CN118251489A - 使用靶向调节rna的反义寡核苷酸调控基因转录 - Google Patents

Abstract

本文描述了使用靶向调节RNA(例如启动子相关RNA和增强子RNA)的反义寡核苷酸(ASO)调控OTC基因转录的方法。这些方法可用于增加鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的表达，从而治疗与异常基因表达相关的疾病。

Description

使用靶向调节RNA的反义寡核苷酸调控基因转录

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年9月3日提交的美国临时申请号63/240,838和2021年12月22日提交的美国临时申请号63/292,792的权益；它们中的每一个通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有已通过EFS网提交并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ASCII拷贝于20XX年某月XX日创建，名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，并且大小是X,XXX,XXX字节。

发明领域

本发明涉及使用靶向OTC调节RNA(例如启动子相关RNA和增强子RNA)的反义寡核苷酸(ASO)上调或下调OTC基因转录的方法。

背景技术

转录因子结合启动子和增强子DNA元件中的特定序列来调节基因转录。最近有报道称，活性启动子和增强子元件本身被转录，产生非编码调节RNA(regRNA)，例如启动子相关RNA(paRNA)和增强子RNA(eRNA)(参见Sartorelli和Lauberth，Nat.Struct.Mol.Biol.(2020)27,521-28)。与编码RNA不同，regRNA是双向转录的。已经针对regRNA的功能提出了各种模型，包括核小体重塑(参见Mousavi等人,Mol.Cell(2013)51(5):606-17)、增强子-启动子循环的调控(参见Lai等人,Nature(2013)494(7438):497-501)以及与转录调节因子的直接相互作用(参见Sigova等人,Science(2015)350,978-81)。

基因表达通常被认为是不可成药的生物过程。尽管不断努力了解基因转录和regRNA的生物学，但临床上合适的调控基因表达的方法仍然有限。仍然需要新的和有用的方法来治疗与异常基因表达相关的疾病。

发明内容

本发明提供了靶向调节RNA(例如启动子相关RNA和增强子RNA)的反义寡核苷酸(ASO)，以及使用这些ASO来调节基因表达的方法。这些方法可用于调控基因产物的水平，例如调控致病基因如鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的表达水平，从而治疗与异常基因表达相关的疾病如尿素循环障碍。

一方面，本文提供与人鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的调节RNA的至少8个连续核苷酸互补的反义寡核苷酸(ASO)，其中所述调节RNA具有选自由SEQ ID NO:1-4或1077组成的组的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO与regRNA中距regRNA 3'末端不超过200个核苷酸的序列互补。

在一些实施方案中，ASO与regRNA中距regRNA 5'末端不超过200个核苷酸的序列互补。

在一些实施方案中，regRNA不是聚腺苷酸化RNA。

在一些实施方案中，ASO不诱导RNA酶H介导的regRNA降解。

在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，并且ASO包含选自由SEQ ID NO:6-14、18-35、39、41、75、76、77、78、87-124或143-892组成的组的核苷酸序列。

在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，并且ASO包含SEQ IDNO:15-17、36-38、64-74、125-142或893-1029的核苷酸序列。

在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，并且ASO包含SEQ IDNO:17的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO的长度不超过50、40、30或25个核苷酸。

在一些实施方案中，ASO包含含有一个或多个化学修饰的RNA多核苷酸。

在一些实施方案中，ASO的5'端的至少3、4或5个核苷酸和3'端的至少3、4或5个核苷酸包含具有一个或多个化学修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，一个或多个化学修饰包括核苷酸糖修饰，其包含2′-O—C1-4烷基如2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-脱氧(2'-H)、2′-O—C1-3烷基-O—C1-3烷基如2'-甲氧基乙基(“2'-MOE”)、2'-氟(“2'-F”)、2'-氨基(“2'-NH2”)、2'-***糖基(“2′-***糖(arabino)”)核苷酸、2'-F-***糖基(“2′-F-***糖”)核苷酸、2'-锁定核酸(“LNA”)核苷酸、2'-酰胺桥核酸(AmNA)、2'-未锁定核酸(“ULNA”)核苷酸、L型糖(“L-糖”)、4'-硫代核糖基核苷酸、受限乙基(cET)、2'-氟-***糖基(FANA)或硫代吗啉代中的一个或多个。

在一些实施方案中，一个或多个化学修饰包括核苷酸间键修饰，其包含硫代磷酸酯(phosphorothioate)(“PS”或(P(S)))、氨基磷酸酯(P(NR1R2)例如二甲氨基氨基磷酸酯(P(N(CH3)2))、膦酰基羧酸酯(P(CH2)nCOOR)例如膦酰基乙酸酯“PACE”(P(CH2COO-))、硫代膦酰基羧酸酯((S)P(CH2)nCOOR)例如硫代膦酰基乙酸酯“硫代PACE”((S)P(CH2COO-))、烷基膦酸酯(P(C1-3烷基)例如甲基膦酸酯—P(CH3)、硼基膦酸酯(P(BH3))或二硫代磷酸酯(P(S)2)中的一个或多个。

在一些实施方案中，一个或多个化学修饰包括核碱基修饰，其包含2-硫尿嘧啶(“2-硫代U”)、2-硫胞嘧啶(“2-硫代C”)、4-硫尿嘧啶(“4-硫代U”)、6-硫鸟嘌呤(“6-硫代G”)、2-氨基腺嘌呤(“2-氨基A”)、2-氨基嘌呤、假尿嘧啶、次黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(“5-甲基C”)、5-甲基尿嘧啶(“5-甲基U”)、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5,6-脱氢尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-烯丙基尿嘧啶(“5-烯丙基U”)、5-烯丙基胞嘧啶(“5-烯丙基C”)、5-氨基烯丙基尿嘧啶(“5-氨基烯丙基U”)、5-氨基烯丙基-胞嘧啶(“5-氨基烯丙基C”)、脱碱基核苷酸、Z碱基、P碱基、非结构核酸(“UNA”)、异鸟嘌呤(“异G”)、异胞嘧啶(“异C”)、甘油核酸(GNA)、甘油核酸(GNA)，或硫代磷酰胺吗啉(TMO)中的一个或多个。

在一些实施方案中，一个或多个化学修饰包含2'-O-甲氧基乙基、胞苷上的5-甲基、锁定核酸(LNA)、磷酸二酯(PO)核苷酸间键或硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键。

在一些实施方案中，一个或多个化学修饰包含2'-O-甲氧基乙基、胞苷上的5-甲基、锁定核酸(LNA)、磷酸二酯(PO)核苷酸间键或硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键。

在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:18-39或67-74的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO不包含未修饰DNA的10个或更多个连续核苷酸。

在一些实施方案中，ASO不包含脱氧核糖核苷酸。

在一些实施方案中，ASO不包含未修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，ASO的长度为5×n+5个核苷酸(n是3或更大的整数)，其中5×m位置处的核苷酸是经LNA修饰的核糖核苷酸(m是1至n的整数)，其余位置的核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，ASO进一步包含GalNAc部分。

在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:142的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO的长度为3×n+2个核苷酸(n是6或更大的整数)，其中3×m位置处的核苷酸是经LNA修饰的核糖核苷酸(m是1至n的整数)，其余位置的核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO进一步包含GalNAc部分。

根据权利要求22所述的ASO，其中ASO包含SEQ ID NO:122的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO的每个核糖核苷酸被2'-O-甲氧基乙基修饰。

在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO的每个核苷酸是被2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO包含未修饰DNA的10个或更多个连续核苷酸，其在5'端和3'端各侧接修饰核糖核苷酸的至少3个核苷酸。

在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。

在一些实施方案中，ASO中的每个胞苷被5-甲基修饰。

在一些实施方案中，regRNA是eRNA。

在一方面，本文提供了包含本文所述的ASo和药学上可接受的载体或赋形剂载体的药物组合物。

在一方面，本文提供了增加人细胞中OTC转录的方法，该方法包括使细胞与本文所述的ASO或本文所述的药物组合物接触。

在一些实施方案中，细胞是肝细胞。

在一些实施方案中，ASO增加细胞中调节RNA的量。

在一些实施方案中，ASO增加细胞中调节RNA的稳定性。

在一方面，本文提供了治疗尿素循环障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的ASO或本文所述的药物组合物。

在一些实施方案中，ASO增加受试者细胞中调节RNA的量。

在一些实施方案中，ASO增加受试者细胞中调节RNA的稳定性。

在一些实施方案中，细胞是肝细胞。

附图说明

图1显示染色体上基因的eRNA、paRNA、mRNA和天然反义转录物(NAT)的说明性示意图。eRNA、paRNA和NAT都是非编码RNA。eRNA是从基因的增强子双向转录的。paRNA是从基因的启动子转录的，与mRNA相同，但以反义方向转录。NAT是从其自身的下游启动子以反义方向转录的，使得转录物至少部分与mRNA重叠。一般来说，eRNA和paRNA上调基因表达，而NAT下调基因表达。

图2A-D显示用指定的ASO处理导致OTC mRNA以剂量依赖性方式上调。图2A显示用hOTC-ASOe1-11处理后的OTC mRNA。图2B显示用hOTC-ASOe1-8处理后的OTC mRNA。图2C显示用hOTC-ASOe2-1处理后的OTC mRNA。图2D显示用hOTC-ASOe1-1处理后的OTC mRNA。

图3A显示用ASO hOTC-ASOe1-10和hOTC-ASOe1-2c处理后，源自OTC缺陷供体的细胞中OTC mRNA增加。图3B显示用ASO hOTC-ASOe1-10和hOTC-ASOe1-2c处理后源自OTC缺陷供体的细胞中尿素生成增加。图3C显示用ASO hOTC-ASOe1-2a处理后WT细胞中OTC mRNA增加。图3D显示用ASO hOTC-ASOe1-2a处理后WT细胞中尿素生成增加。

图4显示指定的小鼠ASO增加了野生型小鼠的原代小鼠肝细胞中的Otc mRNA水平。单向ANOVA*：p 0.05-0.005；**：p<0.005。

图5显示指定的小鼠ASO增加了spf^ash原代小鼠肝细胞中的Otc mRNA水平。单向ANOVA**：p<0.005。

图6A显示用IFNy处理后Serping1的上调。图6B显示用JAK抑制剂托法替布治疗后Serping1的下调。

图7显示IFNy诱导后Serping1 mRNA与蛋白质分泌的相关性。

图8显示用IFNy处理的小鼠肝脏中Serping1 mRNA和regRNA的诱导。

图9A显示在用IFNy处理后的时程研究中小鼠肝细胞中Serping1mRNA和regRNA水平。图9B显示在用IFNy处理后的时程研究中小鼠肝细胞中Serping1 mRNA和regRNA水平。

图10显示用IFNg或PBS(对照)处理后Serping1增强子2RNA和启动子2RNA水平。

图11A显示Serping1染色体邻域的示意图。图11B显示用指定的ASO处理后Serping1、Irf1、Ube216和NTC-3_S的mRNA水平。

图12显示用指定的ASO处理后Serping1的mRNA水平。

图13显示用指定的ASO处理后24、48和72小时Serping1的mRNA水平。

图14A显示了体内小鼠研究时间线的图。图14B显示用ASO-2处理后体内Serping1mRNA表达增加。

图15A显示了IFNy加上指定的ASO对Serping1 mRNA表达的累加效应，相对于未处理的细胞归一化。图15B显示了IFNy加上指定的ASO对Serping1 mRNA表达的累加效应，相对于未处理的细胞归一化。

图16显示JAK1抑制剂托法替布或JAK1抑制剂托法替布加ASO-2处理后的Serping1mRNA表达，相对于未处理的细胞归一化。

图17显示指定的ASO处理在使用JAK1抑制剂托法替布的Serping1敲低***中增加Serping1 mRNA表达。

图18A和18B显示具有化学修饰的各种人OTC ASO的示意图。浅灰色表示2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-MOE)修饰。深灰色表示锁定核酸(LNA)修饰。线括号表示磷酸二酯(PO)键。*C表示胞苷上的5-甲基。^表示FANA核苷。独特序列标识符被分配给具有该图中所示的特定化学修饰的核苷酸序列。图18C显示具有化学修饰的各种小鼠OTC ASO的示意图。浅灰色表示2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-MOE)修饰。*C表示胞苷上的5-甲基。独特序列标识符被分配给具有该图中所示的特定化学修饰的核苷酸序列。

图19显示具有化学修饰的各种Serping1 ASO的示意图。浅灰色表示2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-MOE)修饰。*C表示胞苷上的5-甲基。独特序列标识符被分配给具有该图中所示的特定化学修饰的核苷酸序列。

图20A显示用指定的ASO处理导致人OTC mRNA以剂量依赖性方式上调。图20B显示用指定的ASO处理导致OTC mRNA以剂量依赖性方式上调。

图21显示用指定的ASO处理导致人OTC mRNA以剂量依赖性方式上调。

图22显示用指定的ASO处理导致人OTC mRNA以剂量依赖性方式上调。

图23显示hOTC-ASOe1-1a不诱导PBMC释放IL6、TNFa、IFNa或IFNb细胞因子。

图24A显示用指定的ASO处理导致小鼠OTC mRNA以剂量依赖性方式上调。图24B显示靶向Otc regRNA的ASO CO-4474没有增加Otc^def小鼠中的小鼠Otc mRNA。图24C显示CO-4474将氨降低至WT水平。

