吸阀层B，隔离层C，腔室层D，上盖E，从下到上分别为下底A、虹吸阀层B，隔离层C，腔室层D，上盖E，依次叠置压合。
进一步地，同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的中心设置有中心定位孔6，同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的周向边缘设置有多个定位孔7，用于离心微流控芯片的定位及离心。
进一步地，加样单元虹吸阀204、通用试剂定量分配单元虹吸阀302、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403和混合反应单元虹吸阀503均设置于虹吸阀层B。
进一步地，暂存腔103、第一顶部连接微孔106、第二顶部连接微孔107、底部连接微孔108均设置在隔离层C；上清虹吸腔201、沉淀处理腔202、通用试剂暂存腔301、选择性试剂室401、壶型反应室501均设置在隔离层C并贯穿腔室层D。
进一步地，分配通道101、透气孔105、第一定量腔109、多个第二定量腔102、混合反应单元加样孔502均设置在腔室层D，透气孔105和混合反应单元加样孔502贯穿上盖E；分配通道101左侧膨大的腔室与暂存腔103形状一致。
进一步地，加样孔203、加液孔303、选择性试剂溶液定量存放单元加液孔402均设置于上盖E。
进一步地，所述下底A为0.4 mm厚的亚克力板（PMMA）；虹吸阀层B为0.3 mm厚的亚克力板（PMMA）；隔离层C为0.1 mm厚的聚丙乙烯薄膜；腔室层D为2 mm厚的亚克力板（PMMA）；上盖E为0.4 mm厚的亚克力板（PMMA）。
一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、利用AutoCAD软件设计出所需芯片的模型，优化模型直到实现所需的功能；
步骤2、利用激光雕刻机雕刻出所述的微流控芯片各部分；
步骤3、将各层做亲水性修饰后按顺序组装在一起，并用热压机压紧；
步骤4、在对应所述的通用试剂定量分配单元3、选择性试剂溶液定量存放单元4及混合反应单元5填充所需的项目检测试剂；
步骤5、要求使用薄膜封闭各腔室加样孔，获得所述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片。
优选的，步骤3中，对分配通道101、加样单元虹吸阀204、通用试剂定量分配单元虹吸阀302、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403和混合反应单元虹吸阀503进行亲水修饰。
一种使用上述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片检测样本的方法，包括以下步骤：
步骤1、将待检测样液加入加样单元2，将通用试剂加入通用试剂暂存腔301，将选择性试剂1加入选择性试剂溶液定量存放单元4，将选择性试剂2加入混合反应单元5，用薄膜密封加液孔303、选择性试剂溶液定量存放单元加液孔402；
步骤2、以第一离心速度离心，使待检测样液分离上清和沉淀，沉淀位于202，上清位于201，此时激活加样单元虹吸阀204；
步骤3、以第二离心速度离心，使加样单元2中待检测样液的上清液通过加样单元虹吸阀204进入弧形定量分配通道单元1并进入各定量腔109、102，随即通过混合反应单元虹吸阀503进入混合反应单元5；
步骤4、刺破通用试剂定量分配单元3封口薄膜，此时激活通用试剂定量分配单元虹吸阀302，以第三离心速度离心，使通用试剂定量分配单元3中的通用试剂通过通用试剂定量分配单元虹吸阀302进入弧形定量分配通道单元1并进入各定量腔109、102，随即通过混合反应单元虹吸阀503进入混合反应单元5；
步骤5、刺破选择性试剂溶液定量存放单元4封口薄膜，此时激活选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403，以第四离心速度离心，并控制离心转动方向，使选择性试剂溶液定量存放单元4中的选择性试剂溶液各腔中试剂通过选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403进入弧形定量分配通道单元1；
步骤6、通过第二定量腔102，随即通过混合反应单元虹吸阀503进入混合反应单元5；
步骤7、控制离心转动速度，不同方向切换离心转动方向，轻轻混匀混合反应单元5中的所有液体，使其充分反应；
步骤8、在充分反应后观察混合反应单元5中各腔室的反应情况，通过仪器或肉眼对检测结果给出定量或定性的判断。
