CN118255891A - 检测尿液11-脱氢血栓烷b2/肌酐的试剂盒及检测方法 - Google Patents
检测尿液11-脱氢血栓烷b2/肌酐的试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物检测分析领域,提供了一种检测尿液11‑脱氢血栓烷B2/肌酐的试剂盒及检测方法。具体地,本发明中提供了一种抗体或抗原结合片段,该抗体或抗原结合片段能够特异性识别11‑脱氢血栓烷B2,包括自下列至少之一的CDR序列:重链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3;轻链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。基于该抗体或其抗原结合片段制备的检测试剂盒能够对尿液中的11‑脱氢血栓烷B2和肌酐实现同步检测,具有灵敏度好、准确度高、线性范围宽、特异性强、操作简单,且不受内源性生物素的干扰的优点,为临床评估血小板活性或阿司匹林抗血小板效果提供了一种更准确、方便和快捷的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测分析领域,具体地,本发明涉及一种11-脱氢血栓烷B2抗体或抗原结合片段及用该抗体或抗原结合片段检测尿液11-脱氢血栓烷B2/肌酐的试剂盒。
背景技术
11-脱氢血栓烷B2(11-dehydro-thromboxane B2,11-dhTXB2)是血栓烷素A2(thromboxane A2,TXA2)的终末代谢产物。在正常情况下的血液循环中,血小板处于静止状态,血管损伤后,血小板内信号途径被激活而活化,其膜磷脂裂解,释放出花生四烯酸,花生四烯酸在血小板环氧化酶(COX-1和COX-2)的作用下生成***素H。***素H化学性质不稳定,可在异构酶的作用下转化为包括TXA2在内的多种具有生物活性的***素类物质。TXA2主要经COX-1途径在血小板中合成,有强烈的缩血管作用,还可通过结合血栓烷素血小板受体(thromboxane platelet receptor,TPR)激活血小板,促进其聚集,从而发挥促血栓形成作用。而阿司匹林作为应用最广泛的抗血小板聚集的药物,能通过不可逆地抑制COX-1活性,减少TXA2合成。然而,TXA2高度不稳定,其生物半衰期极短仅约30秒,会迅速被水解为较稳定的血栓烷素B2(thromboxane B2,TXB2),TXB2通过肝脏进一步代谢为11-dhTXB2,并随尿液排出。因而,尿液11-dhTXB2含量能直接反映体内TXA2的生成水平,评估血小板活性及阿司匹林的抗血小板效果。
为使尿液11-dhTXB2的测定更加标准,需要用尿肌酐(creatinine,CRE)浓度校正检测值,以减少因饮食和饮水等导致的尿液浓度差异或肾功能的影响,即分别测定尿11-dhTXB2和尿肌酐的值,再通过计算得到其相对肌酐的值。其中11-dhTXB2常规的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、酶联免疫分析法(ELISA)、化学发光法(CLIA)等;肌酐检测法有苦味酸法、干化学法、酶法等。
分析现有检测技术和测量方法,发现以下问题:
1)受仪器的限制:由于11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐的测量方法是基于不同的方法学建立起来的,所以要用不同的仪器分别测量。
2)测量步骤繁琐:由上一点提到的需要用到不同的仪器,这必然导致对同一样本分别进行处理,才能保证分别测量尿11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐的准确。
3)测量结果不精确:由于需要用到不同的仪器,尿11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐的检测必然存在一定的时间差,不同时间点尿11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐的差异会放大11-脱氢血栓烷B2/肌酐结果的偏差。
因此,迫切需要开发一种新的方法,该方法能够在同一仪器中同时检测11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐的含量,以提高检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,因此,本发明开发了一种能够与11-脱氢血栓烷B2结合的11-脱氢血栓烷B2抗体或抗原结合片段,该抗体或抗原结合片段能够特异性地与11-脱氢血栓烷B2进行结合,基于此,本发明利用11-脱氢血栓烷B2抗体或抗原结合片段,制备了尿液11-脱氢血栓烷B2/肌酐检测试剂盒,该试剂盒对尿11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐的测定均基于免疫竞争法,利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理,使两个指标可以在发光仪上同步检测,具有灵敏度好、准确度高、线性范围宽、特异性强、操作简单,且不受内源性生物素的干扰的优势,为临床评估血小板活性或阿司匹林抗血小板效果提供了一种更准确、方便和快捷的方法。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例,所述抗体或抗原结合片段包括选自下列至少之一的CDR序列:重链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3;轻链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6。根据本发明实施例的抗体或抗原结合片段具有11-脱氢血栓烷B2结合亲和力,可用于检测11-脱氢血栓烷B2、检测含有11-脱氢血栓烷B2细胞。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例,所述融合蛋白包括第一方面所述的抗体或抗原结合片段;和生物活性蛋白或其片段。本发明的融合蛋白具有11-脱氢血栓烷B2结合亲和力,可用于检测11-脱氢血栓烷B2、检测含有11-脱氢血栓烷B2细胞。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子编码第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白。本发明的核酸分子可编码第一方面的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例,所述表达载体携带第三方面所述的核酸分子。由此,采用本发明的表达载体可有效实现第一方面的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白的表达,进而实现抗体或抗原结合片段、或融合蛋白的体外大量获得。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,所述重组细胞包括携带第三方面所述的核酸分子或第四方面所述的表达载体;或表达第一方面所述的抗体或抗原结合片段或第二方面所述的融合蛋白。利用该重组细胞在适合条件下,能够在细胞内有效地表达前述的抗体或抗原结合片段、或融合蛋白。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种制备抗体或抗原片段的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括将第五方面所述的重组细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养,以便获得所述抗体或抗原结合片段。由此,本发明的方法可用于生产前述的抗体或抗原结合片段。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种偶联物。根据本发明的实施例,所述偶联物包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白或依据第六方面所述的方法制备得到的抗体或抗原结合片段;以及偶联部分,所述偶联部分与所述抗体或抗原结合片段、或所述融合蛋白相连。本发明的偶联物具有11-脱氢血栓烷B2结合亲和力,可用于检测11-脱氢血栓烷B2、检测含有11-脱氢血栓烷B2的细胞。
在本发明的第八方面,本发明提出了第一方面所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测11-脱氢血栓烷B2。根据本发明的实施例,该抗体或抗原结合片段能够高特异性结合11-脱氢血栓烷B2。因此,包含所述抗体或抗原结合片段的试剂盒可用于高特异性、高灵敏度检测11-脱氢血栓烷B2。
在本发明的第九方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本申请的实施例,所述试剂盒包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述表达载体、第五方面所述的重组细胞、依据第六方面所述的方法制备的抗体或抗原结合片段或第七方面所述的偶联物。根据本发明的实施例,所述抗体或其抗原结合片段能够高特异性结合11-脱氢血栓烷B2。在一些科学研究中,该试剂盒可用于定性或定量检测生物样本中的11-脱氢血栓烷B2,也可用于对个体状态进行判断,如获得所述个体的11-脱氢血栓烷B2水平后,判断其11-脱氢血栓烷B2水平是否高于或低于正常水平。
在本发明的第十方面,本发明提出了一种检测11-脱氢血栓烷B2含量的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:采用第九方面所述的试剂盒对待测样本进行检测处理,以便确定所述待测样本中所述11-脱氢血栓烷B2的含量。本发明所述的方法能够高灵敏度检测11-脱氢血栓烷B2,且有利于低浓度11-脱氢血栓烷B2的检测,此外,该方法具有特异性强、线性范围宽、操作简单,无需对样品进行前处理等优点。在临床实际应用中,可借助化学发光仪快速高通量检测大批量样本。
在本发明的第十一方面,本发明提出了一种检测11-脱氢血栓烷B2相对含量的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:采用第九方面所述的试剂盒对待测样本进行检测处理,以便确定所述待测样本中所述11-脱氢血栓烷B2的相对含量。由于11-脱氢血栓烷B2和肌酐都是小分子,小分子的自由度大,不利于与抗体结合位点的暴露,也就不利于抗原与抗体的结合,而本发明的方法在测定样品中11-脱氢血栓烷B2和肌酐的含量前,会让样品中的小分子抗原(11-脱氢血栓烷B2和肌酐)先与酶标抗体反应,再加入磁珠包被的小分子衍生物进行竞争,因此有利于低浓度抗原的检出,提高试剂灵敏度。此外,该方法具有特异性强、线性范围宽、操作简单,无需对样品进行前处理等优点。在临床实际应用中,可借助化学发光仪快速高通量检测大批量样本。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是根据本发明实施例的试剂盒11-脱氢血栓烷B2检测体系的校准曲线图;
图2是根据本发明实施例的试剂盒肌酐检测体系的校准曲线图;
图3是根据本发明实施例的试剂盒11-脱氢血栓烷B2检测体系的线性图;
图4是根据本发明实施例的试剂盒1肌酐检测体系的线性图;
图5是根据本发明实施例的试剂盒中11-脱氢血栓烷B2检测体系与市售ELISA试剂盒相关性图;
图6是根据本发明实施例的试剂盒中肌酐检测体系与市售酶法试剂盒相关性图;
图7是根据本发明实施例的试剂盒11-脱氢血栓烷B2/肌酐结果与市售试剂计算结果相关性;