图25A显示用hOTC-ASOe1-10处理后OTC基因表达的上调。图25B显示配对末端测序的ChIP-seq文库与人hg38基因组的比对和峰。图25C显示用hOTC-ASOe1-10处理后鉴定出OTC增强子、OTC启动子和控制区(GAPDH、RPGR、TSPAN7)处的差异峰。

图26显示OTC启动子和增强子以及邻近的RPGR启动子(由框出的区域指示)处的可及染色质区域。

图27A显示ASO处理后，从OTC增强子转录的负链regRNA(RR1)随时间的相对表达水平。图27B显示ASO处理后，从OTC增强子转录的正链regRNA(RR2)随时间的相对表达水平。图27C显示hOTC-ASOe1-10处理后随时间的OTC mRNA效应。图27D显示hOTC-ASOe1-10处理后的H3K27ac ChIP-qPCR结果。图27E提供了对OTC ASO的转录和染色质反应的时间模型。

图28A显示与NTC ASO相比，用hOTC-ASOe1-10处理后指定的负调节剂的结合的相对损失。图28B显示RNA酶处理后，肝细胞中OTC增强子处的HDAC5和NCOR1结合没有减少。

图29A显示用siHDAC5或siNCOR1处理导致靶mRNA水平降低至少50％。图29B显示HDAC5或NCOR1敲低的siRNA敲低导致肝细胞中OTC mRNA表达增加。图29C显示在未处理的肝细胞以及用siHDAC5或siNCOR1处理的肝细胞中用hOTC-ASOe1-10处理后的OTC mRNA倍数变化。

图30提供了用靶向OTC regRNA的ASO处理后OTC基因表达的模型。

图31显示用指定的ASO处理后NHP中的氨和尿素水平。

图32显示在人源化小鼠模型中用指定的ASO处理后的相对OTC、NAGS、CPS1、ASS1、ASL或ARG1 mRNA表达。

图33显示人源化小鼠中的CO-5318和CO-5319处理显示氨随时间减少，尿素相应增加

图34A显示ASO CO-3265、CO-3279、CO-2043和CO-2051以剂量依赖性方式增加Serping1 mRNA表达。图34B显示ASO CO-2043、CO-2051、CO-3265、CO-3419、CO-4069和CO-3279以剂量依赖性方式增加C1NH+/-肝细胞中的Serping1基因表达。

图35显示指定的ASO增加小鼠中的Serping1 mRNA。

图36显示CO-2051减少了CINH+/-小鼠的耳朵和结肠中的染料外渗量。

图37A显示CO-2051增加WT小鼠中的Serping1蛋白表达。图37B显示CO-2051增加C1NH+/-小鼠中的Serping1蛋白表达。图37C显示CO-2051-GalNAc增加C1NH+/-小鼠中的Serping1蛋白表达。图37D显示用CO-2051-GalNAc处理后染料外渗的定量。

具体实施方式

本发明提供了靶向调节RNA(例如启动子相关RNA和增强子RNA)的反义寡核苷酸(ASO)，以及使用这些ASO来调节基因表达的方法。这些方法可用于调控基因产物的水平，例如调控致病基因如鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的表达水平，从而治疗与异常基因表达相关的疾病如尿素循环障碍。

本申请中描述的多特异性结合蛋白的各个方面在下面的章节中阐述。

定义

为促进对本申请的理解，以下定义多个术语和短语。

除非上下文不合适，否则如本文所用的术语“一个”和“一种”意指“一个或多个/一种或多种”并且包括复数个/种。

如本文所用，术语“鸟氨酸转氨甲酰酶”或“OTC”是指UniProt登录号P00480的蛋白质和相关异构体和直系同源物。

如本文所用，术语“调节RNA”和“regRNA”可互换使用，指从基因(例如蛋白质编码基因)的调节元件转录的非编码RNA，其中该基因本身不是非编码RNA。示例性调节元件包括但不限于启动子、增强子和超级增强子。从启动子沿反义方向转录的非编码RNA也称为“启动子RNA”或“paRNA”。从增强子或超级增强子沿有义方向或反义方向转录的非编码RNA也称为“增强子RNA”或“eRNA”。应理解，与基因转录物的至少一部分互补的天然反义转录物(NAT)不是本文所用的调节RNA。

如本文所用，术语“新生RNA”是指仍在被RNA聚合酶转录或刚刚被RNA聚合酶转录并且仍然拴系于其从中转录的DNA的RNA。与其从中转录的DNA分离的RNA也称为“不受拴系的RNA”。

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”或“ASO”是指具有在合适条件下与靶核酸杂交的核苷酸序列的单链寡核苷酸或包含此类单链寡核苷酸的缀合物。

如本文所用，regRNA的稳定性与regRNA的降解速率反向相关。当ASO增加regRNA的稳定性时，它会降低regRNA的降解速率。当ASO降低regRNA的稳定性时，它会增加regRNA的降解速率。regRNA的降解速率可以通过阻断新regRNA的合成并评估现有regRNA的半衰期来测量。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指要通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体优选包括但不限于哺乳动物(例如啮齿类动物、灵长类动物、猿类、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等)，并且更优选包括人类。

如本文所用，术语“有效量”是指足以产生有益或期望结果的化合物(例如，本申请的化合物)的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用并且不旨在限于特定配制物或施用途径。如本文所用，术语“治疗”包括任何效应，例如减轻、减少、调控、改善或消除，其导致病症、疾病、障碍等的改善，或改善其症状。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，从而使该组合物特别适于体内或离体的诊断或治疗用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲的盐水溶液、水、乳剂(诸如油/水乳剂或水/油乳剂)以及各种类型的润湿剂。组合物还可以包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如，Martin,Remington'sPharmaceutical Sciences,第15版,Mack Publ.Co.,Easton,PA(1975)。

在说明书通篇中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或者当过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，可以想到，此外，本申请中所述的组合物基本上由或由所引用的组分组成，并且根据本申请的过程和方法基本上由或由引用的处理步骤组成。

一般来说，除非另有说明，否则指定百分比的组合物均按重量计。此外，如果变量没有附带定义，则以变量的先前定义为准。

反义寡核苷酸

本文公开的反义寡核苷酸(ASO)与从靶基因的调节元件转录的regRNA杂交。应理解，eRNA和paRNA都是促进或上调基因表达的regRNA(图1)。在某些实施方案中，靶regRNA为eRNA。在某些实施方案中，靶regRNA为paRNA。在某些实施方案中，靶regRNA不是聚腺苷酸化RNA。eRNA可以使用本领域已知的方法来鉴定，例如使用测序的转座酶可及染色质测定(ATAC-seq)、全局连续测序、精确连续测序、帽分析基因表达和组蛋白修饰分析(参见，例如，Sartorelli&Lauberth,Nat.Struct.Mol.Biol.(2020)27:521-28；PCT申请公开号WO2013/177248)。paRNA是从靶基因的启动子沿反义方向转录的RNA(有义方向的转录物是靶基因的mRNA)。考虑到它们的具***置和方向，可以通过类似的方法来鉴定它们。在人类OTC中，eRNA已被鉴定为从相同的增强子区域转录。在小鼠SERPING1中，paRNA已被鉴定为从SERPING1启动子转录，但方向与SERPING1 mRNA相反。下表1中提供了示例性regRNA的核苷酸序列。这些regRNA中的任一个均被考虑作为本文公开的ASO的靶regRNA。

表1.示例性regRNA

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本发明描述了增加靶regRNA的量或稳定性，从而增加靶基因的表达的ASO。这不同于之前描述的被设计为抑制eRNA的ASO(参见例如，PCT申请公开号WO2013/177248和PCT申请公开号WO2017/075406)。不希望受理论束缚，假设ASO上调regRNA的能力归因于regRNA中靶序列的选择和/或ASO的化学修饰。

在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:1073的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:1074的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA包含SEQ ID NO:1075的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA包含SEQ ID NO:1076的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:1077的核苷酸序列。在一些实施方案中，调节RNA具有SEQ ID NO:1078的核苷酸序列。

ASO序列

如本文所公开的，结合更接近OTC靶regRNA的5'或3'端的序列的ASO更有可能上调regRNA。不希望受理论束缚，假设这种ASO与OTC regRNA的末端部分杂交，并且防止或减缓5'→3'和/或3'→5'RNA降解而不阻断regRNA的功能区域。在某些实施方案中，本文公开的ASO与靶regRNA中距靶regRNA的5'或3'端不超过300、250、200、150、100、50、40、30、20或10个核苷酸的序列互补。在某些实施方案中，本文公开的ASO与靶regRNA中距靶regRNA的5'端不超过300、250、200、150、100、50、40、30、20或10个核苷酸的序列互补(即，与ASO形成双链体的regRNA序列的最5'端核苷酸距靶regRNA的5'端不超过300、250、200、150、100、50、40、30、20或10个核苷酸)。在某些实施方案中，本文公开的ASO与靶regRNA中距靶regRNA的3'端不超过300、250、200、150、100、50、40、30、20或10个核苷酸的序列互补(即，与ASO形成双链体的regRNA序列的最3'端核苷酸距靶regRNA的3'端不超过300、250、200、150、100、50、40、30、20或10个核苷酸)。

在某些实施方案中，ASO的长度不超过8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在某些实施方案中，ASO的长度为至少8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在某些实施方案中，ASO的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

在某些实施方案中，ASO被设计为缺乏在其自身内部或彼此之间形成的稳定二级结构，从而增加准备与靶regRNA杂交的单链形式的ASO的量。预测二级结构的方法是本领域已知的(参见例如，Seetin和Mathews,Methods Mol.Biol.(2012)905:99-122；Zhao等人,PLoS Comput.Biol.(2021)17(8):e1009291)并且基于网络的程序(例如RNAfold)可供公共用户使用。

例如，ASO已被设计用于靶向人OTC eRNA或小鼠SERPING1paRNA。这些ASO的核苷酸序列在下表2中提供。

表2.靶向regRNA的示例性ASO序列

表3和4提供了hOTC-ASOe1-1和hOTC-ASOe2-2的额外化学修饰

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hOTC-ASOe1-1(SEQ ID NO:6)与距人OTC eRNA-1A的3'端1个核苷酸的序列互补。SEQ ID NO:7-14与SEQ ID NO:6至少部分重叠，也与接近人OTC eRNA-1A的3'端的序列互补。hOTC-ASOe2-1(SEQ ID NO:15)与距人OTC eRNA-2A的3'端9个核苷酸和距人OTC eRNA-2B的3'端87个核苷酸的序列互补。SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:16部分重叠，也与接近人OTCeRNA-2A和人OTC eRNA-2B的3'端的序列互补。hOTC-ASOe2-2(SEQ ID NO:16)与距人OTCeRNA-2A的5'端57个核苷酸的序列互补。

杂交和ΔG

本文使用的术语“杂交(hybridizing或hybridizes)”应理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间的结合亲和力是杂交的强度。它通常用解链温度(T_m)来描述，解链温度定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体时的温度。在生理条件下，T_m并不严格与亲和力成比例(Mergny和Lacroix,2003,Oligonucleotides 13:515-537)。标准态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更准确表示，并且与反应的解离常数(K_d)相关，ΔG°＝-RTIn(K_d)，其中R是气体常数，T是绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与水溶液浓度为1M，pH为7，温度为37℃的反应相关的自由能。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验测量，例如通过使用等温滴定量热法(ITC)方法，如Hansen等人,1965,Chem,Comm.36-38和Holdgate等人,2005,Drug Discov Today所述。本领域技术人员将知道商业设备可用于ΔG°测量。ΔG°也可以通过使用最近邻模型进行数值估计，如SantaLucia,1998,Proc Natl Aced SciUSA.95:1460-1465所述，使用Sugimoto等人,1995,Biochemistry 34:11211-11216和McTigue等人,2004,Biochemistry 43:5388-5405所述的适当导出的热力学参数。为了具有通过杂交调控其预期核酸靶标的可能性，本发明的寡核苷酸与靶核酸杂交，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，估计ΔG°值低于-10kcal/mol。在一些实施方案中，杂交的程度或强度通过标准态吉布斯自由能ΔG°来测量。寡核苷酸可以与靶核酸杂交，对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，估计ΔG°值低于-10kcal/mol的范围，例如低于-15kcal/mol，例如低于-20kcal/mol和例如低于-25kcal/mol。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸杂交的估计ΔG°值为-10至-60kcal/mol，例如-12至-40kcal/mol、-15至-30kcal/mol、-16至-27kcal/mol、或-18至-25kcal/mol。