本发明检测方法具体可应用于CRISPR检测核酸、检测抗原抗体、核酸适配体、代谢产物、酶等各类生物识别元件。用于识别检测病原体如细菌、病毒等表面的靶蛋白；也可用于检测某些抗原，例如癌胚抗原；或细胞外囊泡、细菌外囊泡等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是。
芯片结构的优点：
1、与传统的分散式实验平台相比，该芯片划分了三个区域，在同一块芯片上实现了多功能集成设计，集成分子、生化、免疫检测项目，实现了单样本多靶标的联合检测，采用分区设计避免交叉污染，简化了实验流程。芯片设计小型化、自动化，使其容易嵌入便携装置，实现快速检测和诊断。
2、芯片采用模块化结构，划分五个模块，使得芯片易于制造和组装，方便不同模块的更替和升级，提高芯片的可定制性和可维护性。
3、选用不同厚度和材质的材料-亚克力板（PMMA）和聚丙乙烯薄膜，实现对样品的精准定量和混合，降低材料成本。
4、芯片改进采用一种简单可行的几何结构设计，精确控制微通道的尺寸和形状，以调整液体在通道中的流速和流动方向，使得同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片具有更好的流体操控性能、操作可靠性和样本分析准确性。
5、应用亲水性涂层，提高液体在微通道中的流动性和精确性，解决液体滞留和混合不均的问题。
6、弧形定量分配通道单元的设计，使得通用试剂及待检样本平均分配；壶型反应室及混合反应单元的结构，促使待检样本和检测试剂充分混合，两个结构单元完成了定量分配与反应混合的优化。
7、废液腔单元的椭圆型收集腔设计，有效实现废液的回收。
8、定量腔组件的设计，通过不同的离心转速，将样本和试剂精准地按照设定的比例和体积分配到相应的位置，实现试剂的按需释放和高通量定量分配，实现微小尺度的定量流体控制。有效地隔离不同的样本和试剂，避免交叉污染。
9、分开存放通用试剂和选择性试剂的腔室，满足芯片不同检测需求。定位孔的设计，实现芯片的准确定位和稳定运行，确保了芯片在离心过程中的稳定性。透气孔设计，维持芯片内外的压力平衡，防止液体泄漏。
10、该芯片结构的设计考虑了分子、生化、免疫检测等多个领域的需求，使得芯片具有广泛的应用潜力。这种综合性的设计使得实验人员可以在同一平台上进行多个项目的检测，提高了实验的整体效率。
检测方法的优点：
1、检测便捷：目前很多生化分子的检测需要大型仪器设备，这些方法需要对样品进行复杂的前处理，分析成本高，检测时间长。而利用本发明则可以无需复杂的处理，可以直接定性或定量检测，检测限低，检测时间短。
2、成本低，易于自动化。芯片可实现试剂的按需释放和高通量定量分配，具有独立微型反应腔室，低损耗。芯片采用虹吸结构，利用离心力和毛细力的作用。在液体释放和虹吸模块，通过高速离心，使液体进入定量腔室并通过引流通道排出多余液体。离心停止时，虹吸阀会自动触发，液体通过低速离心引流至反应腔室进行反应。反应模块为独立微型腔室，气压平衡，反应迅速。整个过程中，试剂可稳定、精确地定量分配到各腔室，避免互相干扰，降低损耗。芯片材料除微通道层为聚丙乙烯薄膜，其余都为亚克力板，降低成本。
3、适用场景广，检测效率高：可以同时进行分子、生化、免疫三种不同诊断方法的检测，实现同一设备多种检测方法，单个样本多种指标检测，大大提高检测效率，降低检测成本。
4、操作简便，单样本多靶标检测：本产品操作简单，一定程度上防止了阳性患者的漏检。降低了样本检测过程中的污染，不需要繁琐的操作技术，降低了对检测人员的专业要求，使得本产品能够有效推广。
附图说明
图1 本发明施例1微流控芯片单元结构示意图。
图2本发明施例1弧形定量分配通道单元结构示意图。
图3本发明施例1加样单元结构示意图。
图4本发明施例1通用试剂定量分配单元结构示意图。
图5本发明施例1选择性试剂溶液定量存放单元结构示意图。
图6本发明施例1反应腔室及混合反应单元结构示意图。
图7本发明实施例1离心式多用微流控联合检测芯片结构示意图。
图8本发明实施例1离心式多用微流控联合检测芯片逐层结构示意图。
图9本发明实施例2的离心式多用微流控联合检测芯片检测流程示意图。