图8是根据本发明实施例的杂交瘤细胞株11DH025表达的抗体的亚型鉴定及抗体可变区的克隆胶图,泳道顺序如表5所示。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步的说明。应注意,下面描述的实施例仅用于解释本发明,而非对本发明的限制。
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本申请中,除非另有说明,术语“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本申请所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本申请中,除非另有说明,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本申请中,除非另有说明,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本文中,术语“片段”是指目标蛋白或多肽,以及具有N-末端(N端)或C-末端(C端)截短、和/或内部删除的目标蛋白或多肽。
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
在本文中,术语“抗体”在最广义上使用,其可以包括全长单克隆抗体、多特异性抗体、以及嵌合抗体,具体结构不受限制,只要它们展示所需的生物学活性。其通常包括分子量较轻的轻链和分子量较重的重链,重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成的抗体分子。其中,肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大,称为可变区(V区);羧基端(C端)相对稳定,变化很小,称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。
在本文中,重链互补决定区(重链可变区CDR)用“HCDRs”或“HCDR”表示,其包括HCDR1(又称CDR-H1)、HCDR2(又称CDR-H2)和HCDR3(又称CDR-H3);轻链互补决定区(轻链可变区CDR)用“LCDRs”或“LCDR”表示,其包括LCDR1(又称CDR-L1)、LCDR2(又称CDR-L2)和LCDR3(又称CDR-L3)。本领域常用的CDR定义方案包括:Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义、Contact定义和AbM定义。
在本文中,术语“抗体可变区”是指抗体重链和轻链中的一个结构域。在自然界中,抗体可变区由免疫球蛋白(重链和轻链)基因中的V,D(仅重链适用),和J片段通过基因重组拼接编码。不同的抗体之间可变区的氨基酸序列具有高度的差异性(抗体的其他区域的氨基酸序列相对高度相同),并负责与特异的抗原决定簇识别和结合。在抗体可变区中,又可以细分出骨架区和CDR区(comlementarity determining region)。一个典型的抗体可变区具有3个骨架区和3个CDR区(它们互相间插排列)。骨架区主要起到蛋白质结构域框架形成的作用,而CDR区主要起到抗原-抗体特异性识别结合的作用。
在本文中,术语“抗原结合片段”也即“抗体片段”是包含抗体的一部分或全部的片段,其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合抗原的性能活性,例如,该片段可包含抗体CDR的一部分或全部。此类片段具生物活性,因为其结合至抗原,且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或单域抗体。此类片段可通过重组核酸技术产生,或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。
需要说明的是,本发明所述的抗体或抗原结合片段、CDRs、轻链可变区或重链可变区等,在不实质性影响抗体活性(保留至少80%、90%、或95%的活性)的前提下,本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸,以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有保守修饰形式的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80%一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。
在本文中,本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
本发明所述的抗体或抗原结合片段通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列,本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于:PCR,DNA人工合成等,具体的方法可参见J.萨姆布鲁克,《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式,可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。其中,本发明中的所述抗体或抗原片段是采用Kabat编号***进行编号和定义的。然而,本领域普通技术人员完全能够将序列表的序列Kabat编号转换为其他编号***(包括但不限于AbM、IMGT、Chothia)下的“HCDRs”和/或“LCDRs”,基于本申请公开的重链可变区和轻链可变区采用本领域公开的其他规则确定的CDR也属于本公开的保护范围。
如本文所述,“Kabat定义”是指Kabat等,U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的定义***。“Chothia定义”参见Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)。
在本文中,术语“保守修饰形式的氨基酸序列”指这样的氨基酸修饰,所述修饰不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性,该修饰包括氨基酸置换、增加和缺失。修饰可通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等标准技术引入本发明的抗体中。保守氨基酸置换系其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸),具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸),具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸),具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸),具有β-支化侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在本文中,术语“同一性”用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时,采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比,例如参见,Ausubel等,编著(1995),Current Protocols in Molecular Biology,第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York);和ALIGN程序(Dayhoff(1978),Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3(National BiomedicalResearch Foundation,Washington,D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法,包括,Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法;Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法;Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444的相似性搜索方法;Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997);和BLASTP,BLASTN,和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的,并且包括但不限于:ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,或者WU-BLAST-2(Altschul等,Meth.Enzym.,266:460-480(1996));或者GAP,BESTFIT,BLASTAltschul等,上文,FASTA,和TFASTA,在Genetics Computing Group(GCG)包,8版,Madison,Wisconsin,USA中可获得;和Intelligenetics,Mountain View,California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中,术语“至少80%同一性”指与各参考序列至少为80%,可为80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的同一性。
在本文中,术语“融合蛋白”是指至少两个蛋白质或者多肽融合而成的新型蛋白,通常可以通过基因工程等技术实现上述融合操作,例如,通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。
在本文中,术语“表达载体”通常是指能够***在合适的宿主中自我复制的核酸分子,该核酸分子包含可表达目标蛋白的核苷酸序列,且可将该核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体,以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常,通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞,所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中,术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对受体细胞(或称宿主细胞)的遗传物质进行修饰改造或重组,获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中,术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如表达载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染,并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞(人羊水来源的细胞)和CoS细胞。