双链体区域

短语“双链体区域”是指两个互补或基本上互补的多核苷酸通过Watson-Crick碱基配对或允许互补或基本上互补的多核苷酸链之间形成稳定双链体的任何其他方式彼此形成碱基对的区域。例如，具有21个核苷酸单位的多核苷酸链可以与另一个21个核苷酸单位的多核苷酸碱基配对，但每条链上仅有19个碱基互补或足够互补，以致“双链体”具有19个碱基对。例如，剩余的碱基可以作为5’和3’突出端存在。此外，在双链体区域内，100％互补是不需要的；在双链体内基本上互补是允许的。基本上互补是指70％或以上的互补。例如，由19个碱基对组成的双链体区域中的错配导致94.7％互补，使该双链体区域基本上互补。双链体区域可由两条单独的寡核苷酸链形成，以及由可形成包含双链体区域的发夹结构的单个寡核苷酸链形成。

dsRNA包括两条RNA链，这两条RNA链在使用dsRNA的条件下互补并杂交形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补并且通常完全互补的互补区域。靶序列可源自OTC或Serping1 regRNA的序列，例如eRNA或paRNA。另一条链(有义链)包含与反义链互补的区域，使得两条链在合适的条件下组合时杂交并形成双链体结构。如本文别处所述和本领域已知的，dsRNA的互补序列也可以作为单个核酸分子的自互补区域包含，而不是在单独的寡核苷酸上。一般而言，双链体结构的长度为15至50个碱基对，例如，长度为15-50、15-49、15-48、15-47、15-46、15-45、15-44、15-43、15-42、15-41、15-40、15-39、15-38、15-37、15-36、15-35、15-34、15-33、15-32、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-50、18-49、18-48、18-47、18-46、18-45、18-44、18-43、18-42、18-41、18-40、18-39、18-38、18-37、18-36、18-35、18-34、18-33、18-32、18-31、18-30、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-50、19-49、19-48、19-47、19-46、19-45、19-44、19-43、19-42、19-41、19-40、19-39、19-38、19-37、19-36、19-35、19-34、19-33、19-32、19-31、19-30、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-50、20-49、20-48、20-47、20-46、20-45、20-44、20-43、20-42、20-41、20-40、20-39、20-38、20-37、20-36、20-35、20-34、20-33、20-32、20-31、20-30、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-50、21-49、21-48、21-47、21-46、21-45、21-44、21-43、21-42、21-41、21-40、21-39、21-38、21-37、21-36、21-35、21-34、21-33、21-32、21-31、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、21-22、22-50、22-49、22-48、22-47、22-46、22-45、22-44、22-43、22-42、22-41、22-40、22-39、22-38、22-37、22-36、22-35、22-34、22-33、22-32、22-31、22-30、22-29、22-28、22-27、22-26、22-25、22-24、22-23、23-50、23-49、23-48、23-47、23-46、23-45、23-44、23-43、23-42、23-41、23-40、23-39、23-38、23-37、23-36、23-35、23-34、23-33、23-32、23-31、23-30、23-29、23-28、23-27、23-26、23-25或23-24个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。

类似地，与靶序列互补的区域的长度可以为15至50个核苷酸，例如，长度为15-50、15-49、15-48、15-47、15-46、15-45、15-44、15-43、15-42、15-41、15-40、15-39、15-38、15-37、15-36、15-35、15-34、15-33、15-32、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-50、18-49、18-48、18-47、18-46、18-45、18-44、18-43、18-42、18-41、18-40、18-39、18-38、18-37、18-36、18-35、18-34、18-33、18-32、18-31、18-30、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-50、19-49、19-48、19-47、19-46、19-45、19-44、19-43、19-42、19-41、19-40、19-39、19-38、19-37、19-36、19-35、19-34、19-33、19-32、19-31、19-30、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-50、20-49、20-48、20-47、20-46、20-45、20-44、20-43、20-42、20-41、20-40、20-39、20-38、20-37、20-36、20-35、20-34、20-33、20-32、20-31、20-30、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-50、21-49、21-48、21-47、21-46、21-45、21-44、21-43、21-42、21-41、21-40、21-39、21-38、21-37、21-36、21-35、21-34、21-33、21-32、21-31、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、21-22、22-50、22-49、22-48、22-47、22-46、22-45、22-44、22-43、22-42、22-41、22-40、22-39、22-38、22-37、22-36、22-35、22-34、22-33、22-32、22-31、22-30、22-29、22-28、22-27、22-26、22-25、22-24、22-23、23-50、23-49、23-48、23-47、23-46、23-45、23-44、23-43、23-42、23-41、23-40、23-39、23-38、23-37、23-36、23-35、23-34、23-33、23-32、23-31、23-30、23-29、23-28、23-27、23-26、23-25或23-24个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。

ASO的化学修饰

在某些实施方案中，ASO不仅仅由DNA组成。在某些实施方案中，ASO包含至少一个相对于天然核苷酸(例如核糖核苷酸)的化学修饰。各种化学修饰可以包括在本公开的ASO中。修饰可包括核糖基团中的一个或多个修饰、磷酸基团中的一个或多个修饰、核碱基中的一个或多个修饰、一个或多个末端修饰或其组合。在一些实施方案中，如表2所示的靶向regRNA的示例性ASO序列被化学修饰。例如，hOTC-ASOe1-1可以被化学修饰以包含hOTC-ASOe1-1a至hOTC-ASOe1-1h中任一个的修饰，如图18A所示。此类修饰可以是但不限于2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-MOE)、锁定核酸(LNA)、胞苷上的5-甲基、限制性乙基(cET)、硫代磷酸(PS)键和/或磷酸二酯(PO)键，或其任何组合。RNA的化学修饰是本领域已知的并且描述于例如PCT申请公开号WO2013/177248中。在某些实施方案中，ASO中的每个胞苷被5-甲基修饰。

与本公开的ASO一起使用的各种化学修饰包括但不限于：3'-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、未锁定核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2'-C-烷基-修饰的核苷酸、2'-羟基-修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5'-磷酸的核苷酸和包含5'-磷酸模拟物的核苷酸。

在某些实施方案中，ASO包含经化学修饰以抵抗一种或多种核RNA酶(例如，外来体复合物或RNA酶H)的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，ASO中的所有核苷酸碱基均被修饰。在某些实施方案中，化学修饰包括β-D-核糖核苷、2'-修饰的核苷(例如，2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-MOE)、2'-O-CH3或2'-氟-***糖(FANA))、双环糖修饰的核苷(例如，具有约束乙基或锁定核酸(LNA))、和/或一个或多个修饰的核苷酸间键(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键)。在某些实施方案中，化学修饰包含2'-MOE和硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，ASO的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸被2'-MOE修饰。在某些实施方案中，ASO的每个核苷酸均被2'-MOE修饰。在某些实施方案中，ASO的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，ASO的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。

可与本公开的ASO一起使用的核苷酸间键修饰包括但不限于硫代磷酸酯“PS”(P(S))、氨基磷酸酯(P(NR1R2)例如二甲氨基氨基磷酸酯(P(N(CH3)2))、膦酰基羧酸酯(P(CH2)nCOOR)例如膦酰基乙酸酯“PACE”(P(CH2COO-))、硫代膦酰基羧酸酯((S)P(CH2)nCOOR)例如硫代膦酰基乙酸酯“硫代PACE”((S)P(CH2COO-))、烷基膦酸酯(P(C1-3烷基)例如甲基膦酸酯-P(CH3)、硼基膦酸酯(P(BH3))和二硫代磷酸酯(P(S)2)

在某些实施方案中，ASO在5'端、3'端或两者处包含一个或多个化学修饰。不希望受理论束缚，多核苷酸(例如多核糖核苷酸)的一个或两个末端的化学修饰可以稳定多核苷酸。在某些实施方案中，ASO在ASO的5'端的至少1、2、3、4或5个核苷酸中包含一个或多个化学修饰。在某些实施方案中，ASO在ASO的3'端的至少1、2、3、4或5个核苷酸中包含一个或多个化学修饰。在某些实施方案中，ASO在ASO的5'端的至少1、2、3、4或5个核苷酸中包含一个或多个化学修饰，并且在ASO的3'端的至少1、2、3、4或5个核苷酸中包含一个或多个化学修饰。

化学结构也可以书面描述。在这种情况下，“M”表示MOE；“d”表示DNA，“L”表示LNA，“＝”表示硫代磷酸酯(PS)键，“-”表示磷酸二酯(PO)键；“5C”表示5-甲基胞嘧啶，“ag”表示GalNAc，“tg”表示Teg-GalNAc，以及“^”表示FANA。

为了避免歧义，该LNA具有下式：

其中B是特定指定的碱基。

表3和表4提供了所选ASO的示例性书面描述，相应的图18D和图18E提供了修饰的视觉表示。

在一些实施方案中，ASO包含选自由SEQ ID NO:6-14、18-35、39、41、75、76、77、78、87-124或143-892组成的组的序列和/或化学修饰。在一些实施方案中，ASO包含选自由SEQID NO:15-17、36-38、64-74、125-142或893-1029组成的组的序列和/或化学修饰。在一些实施方案中，ASO包含选自由SEQ ID NO:87-124组成的组的序列和化学修饰。在一些实施方案中，ASO包含选自由SEQ ID NO:125-142组成的组的序列和化学修饰。在一些实施方案中，ASO包含选自由SEQ ID NO:1030-1072组成的组的序列和化学修饰。

高亲和力修饰核苷

高亲和力修饰核苷是修饰的核苷酸，当掺入寡核苷酸中时，其增强寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，例如通过解链温度(Tm)测量。本发明的高亲和力修饰核苷优选导致每个修饰核苷的解链温度增加+0.5至+12℃，例如+1.5至+10℃或+3至+8℃。许多高亲和力修饰核苷是本领域已知的并且包括例如许多2'取代的核苷以及锁定核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment,2000,3(2),293-213)，每一个均通过引用并入本文。

糖修饰

本文所述的ASO可包含一个或多个具有修饰糖部分的核苷，即与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时糖部分的修饰。已经制备了许多具有核糖糖部分修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些特性，例如亲和力和/或核酸酶抗性。此类修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些，例如通过用己糖环(HNA)或双环替换，其通常在核糖环(LNA)上的C2和C4碳之间具有双基桥，或通常在C2和C3碳之间缺乏键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰核苷包括例如二环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)，两者均通过引用并入本文。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2'-OH基团而进行的修饰。取代基可以例如在2'、3'、4'或5'位置处引入。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含修饰的糖部分，例如2'-O-甲基(2'OMe)部分、2'-O-甲氧基乙基部分、双环糖部分、PNA(例如，包含一个或多个通过酰胺键或羰基亚甲基键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元作为重复单元取代糖-磷酸主链的寡核苷酸)、锁定核苷(LNA)(例如，包含一个或多个锁定核糖的寡核苷酸，并且可以是2'-脱氧核苷酸或2'OMe核苷酸的混合物)、c-ET(例如，包含一个或多个cET糖的寡核苷酸)、cMOE(例如，包含一个或多个cMOE糖的寡核苷酸)、吗啉代寡聚体(例如，包含含有一个或多个二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体的主链的寡核苷酸)、2'-脱氧-2'-氟核苷(例如，包含一个或多个2'-氟-β-D-阿糖核苷的寡核苷酸)、tcDNA(例如，包含一个或多个tcDNA修饰的糖的寡核苷酸)、约束乙基2'-4'-桥连核酸(cEt)、S-cEt、亚乙基桥连核酸(ENA)(例如，包含一个或多个ENA修饰的糖的寡核苷酸)、己醇核酸(HNA)(例如，包含一个或多个HNA修饰的糖的寡核苷酸)或三环类似物(tcDNA)(例如，包含一个或多个tcDNA修饰的糖的寡核苷酸)中任一个。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括核碱基修饰，其选自由以下组成的组：2-硫尿嘧啶(“2-硫代U”)、2-硫胞嘧啶(“2-硫代C”)、4-硫尿嘧啶(“4-硫代U”)、6-硫鸟嘌呤(“6-硫代G”)、2-氨基腺嘌呤(“2-氨基A”)、2-氨基嘌呤、假尿嘧啶、次黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(“5-甲基C”)、5-甲基尿嘧啶(“5-甲基U”)、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5,6-脱氢尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-烯丙基尿嘧啶(“5-烯丙基U”)、5-烯丙基胞嘧啶(“5-烯丙基C”)、5-氨基烯丙基尿嘧啶(“5-氨基烯丙基U”)、5-氨基烯丙基-胞嘧啶(“5-氨基烯丙基C”)、脱碱基核苷酸、Z碱基、P碱基、非结构核酸(“UNA”)、异鸟嘌呤(“异G”)、异胞嘧啶(“异C”)、甘油核酸(GNA)、甘油核酸(GNA)、硫代吗啉(C4H9NS)或硫代磷酰胺吗啉(TMO)。甘油核酸(GNA)(也称为二醇核酸)的合成描述于Zhang等人,CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry 4.40.1-4.40.18中，2010年9月，通过引用并入文中。Langer等人,J.Am.Chem.Soc.2020,142,38,16240-16253描述了硫代磷酰胺吗啉寡核苷酸的合成。

2′糖修饰核苷

2'糖修饰核苷是在2'位置具有除H或-OH之外的取代基(2'取代核苷)或包含能够在2'碳和核糖环中的第二个碳之间形成桥的2'连接的双自由基的核苷，例如LNA(2'-4'双自由基桥接)核苷。

不希望受理论束缚，2'修饰糖可以提供寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增强的核酸酶抗性。2'取代的修饰核苷的实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。对于更多实例，请参见例如，Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213，以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937，每一个均通过引用并入本文。

锁定核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”是2'-糖修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2'和C4'的双自由基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。换句话说，锁定核苷是包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4'-CH₂-O-2'桥。该结构有效地将核糖“锁定”在3'-内结构构象中。已证明向寡核苷酸中添加锁定核苷可增加寡核苷酸在血清中的稳定性，并减少脱靶效应(Grunweller,A.等人,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。这些核苷有时也被称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。当LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与增强的杂交亲和力(双链体稳定性)相关。这可以通过测量寡核苷酸/补体双链体的解链温度来常规确定。示例性LNA核苷包括β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA例如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。