其中，1、弧形定量分配通道单元，2、加样单元，3、通用试剂定量分配单元，4、选择性试剂溶液定量存放单元，5、混合反应单元，6、中心定位孔；7、定位孔；101、分配通道；102、第二定量腔；103、暂存腔；104、废液腔；105、透气孔；106、第一顶部连接微孔；107、第二顶部连接微孔；108、底部连接微孔；109、第一定量腔；201、上清虹吸腔；202、沉淀处理腔；203、加样孔；204、加样单元虹吸阀；301、通用试剂暂存腔；302、通用试剂定量分配单元虹吸阀；303、加液孔；401、选择性试剂室；402、选择性试剂溶液定量存放单元加液孔；403、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀；501、壶型反应室；502、混合反应单元加样孔；503、混合反应单元虹吸阀；A、下底；B、虹吸阀层；C、隔离层；D、腔室层；E、上盖。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面参照附图来描述本本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。需要说明的是，在本本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本本发明的限制。此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。本发明及附图中的术语“第一”、“第二”等（如果存在）是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本专利中的具体含义。
实施例1。
如图1所示，一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，包括三个相同微流控芯片单元，所述微流控芯片单元包括：
弧形定量分配通道单元1，所述弧形定量分配通道单元1包括分配通道101，分配通道101外侧设置有定量腔组件；分配通道101两端分别设有暂存腔103和废液腔104，废液腔104的端部设置有透气孔105；其中，定量腔组件包括第一定量腔109和多个第二定量腔102，第一定量腔109的端部设置有第一顶部连接微孔106，第二定量腔102的端部设置有第二顶部连接微孔107，第二定量腔102的靠近分配通道的端部设置有底部连接微孔108。弧形定量分配通道单元1用于各类通用试剂及待检样本的平均分配，将多余样本、缓冲液、稀释液及检测试剂送往废液腔104。定量腔组件用于各类样本、缓冲液、稀释液及检测试剂的定量。如图2所示。
加样单元2，设置在弧形定量分配通道单元1内侧靠近暂存腔103，与分配通道101相连接；所述加样单元2包括上清虹吸腔201，上清虹吸腔201靠近分配通道101一端设置有沉淀处理腔202，且上清虹吸腔201与沉淀处理腔202一体成型；上清虹吸腔201远离分配通道101一端设置有加样孔203；靠近沉淀处理腔202的上清虹吸腔201上设置有加样单元虹吸阀204。上清虹吸腔201用于加入待测样品及虹吸定量分配样品，沉淀处理腔202用于血细胞、体细胞及其他细胞碎片的储存，主要用于用于放置并分离待检测样液。如图3所示。
通用试剂定量分配单元3，设置在靠近加样单元2一侧，与分配通道101相连接；所述通用试剂定量分配单元3包含通用试剂暂存腔301，通用试剂暂存腔301靠近分配通道101一端设置有通用试剂定量分配单元虹吸阀302，通用试剂暂存腔301远离分配通道101一端设置有加液孔303。其中加液孔303在添加完通用试剂后需用薄膜封闭；通用试剂定量分配单元3用于放置各类通用试剂，如分子CRISPR诊断检测中NEB缓冲液的存放；免疫检测中感光微球标记的链霉亲和素的存放；生化检测中各类稀释液的存放等。如图4所示。
选择性试剂溶液定量存放单元4，设置在与加样单元2同侧，从靠近暂存腔103的第二个定量腔102开始一一对应，与底部连接微孔108连接；所述选择性试剂溶液定量存放单元4包含选择性试剂室401，选择性试剂室401远离分配通道101一端设置有选择性试剂溶液定量存放单元加液孔402，选择性试剂室401靠近分配通道101一端设置有选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403。其中加液孔402在添加完选择性试剂后需用薄膜封闭；选择性试剂溶液定量存放单元4用于放置各类选择性试剂，如分子CRISPR诊断检测中的各类荧光淬灭探针；免疫检测中生物素标记的各类单克隆抗体A；生化检测中的各类化学试剂A及选择性酶液A等。如图5所示。
混合反应单元5，设置在与定量腔组件同侧，与顶部透气微孔106、107相连接，与定量腔组件一一对应；所述混合反应单元5包含壶型反应室501，含壶型反应室501一端设置有混合反应单元加样孔502和混合反应单元虹吸阀503。混合反应单元5用于放置各类选择性试剂及不同检测试剂混合后的反应、检测；其中分子CRISPR诊断检测常存放Cas酶及crRNA等；免疫检测中通常存放发光微球标记的各类单克隆抗体B；生化检测中通常存放的各类化学试剂B或选择性酶液B等。如图6所示。