在本文中,术语“磁性微粒”、“磁微粒”、“磁性微球”和“磁珠”具有相同的意义,都是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料。因其具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性,可将抗原/抗体、酶、核酸/寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面,并在磁场中富集。
在本文中,为便于表达,有时将11-脱氢血栓烷B2缩写为“11-dhTXB2”,肌酐缩写为“CRE”,如无特殊说明,缩写形式与原表达形式无区别。
本发明检测尿液11-脱氢血栓烷B2和肌酐的试剂盒的详细说明
本发明提出了一种抗体或抗原结合片段、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、偶联物、试剂盒、制备抗体或抗原结合片段的方法、检测11-脱氢血栓烷B2含量的方法或检测11-脱氢血栓烷B2相对含量的方法,下面将分别对其进行详细描述。
抗体或抗原结合片段
在本发明的第一方面,本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例,所述抗体或抗原结合片段包括选自下列至少之一的CDR序列:重链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3;轻链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6。根据本发明实施例的抗体或抗原结合片段具有11-脱氢血栓烷B2结合亲和力,可用于检测11-脱氢血栓烷B2、检测含有11-脱氢血栓烷B2细胞。
根据本发明的一些实施方案,所述抗体或抗原结合片段包括HCDR1~3和LCDR1~3;其中,所述HCDR1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;所述HCDR2具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;所述HCDR3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;所述LCDR1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;所述LCDR2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;和所述LCDR3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本发明的一个可选实施例中,“如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列”是指与SEQID NO:1所示的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列、以及与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是与11-脱氢血栓烷B2抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链,如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸,或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺,丝氨酸取代苏氨酸等等。同“如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列”、“如SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列”、“如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列”、或“如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列”。
根据本发明的实施例,所述HCDR1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有1~2个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述HCDR2具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有1~2个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述HCDR3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有1~2个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述LCDR1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有1~2个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述LCDR2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有1~2个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述LCDR3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与其具有1~2个氨基酸差异的氨基酸序列。
在本文中,术语“或与其具有1~2个氨基酸差异的氨基酸序列”是指与前述的氨基酸序列相比,具有1或2个氨基酸差异,该差异不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性,该修饰包括氨基酸置换、增加和缺失。
根据本发明的实施例,所述抗体或其抗原结合片段特异性识别11-脱氢血栓烷B2。尤其是特异性识别具有如SEQ ID NO:14所示序列的抗原。
根据本发明的一些实施方案,所述抗体或抗原结合片段包括重链框架区和/或轻链框架区。
根据本发明的一些实施方案,所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于鼠源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案,所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于鼠源抗体或其突变体和人源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案,所述抗体或抗原结合片段包括:具有氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区;和具有氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
根据本发明的一些实施方案,进一步包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
根据本发明的一些实施方案,所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案,所述重链恒定区包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区。
根据本发明的一些实施方案,所述轻链恒定区包括选自κ型或λ型轻链恒定区。
根据本发明的一些实施方案,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源抗体或其突变体和人源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案,所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连;和/或所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的C端相连。
根据本发明的一些实施方案,所述重链恒定区具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;和/或所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案,所述抗体包括多抗、全长单抗、F(ab’)2抗体、Fab’抗体、Fab抗体、F(ab)2抗体、Fv抗体、单链抗体以及最小识别单位中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案,所述抗原结合片段包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一。
在本文中,术语“全长抗体”、“全长单抗”或“全长单克隆抗体”均是由至少两条相同的轻链和至少两条相同的重链通过链间二硫键连接而成,如免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白E(IgE)。
在本文中,术语“多抗”和“多特异性抗体”同义,均是指可识别多种抗原表位的抗体,例如可识别两种抗原表位的抗体(双特异性抗体,简称双抗)、三种抗原表位的抗体或者四种抗原表位的抗体,其为广义理解,具体结构不受限制,可识别多种抗原表位即可。
在本文中,术语“单域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”可互换使用,其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,HamersR.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”;Nature 363,446-448(1993)),包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区,其通过重链可变区与抗原蛋白特异性结合。
在本文中,术语“Fab抗体”或“Fab片段”通常是指仅含Fab分子的抗体或片段,其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成,轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中,术语“F(ab’)2抗体”或“F(ab’)2片段”具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab’)部分。
在本文中,术语“Fv抗体”或“Fv片段”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体或片段,是抗体分子保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中,术语“单链抗体”、“scFv片段”是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接而成的抗体或片段。
在本文中,术语“最小识别单位”和“MRU”均是指仅由一个CDR组成的抗体或片段,其分子量十分小仅占完全抗体的1%左右。
根据本发明的一些实施方案,所述抗体或抗原结合片段包括:具有氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链;和具有氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
融合蛋白
在本发明的第二方面,本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例,所述融合蛋白包括第一方面所述的抗体或抗原结合片段;和生物活性蛋白或其片段。本发明的融合蛋白具有11-脱氢血栓烷B2结合亲和力,可用于检测11-脱氢血栓烷B2、检测含有11-脱氢血栓烷B2细胞。