用于本发明的多核苷酸的双环核苷的实例包括但不限于包含4'和2'核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸试剂包括一个或多个包含4'至2'桥的双环核苷。此类4'至2'桥接双环核苷的实例包括但不限于4'-(CH₂)-O-2'(LNA)；4'-(CH₂)-S-2'；4'-(CH₂)₂-O-2'(ENA)；4'-CH(CH₃)-O-2'(也称为“约束乙基”或“cEt”)和4'-CH(CH₂OCH₃)-O-2'(及其类似物；参见，例如，美国专利号7,399,845)；4'-C(CH₃)(CH₃)-O-2'(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,283)；4'-CH₂-N(OCH₃)-2'(及其类似物；参见例如，美国专利号8,278,425)；4'-CH₂-O-N(CH₃)₂-2'(参见例如，美国专利公开号2004/0171570)；4'-CH₂-N(R)-O-2'，其中R是H、C₁-C₁₂烷基或保护基(参见例如，美国专利号7,427,672)；4'-CH₂-C(H)(CH₃)-2'(参见例如，Chattopadh yaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4'-CH₂-C(＝CH₂)-2'(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,426)。上述各自的全部内容通过引用并入本文。

教导锁定核酸核苷酸的制备的其他代表性美国专利和美国专利公开包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US2008/0039618；和US2009/0012281，其各自的全部内容通过引用并入本文。

可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见国际公开号WO 99/14226，其内容通过引用并入文中)。

本发明的寡核苷酸还可以被修饰以包括一个或多个约束乙基核苷。如本文所用，“约束乙基核苷”或“cEt”是包含双环糖部分的锁定核苷，所述双环糖部分包含4'-CH(CH₃)-O-2'桥。在一个实施方案中，约束乙基核苷处于S构象，在本文中称为“S-cEt”。

本发明的寡核苷酸还可以包括一个或多个“构象限制核苷”(“CRN”)。CRN是核苷类似物，具有连接核糖的C2'和C4'碳或核糖的C3和--C5'碳的接头。CRN将核糖环锁定为稳定构象并增加与mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度，可将氧置于稳定性和亲和力的最佳位置，从而减少核糖环褶皱(puckering)。

教导某些上述CRN的制备的代表性出版物包括但不限于美国专利公开号2013/0190383；以及PCT公开WO 2013/036868，其各自全部内容特此通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个UNA(未锁定核苷)核苷单体。UNA是未锁定无环核苷，其中糖的任何键已被去除，形成未锁定“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖C1'-C4'之间的键已被去除的单体(即，C1'和C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2'-C3'键(即C2'和C3'碳之间的共价碳-碳键)已被去除(参见Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter等人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039特此通过引用并入)。

教导UNA制备的代表性美国出版物包括但不限于美国专利号8,314,227；以及美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，其各自的全部内容通过引用并入本文。

核糖分子也可以用环丙烷环修饰以产生三环脱氧核酸(三环DNA)。核糖部分可以被另一种糖取代，例如1,5,-脱水己糖醇、苏糖以产生苏糖核苷(TNA)，或***糖以产生***糖核苷。核糖分子还可以被非糖如环己烯取代，生成环己烯核苷，或被乙二醇取代，生成乙二醇核苷。

对核苷分子末端的潜在稳定修饰可包括N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇)(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3”-磷酸、反向碱基dT(idT)和其他。这种修饰的公开可以在PCT公开号WO2011/005861中找到。

本发明的寡核苷酸的其他替代化学包括5'磷酸或5'磷酸模拟物，例如寡核苷酸的5'-末端磷酸或磷酸模拟物。合适的磷酸模拟物公开于例如美国专利公开号2012/0157511中，其全部内容通过引用并入本文。

另外的非限制性示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76、Seth等人J.Org.Chem.2010,第75(5)卷第1569-81页、Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238、以及Wan和Seth,J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667中，其各自特此通过引用并入。

在一些实施方案中，ASO的长度为5×n+5个核苷酸(n是3或更大的整数)，其中5×m位置处的核苷酸是经LNA修饰的核糖核苷酸(m是1至n的整数)，其余位置的核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，核苷酸糖修饰是2′-O—C1-4烷基如2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-脱氧(2'-H)、2′-O—C1-3烷基-O—C1-3烷基如2'-甲氧基乙基(“2'-MOE”)、2'-氟(“2'-F”)、2'-氨基(“2'-NH2”)、2'-***糖基(“2′-***糖”)核苷酸、2'-F-***糖基(“2′-F-***糖”)核苷酸、2'-锁定核酸(“LNA”)核苷酸、2'-酰胺桥核酸(AmNA)、2'-未锁定核酸(“ULNA”)核苷酸、L型糖(“L-糖”)或4'-硫代核糖基核苷酸。

混合体和间隔体

ASO可以具有混合体和/或间隔体结构，例如，以图18A、图18B、图18C或图19中的ASO所公开的模式。

在某些实施方案中，ASO是混合体。如本文所用，术语“混合体”是指在寡核苷酸序列的至少一部分上包含DNA单体和核苷类似物单体的交替组成的寡核苷酸。在某些实施方案中，ASO是基于间隔体结构的混合体，其在间隙中包含DNA核苷酸和2'-MOE核苷酸的混合物，侧翼中是RNA序列。混合体可被设计为包含亲和力增强核苷酸类似物的混合物，例如在非限制性实例中2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、***核酸(ANA)单体、2'-氟-ANA单体、HNA单体、INA单体、2'-MOE-RNA(2'-O-甲氧基乙基-RNA)、2'氟-DNA和LNA。在一些实施方案中，混合体不能募集RNA酶H。在一些实施方案中，混合体包含一种类型的亲和力增强核苷酸类似物以及DNA和/或RNA。

多个不同的修饰可以在混合体中间隔开。例如，ASO可包含多个核苷酸中的LNA修饰以及剩余一些或全部核苷酸中的不同修饰。在一些实施方案中，任何两个相邻的LNA修饰的核苷酸间隔至少1、2、3、4或5个核苷酸。在整个ASO中，相邻LNA修饰的核苷酸之间的距离可以是恒定的(例如，任何两个相邻的LNA修饰的核苷酸间隔1、2、3、4或5个核苷酸)或可变的。在一些实施方案中，ASO的长度是3×n、3×n-1或3×n-2个核苷酸(n是6或更大的整数)，其中(a)(i)位置3×m-2(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸，(ii)位置3×m-1(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸，或(iii)位置3×m(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸；(b)其余位置处的核苷酸包含第二不同的修饰(例如，2'-O-甲氧基乙基)。本文中称为hOTC-ASOe1-1d的ASO具有这样的结构。在一些实施方案中，ASO的长度是2×n或2×n-1个核苷酸(n是9或更大的整数)，其中(a)(i)位置2×m-1(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸，或(ii)位置2×m(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸；以及(b)其余位置处的核苷酸包含第二不同的修饰(例如，2'-O-甲氧基乙基)。本文中称为hOTC-ASOe1-1e的ASO具有这样的结构。还考虑了类似的修饰模式，例如，其中第一修饰重复4、5或更多个核苷酸。在一些实施方案中，ASO的长度是4×n、4×n-1或4×n-2个核苷酸(n是6或更大的整数)，其中(a)(i)位置4×m-2(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸，(ii)位置4×m-1(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸，或(iii)位置3×m(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸；(b)其余位置处的核苷酸包含第二不同的修饰(例如，2'-O-甲氧基乙基)。在一些实施方案中，ASO的长度是5×n、5×n-1或5×n-2个核苷酸(n是6或更大的整数)，其中(a)(i)位置5×m-2(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸，(ii)位置5×m-1(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸，或(iii)位置5×m(m是1至n的整数)处的核苷酸是包含第一修饰(例如，LNA)的核糖核苷酸；(b)其余位置处的核苷酸包含第二不同的修饰(例如，2'-O-甲氧基乙基)。

在一些实施方案中，ASO进一步包含ASO的5'或3'末端的GalNAc或Teg-GalNAc部分。

在某些实施方案中，ASO包含侧接RNA序列的DNA序列(例如，具有未修饰DNA的至少8、9、10、11、12、13、14或15个连续核苷酸)。这种结构被称为“间隔体”，其中内部DNA区域被称为“间隙”，外部RNA区域被称为“翼”(参见，例如，PCT申请公开号WO2013/177248)。已知间隔体通过募集核RNA酶(例如，RNA酶H)来促进靶RNA的降解。令人惊讶的是，在本公开中，已发现结合regRNA(例如hOTC-ASOe1-1a)的间隔体，如具有相同序列但具有不同化学修饰的regRNA(例如hOTC-ASOe1-1d和hOTC-ASOe1-1h)，还可以增加靶基因表达。在某些实施方案中，ASO包含侧接RNA序列的DNA序列并且不诱导RNA酶或RNA酶H介导的降解。

在某些实施方案中，间隔体的长度为约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸。在某些实施方案中，间隙的长度为约7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个核苷酸。在某些实施方案中，一个或两个翼的长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。在某些实施方案中，一个或两个翼包含RNA修饰，例如，β-D-核糖核苷、2'-修饰的核苷(例如，2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-MOE)、2'-O-CH₃或2'-氟-***糖(FANA))、和双环糖修饰的核苷(例如，具有约束乙基或锁定核酸(LNA))。在某些实施方案中，间隔体中的每个核糖核苷酸均被2'-MOE修饰。在某些实施方案中，间隔体包含一个或多个修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键。在某些实施方案中，间隔体中的每两个相邻核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键连接。

在某些实施方案中，ASO不包含未修饰DNA的7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、或15个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，这样的DNA序列每2、3、4、5或更多个核苷酸被修饰的(例如，2'-MOE修饰的)核糖核苷酸破坏。本文中称为hOTC-ASOe1-1f的ASO具有这样的结构。在一些实施方案中，ASO仅包含核糖核苷酸而不包含脱氧核糖核苷酸。

混合体和间隔体的结构特点可以结合起来。在某些实施方案中，ASO具有与本文公开的混合体相似的结构(例如，具有间隔修饰的混合体)，除了间隙中的第二修饰改变为第三修饰(例如，脱氧核糖核苷酸)。本文称为hOTC-ASOe1-1c、hOTC-ASOe1-2b、hOTC-ASOe1-5a和hOTC-ASOe1-6a的ASO具有这样的结构。在某些实施方案中，ASO具有与本文公开的间隔体相似的结构，除了在间隙中核苷酸以混合体模式修饰。本文中称为hOTC-ASOe1-1b的ASO具有这样的结构。

在某些实施方案中，ASO进一步包含配体部分，例如特异性靶向受试者中的组织或器官的配体部分。例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)特异性靶向肝脏。在某些实施方案中，配体部分包含GalNAc。在某些实施方案中，配体部分包含三簇GalNAc部分，通常指示GAlNAc3。其他类型的GalNAc部分是一簇、二簇或四簇GAlNAc，指示为GAlNAc1、GAlNAc2或GAlNAc4。在某些实施方案中，配体部分包含GalNAc1、GALNAc2、GAlNAc3或GalNAc4。

药物组合物

在某些实施方案中，本文公开的ASO可以存在于药物组合物中。药物组合物可配制用于多种药物递送***。组合物中还可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体以进行适当的配制。用于本公开的合适配制物可见于Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版,1985。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如，Langer(Science 249:1527-1533,1990)。

适合递送核酸的示例性载体和药物配制物描述于以下中：Durymanov和Reineke(2018)Front.Pharmacol.9:971；Barba等人(2019)Pharmaceutics 11(8):360；Ni等人(2019)Life(Basel)9(3):59。应理解，与ASO缀合的配体部分的存在可以避免对用于递送到配体部分靶向的组织或器官的载体的需要。

将本发明的寡核苷酸递送到细胞，例如受试者体内的细胞，例如人类受试者，例如有需要的受试者，例如患有OTC相关障碍的受试者可以通过多种不同的方式实现。例如，递送可以通过使细胞与本发明的寡核苷酸在体外或体内接触来进行。体内递送还可以通过向受试者施用包含寡核苷酸的组合物来直接进行。这些替代方案将在下面进一步讨论。

一般而言，递送核酸分子的任何方法(体外或体内)均可适用于与本发明的寡核苷酸一起使用(参见例如，Akhtar S.和Julian R L.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144和WO 94/02595，其全部内容通过引用并入本文)。对于体内递送，为了递送寡核苷酸分子而需要考虑的因素包括，例如，所递送的分子的生物稳定性、非特异性效应的预防以及所递送的分子在靶组织中的积累。寡核苷酸的非特异性效应可以通过局部施用来最小化，例如通过直接注射或植入组织中或局部施用制剂。对治疗部位的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制药剂暴露于可能被药剂伤害或可能降解药剂的全身组织，并允许施用较低总剂量的寡核苷酸分子。