本实施例中，所述分配通道101、加样单元虹吸阀204、通用试剂定量分配单元虹吸阀302、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403和混合反应单元虹吸阀503的内壁设置有亲水性涂层。所述废液腔104为椭圆型。
本实施例中，同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的中心设置有中心定位孔6，同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的周向边缘设置有多个定位孔7，用于离心微流控芯片的定位及离心。
本实施例中，所述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，包括下底A、虹吸阀层B，隔离层C，腔室层D，上盖E，从下到上分别为下底A、虹吸阀层B，隔离层C，腔室层D，上盖E，依次叠置压合；加样单元虹吸阀204、通用试剂定量分配单元虹吸阀302、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403和混合反应单元虹吸阀503均设置于虹吸阀层B；暂存腔103、第一顶部连接微孔106、第二顶部连接微孔107、底部连接微孔108均设置在隔离层C；上清虹吸腔201、沉淀处理腔202、通用试剂暂存腔301、选择性试剂室401、壶型反应室501均设置在隔离层C并贯穿腔室层D；分配通道101、透气孔105、第一定量腔109、多个第二定量腔102、混合反应单元加样孔502均设置在腔室层D，透气孔105和混合反应单元加样孔502贯穿上盖E；分配通道101左侧膨大的腔室与暂存腔103形状一致；加样孔203、加液孔303、选择性试剂溶液定量存放单元加液孔402均设置于上盖E。所述下底A为0.4 mm厚的亚克力板（PMMA）；虹吸阀层B为0.3 mm厚的亚克力板（PMMA）；隔离层C为0.1 mm厚的亚克力板（PMMA）；腔室层D为2mm厚的聚丙乙烯薄膜；上盖E为0.4 mm厚的亚克力板（PMMA），如图8所示。
上述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、利用AutoCAD软件设计出所需芯片的模型，优化模型直到实现所需的功能；
步骤2、利用激光雕刻机雕刻出所述的微流控芯片各部分；
步骤3、对分配通道101、加样单元虹吸阀204、通用试剂定量分配单元虹吸阀302、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403和混合反应单元虹吸阀503进行亲水修饰；将各层做亲水性修饰后按顺序组装在一起，并用热压机压紧；如图8所示；
步骤4、在对应所述的通用试剂定量分配单元3、选择性试剂溶液定量存放单元4及混合反应单元5填充所需的项目检测试剂；
步骤5、要求使用薄膜封闭各腔室加样孔，获得所述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片。
实施例2。
本实施例中为实现分子诊断的操作过程，提供一种基于CRISPR快速检测技术，使用如图7所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片进行检测，可实现单样本多靶标核酸的多重分析，可以同时测试三个样本九个指标。其原理是：RPA扩增的特异性核酸片段，特异性核酸片段在与crRNA互补后引导Cas12a-crRNA-特异性核酸片段形成具有核酸酶活性的复合体，此复合体可以切割荧光淬灭探针，探针被水解后释放出荧光信号，通过检测荧光信号便可实现对待测样本的诊断。
以联合检测HPV16、HPV18为例，该检测方法具体包括以下步骤：
步骤1、首先将RPA扩增试剂包埋进微流控芯片加样单元2中；NEB缓冲液加入通用试剂定量分配单元3；FAM-TBA11-BIO荧光淬灭探针加入选择性试剂溶液定量存放单元4，Cas12a酶及HPV16 crRNA、HPV18 crRNA2分别对应填充进混合反应单元5。其中通用试剂定量分配单元3和选择性试剂溶液定量存放单元4在填充完试剂后需用薄膜密封加样口，如图9a所示。
步骤2、将热裂解后的待测***拭子样本加入到加样单元2中，37℃，15min进行RPA扩增，随后检，先利用第一离心速度对离心式微流控芯片离心，激活加样单元虹吸阀204，再利用第二离心速度对离心式微流控芯片离心，将待检样本分别通过加样单元虹吸阀204、分配通道101及定量腔组件（如图9b所示）最终流入混合反应单元5（如图9c所示）。