根据本发明的一些实施方案,所述生物活性蛋白或其片段包括选自蛋白标签、白蛋白或其片段和Fc片段中的至少之一。
在本文中,“蛋白标签”通常是指与目标蛋白(抗体或抗原结合片段)一起融合表达的一种多肽或者蛋白,其可用于目标蛋白的表达、检测、失踪或纯化等。包括但不限于His标签(又称His-Tag,序列为HHHHHH)、Flag标签(又称Flag-Tag,序列为DYKDDDDK)、GST标签(又称GST-Tag、谷胱甘肽巯基转移酶标签)、MBP标签(又称MBP-Tag、麦芽糖结合蛋白标签)、SUMO标签和C-Myc标签等。
在本文中,“Fc片段”通常是指来自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的Fc区,包括CH2、CH3区和任选地铰链区。优选的,IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM来源于鼠源、人源、灵长目源或羊驼源。
根据本发明的一些实施方案,所述白蛋白或其片段为血清白蛋白或其片段。
核酸分子、表达载体、重组细胞和制备抗体或抗原片段的方法
在制备或者获取这些抗体或其抗原结合片段的过程中,可以利用表达这些抗体或抗原结合片段的核酸分子,与不同的载体连接,然后在不同细胞中表达,来获得相应抗体或其抗原结合片段。
为此,在本发明的第三方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子编码第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白。所提供的核酸分子可以通过本领域人员的公知技术获得。而且还可以经过种属优化,更易在哺乳动物细胞中表达。
根据本发明的一些实施方案,所述核酸分子为DNA。
需要说明的是,对于本文中所提及的核酸分子,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本说明书和权利要求书中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外,本发明中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例,所述表达载体携带第三方面所述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到表达载体上时,可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连,只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于表达载体本身,也可以是外源性的,即并非来自于表达载体本身。当然,所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到表达载体上,使得表达载体内的控制元件,例如转录控制序列和翻译控制序列等等,能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的表达载体例如可以为质粒、噬菌体等等。
根据本发明的一些具体实施例,所述表达载体导入合适的受体细胞后,可在调控***的介导下,有效实现前述的抗体或抗原结合片段、前述的融合蛋白的表达,进而实现抗体或抗原结合片段、融合蛋白的体外大量获得。
根据本发明的实施例,所述表达载体包括选自真核表达载体或原核表达载体。
在本发明的一个可选实施例中,所述表达载体为质粒表达载体、病毒表达载体,例如慢病毒表达载体。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,所述重组细胞包括携带第三方面所述的核酸分子或第四方面所述的表达载体;或表达第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白。利用该重组细胞在适合条件下,能够在细胞内有效地表达前述的抗体或抗原结合片段、或融合蛋白。
需要说明的是,“适合条件”,是指适合本发明所述抗体或抗原结合片段、或融合蛋白表达的条件。本领域技术人员容易理解的是,适合所述抗体或抗原结合片段、或融合蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制,本领域技术人员可根据实验室的具体环境,优化最适的上述抗体或抗原结合片段、或融合蛋白表达的条件。
根据本发明的一些实施方案,所述重组细胞是通过将第四方面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
需要注意的是,本发明所述重组细胞不受特别限制,可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌,草地粘虫等昆虫细胞,烟草等植物细胞,BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中,本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞,包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞,且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
根据本发明的实施例,所述重组细胞为真核细胞,优选为哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种制备抗体或抗原片段的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括将第五方面所述的重组细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养,以便获得所述抗体或抗原结合片段。由此,本发明的方法可用于生产前述的抗体或抗原结合片段。
偶联物和试剂盒
在本发明的第七方面,本发明提出了一种偶联物。根据本发明的实施例,所述偶联物包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白或依据第六方面所述的方法制备得到的抗体或抗原结合片段;以及偶联部分,所述偶联部分与所述抗体或抗原结合片段、或所述融合蛋白相连。本发明的偶联物具有11-脱氢血栓烷B2结合亲和力,可用于检测11-脱氢血栓烷B2、检测含有11-脱氢血栓烷B2的细胞。
根据本发明的一些实施方案,所述偶联部分包括选自为载体、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物和化疗剂中的至少之一。
在本文中,所述载体可以为能够在液相中悬浊或分散的物质(例如,粒子、磁珠等固相载体),或者为能够收容或搭载液相的固相(例如,板、膜、试管等支持体,以及孔板、微流路、玻璃毛细管、纳米柱、整体柱等的容器);也可以为用于对抗体或抗原结合片段、或融合蛋白进行标记的标记载体,例如酶(例如,过氧化物酶、碱性磷酸酶、虫萤光素酶(luciferin)、β半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如,链霉亲和素和生物素中的一者,相互互补的正义链和反义链的核酸中的一者)、荧光染料(例如,荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质)、发光物质(例如,虫萤光素、水母发光蛋白(Aequorin)、吖啶酯、三(2,2'联吡啶)钌、鲁米诺)、放射性同位素(例如,3H、14C、32P、35S、125I)以及金胶体等。
根据本发明的一些实施方案,所述载体选自酶。
根据本发明的一些实施方案,所述酶选自过氧化物酶、碱性磷酸酶、虫萤光素酶(luciferin)、β半乳糖苷酶的任意一种或多种。
根据本发明的实施例,所述药物为可与抗体或抗原结合片段、或融合蛋白结合的小分子药物。
根据本发明的实施例,所述蛋白标签包括但不限His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签和C-Myc标签等。
根据本发明的实施例,所述修饰物应作广义理解,可以指用于修饰蛋白的物质。示例性地,可以为聚乙二醇或其衍生物。
需要说明的是,偶联部分和抗体或抗原结合片段、或融合蛋白的结合方法,可以使用本领域公知的方法。例如,可以举出物理吸附法、共价结合法、利用亲和性物质(例如,生物素、链霉亲和素)的方法及离子结合法。
在本发明的第九方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本申请的实施例,所述试剂盒包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述表达载体、第五方面所述的重组细胞、依据第六方面所述的方法制备的抗体或抗原结合片段或第七方面所述的偶联物。根据本发明的实施例,所述抗体或其抗原结合片段能够高特异性结合11-脱氢血栓烷B2。在一些科学研究中,该试剂盒可用于定性或定量检测生物样本中的11-脱氢血栓烷B2,也可用于对个体状态进行判断,如获得所述个体的11-脱氢血栓烷B2水平后,判断其11-脱氢血栓烷B2水平是否高于或低于正常水平。
本发明所述的试剂盒按照竞争法的原理对试剂盒组成进行配制,包被磁微粒的抗原衍生物与待检样本中的抗原竞争液相中的标记抗体,磁微粒均匀分散在整个反应体系中,由于接触面的影响,待检样本中的抗原与抗体特异性结合速率要快于固相抗原与液相抗体的结合,速率差异越明显,抑制率越大,即灵敏度越高,越利于检出低浓度的待检抗原。
如前所述,本发明一些具体实施方式的抗体或抗原结合片段能够有效与11-脱氢血栓烷B2进行结合,因此,包含所述抗体或抗原结合片段的试剂或试剂盒能够有效的对11-脱氢血栓烷B2进行定性或定量检测。本发明提供的试剂或试剂盒,例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用11-脱氢血栓烷B2和抗体特异性结合性来检测的试剂或试剂盒等。
根据本发明的一些实施方案,所述试剂盒进一步包括如下附加技术特征的至少之一:
根据本发明的一些实施方案,所述试剂盒进一步包括第一磁微粒。
根据本发明的一些实施方案,所述试剂盒进一步包括第一磁微粒、肌酐抗体、第二磁微粒、11-脱氢血栓烷B2校准品、肌酐校准品以及发光底物液。
根据本发明的一些实施方案,所述抗体或抗原结合片段和所述肌酐抗体分别被生物标记物标记。
根据本发明的一些实施方案,所述生物标记物选自生物酶、荧光素和化学发光标记物中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案,所述生物酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少之一。
根据本发明的一些实施方案,所述第一磁微粒包被有11-脱氢血栓烷B2衍生物,所述第二磁微粒包被有肌酐衍生物。
根据本发明的一些实施方案,所述第一磁微粒和所述第二磁微粒分别选自磁性微球。
本发明所述的磁微粒为具有超顺磁和相应的磁场响应性的磁珠,根据磁珠表面基团类型,所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、硅基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、醛基磁珠、巯基磁珠以及链霉亲和素磁珠等,优选羧基磁珠。
根据本发明的一些实施方案,所述磁性微球表面修饰有活性基团。
根据本发明的一些实施方案,所述活性基团选自羟基、巯基、羧基、氨基、硅基、甲苯磺酰基、链霉亲和素,以及其衍生基团的至少一种。
根据本发明的一些实施方案,所述磁性微球的粒径为0.5~5μm。