为了全身施用寡核苷酸以治疗疾病，寡核苷酸可以包括替代的核碱基、替代的糖部分和/或替代的核苷间键，或者替代地使用药物递送***来递送；两种方法均可防止寡核苷酸在体内被内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。寡核苷酸或药物载体的修饰还可以允许寡核苷酸组合物靶向靶组织并避免不期望的脱靶效应。寡核苷酸分子可以通过与亲油基团(例如胆固醇)化学缀合来修饰，以增强细胞摄取并防止降解。在替代实施方案中，寡核苷酸可以使用药物递送***来递送，例如纳米颗粒、脂质纳米颗粒、多聚体纳米颗粒、脂质体复合物纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送***。带正电荷的阳离子递送***促进寡核苷酸分子(带负电荷)的结合，并且还增强带负电荷的细胞膜处的相互作用，以允许细胞有效摄取寡核苷酸。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可以与寡核苷酸结合，或诱导形成包裹寡核苷酸的囊泡或胶束。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止寡核苷酸的降解。一般而言，本领域已知的任何核酸递送方法可适用于本发明的寡核苷酸的递送。用于制备和施用阳离子寡核苷酸复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围之内(参见例如，Soren sen,D R.,等人(2003)J.Mol.Biol 327:761-766；Verma,U N.等人,(2003)Clin.Cancer Res.9:1291-1300；Arnold,A S等人,(2007)J.Hypertens.25:197-205，其全部内容通过引用并入本文)。可用于全身递送寡核苷酸的药物递送***的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen,D R.,等人(2003),同上；Verma,U N.等人,(2003),同上)，Oligofectamine、“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann,T S.等人,(2006)Nature 441:111-114)、心磷脂(Chien,P Y.等人,(2005)Cancer Ge ne Ther.12:321-328；Pal,A.等人,(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet M E.等人,(2008)Pharm.Res.Aug 16Epu b ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3:472-487)和聚酰胺胺(Tomalia,D A.等人,(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67；Yoo,H.等人,(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在一些实施方案中，寡核苷酸与环糊精形成复合物用于全身施用。寡核苷酸和环糊精的施用方法和药物组合物可以在美国专利号7,427,605中找到，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸通过多聚体或脂质体复合物纳米颗粒递送。寡核苷酸和多聚体纳米颗粒和脂质体复合物纳米颗粒的施用方法和药物组合物可以在美国专利申请号2017/0121454；2016/0369269；2016/0279256；2016/0251478；2016/0230189；2015/0335764；2015/0307554；2015/0174549；2014/0342003；2014/0135376；和2013/0317086中找到，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本文所述的化合物可以与额外治疗剂组合施用。额外治疗剂的实例包括标准护理抗癫痫药物，例如奎尼丁和/或钠通道阻滞剂。另外，本文所述的化合物可以与推荐的生活方式改变例如生酮饮食组合施用。

膜分子组件递送方法

本发明的寡核苷酸还可以使用多种膜分子组件递送方法来递送，包括本领域已知的聚合、可生物降解的微粒或微胶囊递送装置。例如，胶体分散***可用于本文所述的寡核苷酸药剂的靶向递送。胶体分散***包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的***，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体是人工膜囊泡，在体外和体内可用作递送载体。已表明，尺寸范围为0.2-4.0μm的大单层囊泡(LUV)可以封装相当大比例的含有大分子的水性缓冲液。脂质体可用于将活性成分转移和递送到作用部位。由于脂质体膜在结构上与生物膜相似，因此当脂质体应用于组织时，脂质体双层与细胞膜双层融合。随着脂质体和细胞融合的进行，包含寡核苷酸的内部水性内容物被递送到细胞中，寡核苷酸可以在细胞中特异性结合靶RNA。在一些情况下，脂质体还被特异性靶向，例如，将寡核苷酸引导到特定细胞类型。脂质体的成分通常是磷脂的组合，通常与类固醇，特别是胆固醇组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH值、离子强度和二价阳离子的存在。

含有寡核苷酸的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中，将脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中，使得与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。洗涤剂可以具有高临界胶束浓度并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡萄糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将寡核苷酸制剂添加到包含脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与寡核苷酸相互作用并在寡核苷酸周围缩合形成脂质体。缩合后，例如通过透析除去洗涤剂，以产生寡核苷酸的脂质体制剂。

如果需要，可以在缩合反应期间添加有助于缩合的载体化合物，例如通过受控添加。例如，载体化合物可以是核酸以外的聚合物(例如精胺或亚精胺)。也可以调节pH以有利于缩合。

用于产生稳定的多核苷酸递送载体的方法进一步描述于例如WO 96/37194中，其全部内容通过引用并入本文，所述多核苷酸递送载体掺入多核苷酸/阳离子脂质体复合物作为递送载体的结构组分。脂质体形成还可以包括以下中所述的示例性方法的一个或多个方面：Feigner,P.L.等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；Bangham等人,(1965)M.Mol.Biol.23:238；Olson等人,(1979)Biochim.Biophys.Acta 557:9；Szoka等人,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75:4194；Mayhew等人,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775:169；Kim等人,(1983)Biochim.Biophys.Acta 728:339；和Fukunaga等人,(1984)Endocrinol.115:757。用于制备用作递送载体的适当尺寸的脂质聚集体的常用技术包括超声处理和冻融加挤压(参见例如，Mayer等人,(1986)Biochim.Biophys.Acta858:161。当需要一致小(50至200nm)且相对均匀的聚集体时，可以使用微流体化(Mayhew等人,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775:169)。这些方法很容易适用于将寡核苷酸制剂包装到脂质体中。

脂质体分为两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用形成稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物与带负电荷的细胞表面结合并内化到核内体中。由于核内体内的酸性pH，脂质体破裂，将其内容物释放到细胞质中(Wang等人(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147:980-985)。

对pH敏感或带负电荷的脂质体包裹核酸而不是与之复合。由于核酸和脂质都带有类似的电荷，因此会发生排斥而不是形成复合物。然而，一些核酸被包裹在这些脂质体的水性内部。pH敏感脂质体已用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送到培养物中的单层细胞。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等人(1992)Journal of Controlled Release,19:269-274)。

一种主要类型的脂质体组合物包括除天然来源的磷脂酰胆碱之外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)形成，例如大豆PC和鸡蛋PC。另一种类型是由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成的。

在体外和体内将脂质体引入细胞的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Feigner,(1994)J.Biol.Chem.269:2550；Nabel,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307；Nabel,(1992)Human Gene Ther.3:649；Gershon,(1993)Biochem.32:7143；和Strauss,(1992)EMBOJ.11:417。

还检查了非离子脂质体***以确定其在将药物递送到皮肤中的效用，特别是包含非离子型表面活性剂和胆固醇的***。包含NOVASOME^TM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)和NOVASOME^TM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)的非离子脂质体配制物用于将环孢菌素-A递送到小鼠皮肤的真皮中。结果表明，这种非离子脂质体***可有效促进环孢菌素A沉积到皮肤的不同层中(Hu等人,(1994)S.T.P.Pharma.Sci.,4(6):466)。

脂质体还可以是空间稳定的脂质体，其包含一种或多种特化脂质，相对于缺乏此类特化脂质的脂质体，其导致循环寿命延长。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷脂G_M1，或(B)用一种或多种亲水性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)部分)衍生化的那些。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但本领域认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的循环半衰期延长源于网状内皮***(RES)细胞的摄取减少(Allen等人,(1987)FEBS Letters,223:42；Wu等人,(1993)Cancer Research,53:3765)。

包含一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjop oulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,(1987),507:64)报道了单唾液酸神经节苷脂G^M1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半衰期的能力。Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1988),85:6949)阐述了这些发现。Allen等人的美国专利号4,837,028和WO 88/04924公开了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂G_M1或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。美国专利号5,543,152(Webb等人)公开了包含鞘磷脂的脂质体。包含1,2-sn-二肉豆蔻基磷脂酰胆碱的脂质体公开于WO 97/13499(Lim等人)中。

在一个实施方案中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优点。非阳离子脂质体虽然不能有效地与质膜融合，但在体内被巨噬细胞吸收，并且可用于将寡核苷酸递送到巨噬细胞。

脂质体的其他优点包括：从天然磷脂获得的脂质体具有生物相容性和可生物降解性；脂质体可以掺入多种水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护其内部隔室中封装的寡核苷酸免受代谢和降解(Rosoff,in"Pharmaceutical Dosage Forms,"Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,第1卷,第245页)。制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水体积。

带正电荷的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可用于形成小脂质体，其与核酸自发地相互作用，形成脂质-核酸复合物，其能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，从而导致寡核苷酸的递送(参见，例如，Feigner,P.L.等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417和美国专利号4,897,355描述了DOTMA及其与DNA的使用)。

DOTMA类似物1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可与磷脂组合使用，形成DNA复合囊泡。LIPOFECTIN^TM Bethesda研究实验室(盖瑟斯堡，马里兰州)是一种将高阴离子核酸递送到活组织培养细胞中的有效试剂，该细胞包含带正电荷的DOTMA脂质体，该脂质体与带负电荷的多核苷酸自发相互作用形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地附着到带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并有效地将功能性核酸递送到例如组织培养细胞中。另一种市售阳离子脂质，1,2-双(油酰氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(BoehringerMannheim,Indianapolis,Ind.)与DOTMA的不同之处在于油酰基部分通过酯而不是醚键连接。

其他报道的阳离子脂质化合物包括已缀合至多种部分的那些化合物，包括例如已缀合至两种类型脂质之一的羧基精胺，并且包括诸如5-羧基精氨酰基甘氨酸二辛油酰基酰胺(“DOGS”)(TRANSFECTA M^TM,Promega,Madison,Wis.)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精氨酰基酰胺(“DPPES”)(参见例如，美国专利号5,171,678)的化合物。

另一种阳离子脂质缀合物包括脂质用胆固醇衍生化(“DC-Chol”)，其已与DOPE组合配制成脂质体(参见，Gao,X.和Huang,L.,(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179:280)。据报道，通过将聚赖氨酸与DOPE缀合而制成的脂聚赖氨酸在血清存在下可有效转染(Zhou,X.等人,(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065:8)。对于某些细胞系，这些含有缀合阳离子脂质的脂质体据说比含有DOTMA的组合物表现出更低的毒性并提供更有效的转染。其他市售阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(Vical,La Jolla,Calif.)和Lipofectamine(DOS PA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Md.)。适合于递送寡核苷酸的其他阳离子脂质描述于WO 98/39359和WO 96/37194中。

脂质体配制物特别适合局部施用，与其他配制物相比，脂质体具有多个优点。这些优点包括减少与所施用药物的高全身吸收相关的副作用，增加所施用药物在所需靶标处的积累，以及将寡核苷酸施用到皮肤中的能力。在一些实施中，脂质体用于将寡核苷酸递送到表皮细胞并且还用于增强寡核苷酸渗透到真皮组织中，例如渗透到皮肤中。例如，可以局部应用脂质体。已记录了将配制为脂质体的药物局部递送到皮肤(参见，例如，Weiner等人,(1992)Journal of Drug Targeti ng,第2卷,405-410和du Plessis等人,(1992)Antiviral Research,18:259-265；Mannino,R.J.和Fould-Fogerite,S.,(1998)Biotechniqu es 6:682-690；Itani,T.等人,(1987)Gene 56:267-276；Nicolau,C.等人(1987)Meth.Enzymol.149:157-176；Straubinger,R.M.和Pap ahadjopoulos,D.(1983)Meth.Enzymol.101:512-527；Wang,C.Y.和Huang,L.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851-7855)。

还检查了非离子脂质体***以确定其在将药物递送到皮肤中的效用，特别是包含非离子型表面活性剂和胆固醇的***。使用包含NOVASOME I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NOVASOME II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体配制物将药物递送到小鼠皮肤的真皮中。这种含有寡核苷酸的配制物可用于治疗皮肤病。

脂质体的靶向也可能基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，并且是本领域已知的。在脂质体靶向递送***的情况下，可以将脂质基团掺入脂质体的脂质双层中，以维持靶向配体与脂质体双层的稳定结合。各种连接基团可用于将脂质链连接到靶向配体。其他方法是本领域已知的并且例如在美国专利申请公开号20060058255中进行了描述，其连接基团通过引用并入本文。

包含寡核苷酸的脂质体可以制成高度可变形的。这种可变形性可以使脂质体穿透小于脂质体平均半径的孔。例如，转移体是另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集体，作为药物递送载体的有吸引力的候选者。转移体可以被描述为脂滴，其高度可变形，以至于它们能够轻松地穿透比脂滴更小的孔。可通过将表面边缘活化剂(通常是表面活性剂)添加到标准脂质体组合物中来制备转移体。可以例如通过感染皮下递送包含寡核苷酸的转移体，以将寡核苷酸递送到皮肤中的角质形成细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在合适的透皮梯度的影响下穿过一系列直径小于50nm的细孔。此外，由于脂质特性，这些转移体可以自我优化(适应孔的形状，例如皮肤中的孔的形状)、自我修复，并且可以经常达到其靶标而不破碎，并且经常自负载。转移体已用于将血清白蛋白递送到皮肤。转移体介导的血清白蛋白递送已被证明与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。

适用于本发明的其他配制物描述于PCT公开号WO 2009/088891、WO 2009/132131和WO 2008/042973中，其全部内容通过引用并入本文。

表面活性剂在配制物诸如乳液(包括微乳液)和脂质体中有广泛的应用。对许多不同类型的天然和合成表面活性剂的特性进行分类和排序的最常见方法是使用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头部”)的性质提供了对配制物中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的方法(Rieger,于Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,第285页)。

如果表面活性剂分子未离子化，则被归类为非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂在药品和化妆品中有广泛的应用，并且可在宽pH值范围内使用。一般来说，它们的HLB值范围为2至约18，这取决于其结构。非离子型表面活性剂包括非离子酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子链烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也属于此类。聚氧乙烯表面活性剂是非离子型表面活性剂类别中最受欢迎的成员。