步骤3、刺破通用试剂定量分配单元3的密封膜，激活通用试剂定量分配单元虹吸阀302，利用第三离心速度对离心式微流控芯片离心，将NEB缓冲液分别通过通用试剂定量分配单元虹吸阀302、分配通道101及定量腔组件（如图9d所示）最终定量流入混合反应单元5（如图9e所示）。
步骤4、分别刺破各选择性试剂溶液定量存放单元4的密封膜，激活选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403（如图9f所示），利用第四离心速度对离心式微流控芯片离心，将各腔室FAM-TBA11-BIO荧光淬灭探针分别通过选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403、分配通道101及第二定量腔102（如图9g所示）最终定量流入混合反应单元5（如图9h所示）。
步骤5、控制离心转动速度，不同方向切换离心转动方向，轻轻混匀混合反应单元5中的所有液体，使其充分反应（整体如图9i所示）。
步骤6、在充分反应后观察混合反应单元5中各腔室的反应情况，通过仪器分别对对照孔、HPV16检测孔、HPV18检测孔的荧光检测结果给出定性的判断。
实施例3。
相较于传统的免疫分析技术，光激化学发光（LICA）技术有着明显的优势：反应均一充分，结果重复性好；操作简便，检测速度快；几乎不产生非特异性荧光，具有较好的检测特异性。目前现有的LICA检测通常采用LICA全自动化检测仪器进行检测，但LICA全自动化检测仪器只能实现单靶标检测，且需要机械臂带动进行加样移液，仪器体积庞大，只能在大型检测实验室进行操作。因此，本发明的目的是提供一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片及光激化学发光多靶标检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，检测结构简单，体积较小，且能够实现单样本多靶标检测光激化学发光检测。
本实施例以同时检测孕妇血清中孕酮和β-HCG的含量为例，对光激化学发光检测的具体步骤进行说明：
步骤1、筛选两对合适的孕酮和β-HCG单克隆抗体，分别进行生物素化后，用于促卵泡成熟激素（FSH）、促***（LH）、催乳素、***（***）、***、睾酮的特异性检测。
步骤2、分别利用生物素偶联孕酮单克隆抗体1和β-HCG单克隆抗体1（生物素化抗体的制备参见Thermo公司生物素标记试剂盒说明书，受体微球和链霉亲和素偶联供体微球购自惠州佰希生物科技有限公司），受体微球分别为偶联孕酮单克隆抗体2和β-HCG单克隆抗体2（受体微球的抗体偶联方法参见惠州佰希生物科技有限公司微球标记说明书）。
步骤3、将链霉亲和素偶联的供体微球填充进通用试剂定量分配单元3；生物素偶联的孕酮单克隆抗体1和β-HCG单克隆抗体1分别填充进选择性试剂溶液定量存放单元4；受体微球分别偶联的孕酮单克隆抗体2和β-HCG单克隆抗体2分别对应填充进混合反应单元5；其中通用试剂定量分配单元3和选择性试剂溶液定量存放单元4在填充完试剂后需用薄膜密封加样口。
步骤4、在加样单元2内加入不同浓度的孕酮/β-HCG抗原，，随后检测流程如图9，先利用第一离心速度对离心式微流控芯片离心，激活加样单元虹吸阀204，再利用第二离心速度对离心式微流控芯片离心，将待检样本分别通过加样单元虹吸阀204、分配通道101及定量腔组件最终流入混合反应单元5。
步骤5、刺破通用试剂定量分配单元3的密封膜，激活通用试剂定量分配单元虹吸阀302，利用第三离心速度对离心式微流控芯片离心，将链霉亲和素偶联的供体微球分别通过通用试剂定量分配单元虹吸阀302、分配通道101及定量腔组件最终定量流入混合反应单元5。
步骤6、分别刺破各选择性试剂溶液定量存放单元4的密封膜，激活选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403，利用第四离心速度对离心式微流控芯片离心，将各腔室的生物素偶联的孕酮单克隆抗体1和β-HCG单克隆抗体1分别通过选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403、分配通道101及第二定量腔102最终定量流入混合反应单元5。
步骤7、控制离心转动速度，不同方向切换离心转动方向，轻轻混匀混合反应单元5中的所有液体，使其充分反应后，进行信号检测；每个抗原浓度重复3次；以抗原浓度为横坐标，测定的荧光信号强度为纵坐标，绘制标准曲线，分别得到孕酮、β-HCG检测的拟合方程；临界值为0ng/mL的LICA信号平均值加三倍的标准差，最低检测限为大于临界值的最低抗原浓度。