根据本发明的一些实施方案,所述磁性微球的粒径为1-3μm。
根据本发明的一些实施方案,所述第一磁微粒与第二磁微粒相同或不同。其中,相同指磁珠粒径和表面基团均相同,不同磁珠的粒径或活性基团不同。
根据本发明的一些实施方案,所述底物液选自AMPPD和APS-5的至少一种。
用途和检测方法
在本发明的第八方面,本发明提出了第一方面所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测11-脱氢血栓烷B2。根据本发明的实施例,该抗体或抗原结合片段能够高特异性结合11-脱氢血栓烷B2。因此,包含所述抗体或抗原结合片段的试剂盒可用于高特异性、高灵敏度检测11-脱氢血栓烷B2。
在本发明的第十方面,本发明提出了一种检测11-脱氢血栓烷B2含量的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:采用第九方面所述的试剂盒对待测样本进行检测处理,以便确定所述待测样本中所述11-脱氢血栓烷B2的含量。本发明所述的方法能够高灵敏度检测11-脱氢血栓烷B2,且有利于对低浓度11-脱氢血栓烷B2的检测,此外,该方法具有特异性强、线性范围宽、操作简单,无需对样品进行前处理等优点。在临床实际应用中,可借助化学发光仪快速高通量检测大批量样本。
根据本发明的一些实施方案,所述检测处理包括:将所述待测样本与所述抗体或抗原结合片段进行第一混合处理,其中,所述抗体或抗原结合片段被生物标记物标记;将第一混合处理产物与所述第一磁微粒进行第二混合处理;将第二混合处理产物进行沉降处理,去除上清,得到第一沉淀;将所述第一沉淀与所述发光底物液进行第一接触处理,检测得到第一发光值RLU;基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量。
根据本发明的一些实施例,所述生物标记物选自生物酶、荧光素和化学发光标记物中的至少之一。
根据本发明的一些实施例,所述生物酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少之一。
根据本发明的一些实施例,所述抗体或抗原结合片段被生物标记物标记采用的方法可基于本领域已知任意方法获得,例如,在所述抗体或抗原结合片段中加入本领域常用活化剂2-Iminothiolane hydrochloride(2-IT,2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐),在生物标记物中加入本领域常用活化剂Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC,4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯),活化后的生物标记物与抗体或抗原结合片段的混合质量比例为(0.5~1.5):1。
根据本发明的一些实施方案,所述检测处理进一步包括:利用所述11-脱氢血栓烷B2校准品绘制11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线;其中,所述11-脱氢血栓烷B2校准品包含预定浓度梯度的11-脱氢血栓烷B2。
根据本发明的一些实施方案,所述基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量步骤包括:基于所述11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线以及所述第一发光值RLU,计算得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量。
根据本发明的一些实施方案,所述待测样本为尿液。
在本发明的第十一方面,本发明提出了一种检测11-脱氢血栓烷B2相对含量的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:采用第九方面所述的试剂盒对待测样本进行检测处理,以便确定所述待测样本中所述11-脱氢血栓烷B2的相对含量。由于11-脱氢血栓烷B2和肌酐都是小分子,小分子的自由度大,不利于与抗体结合的位点的暴露,也就不利于抗原与抗体的结合,而本发明的方法在测定样品中的11-脱氢血栓烷B2和肌酐的含量前,会让样品中的小分子抗原(11-脱氢血栓烷B2和肌酐)先与酶标抗体反应,再加入磁珠包被的小分子衍生物进行竞争,因此有利于低浓度抗原的检出,提高试剂灵敏度。此外,该方法具有特异性强、线性范围宽、操作简单,无需对样品进行前处理等优点。在临床实际应用中,可借助化学发光仪快速高通量检测大批量样本。
根据本发明的一些实施方案,所述检测处理包括:将所述待测样本与所述抗体或抗原结合片段、所述肌酐抗体分别进行第一混合处理、第二混合处理,其中,所述抗体或抗原结合片段和所述肌酐抗体分别被生物标记物标记;将第一混合处理产物与所述第一磁微粒进行第三混合处理,所述第一混合处理产物中含有所述抗体或抗原结合片段;将第二混合处理产物与所述第二磁微粒进行第四混合处理,所述第二混合处理产物中含有肌酐抗体;将第三混合处理产物、第四混合处理产物分别进行沉降处理,去除上清,得到第三沉淀和第四沉淀;将所述第三沉淀、所述第四沉淀分别与所述发光底物液进行第一接触处理、第二接触处理,检测得到第一发光值RLU和第二发光值RLU;基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量;基于第二发光值RLU,得到所述待测样本中肌酐的含量;基于下述的公式,确定所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的相对含量
根据本发明的一些实施例,所述生物标记物选自生物酶、荧光素和化学发光标记物中的至少之一。
根据本发明的一些实施例,所述生物酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少之一。
根据本发明的一些实施例,所述抗体或抗原结合片段和所述肌酐抗体分别被生物标记物标记采用的方法可基于本领域已知任意方法获得,例如,在所述抗体或抗原结合片段和所述肌酐抗体分别中加入本领域常用活化剂2-Iminothiolane hydrochloride(2-IT,2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐),在生物标记物中加入本领域常用活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC,4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯),活化后的生物标记物与抗体或抗原结合或片段或所述肌酐抗体的混合质量比例为(0.5~1.5):1。
根据本发明的一些实施方案,所述检测处理进一步包括:利用11-脱氢血栓烷B2校准品、肌酐校准品分别绘制11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线、肌酐浓度-发光值标准曲线;其中,所述11-脱氢血栓烷B2校准品包含预定浓度梯度的11-脱氢血栓烷B2;所述肌酐校准品包含预定浓度梯度的肌酐。
根据本发明的一些实施方案,所述基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量步骤包括:基于所述11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线以及所述第一发光值RLU,计算得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量。
根据本发明的一些实施方案,所述基于第二发光值RLU,得到所述待测样本中肌酐的含量步骤包括:基于所述肌酐浓度-发光值标准曲线以及所述第二发光值RLU,计算得到所述待测样本中肌酐的含量。
根据本发明的一些实施方案,所述待测样本为尿液。
在本申请的一个示例中,11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线由以下方法获得,包括:
(1)免疫反应:将50μL11-脱氢血栓烷B2校准品(11-脱氢血栓烷B2浓度分别为0pg/mL,100pg/mL,500pg/mL,2000pg/mL,5000pg/mL,10000pg/mL)与50μL被生物标记物标记的所述抗体或抗原结合片段依次加入反应管中,37℃条件下温育10min,再加入包被有11-脱氢血栓烷B2衍生物的第一磁微粒,37℃条件下继续温育10min;
(2)磁分离:将反应管置于磁场中,使磁微粒在磁场中沉降,去上清,去除磁场,加入200-500μL清洗液,然后再次使磁微粒在磁场中沉降,去除上清液;如此重复2-4次,以去除未反应的其他物质;
(3)读值:加入发光底物液200μL,2分钟后,读取发光值(RLU);
(4)根据检测的发光值使用Logistic四参数拟合,获得11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线。
在本发明的第十二方面,本发明提出了一种检测肌酐含量的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:采用第九方面所述的试剂盒对待测样本进行检测处理,以便确定所述待测样本中所述肌酐的含量。本发明所述的方法能够高灵敏度检测肌酐,且有利于对低浓度肌酐的检测,此外,该方法具有特异性强、线性范围宽、操作简单,无需对样品进行前处理等优点。在临床实际应用中,可借助化学发光仪快速高通量检测大批量样本。
根据本发明的一些实施方案,所述检测处理包括:将所述待测样本与所述肌酐抗体进行第一混合处理,其中,所述肌酐抗体被生物标记物标记;将第一混合处理产物与所述第一磁微粒进行第二混合处理;将第二混合处理产物进行沉降处理,去除上清,得到第一沉淀;将所述第一沉淀与所述发光底物液进行第一接触处理,检测得到第一发光值RLU;基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中肌酐的含量。
根据本发明的一些实施例,所述生物标记物选自生物酶、荧光素和化学发光标记物中的至少之一。
根据本发明的一些实施例,所述生物酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少之一。
根据本发明的一些实施例,所述肌酐抗体被生物标记物标记采用的方法可基于本领域已知任意方法获得,例如,在所述肌酐抗体中加入本领域常用活化剂2-Iminothiolanehydrochloride(2-IT,2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐),在生物标记物中加入本领域常用活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC,4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯),活化后的生物标记物与抗体或抗原结合片段的混合质量比例为(0.5~1.5):1。
根据本发明的一些实施方案,所述检测处理进一步包括:利用所述肌酐校准品绘制肌酐浓度-发光值标准曲线;其中,所述肌酐校准品包含预定浓度梯度的肌酐。
根据本发明的一些实施方案,所述基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中肌酐的含量步骤包括:基于所述肌酐浓度-发光值标准曲线以及所述第一发光值RLU,计算得到所述待测样本中肌酐的含量。
根据本发明的一些实施方案,所述待测样本为尿液。
上述检测试剂盒及其检测方法具有以下有益效果:
本发明对尿11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐的测定均基于免疫竞争法,利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理,使两个指标可以在发光仪上同步检测,具有灵敏度好、准确度高、线性范围宽、特异性强、操作简单,且不受内源性生物素的干扰的优势,为临床评估血小板活性或阿司匹林抗血小板效果提供了一种更准确、方便和快捷的方法。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
其中,
全自动化学发光分析仪:科斯迈SMART 500H;
11-脱氢血栓烷B2衍生物:偶联有BSA,购自美国CD公司;
11-脱氢血栓烷B2:购自美国Cyman公司;
2,3-dinor血栓烷B2:购自美国Cyman公司;
肌酐抗体:羊多抗,购自美国CD公司;
肌酐衍生物:偶联有BSA,购自美国CD公司;
肌酐:购自Sigma公司;
磁珠:带有羧基基团,粒径1.0-3.0μm,购自日本JSR公司;
碱性磷酸酶(ALP):购自英国BBI公司;
EDC:购自Sigma公司;
发光底物液:来自本公司自研试剂,主要成分为APS-5;
包被缓冲液:0.05mmol/L MES(生物缓冲液),pH 6.0;
封闭液:100mmol/L甘氨酸,10%BSA(牛血清白蛋白),pH 7.4;
清洗液:10mmo/L PB(磷酸缓冲液),0.05%Tw-20,pH 7.4;
包被保存液:50mmo/L PB(磷酸缓冲液),1.0%BSA(牛血清白蛋白),pH 7.4;
酶标保存液:50mmo/L PB(磷酸缓冲液),1.0%BSA(牛血清白蛋白),pH 7.4;
校准品稀释液:50mmol/L PBST(磷酸盐缓冲液)。
本文中涉及的氨基酸序列如表1所示:
表1:氨基酸序列
除非另外指明,否则实践本公开将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.);《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,2011),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
在本发明实施例中,制备表达载体用到的核苷酸序列可根据其氨基酸序列采用常规方法或常规的软件(例如在线程序Vectorbuilder(网址:https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)、GeneOptimizer在线程序等)得到。
实施例1:单克隆抗体的大量制备
1.用N-羟基琥珀酰亚胺酯法将11-脱氢血栓烷B2与KLH(血蓝蛋白)偶联,作为11-脱氢血栓烷B2免疫原。
2.选取6~8周龄的BALB/c小鼠进行如下免疫程序:初次免疫时,用25μg11-脱氢血栓烷B2免疫原与等量弗式完全佐剂混合,经乳化后皮下多点注射;首次免疫后14天,用12.5μg11-脱氢血栓烷B2免疫原与弗氏不完全佐剂混合,乳化后加强免疫。二次免疫后14天,用12.5μg11-脱氢血栓烷B2免疫原与弗氏不完全佐剂混合,乳化后加强免疫。三次免疫后14天采血并分离血清,用1μg/mL11-脱氢血栓烷B2衍生物包被ELISA板,进行间接ELISA试验,测定血清效价。
结果显示制备的鼠抗血清效价大于7.2万,典型的免疫小鼠血清检测结果参见表2。
表2:免疫小鼠血清检测结果
血清稀释倍数 | OD450 |
100 | 1.754 |
300 | 1.707 |
900 | 1.646 |
2700 | 1.548 |
8100 | 1.388 |
24300 | 0.991 |
72900 | 0.596 |
空白 | 0.137 |
3.在上述免疫小鼠中进行细胞融合,具体过程如下:摘出小鼠眼球取血后,脱臼处死小鼠,放入70%酒精瓶中放置2分钟后,于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上,解开腹部皮肤找到脾脏,用镊子取下,放入200目不锈钢滤膜中轻轻研碎,用DMEM培养基(Thermo,11965092)轻轻冲洗下细胞,之后200×g室温离心10分钟,弃上清后备用;制备饲养细胞时,脱臼处死小鼠,放入70%酒精瓶中放置2分钟后,于生物安全柜内将小鼠固定于泡沫板上,解开腹部皮肤,用注射器吸取PBS轻轻注入腹膜下,从另一边再将含有饲养细胞的液体洗出,之后200×g室温离心10分钟,弃上清后备用。将2.0×107个FO骨髓瘤细胞与2.0×108个脾细胞混匀,离心机中200×g离心10分钟,弃上清,轻微振荡混匀,于37℃水浴中,在90秒内滴加1ml体积浓度为50%的PEG-1450(Merk,P1458)水溶液,然后滴加20mL DMEM培养基,离心机中200×g离心10分钟,弃上清,重复洗一次,离心机中200×g离心10分钟,弃上清,得到杂交瘤细胞,将细胞铺到10块96孔培养板中,每孔150μL。将饲养层细胞10000个细胞/孔加入上述10块96孔细胞培养板中,每孔100μL,将培养板标记好后,放入37℃的含5% CO2的细胞培养箱中培养,第二日加入HAT筛选培养基(Merk,H0262),再用HAT选择培养1~2天内,将有大量瘤细胞死亡,3~4天后瘤细胞消失,杂交细胞形成小集落,HAT筛选培养液维持7~10天后应换用HT培养液(Merk,H0137),再维持2周,改用20% FBS(ExCell,FSP500)的DMEM培养基继续培养。在上述选择培养期间,杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间,一般每2~3天换一半培养液。
4.通过正交实验确定11-脱氢血栓烷B2衍生物作为抗原最佳包被量。将0.5、1.0、2.0、4.0μg的11-脱氢血栓烷B2衍生物包被96孔板,每个浓度6个孔分别设置为3个阳性和3个阴性。用不同稀释倍数的11-脱氢血栓烷B2免疫鼠阳性血清进行方正滴定,同时以未免疫鼠阴性血清作为阴性对照。用每孔0.5μg纯化的11-脱氢血栓烷B2衍生物包被96孔ELISA板,4℃过夜;PBST洗涤2次;每孔加入200μL的1%BSA的PBS,室温封闭2小时后置于三折纸上拍干;加样:加待检样品0.1mL于反应孔中,置37℃温育1小时,然后洗涤,同时做空白孔(不加样品),阴性对照孔及阳性对照孔。各反应孔中加入新稀释的抗体0.1mL,置37℃温育1小时,然后洗涤3次。加酶标二抗:各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1mL。37℃温育1小时,洗涤3次。加底物液显色:各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL,室温静置10分钟。各反应孔中加入1M H2SO40.1 mL。测OD值判断结果,使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。以阴性对照OD值的2.1倍以上为阳性(以空白对照孔调零后计算)。挑选出抗11-脱氢血栓烷B2的杂交瘤细胞单克隆。
按照上述方法,将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,通过有限稀释法将原有的孔用HAT选择培养基稀释后重新分到96孔培养板中,之后观察细胞的形态和数量。调整细胞为3~10个细胞/mL。取前一日准备的饲养细胞层的细胞培养板,每孔加入稀释细胞100μL。于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。在第7天换液,以后每2~3天换液1次。8~9天可见细胞克隆形成,及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。每个克隆应尽快冻存,最终选定克隆号11DH025杂交瘤细胞株用于抗体生产。
5.通过腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂于8周龄BALB/C鼠,2周后腹腔注射1×106个克隆号11DH025的杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一只小鼠可获5~10ml腹水。也可用注射器抽提腹水,可反复收集数次。将获得的腹水于3000×g离心10分钟,弃去上层油脂和底部沉淀,收集上清分装于-20℃,腹水上清解冻并平衡至室温后,加入1/10体积的1M Tris-HCl PH8.0,使样品PH值至8.0。用20个柱体积100mMPH=8.0的Tris-HCl平衡protein G亲和柱中,将调节PH至8.0后的腹水上清上柱,之后用20个柱体积100mM PH=8.0的Tris-HCl洗涤,最后用100mM Glycine-HCL PH 2.5洗脱抗体(即11-脱氢血栓烷B2抗体11DH025,可简称抗体11DH025或11DH025)。将抗体洗脱液加入到浓缩管(Millipore,UFC801008,10K)中离心机(湘仪,L550)室温3000×g离心20分钟。分批离心至溶液体积至1ml/浓缩管(2管),加入10mM PBS PH=7.4缓冲液4mL,继续室温3000×g离心20分钟。重复离心3次,使抗体的缓冲液为10mM PBS PH=7.4,加入10mM PBS PH=7.4至总体积10mL。最后将浓缩后的抗体溶液2mL/管分装于离心管中,-80℃中保存。利用BCA试剂盒(索莱宝,PC0020)测定抗体浓度,测定纯化后的单克隆抗体浓度为1.832mg/mL。
实施例2:抗体效价测定
利用ELISA间接法检测11-脱氢血栓烷B2抗体11DH025的效价。将11-脱氢血栓烷B2衍生物用PBS稀释,以0.2μg/mL、100μL/孔包被于96孔酶标板中,4℃过夜后,酶标板用PBST溶液清洗2次,每次清洗300μL/孔,清洗后拍干。用1%BSA的PBS溶液,200μL/孔封闭酶标板,室温2小时,封闭后拍干;加入PTB稀释至20ng/mL的11-脱氢血栓烷B2抗体11DH025,37℃恒温箱中反应1小时,酶标板用PBST溶液清洗2次,每次清洗300μL/孔。清洗后拍干。加入PTB稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠抗体,37℃恒温箱中反应1小时,酶标板用PBST溶液清洗2次,每次清洗300μL/孔。清洗后拍干。加入TMB底物溶液,100μL/孔室温反应10分钟,加入100μL/孔的1M H2SO4终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果参见表3,可见纯化后的抗体效价大于160万。
表3:抗体效价测定结果
实施例3:单克隆抗体的序列分析
(1)单克隆抗体亚型鉴定
将杂交瘤细胞株11DH025用加有10%血清的DMEM培养基(GIBCO,#C11995500BT)培养在10cm直径的细胞培养皿中(37℃、5% CO2)。培养7天后将细胞转移至15ml离心管中,血球计数板计数后取出4×106个细胞,以200×g离心5分钟后,弃上清,并将离心管倒置,将管内液体控干。管内细胞利用QIAGEN公司的反转录试剂盒(Qiagen,74134)合成cDNA。
抗体亚型是通过用抗体亚型特异的引物做PCR确定的。上述合成的cDNA被用来作为PCR反应模板。PCR反应溶液体系:TAKARA Ex Taq(5U/μL,TAKARA,RR001B),0.25μL;10×Ex Taq Buffer,5μL;dNTP混合物(各2.5mM),4μL;模板cDNA,1μL;上游引物(100μM),1μL;下游引物(100μM),1μL;加入双蒸水至总体积50μL。PCR反应温度程序:94℃5分钟预变性,温度循环30次(94℃1分钟,57℃1分钟,72℃1分钟),72℃10分钟延伸。反应结束后,PCR产物各取10μL上样于1%琼脂糖凝胶中进行电泳,各泳道所加样品顺序如表5所示。根据PCR产物结果可以推断出抗体的亚型(表4),具体结果参见图8。本发明获得的单克隆抗体11DH025为重链为IgG1,轻链为kappa。