如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被归类为阴离子。阴离子型表面活性剂包括羧酸盐，例如皂、酰基乳酸盐、氨基酸的酰基酰胺，硫酸酯，例如烷基硫酸盐和乙氧基化烷基硫酸盐，磺酸盐，例如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐，以及磷酸盐。阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸盐和皂。

如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被归类为阳离子。阳离子型表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是此类中最常用的成员。

如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则该表面活性剂被归类为两性。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。

已综述表面活性剂在药物产品、配制物和乳液中的使用(Rieger,于Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,第285页)。

用于本发明方法的寡核苷酸还可以作为胶束配制物提供。胶束是一种特殊类型的分子组件，其中两亲性分子排列成球形结构，使得分子的所有疏水部分都向内，而亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。

基于脂质纳米颗粒的递送方法

本发明的寡核苷酸可以完全封装在脂质配制物中，例如脂质纳米颗粒(LNP)或其他核酸-脂质颗粒。LNP可用于全身应用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命并在远端部位(例如与施用部位物理上分离的部位)积聚。LNP包括“pSPLP”，其包括封装的缩合剂-核酸复合物，如PCT公开号WO 00/03683中所述。本发明的颗粒通常具有约50nm至约150nm，更通常约60nm至约130nm，更通常约70nm至约110nm，最通常约70nm至约90nm的平均直径，并且基本上无毒。此外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于，例如，美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美国公开号2010/0324120和PCT公开号WO 96/40964中。

阳离子脂质的非限制性实例包括N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N--(I-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N--(I-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯四氢--3aH-环戊并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-叶乙基氮杂二叶二十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。阳离子脂质可占颗粒中存在的总脂质的例如约20mol％至约50mol％或约40mol％。

可离子化/非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。非阳离子脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10mol％或约60mol％(如果包括胆固醇的话)。

抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如聚乙二醇(PEG)-脂质，包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基(C₁₂)、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基(C₁₄)、PEG-二棕榈酰氧基丙基(C₁₆)或PEG-二硬脂酰氧基丙基(C₁₈)。防止颗粒聚集的缀合脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的0mol％至约20mol％或约2mol％。

在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒进一步包括颗粒中存在的总脂质的例如约10mol％至约60mol％或约50mol％的胆固醇。

ASO也可以以类脂质形式递送。类脂质的合成已被广泛描述，并且含有这些化合物的配制物特别适合于递送修饰的核酸分子或ASO(参见Mahon等人,Bioconjug Chem.201021:1448-1454；Schroeder等人,J Intern Med.2010 267:9-21；Akinc等人,NatBiotechnol.2008 26:561-569；Love等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869；Siegwart等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2011108:12996-3001；所有这些都全文并入本文)。

用于RNA递送的脂质组合物公开于WO2012170930A1、WO2013149141A1和WO2014152211A1中，其各自通过引用并入本文。

治疗应用

本发明提供了治疗与基因表达降低(例如OTC基因表达降低)相关的疾病和障碍的方法。该方法使用与从靶基因(例如OTC)的调节元件转录的调节RNA杂交的ASO或包含ASO的药物组合物。本文所述的寡核苷酸组合物可用于本发明的方法中，并且虽然不受理论的束缚，但据信通过其调控OTC的水平、状态和/或活性的能力来发挥其期望的效果，例如通过增加受试者(例如，哺乳动物、灵长类动物或人类)细胞中OTC蛋白的水平。

本发明的一个方面涉及在有需要的受试者中治疗与OTC相关的障碍(例如，尿素循环障碍)的方法。本发明的另一方面包括增加被鉴定为患有OTC相关障碍的受试者的细胞中OTC的水平。又另一方面包括增加受试者细胞中OTC表达的方法。该方法可以包括使细胞与有效增加细胞中OTC表达的量的寡核苷酸或ASO接触，从而增加细胞中OTC表达。

基于上述方法，本发明的进一步的方面包括本发明的寡核苷酸或包含此类寡核苷酸的组合物，其用于治疗，或用作药物，或用于治疗有需要的受试者的OTC或尿素循环相关障碍，或用于增加被鉴定患有OTC相关障碍的受试者的细胞中的OTC水平，或用于增加受试者的细胞中的OTC表达。该用途包括使细胞与有效增加细胞中OTC表达的量的寡核苷酸接触，从而增加细胞中OTC表达。以下关于本发明的方法描述的实施方案也可应用于这些进一步的方面。

细胞与寡核苷酸的接触可以在体外、离体或体内进行。使细胞在体内与寡核苷酸接触包括使受试者(例如人类受试者)内的细胞或细胞群与寡核苷酸接触。接触细胞的体外和体内方法的组合也是可能的。如上所述，接触细胞可以是直接的或间接的。此外，接触细胞可以通过靶向配体完成，包括本文所述的或本领域已知的任何配体。在一些实施方案中，靶向配体是碳水化合物部分，例如GalNAc3配体，或将寡核苷酸引导至感兴趣位点的任何其他配体。细胞可以是肝细胞(例如肝细胞)。

本文公开的ASO或药物组合物的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病灶内注射。在某些实施方案中，ASO或药物组合物被全身施用。在某些实施方案中，ASO或药物组合物通过肠胃外途径施用。例如，在某些实施方案中，ASO或药物组合物通过静脉内(例如，通过静脉内输注)施用，例如使用预填充袋、预填充笔或预填充注射器。在其他实施方案中，将ASO或药物组合物局部施用至其中需要靶基因表达增加的器官或组织(例如肝脏)。

在一些实施方案中，将寡核苷酸施用于受试者，使得寡核苷酸被递送至受试者体内的特定位点。这种靶向递送可以通过全身施用或局部施用来实现。OTC表达的增加可以使用源自受试者体内特定位点的样品中OTC mRNA或OTC蛋白的水平或水平变化的测量值来评估。在某些实施方案中，所述方法包括OTC表达的临床相关增加，例如，如通过用降低OTC表达的药剂治疗受试者后的临床相关结果所证明的。

在其他实施方案中，寡核苷酸以有效导致OTC障碍的一种或多种症状减少(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的量和时间施用，例如血液中高氨水平。

OTC表达水平增加

本文公开的治疗方法使用靶向OTC的ASO，被设计为增加受试者中的OTC表达水平。OTC基因表达的增加包括OTC基因的任何水平的增加，例如OTC基因表达的至少部分增加。增加可以通过与对照水平相比这些变量中的一个或多个的绝对或相对水平的增加来评估。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平，或从未处理或用对照(例如，仅缓冲液对照或无活性剂对照)处理的类似受试者、细胞或样品确定的水平。在某些实施方案中，所述方法引起OTC表达的临床相关增加，例如，如通过用增加OTC表达的药剂处理受试者后的临床相关结果所证明的。

在某些实施方案中，相对于给药前基线水平，本文公开的方法使OTC基因表达增加至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。在某些实施方案中，相对于给药前基线水平，本文公开的方法使OTC基因表达增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在某些实施方案中，受试者具有OTC表达缺陷，并且本文公开的方法将OTC表达水平或活性恢复至相似年龄和性别的物种的受试者中平均OTC表达水平或活性的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

OTC基因的表达可以基于与OTC基因表达相关的任何变量的水平来评估，例如OTCmRNA水平或OTC蛋白质水平。应理解，OTC是某些哺乳动物(例如人类和小鼠)的X染色体基因，女性受试者表现出X染色体失活的镶嵌模式。在某些实施方案中，本文中OTC的表达水平或活性是指肝脏中的平均表达水平或活性。

在某些实施方案中，替代标记物可用于检测OTC表达水平的增加。例如，如可接受的诊断和监测标准所证明的，用增加OTC表达的药剂有效治疗OTC相关障碍可以被理解为证明OTC的临床相关增加。

OTC基因表达的增加可以通过第一细胞或细胞组(此类细胞可以存在于例如源自受试者的样品中)表达的mRNA量的增加来体现，其中OTC基因被转录并且已经被处理(例如，通过使一个或多个细胞与本发明的寡核苷酸接触，或通过将本发明的寡核苷酸施用于其中存在或曾经存在该细胞的受试者)，使得相比于与第一细胞或细胞组基本上相同但尚未如此处理的第二细胞或细胞组(未用寡核苷酸处理或未用靶向感兴趣基因的寡核苷酸处理的一个或多个对照细胞)，OTC基因表达增加。

在其他实施方案中，OTC基因表达的增加可以根据与OTC基因表达功能性相关的参数(例如OTC蛋白表达或OTC活性)的增加来评估。OTC增加可以在表达OTC的任何细胞中测定，无论与表达构建体是内源的还是异源的，并且通过本领域已知的任何测定法来测定。

OTC表达的增加可以表现为细胞或细胞组表达的OTC蛋白水平(例如，源自受试者的样品中表达的蛋白水平)相对于对照细胞或细胞对照组的增加。OTC表达的增加还可以表现为处理的细胞或细胞组中OTC mRNA水平相对于对照细胞或细胞对照组的增加。

可用于评估OTC基因表达的增加的对照细胞或细胞组包括尚未与本发明的寡核苷酸接触的细胞或细胞组。例如，在用寡核苷酸处理受试者之前，对照细胞或细胞组可源自个体受试者(例如，人类或动物受试者)。

细胞或细胞组表达的OTC mRNA水平可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来测定。在一个实施方案中，通过检测转录的多核苷酸或其部分，例如OTC基因的mRNA，测定样品中OTC的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，包括例如使用酸性苯酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNEASYTM RNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix，瑞士)。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核运行测定、RT-PCR、RNA酶保护测定、Northern印迹、原位杂交和微阵列分析。循环OTC mRNA可以使用PCT公布WO 2012/177906中所述的方法进行检测，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，使用核酸探针测定OTC的表达水平。本文使用的术语“探针”是指能够选择性结合特定OTC序列(例如mRNA或多肽)的任何分子。探针可由本领域技术人员合成，或衍生自适当的生物制剂。探针可能经过专门设计以进行标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。

分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。一种测定mRNA水平的方法包括将分离的mRNA与可与OTC mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方案中，将mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移至膜(例如硝化纤维素)。在替代实施方案中，将一个或多个探针固定在固体表面上并且将mRNA与一个或多个探针接触，例如在AFFYMETRIX基因芯片阵列中。本领域技术人员可以容易地采用已知的mRNA检测方法来用于测定OTC mRNA的水平。

用于测定样品中OTC表达水平的替代方法涉及样品中例如mRN A的核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PC R(Mullis,1987,U.S.Pat.No.4,683,202中所述的实验实施方案)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自维持序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.US A 87:1874-1878)、转录扩增***(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Tec hnology 6:1197)、滚环复制(Lizardi等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子的数量非常少，这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。在本发明的特定方面，OTC的表达水平通过定量荧光RT-PCR(即TAQMANTM***)或荧光素酶测定法来测定。

OTC mRNA的表达水平可以使用膜印迹(例如用于杂交分析，例如Northern、Southern、dot等)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合核酸的任何固体支持物)来监测。参见美国专利号5,770,722；5,874,219；5,744,305；5,677,195；和5,445,934，其通过引用并入本文。OTC表达水平的测定还可包括使用溶液中的核酸探针。

在一些实施方案中，使用分支DNA(bDNA)测定、定量PCR(qPCR)、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq或微阵列分析来评估mRNA表达水平。此类方法也可用于检测OTC核酸。

OTC蛋白表达水平可以使用本领域已知的用于测量蛋白水平的任何方法来测定。此类方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、FACS、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定、Luminex、MSD、FISH等。此类测定还可用于检测指示OTC蛋白的存在或复制的蛋白。

实施例

以下是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如数量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。

除非另外指示，否则本发明的实施将采用属于本领域的技能的常规蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。此类技术充分说明于文献中。参见例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,本期新增)；Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(1992)。

实施例1：使用靶向regRNA的ASO调控OTC表达

鉴定了人类OTC的两个人类OTC regRNA靶标(RR1和RR2)。合成了69个靶向RR1的ASO和133个靶向RR2的ASO。在原代人肝细胞中以5μM筛选这202个初始ASO，以确定增加OTCmRNA的功效。在原代人肝细胞和原代人供体肝细胞中，在1.25μM、2.5μM和5μM下进一步测试了显示功效的ASO的剂量依赖性功效。选择表现出剂量依赖性功效的阳性ASO进行ASO碱基行走并平铺在regRNA命中区域周围。根据初步筛选，选择了31个RR1 ASO和35个RR2 ASO进行碱基行走并平铺在初始ASO命中周围。进一步测试了这些额外的ASO的剂量依赖性功效。通过改变所选ASO的化学修饰的化学性质、类型和位置，选择ASO进行化学微调。鉴定出71个靶向RR1的ASO和67个靶向RR2的ASO。

对小鼠OTC regRNA重复此过程，以鉴定改变小鼠OTC表达的ASO。鉴定了小鼠OTC的四个小鼠OTC regRNA靶标。合成了126个靶向regRNA的ASO。在原代小鼠肝细胞中筛选这126个初始ASO，以确定增加OTC mRNA的功效。选择表现出剂量依赖性功效的阳性ASO进行ASO碱基行走并平铺在regRNA命中区域周围。根据初步筛选，选择了24个ASO进行碱基行走并平铺在初始ASO命中周围。进一步测试了这些额外的ASO的剂量依赖性功效。通过改变所选ASO的化学修饰的化学性质、类型和位置，选择4个ASO进行化学微调。