步骤8、配制浓度为100ng/mL的促卵泡成熟激素（FSH）、促***（LH）、催乳素、***（***）、***、睾酮激素溶液，分别用于孕酮/β-HCG的特异性检测，6种孕激素之间无交叉反应，表明采用离心式微流控芯片检测6种孕激素具有较好的特异性。
步骤9、将从医院获得的已知孕酮、β-HCG浓度的孕妇血液样本加入加样单元2；离心式微流控芯片经离心、孵育和检测，步骤如上步骤4至步骤7所示。读取荧光检测信号，通过标准曲线计算得出离心式微流控芯片测得的孕酮、β-HCG检测浓度。
通过将离心式微流控芯片测得的孕酮、β-HCG浓度与大型化学发光仪测得的对应样本浓度进行曲线拟合，比较两种方法的相关性，变异系数等。
实施例4。
对于三甲医院来说，样本量非常大，将化学发光仪、生化分析仪两种设备分开检测各自的检测通量可以做到很高。但对于基层医疗机构来说，检验样本量不大，配备两台设备意义不大，一来维护成本高，二来占用额外的人力和场地，一台仪器可以同时进行免疫和生化检测对于基层医院意义较大。本微流控芯片通过填充不同的试剂同样可以进行快速生化分析。以同时检测血液中天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶（ALT）的浓度为例，具体步骤如下：
步骤1、分别配制检测AST的试剂R1、R2和检测ALT的试剂S1、S2；R1、R2及S1、S2的配方分别如下表1、表2所示。
步骤2、将样本稀释液填充进通用试剂定量分配单元3；AST的试剂R1和ALT的试剂S1分别填充进对应的选择性试剂溶液定量存放单元4；AST的试剂R2和ALT的试剂S2分别填充进对应的混合反应单元5；其中通用试剂定量分配单元3和选择性试剂溶液定量存放单元4在填充完试剂后需用薄膜密封加样口。
步骤3、在加样单元2内加入不同浓度的AST/ALT标准物质，随后检测流程如图9，先利用第一离心速度对离心式微流控芯片离心，激活加样单元虹吸阀204，再利用第二离心速度对离心式微流控芯片离心，将待检样本分别通过加样单元虹吸阀204、分配通道101及定量腔组件最终流入混合反应单元5。
步骤4、刺破通用试剂定量分配单元3的密封膜，利用第三离心速度对离心式微流控芯片离心，激活通用试剂定量分配单元虹吸阀302，将样本稀释液通过通用试剂定量分配单元虹吸阀302、分配通道101及定量腔组件最终定量流入混合反应单元5。
步骤5、分别刺破各选择性试剂溶液定量存放单元4的密封膜，激活选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403，利用第四离心速度对离心式微流控芯片离心，将各腔室的AST的试剂R2和ALT的试剂S2分别通过选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀403、分配通道101及第二定量腔102最终定量流入混合反应单元5。
步骤6、控制离心转动速度，不同方向切换离心转动方向，轻轻混匀混合反应单元5中的所有液体，使其充分反应后，进行信号检测；每个样品浓度重复3次；以不同的AST/ALT浓度为横坐标，测定的对应吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，分别得到AST/ALT检测的拟合方程；检测AST/ALT标准曲线的R2值，判断是否具有较好的拟合性。
步骤7、分别配制浓度为100ng/mL的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酸转肽酶、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、碱性磷酸酶；分别用于AST/ALT的特异性检测，8种肝功能检查指标之间无交叉反应，表明采用离心式微流控芯片检测8种肝功能检查指标具有较好的特异性。
步骤8、将从医院获得的已知AST/ALT浓度的血液样本加入加样单元2，离心式微流控芯片经离心、孵育和检测，步骤如上步骤3至步骤6所示。读取吸光度检测信号，通过标准曲线计算得出离心式微流控芯片测得的AST、ALT检测浓度。
通过将离心式微流控芯片测得的AST、ALT浓度检测结果与大型化学发光仪测得的对应样本浓度进行曲线拟合，比较两种方法的相关性，变异系数等。结果相关性较强后进行实际样本检测。
实验显示结果相关性较强后，表明该芯片可以直接进行实际样本检测。
表1：天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）检测试剂配方。