表4:PCR引物信息
其中S=C or G,M=A or C,R=A or G,and W=A or T。
表5:抗体信息
(2)杂交瘤细胞株11DH025抗体可变区(V区)测序
将本实施例步骤(1)中细胞株11DH025的抗体的V区在PCR扩增后得到的片段从琼脂糖凝胶上切割下来,并用DNA抽提试剂盒(Qiagen,74134)提取出来。提取得到的DNA片段被与pEASY-T1克隆载体链接,并被转化到Trans1-T1感受态细胞中(Transgen,CT101-1)。转化的细菌菌落被挑取到LB培养基中,经过过夜培养后进行DNA测序。本发明提供的识别11-脱氢血栓烷B2的抗体(11DH025)的轻链V区核酸序列如SEQ ID NO:8所示,重链V区的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
实施例4:利用11-脱氢血栓烷B2抗体制备的试剂盒
1.磁珠-抗原复合物的制备(粒径1.0-3.0μm)
磁珠-抗原复合物指包被有11-脱氢血栓烷B2衍生物的磁微粒A,或包被有肌酐衍生物的磁微粒B,分别用于11-脱氢血栓烷B2检测与肌酐检测,其制备过程分别如下:
磁微粒A的制备:将混合均匀的磁珠(磁珠在体系中的浓度为0.01-5mg/mL)外加磁场去掉上清,用包被缓冲液清洗一次,然后加入活化剂EDC至0.01-2mg/mL,常温震荡反应0.5-2h,然后加磁场去上清,加入包被缓冲液及适量11-脱氢血栓烷B2衍生物(11-脱氢血栓烷B2衍生物在体系中的浓度为0.1-5μg/mL),常温震荡反应1-3h,反应结束后加磁场去上清,加入封闭液,继续震荡反应1-3h,封闭结束后用清洗液清洗磁珠3次,最后用包被保存液稀释磁微粒A至使用浓度,4℃保存即可。
磁微粒B的制备:将混合均匀的磁珠(磁珠在体系中的浓度为0.01-5mg/mL)外加磁场去掉上清,用包被缓冲液清洗一次,然后加入活化剂EDC至0.01-2mg/mL,常温震荡反应0.5-2h,然后加磁场去上清,加入包被缓冲液及肌酐衍生物(肌酐衍生物在体系中的浓度为0.1-5μg/mL),常温震荡反应1-3h,反应结束后加磁场去上清,加入封闭液,继续震荡反应1-3h,封闭结束后用清洗液清洗磁珠3次,最后用包被保存液稀释磁微粒A至使用浓度,4℃保存即可。
2.碱性磷酸酶标记抗体的制备
碱性磷酸酶标记抗体指碱性磷酸酶标记的由前面实施例制备的11-脱氢血栓烷B2抗体,或碱性磷酸酶标记的肌酐抗体,在检测过程中分别与磁微粒A上连接的11-脱氢血栓烷B2衍生物和磁微粒B上连接的肌酐衍生物结合,用于11-脱氢血栓烷B2检测与尿肌酐检测,其制备过程分别如下:
(1)碱性磷酸酶标记的11-脱氢血栓烷B2抗体的制备:
取1.0mg由前面实施例制备得到的11-脱氢血栓烷B2抗体,浓缩至2.5mg/mL,加入浓度为13.76mg/mL的活化剂2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(2-IT)溶液5μL,室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐,收集活化后的11-脱氢血栓烷B2抗体。
取1.2mg碱性磷酸酶,浓缩至2.5mg/mL,加入浓度为6.69mg/mL的活化剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)溶液12μL,室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐,收集活化后的碱性磷酸酶。
将活化后的11-脱氢血栓烷B2抗体与碱性磷酸酶,按1.0mg的抗体加入1.0mg碱性磷酸酶的比例混合(质量比为1:1),放置4℃下反应18小时。
使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化,除去未连接的11-脱氢血栓烷B2抗体和碱性磷酸酶,将连接物保存于4℃。使用时,用酶标保存液稀释至使用浓度即可。
(2)碱性磷酸酶标记的肌酐抗体的制备:
取1.0mg的肌酐抗体,浓缩至2.5mg/mL,加入浓度为13.76mg/mL的活化剂2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(2-IT)溶液5μL,室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐,收集活化后的肌酐抗体。
取1.2mg碱性磷酸酶,浓缩至2.5mg/mL,加入浓度为6.69mg/mL的活化剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)溶液12μL,室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐,收集活化后的碱性磷酸酶。
将活化后的肌酐抗体与碱性磷酸酶,按1.0mg的抗体加入1.0mg碱性磷酸酶的比例混合(质量比为1:1),放置4℃下反应18小时。
使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化,除去未连接的肌酐抗体和碱性磷酸酶,将连接物保存于4℃。使用时,用酶标保存液稀释至使用浓度即可。
3.除步骤1和步骤2制备的磁珠-抗原复合物和碱性磷酸酶标记抗体外,试剂盒中还有校准品以及发光底物液,其中,校准品为由校准品稀释液和不同水平的11-脱氢血栓烷B2与不同水平的肌酐混合溶液组成,发光底物液,来自公司自研试剂盒,主要成分为APS-5。
实施例5:试剂盒的磁微粒分离化学发光免疫检测方法
采用实施例4的试剂盒进行检测尿液中11-脱氢血栓烷B2的相对含量的步骤如下:
1.11-脱氢血栓烷B2一步半法检测程序:
(a1)免疫反应:将50μL的校准品与50μL碱性磷酸酶标记的11-脱氢血栓烷B2抗体依次加入反应管中,37℃条件下温育10min,再加入50μL包被有11-脱氢血栓烷B2衍生物的磁微粒A,37℃条件下继续温育10min,其中,所述校准品由校准品稀释液和不同水平的11-脱氢血栓烷B2(11-脱氢血栓烷B2浓度分别为0pg/mL,100pg/mL,500pg/mL,2000pg/mL,5000pg/mL,10000pg/mL)组成的混合溶液;
(a2)磁分离:将孵育完成的反应管置于磁场中,使磁微粒在磁场中沉降,去上清,去除磁场,加入200-500μL清洗液,然后再次使磁微粒在磁场中沉降,去除上清液;如此重复2-4次,以去除未反应的其他物质;
(a3)读值:加入发光底物液200μL,2分钟后,读取发光值(RLU);
(a4)根据检测的数值使用Logistic四参数拟合,获得11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线。
(a5)重复上述(a1)~(a3)步骤,检测待测尿液样本,读取对应的发光值(RLU);
(a6)将待测尿液样本的发光值带入步骤(a4)拟合的Logistic四参数方程,即可计算出待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量。
2.肌酐一步半法检测程序:
(b1)免疫反应:将50μL的校准品与50μL碱性磷酸酶标记的肌酐抗体依次加入反应管中,37℃条件下温育10min,再加入包被有肌酐衍生物的磁微粒B,37℃条件下继续温育10min,其中,所述校准品由校准品稀释液(50mmol/L的PBST缓冲液)和不同水平的肌酐(肌酐浓度分别为0mg/dL,0.5mg/dL,2.5mg/dL,5mg/dL,10mg/dL,20mg/dL)组成的混合溶液;
(b2)磁分离:将反应管置于磁场中,使磁微粒在磁场中沉降,去上清,去除磁场,加入200-500μL清洗液,然后再次使磁微粒在磁场中沉降,去除上清液;如此重复2-4次,以去除未反应的其他物质;
(b3)读值:加入发光底物液200μL,2分钟后,读取发光值(RLU);
(b4)根据检测的数值使用Logistic四参数拟合,获得肌酐浓度-发光值标准曲线。
(b5)待测尿液样本稀释10倍后,取50μL检测,重复上述(b1)~(b3)步骤,读取对应的发光值(RLU);
(b6)将稀释样本的发光值带入步骤(b4)拟合的Logistic四参数方程,计算稀释样本中肌酐的含量,结果乘以10,即为待测尿样的肌酐浓度。
3.11-脱氢血栓烷B2/肌酐(11-脱氢血栓烷B2相对含量)结果计算公式:
实施例6:试剂盒性能检测
1.试剂盒标定曲线
使用本发明的试剂盒按照实施例5所述的方法测定含有不同水平11-脱氢血栓烷B2以及不同水平肌酐的校准品,分别得到11-脱氢血栓烷B2校准曲线(如图1所示)与肌酐校准曲线(如图2所示)。
2.试剂盒重复性
使用本发明的试剂盒按照实施例5所述的方法分别重复测定高、低两个水平的质控品10次。实验结果如表6所示,说明本发明的试剂盒的重复性CV控制在5%以内,重复性良好。
表6:重复性检测数据与分析
3.试剂盒线性
用本发明中校准品稀释液按比例稀释试剂盒高浓度校准品,分析试剂盒线性,如图3、4所示。本发明试剂盒中11-脱氢血栓烷B2检测体系(磁微粒A和碱性磷酸酶标记的11-脱氢血栓烷B2抗体)线性可达10000pg/mL,肌酐检测体系(磁微粒B和碱性磷酸酶标记的肌酐抗体)线性可达20mg/dL。
4.11-脱氢血栓烷B2检测体系特异性
为验证本发明的试剂盒中的11-脱氢血栓烷B2检测体系(磁微粒A和碱性磷酸酶标记的11-脱氢血栓烷B2抗体)对11-脱氢血栓烷B2具有特异性,采用本发明试剂盒中的11-脱氢血栓烷B2检测体系对血栓烷素A2在尿液中的另一种代谢物2,3-dinor血栓烷B2做了特异性分析,将2,3-dinor血栓烷B2用本发明中的校准品稀释液稀释至0.02ng/mL、0.2ng/mL、2ng/mL、20ng/mL的梯度浓度,用本发明中的11-脱氢血栓烷B2检测体系进行测试,每个梯度浓度重复测定3次,结果均未检出浓度值(数据未展出),说明不存在交叉反应,本发明中的11-脱氢血栓烷B2检测体系特异性较好。
5.试剂盒相关性
收集29例需检测的尿液样本,11-dhTXB2浓度分别用商用试剂盒(ELISA法,来自Corgenix)与本发明试剂盒中的11-脱氢血栓烷B2检测体系(磁微粒A和碱性磷酸酶标记的11-脱氢血栓烷B2抗体)进行测定,肌酐浓度分别用市售酶法试剂盒和本发明试剂盒中的肌酐检测体系(磁微粒B和碱性磷酸酶标记的肌酐抗体)进行测定。检测数据见表7,相关性分析如图5、图6所示,检测结果表明本发明的试剂盒检测11-dhTXB2/CRE样本的准确度较高,能满足临床检测需求。
表7:相关性检测数据
综上所述,本发明利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合,使尿11-脱氢血栓烷B2和尿肌酐两个指标可以在发光仪上基于免疫竞争法原理,实现同步检测,操作简便,消除了因检测时间差异对不同测定结果产生偏差的可能,重复性和准确度好,线性范围宽,其中尿11-脱氢血栓烷B2检测线性可达10ng/mL,另外,各检测体系均采用相应小分子衍生物直接包被磁珠的方式,试剂灵敏度高,且不受内源性生物素的干扰,特异性强。为临床评估阿司匹林代谢能力提供了一种更准确、方便和快捷的方法。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (19)
1.一种抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括选自下列至少之一的CDR序列:
重链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3;
轻链可变区的CDR序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段包括HCDR1~3和LCDR1~3;其中,