人和小鼠ASO的选择和化学修饰显示在表2、3、4和图18A、18B、18C、18D和18E中。

本实例被设计为使用靶向从人类OTC增强子转录的eRNA的ASO来评估人肝细胞中OTC表达的调控。

在体外培养来自四个供体(HUM4178、HUM181511A、HUM190171、HUM181371)的肝细胞。将细胞涂铺在生长培养基中，并在涂铺后4-6小时用终浓度1.25μM、2.5μM、5μM或10μMhOTC-AS Oe1-1d、hOTC-ASOe1-1h、hOTC-ASOe2-1或hOTC-ASOe1-1a处理(参见图18A、18B、18D和18E的人OTC序列和选定的ASO的化学修饰，以及图18C的小鼠OTC序列和选定的ASO的化学修饰)。处理后48小时收集细胞并进行处理以用于RNA分离、cDNA合成和QPCR分析。Taqman探针Hs00166892_m1(OTC)60X用于OTC表达。将OTC水平归一化为B2M表达。

图2A显示用hOTC-ASOe1-11处理后的OTC mRNA。图2B显示用hOTC-ASOe1-8处理后的OTC mRNA。图2C显示用hOTC-AS Oe2-1处理后的OTC mRNA。图2D显示用hOTC-ASOe1-1处理后的OTC mRNA。每种ASO处理都会导致每个供体中OTC表达的剂量依赖性增加。因此，靶向相同regRNA的四种不同的RNA致动器增加了人类OTC mRNA剂量依赖性物质。

在体外培养来自OTC缺陷供体的肝细胞。将细胞涂铺在生长培养基中，并在涂铺后4小时用终浓度5uM ASO hOTC-ASOe1-10和hOTC-ASOe1-2c处理。使用包含随机序列的非靶向对照(NTC)ASO作为阴性对照。收集上清液用于尿素生成分析，并在处理后第2天收集细胞裂解物用于获得mRNA。对于mRNA分析，使用taqman探针Hs00166892_m1进行OTC表达。将OTC水平归一化为B2M表达。对于尿素生成，通过尿素氮(BUN)比色检测试剂盒(Thermofisher，目录号：EIABUN)测量收集的上清液，并通过白蛋白ELISA(Bethyl，目录号：E88-129)进行归一化。使用Prism(GraphPad)中的单向ANOVA进行统计。

在一项剂量研究中，还使用hOTC-ASOe1-2a在野生型肝细胞中重复尿素测定。将细胞涂铺在生长培养基中，并在涂铺后4小时用终浓度1.25uM、2.5uM、5uM和10uM ASO hOTC-ASOe1-2a处理。使用包含随机序列的非靶向对照(NTC)ASO作为阴性对照。在处理后第6天，收集上清液用于尿素生成分析，并收集细胞裂解物用于获得mRNA。如上所述处理样品。

如图3A和3B所示，用两种ASO处理导致患者细胞中尿素生成增加(图3B)，这与OTCmRNA上调相关(图3A)。尿素生成测定的正常范围是18-30ug尿素/mg白蛋白。一种ASO将平均浓度提高到约13ug尿素/mg白蛋白，几乎是阴性对照样品7ug尿素/mg白蛋白的两倍，并且几乎在正常尿素生成范围内。此外，hOTC-ASOe1-2a诱导WT肝细胞中OTC mRNA(图3C)和尿素(图3D)的剂量依赖性增加。

大多数regRNA不具有人类和小鼠基因组之间保守的大序列区域。为了进行体内概念验证，鉴定了小鼠Otc区域周围的regRNA，并设计了靶向这些小鼠regRNA(启动子和增强子)的ASO，并在野生型(B6EiC3SnF1/J，[WT])原代小鼠肝细胞和Otc缺陷供体(B6EiC3Sn a/A-Otc^spf-ash/J，[OTCD])原代小鼠肝细胞中进行筛选。

原代肝细胞分离自JAX实验室的小鼠品系B6EiC3SnF1/J(对照WT)和Otc缺陷供体(B6EiC3Sn a/A-Otc^spf-ash/J，目录：001811)的雄性小鼠。spf ^ash小鼠的Otc基因中有一个变异c.386G>A，p.Arg129His，其影响剪接，导致spf/ash肝脏中Otc mRNA水平降低(wt对照的5～12％)。因此，雄性spf ^ash小鼠具有温和的生化表型和较低的OTC活性(野生型的5％-10％)。

第0天以每孔20,000个细胞涂铺原代肝细胞。第2天用终浓度5μM小鼠ASO处理细胞。将细胞孵育2天，并在处理后第2天收集裂解物用于mRNA分析。taqman探针Mm01288053_m1用于小鼠OTC表达。Ppia和Hprt用作基因表达归一化的管家基因。使用Prism(GraphPad)中的单向ANOVA进行统计。

六种ASO中的五种在体外增加了WT肝细胞中的Otc mRNA，单向ANOVA*：p 0.05-0.005；**：p<0.005(图4)。六种ASO中的四种在体外增加了OTCD肝细胞中的Otc mRNA，单向ANOVA*：p0.05-0.005；**：p<0.005(图5)。因此，靶向regRNA的ASO可用于增加患病小鼠肝细胞中的OTC表达。ASO介导的OTC缺陷小鼠细胞中的OTC上调使其能够在疾病模型中进行测试，并具有体内表型读数。

对hOTC-ASOe1-1进行了额外的化学修饰。表3和图18D中提供了修饰。如前所述，新的ASO在肝细胞中以5uM、9uM或10uM浓度进行评估。表5提供了指定ASO的OTC mRNA倍数变化和标准偏差。

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对hOTC-ASOe2-2进行了额外的化学修饰。表4和图18E中提供了修饰。如前所述，新的ASO在肝细胞中以5uM、9uM或10uM浓度进行评估。表6提供了指定ASO的OTC mRNA倍数变化和标准偏差。

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还评估了两种ASO(hOTC-ASOe1-1d和hOTC-ASOe2-2e)的剂量反应。如上所述，将细胞与增加浓度的每种ASO一起孵育。OCT mRNA通过qRT-PCR测定。

如表7所示，用增加量的hOTC-ASOe1-1d处理肝细胞导致OTC mRNA的剂量依赖性增加。

如表8所示，用增加量的hOTC-ASOe2-2e处理肝细胞导致OTC mRNA的剂量依赖性增加。

如上所述，生成额外的ASO并在肝细胞中测试。表9中提供了ASO序列、X染色体起始和终止位置、以及OTC mRNA倍数变化(FC)和标准偏差(SD)。

SEQ ID NO:143-892的ASO靶向人OTC eRNA-1(SEQ ID NO:1)。所有碱基均为2'-O-甲氧基乙基，所有胞苷均具有5-甲基(胞苷上的5-甲基)。

SEQ ID NO:893-1029的ASO靶向人OTC eRNA-2(SEQ ID NO:2)。ASO是LNA位于碱基6、11和16处的2'-O-甲氧基乙基。这种ASO也可以被描述为5×n+5个核苷酸(n是3或更大的整数)，其中5×m位置处的核苷酸是经LNA修饰的核糖核苷酸(m是1至n的整数)并且其余位置的核苷酸是2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸，所有胞苷都有5-甲基(胞苷上的5-甲基)。

SEQ ID NO:1030-1072的ASO靶向人OTC paRNA-1(SEQ ID NO:1077)。所有碱基均为2'-O-甲氧基乙基，所有胞苷均具有5-甲基(胞苷上的5-甲基)。

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实施例2：使用靶向paRNA或eRNa的ASO调控SERPING1表达

本实施例旨在使用靶向从鼠SERPING1启动子转录的paRNA的ASO评估鼠肝细胞中SERPING1表达的调控。

关于所选小鼠Serping1 ASO的序列和化学修饰，参见图19。

约6-7周龄雌性C57Bl/6小鼠用单次5mg/kg IP剂量的IFNy(每只小鼠125ug)或PBS作为阴性对照处理，并在处理后30分钟、1小时、2小时、6小时、10小时和24小时处死。约7周龄的雄性C57Bl/6小鼠用15mg/kg IP剂量的托法替布处理两次(间隔12小时)，并在处理后2小时和6小时处死。两个实验中的小鼠肝脏均在列出的时间点收集，并进行处理以用于RNA分离和cDNA合成用于相对RNA测量(Taqman qPCR(Mm00437835_m1))。

Serping1 mRNA用IFNy以时间依赖性方式上调，最高倍数变化(约3倍诱导)发生在给药后24小时(图6A)。Jak1抑制剂托法替布使Serping1 mRNA下调，50％降低发生在6小时(图6B)。因此，Serping1可能受IFNy-Jak通路控制。

约6-7周龄雌性C57Bl/6小鼠用单次5mg/kg IP剂量的IFNg(每只小鼠125ug)处理，并在处理后24小时、48小时和72小时处死。收集血清通过蛋白质印迹进行mRNA和蛋白质分析。使用的Serping1抗体是针对SERPING1(ab134918)的兔单克隆抗体[EPR8015]。将蛋白质水平归一化为转铁蛋白(兔Abcam 82411)。将Serping1 mRNA归一化为作为管家基因的Hmbs。

从24-48小时观察到血清中Serping1 mRNA和蛋白质的持续增加(图7)。表10提供了IFNg处理后的血清mRNA水平。

接下来，约6-7周龄雌性C57Bl/6小鼠用单次5mg/kg IP剂量的IFNy(每只小鼠125ug)或PBS作为阴性对照处理，并在处理后6小时和24小时处死。通过Qiagen Trizol方法处理6小时和24小时时间点的肝脏，并通过SYBR green PCR进行测量。使用PCR测定Serping1mRNA和regRNA表达水平。

如图8所示，在IFNg诱导后，regRNA水平首先增加，随后mRNA增加。

接下来，将冷冻保存的小鼠肝细胞(Lonza)涂铺在胶原蛋白包被的板上，允许附着24小时，并用1000ng/ml IFNγ刺激并在处理后0.5小时、2小时、4小时、8小时、24小时和30小时收集。将细胞在Qiagen RLT缓冲液中裂解，并使用Quick-RNA Zymo试剂盒进行处理，并使用regRNA特异性引物通过SYBR绿色qPCR测量mRNA。

如图9A和9B所示，IFNy刺激在上调Serping1 mRNA之前增加了Serping1 regRNA。Serping1 regRNA水平在2小时达到峰值，而Serping1 mRNA在30小时达到峰值。因此，IFNg处理导致小鼠肝细胞中Serping1 mRNA的时间依赖性增加。

约6-7周龄雌性C57Bl/6小鼠用单次5mg/kg IP剂量的IFNg(每只小鼠125ug)处理，并在处理后6小时和24小时收集。对6小时和24小时时间点的肝脏粉末进行处理用于ATAC-seq。表观基因组数据揭示了2个热点，增强子2和启动子2作为靶向和上调的理想区域(图10)。

接下来，冷冻保存的小鼠肝细胞(Lonza)在第1天(涂铺后24小时)通过自由摄取法以剂量反应的方式用粉末培养基中选定的ASO(mS erping1pa-ASO-1、mSerping1pa-ASO-2和mSerping1pa-ASO-3)处理，并在第3天收获。Scramble ASO(NTC-3S)用作对照。将细胞在RL T Qiagen缓冲液中裂解，并通过RNAeasy Plus 96试剂盒进行处理，并通过Taqman qPCR测量mRNA。mSerping1pa-ASO-1是mSerping1pa-ASO-2的优化序列。

使用选定的靶向paRNA的ASO，Serping1 mRNA以剂量依赖性方式上调(图11B)，而相邻基因Irf1和Ubel26没有上调。Serping1染色体邻域的示意图如图11A所示。

接下来，设计了前导ASO序列的优化版本，并在新鲜分离的小鼠肝细胞中进行了测试。在第1天(涂铺后24小时)通过游离摄取方法以剂量反应方式用粉末培养基中ASO处理细胞，并在第3天收获。加扰ASO(NTC-3S)用作对照。mSERPING1-ASOpa-6是靶向Serping1的IONIS鼠序列(Bhattacharjee等人,2013)。

如图12所示，Serping1通过靶向regRNA的ASO以剂量依赖性方式上调。用ASO处理后Serping1 mRNA的倍数变化显示在表11中。

还进行了更长时间的测定。在第1天(涂铺后24小时)通过自由摄取方法用粉末培养基中10μM选定的ASO(mSerping1pa-ASO-2、mSerping1pa-ASO-3、mSerping1pa-ASO-4)处理新鲜分离的小鼠肝细胞，并在8小时、24小时、48小时和72小时收集用于RNA加工。使用加扰ASO(NTC-Scr3S)作为对照。将mRNA归一化为NTC。

选定的ASO在24小时时将Serping1增加到约1.5-2倍(图13)

接下来进行体内测定。约8周龄雄性C57/Bl6小鼠在第1天和第4天通过SC注射用选定的与GalNAc(mSerping1 ASO-2GalNAc)缀合的ASO进行处理，在第6天收集血清。使用PBS和加扰ASO NTC作为对照。使用血清采血通过蛋白质印迹测量Serping1蛋白。研究设计的示意图如图14A所示。

在2剂与GalNAc缀合的ASO后，Serping1蛋白水平与阴性对照相比增加约1.5倍(图14B)。

接下来评估IFNg加ASO处理对Serping1 mRNA表达的累加效应。第2天通过自由摄取法用粉末培养基中5μM mSerping1 ASO-2加100ng/ml IFNg处理冷冻保存的小鼠肝细胞。第4天收集细胞进行mRNA分析。未处理的小鼠和加扰ASO NTC用作对照。5μMmSerping1 ASO-2与IFNg组合导致最高倍数变化，相对于阴性对照约2.75倍(图15A)。