表2：丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂配方。
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Claims (10)
1.一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，包括多个微流控芯片单元，其特征在于，所述微流控芯片单元包括：
弧形定量分配通道单元（1），所述弧形定量分配通道单元（1）包括分配通道（101），所述分配通道（101）外侧设置有定量腔组件；所述分配通道（101）两端分别设有暂存腔（103）和废液腔（104），所述废液腔（104）的端部设置有透气孔（105）；其中，所述定量腔组件包括第一定量（109）和多个第二定量腔（102），所述第一定量腔（109）的端部设置有第一顶部连接微孔（106），所述第二定量腔（102）的端部设置有第二顶部连接微孔（107），所述第二定量腔（102）的靠近分配通道的端部设置有底部连接微孔（108）；
加样单元（2），设置在弧形定量分配通道单元（1）内侧靠近暂存腔（103），与分配通道（101）相连接；所述加样单元（2）包括上清虹吸腔（201），所述上清虹吸腔（201）靠近分配通道（101）一端设置有沉淀处理腔（202），且所述上清虹吸腔（201）与所述沉淀处理腔（202）一体成型；所述上清虹吸腔（201）远离所述分配通道（101）一端设置有加样孔（203）；靠近所述沉淀处理腔（202）的上清虹吸腔（201）上设置有加样单元虹吸阀（204）；
通用试剂定量分配单元（3），设置在靠近加样单元（2）一侧，与分配通道（101）相连接；所述通用试剂定量分配单元（3）包含通用试剂暂存腔（301），所述通用试剂暂存腔（301）靠近所述分配通道（101）一端设置有通用试剂定量分配单元虹吸阀（302），所述通用试剂暂存腔（301）远离所述分配通道（101）一端设置有加液孔（303）；
选择性试剂溶液定量存放单元（4），设置在与所述加样单元（2）同侧，从靠近暂存腔（103）的第二个定量腔（102）开始一一对应，与底部连接微孔（108）连接；所述选择性试剂溶液定量存放单元（4）包含选择性试剂室（401），所述选择性试剂室（401）远离所述分配通道（101）一端设置有选择性试剂溶液定量存放单元加液孔（402），所述选择性试剂室（401）靠近所述分配通道（101）一端设置有选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀（403）；
混合反应单元（5），设置在与定量腔组件同侧，与顶部连接微孔（106）、（107）相连接，与定量腔组件一一对应；所述混合反应单元（5）包含壶型反应室（501），所述含壶型反应室（501）一端设置有混合反应单元加样孔（502）和混合反应单元虹吸阀（503）。
2.根据权利要求1所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，其特征在于，所述分配通道（101）、加样单元虹吸阀（204）、通用试剂定量分配单元虹吸阀（302）、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀（403）和混合反应单元虹吸阀（503）的内壁设置有亲水性涂层。
3.根据权利要求1所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，其特征在于，所述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，包括下底（A）、虹吸阀层（B），隔离层（C），腔室层（D），上盖（E），从下到上分别为下底（A）、虹吸阀层（B），隔离层（C），腔室层（D），上盖（E），依次叠置压合。
4.根据权利要求1所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，其特征在于，同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的中心设置有中心定位孔（6），同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的周向边缘设置有多个定位孔（7）。