所述HCDR1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
所述HCDR2具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;
所述HCDR3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;
所述LCDR1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;
所述LCDR2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;和
所述LCDR3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段包括重链框架区和/或轻链框架区;
任选地,所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于鼠源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一;
任选地,所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于鼠源抗体或其突变体和人源抗体或其突变体中的至少之一;
任选地,所述抗体或抗原结合片段包括:
具有氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区;和
具有氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,进一步包括重链恒定区和/或轻链恒定区;
任选地,所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一;
任选地,所述重链恒定区包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区;或者
所述轻链恒定区包括选自κ型或λ型轻链恒定区;
任选地,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源抗体或其突变体和人源抗体或其突变体中的至少之一;
任选地,所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连;和/或
所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的C端相连;
任选地,所述重链恒定区具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;和/或
所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列;
任选地,所述抗体包括多抗、全长单抗、F(ab’)2抗体、Fab’抗体、Fab抗体、F(ab)2抗体、Fv抗体、单链抗体以及最小识别单位中的至少之一;或者
所述抗原结合片段包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一;
任选地,所述抗体或抗原结合片段包括:
具有氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链;和
具有氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
5.一种融合蛋白,其特征在于,包括:
权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段;和
生物活性蛋白或其片段;
任选地,所述生物活性蛋白或其片段包括选自蛋白标签、白蛋白或其片段和Fc片段中的至少之一。
6.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5所述的融合蛋白;
任选地,所述核酸分子为DNA。
7.一种表达载体,其特征在于,携带权利要求6所述的核酸分子;
任选地,所述表达载体包括选自真核表达载体或原核表达载体。
8.一种重组细胞,其特征在于,包括:
携带权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体;或
表达权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求5所述的融合蛋白;
任选地,所述重组细胞是通过将权利要求7所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
9.一种制备权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法,其特征在于,包括:
将权利要求8所述的重组细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养,以便获得所述抗体或抗原结合片段。
10.一种偶联物,其特征在于,包含:
权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5所述的融合蛋白、或依据权利要求9所述的方法制备得到的抗体或抗原结合片段;以及
偶联部分,所述偶联部分与所述抗体或抗原结合片段、或者所述融合蛋白相连;
任选地,所述偶联部分包括选自载体、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物和化疗剂中的至少之一。
11.权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测11-脱氢血栓烷B2。
12.一种试剂盒,其特征在于,包括:
权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的重组细胞、依据权利要求9所述的方法制备得到的抗体或抗原结合片段或权利要求10所述的偶联物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括第一磁微粒;
任选地,进一步包括肌酐抗体、第二磁微粒、11-脱氢血栓烷B2校准品、肌酐校准品以及发光底物液;
任选地,所述抗体或抗原结合片段和所述肌酐抗体分别被生物标记物标记;
任选地,所述生物标记物选自生物酶、荧光素和化学发光标记物中的至少之一;
任选地,所述生物酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少之一;
任选地,所述第一磁微粒包被有11-脱氢血栓烷B2衍生物;
任选地,所述第二磁微粒包被有肌酐衍生物;
任选地,所述第一磁微粒和所述第二磁微粒分别选自磁性微球;
任选地,所述磁性微球表面修饰有活性基团;
任选地,所述活性基团选自羟基、巯基、羧基、氨基、硅基、甲苯磺酰基、链霉亲和素,以及其衍生基团的至少一种;
任选地,所述磁性微球的粒径为0.5~5μm;
任选地,所述发光底物液选自AMPPD和APS-5的至少一种。
14.一种检测11-脱氢血栓烷B2含量的方法,其特征在于,包括;
采用权利要求12或13所述的试剂盒对待测样本进行检测处理,以便确定所述待测样本中所述11-脱氢血栓烷B2的含量。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述检测处理包括:
将所述待测样本与所述抗体或抗原结合片段进行第一混合处理,其中,所述抗体或抗原结合片段被生物标记物标记;
将第一混合处理产物与所述第一磁微粒进行第二混合处理;
将第二混合处理产物进行沉降处理,去除上清,得到第一沉淀;
将所述第一沉淀与所述发光底物液进行第一接触处理,检测得到第一发光值RLU;
基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量;
任选地,所述生物标记物选自生物酶、荧光素和化学发光标记物中的至少之一;
任选地,所述生物酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少之一。
16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述检测处理进一步包括:
利用所述11-脱氢血栓烷B2校准品绘制11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线;其中,
所述11-脱氢血栓烷B2校准品包含预定浓度梯度的11-脱氢血栓烷B2;
任选地,所述基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量步骤包括:
基于所述11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线以及所述第一发光值RLU,计算得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量;
任选地,所述待测样本为尿液。
17.一种检测11-脱氢血栓烷B2相对含量的方法,其特征在于,包括;
采用权利要求12或13所述的试剂盒对待测样本进行检测处理,以便确定所述待测样本中所述11-脱氢血栓烷B2的相对含量。
18.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,所述检测处理包括:
将所述待测样本与所述抗体或抗原结合片段、所述肌酐抗体分别进行第一混合处理、第二混合处理,其中,所述抗体或抗原结合片段和所述肌酐抗体分别被生物标记物标记;
将第一混合处理产物与所述第一磁微粒进行第三混合处理,所述第一混合处理产物中含有所述抗体或抗原结合片段;
将第二混合处理产物与所述第二磁微粒进行第四混合处理,所述第二混合处理产物中含有肌酐抗体;
将第三混合处理产物、第四混合处理产物分别进行沉降处理,去除上清,得到第三沉淀和第四沉淀;
将所述第三沉淀、所述第四沉淀分别与所述发光底物液进行第一接触处理、第二接触处理,检测得到第一发光值RLU和第二发光值RLU;
基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量;
基于第二发光值RLU,得到所述待测样本中肌酐的含量;
基于下述的公式,确定所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的相对含量
任选地,所述生物标记物选自生物酶、荧光素和化学发光标记物中的至少之一;
任选地,所述生物酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少之一。
19.根据权利要求18所述的方法,其特征在于,所述检测处理进一步包括:
利用所述11-脱氢血栓烷B2校准品、所述肌酐校准品分别绘制11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线、肌酐浓度-发光值标准曲线;其中,
所述11-脱氢血栓烷B2校准品包含预定浓度梯度的11-脱氢血栓烷B2;
所述肌酐校准品包含预定浓度梯度的肌酐;
任选地,所述基于第一发光值RLU,得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量步骤包括:
基于所述11-脱氢血栓烷B2浓度-发光值标准曲线以及所述第一发光值RLU,计算得到所述待测样本中11-脱氢血栓烷B2的含量;
任选地,所述基于第二发光值RLU,得到所述待测样本中肌酐的含量步骤包括:
基于所述肌酐浓度-发光值标准曲线以及所述第二发光值RLU,计算得到所述待测样本中肌酐的含量;
任选地,所述待测样本为尿液。
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