5.根据权利要求1所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，其特征在于，加样单元虹吸阀（204）、通用试剂定量分配单元虹吸阀（302）、选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀（403）和混合反应单元虹吸阀（503）均设置于虹吸阀层（B）。
6.根据权利要求1所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，其特征在于，暂存腔（103）、第一顶部连接微孔（106）、第二顶部连接微孔（107）、底部连接微孔（108）均设置在隔离层（C）；上清虹吸腔（201）、沉淀处理腔（202）、通用试剂暂存腔（301）、选择性试剂室（401）、壶型反应室（501）均设置在隔离层（C）并贯穿腔室层（D）。
7.根据权利要求1所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，其特征在于，分配通道（101）、废液腔（104）、透气孔（105）、第一定量腔（109）、多个第二定量腔（102）、混合反应单元加样孔（502）均设置在腔室层（D），透气孔（105）和混合反应单元加样孔（502）贯穿上盖（E）；加样孔（203）、加液孔（303）、选择性试剂溶液定量存放单元加液孔（402）均设置于上盖（E）。
8.根据权利要求1所述的同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片，其特征在于，所述下底（A）为0.4 mm厚的亚克力板；虹吸阀层（B）为0.3 mm厚的亚克力板；隔离层（C）为0.1 mm厚的亚克力板；腔室层（D）为2 mm厚的聚丙乙烯薄膜；上盖（E）为0.4 mm厚的亚克力板。
9.一种同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、利用AutoCAD软件设计出所需芯片的模型，优化模型直到实现所需的功能；
步骤2、利用激光雕刻机雕刻出所述的微流控芯片各部分；
步骤3、将各层做亲水性修饰后按顺序组装在一起，并用热压机压紧；
步骤4、在对应所述的通用试剂定量分配单元（3）、选择性试剂溶液定量存放单元（4）及混合反应单元（5）填充所需的项目检测试剂；
步骤5、要求使用薄膜封闭各腔室加样孔，获得所述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片。
10.一种使用上述同时进行分子诊断、免疫诊断、生化检测的微流控芯片检测样本的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将待检测样液加入加样单元（2），将通用试剂加入通用试剂暂存腔（301），将选择性试剂1加入选择性试剂溶液定量存放单元（4），将选择性试剂2加入混合反应单元（5），用薄膜密封加液孔（303）、选择性试剂溶液定量存放单元加液孔（402）；
步骤2、以第一离心速度离心，使待检测样液分离上清和沉淀，沉淀位于（202），上清位于（201），此时激活加样单元虹吸阀（204）；
步骤3、以第二离心速度离心，使加样单元（2）中待检测样液的上清液通过加样单元虹吸阀（204）进入弧形定量分配通道单元（1）并进入各定量腔（109）、（102），随即通过混合反应单元虹吸阀（503）进入混合反应单元（5）；
步骤4、刺破通用试剂定量分配单元（3）封口薄膜，此时激活通用试剂定量分配单元虹吸阀（302），以第三离心速度离心，使通用试剂定量分配单元（3）中的通用试剂通过通用试剂定量分配单元虹吸阀（302）进入弧形定量分配通道单元（1）并进入各定量腔（109）、（102），随即通过混合反应单元虹吸阀（503）进入混合反应单元（5）；
步骤5、刺破选择性试剂溶液定量存放单元（4）封口薄膜，此时激活选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀（403），以第四离心速度离心，并控制离心转动方向，使选择性试剂溶液定量存放单元（4）中的选择性试剂溶液各腔中试剂通过选择性试剂溶液定量存放单元虹吸阀（403）进入弧形定量分配通道单元（1）；
步骤6、通过第二定量腔（102），随即通过混合反应单元虹吸阀（503）进入混合反应单元（5）；
步骤7、控制离心转动速度，不同方向切换离心转动方向，轻轻混匀混合反应单元（5）中的所有液体，使其充分反应；
步骤8、在充分反应后观察混合反应单元（5）中各腔室的反应情况，通过仪器或肉眼对检测结果给出定量或定性的判断。
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