还进行了联合治疗的时程测定。在第1天(涂铺后24小时)通过自由摄取法用粉末培养基中10μM mSerping1 ASO-2、mSerping1 ASO-3或mSerping1 ASO-4加1000ng/ml IFNg处理新鲜分离的小鼠肝细胞，并在8小时、24小时、48小时和72小时收集用于RNA加工。加扰ASO NTC加IFNg用作对照。

较高浓度的ASO还导致Serping1 mRNA较对照小鼠增加约3倍(图15B)。

接下来，评估了Jak1抑制剂加ASO对Serping1 mRNA的拯救作用。第2天通过自由摄取法用粉末培养基中5μM mSerping1 ASO-2加3μM Jak1抑制剂托法替布处理冷冻保存的小鼠肝细胞。第4天收集细胞进行mRNA分析。

mSerping1 ASO-2与Jak1抑制的组合导致Serping1 mRNA恢复到正常水平(图16)。

使用1μM Jak1抑制剂托法替布在Serping1敲低(KD)***中进行了类似的拯救实验。该***模拟HAE疾病，因为在HAE中，只有一个健康拷贝的Serping1，因此绝对水平为WT个体的50％。

第1天通过自由摄取法用粉末培养基中10μM和5μM mSerping1ASO-2和mSerping1ASO-3和1μM Jak1处理新鲜分离的小鼠肝细胞。在第4天收集细胞用于mRNA分析。

Jak1抑制剂使Serping1降低到正常表达的50％，类似于HAE疾病。用选定的ASO处理后，Serping1水平恢复>1.5倍，接近WT水平(图17)。

其他ASO平铺在mSERPING1-ASOpa-1(CO-3149)、mSERPING1-ASOpa-2(CO-2043)和mSERPING1-ASOpa-3(CO-2051)周围。新序列提供如下：

如前所述对ASO进行测试。简而言之，将小鼠肝细胞涂铺并在第1天涂铺后24小时用ASO处理。处理后48小时收获细胞。如图34A所示，ASO CO-3265、CO-3279、CO-2043和CO-2051以剂量依赖性方式增加Serping1 mRNA表达。

接下来，在C57BL/6J小鼠的C1NH+/-肝细胞中测试选择的Serping1 ASO。C1NH+/-肝细胞缺乏Serping1表达。如图34B所示，ASO CO-2043、CO-2051、CO-3265、CO-3419、CO-4069和CO-3279以剂量依赖性方式增加C1NH+/-肝细胞中的Serping1基因表达。

还在C1NH缺陷小鼠中测试了GAlNAc-ASO。在第1天和第3天对小鼠放血并给药ASOCO-2051和CO-3265，并在第6天处死。如图35所示，两种ASO都增加了小鼠中的Serping1mRNA。

接下来，进行血管通透性测定。C57 Bl6小鼠皮下注射ASO，剂量为260mg/kg/wk。Evan蓝色处理基于参考文献J Clin Invest.2002；109(8):1057-1063，以150mg/kg IP注射，并在第6天和第8天进行。对第8天处决的小鼠进行染料定量。尸检时，将组织干燥、称重并添加到1mL甲酰胺中。从组织中提取染料并在OD 620nm处测量。如图36所示，CO-2051减少了C1NH+/-小鼠的耳朵和结肠中的染料外渗量。

CO-2051还增加了WT和C1NH+/-小鼠中的Serping1 mRNA。WT或C1NH+/-小鼠用260mg/kg ASO处理。在第1、3、5和7天收集血液并处理成血清，使用恒定的负载体积(例如1uL血清)通过蛋白质印迹进行蛋白质测量。使用标准方法添加Serping1和转铁蛋白abcam抗体。使用LiCOR扫描仪对各个条带进行成像，并使用ImageStudio分析软件进行定量。如图37A和3B所示，用裸ASO在WT和患病小鼠中观察到Serping1上调。

重复测定并用较低剂量的GalNAc-ASO CO-2051(15mg/kg)观察到持续的蛋白质上调(图37C和37D)。

实施例3：平铺和优化靶向人OTC regRNA的ASO

合成并表征了通过在hOTC-ASOe1-2a周围碱基行走和延伸产生的其他ASO。此外，ASO通过改变化学修饰的化学性质、类型和位置进行了微调。合成并进一步表征的ASO为ASO序列hOTC-ASOe1-1a、hOTC-ASOe1-3a、hOTC-ASOe1-4a、hOTC-ASOe1-1h和hOT C-ASOe1-1d。

还合成并表征了通过在hOTC-ASOe2-2a周围碱基行走和延伸产生的其他ASO。此外，ASO通过改变化学修饰的化学性质、类型和位置进行了微调。合成并进一步表征的ASO为ASO序列hOTC-AS O-e2-2a、hOTC-ASO-e2-2b、hOTC-ASO-e2-2c、hOTC-ASO-e2-2d、hOTC-ASO-e2-2e、hOTC-ASO-e2-4、hOTC-ASO-e2-5、hOTC-ASO-e2-6和hOTC-ASO-e2-7。关于人OTC序列和所选ASO的化学修饰，参见表2、3、4和图18A、18B、18D和18E。

在体外培养来自一名供体的肝细胞。将细胞涂铺在生长培养基中，并在涂铺后4-6小时用终浓度1μM、3μM或9μM hOTC-ASO-e1-4a(图20A，碱基行走ASO)，或1.25μM、2.5μM、5μM或10μMhOTC-ASOe1-1d、hOTC-ASOe1-1h或hOTC-ASOe1-1a(图20B，微调ASO)处理。

在体外培养来自一名供体的肝细胞。将细胞涂铺在生长培养基中，并在涂铺后4-6小时用终浓度1μM、3μM或9μM hOTC-ASO-e2-2a、hOTC-ASO-e2-2b、hOTC-ASO-e2-2c、hOTC-ASO-e2-2d、hOTC-ASO-e2-2e、hOTC-ASO-e2-4、hOTC-ASO-e2-5、hOTC-ASO-e2-6和hOTC-ASO-e2-7处理。

处理后48小时收集细胞并进行处理以用于RNA分离、cDNA合成和QPCR分析。Taqman探针Hs00166892_m1(OTC)60X用于OTC表达。将OTC水平归一化为B2M表达。

与亲本序列hOTC-ASOe1-2a相比，在hOTC-ASOe1-2a周围碱基行走和延伸导致效力提高3倍(图20A)。与亲本序列hOTC-ASOe1-2a相比，通过改变修饰的类型、化学性质和位置进行的额外微调导致功效增加，如原代肝细胞中OTC mRNA的剂量依赖性增加所示(图20B)。

与亲本序列相比，通过基于hOTC-ASOe2-2a改变修饰的类型、化学性质和位置进行的微调还导致功效增加，如原代肝细胞中OTC mRNA的剂量依赖性增加所示(图21)。

接下来，在OTC缺陷的供体细胞系中对选定的ASO进行了表征。在体外培养来自OTC缺陷供体的肝细胞。将细胞涂铺在生长培养基中，并在涂铺后4小时用终浓度1μM、3μM和9μMASO hOTC-ASOe1-10、hOTC-ASOe1-2a、hOTC-ASOe1-12、hOTC-ASOe1-11和hOTC-ASOe1-1a处理。使用包含随机序列的非靶向对照(NTC)ASO作为阴性对照(SRC3)。在处理后第2天和第6天，收集上清液用于尿素生成分析，并收集细胞裂解物用于获得mRNA。对于mRNA分析，使用taqman探针Hs00166892_m1进行OTC表达。将OTC水平归一化为B2M表达。对于尿素生成，通过尿素氮(BUN)比色检测试剂盒(Thermofisher，目录号：EIABUN)测量收集的上清液，并通过白蛋白ELISA(Bethyl，目录号：E88-129)进行归一化。使用Prism(GraphPad)中的单向ANOVA进行统计。

如图22所示，在第2天和第6天用多种ASO处理后观察到OTC mRNA的剂量依赖性增加。

接下来，进行体外PBMC测定以评估ASO毒性。

外周血单核细胞(PBMC)是从新鲜人全血中分离出来的(由Research BloodComponents LLC提供)。将体积15ml全血与15ml PBS+2％FBS混合，加入到含有15ml Ficoll的SepMate分离管(STEMCELL Technologies)中，并以800g离心20分钟。除去所得顶层，并用20ml PBS+2％FBS洗涤剩余的单核细胞层，随后以300g离心8分钟。使用PBS+2％FBS进行另外两次洗涤。第三次洗涤后，将细胞沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液(Abcam，ab204733)中10分钟，然后以400g离心5分钟。然后将沉淀重悬于10ml PBS+2％FBS中，以120g离心10分钟，并将最终的PBMC沉淀重悬于RPMI 1640(Sigma Aldrich)中。将分离的PBMC以每孔100,000个细胞的密度涂铺在V形底96孔板中，并用0.7uM或1.4uM hOTC-ASOe1-1a或NTC处理。24小时后，将板以1200rpm离心5分钟并收集上清液用于细胞因子分析。与Dana Farber癌症研究所合作，使用Luminex平台对人TNFα、IL6、IL1β、IFNα和IFNβ进行定量。

如图23所示，用hOTC-ASOe1-1a处理细胞没有诱导PBMC释放细胞因子。

实施例4：平铺和优化靶向小鼠OTC regRNA的ASO

制备了靶向额外小鼠regRNA的小鼠ASO，并对其进行了测试。合成并表征的ASO为mOTC-ASOe-3、mOTC-ASOe-4、mOTC-ASOe-5和mOTC-ASOe-6

如上所述，在小鼠原代肝细胞中测试了新合成的小鼠ASO。简言之，第0天以每孔20,000个细胞涂铺原代肝细胞。第2天用10、5、2.5、1.25或0.625μM小鼠ASO处理细胞。将细胞孵育2天，并在处理后第2天收集裂解物用于mRNA分析。taqman探针Mm01288053_m1用于小鼠OTC表达。Ppia和Hprt用作基因表达归一化的管家基因。使用Prism(GraphPad)中的单向ANOVA进行统计

如图24A所示，新的小鼠ASO以剂量依赖性方式增加小鼠Otc表达。

将末端GalNAc与mOTC-ASOe-3缀合，得到ASO CO-4474。在铵攻击测定中在OTC缺陷小鼠(OTC^def)中测试了这种ASO。简言之，将10只雄性B6EiC3Sn a/A-Otc^spf-ash/J小鼠(纯合)和10只C57 WT小鼠每周用铵处理一次，持续4周，并在第1、3、5、8、10、12、15和17天给药ASO。向小鼠给药100mg/kg/周ASO或50mg/kg/周ASO。如前所述，在研究结束时收集样品进行OTCmRNA定量。

如图24B所示，靶向Otc regRNA的ASO CO-4474没有增加Otc^def小鼠中的小鼠OtcmRNA。此外，靶向Otc regRNA的ASO CO-4474没有改变其他小鼠UCD基因表达。然而，如图24C所示，CO-4474将氨降低到WT水平。因此，小鼠Otc ASO能够挽救Otc缺陷表型。

实施例5：靶向regRNA的ASO导致表观基因组H3K27乙酰化增加

接下来，评估ASO处理后人肝细胞中的相对增强子活性。

在体外培养来自单个供体(HUM181371，Lonza)的原代人肝细胞。使用10cm²胶原包被的板在涂铺培养基中涂铺7.5x10⁶个细胞，并且每15分钟搅拌一次板以确保整个板上的细胞密度均匀。涂铺后四小时将涂铺培养基更换为生长培养基，并且每48小时更换一次生长培养基，持续6天。第四天更换培养基时，将2μM ASO在生长培养基中稀释。使用非靶向对照(NTC)ASO或靶向从OTC增强子转录(负链)的非编码RNA(regRNA)的hOTC-ASOe1-10处理7.5x10⁶个肝细胞。第六天，用ASO处理肝细胞48小时，并通过向培养基中添加11％甲醛(最终1％)交联15分钟。通过添加200mM甘氨酸使甲醛淬灭5分钟，刮下细胞并用冰冷的1XPBS洗涤3次。

交联之前，收集小外周细胞刮片以用于RNA分离、cDNA合成(随机六聚体)和qPCR分析(OTC mRNA和PPIA TaqMan探针分别为#Hs00166892_m1和#Hs04194521_s1)，以验证与NTCASO处理相比，hOTC-ASOe1-10处理的肝细胞中OTC mRNA上调。将周期阈值(CT)值归一化为内源性对照基因(即PPIA)的CT值(＝dCT)，并通过从NTC ASO dCT值减去hOTC-ASOe1-10dCT来计算相对倍数变化(图25A)。

对用NTC ASO或hOTC-ASOe1-10处理的交联肝细胞样品进行H3K27ac染色质免疫沉淀，然后进行高通量测序(ChIP-seq)。细胞沉淀用冰冷的LB1(50mM Hepes-KOH，pH 7.5，140mM NaCl，140mM，1mM EDTA，pH 8.0，10％甘油溶液，0.5％ NP-40，0.25％Triton X-100)加新鲜蛋白酶抑制剂在4℃下裂解10分钟，然后与LB2(10mM Tris-HCL pH 8.0，200mMNaCl，1mM EDTA，pH 8.0，1mM EGTA，pH 8.0)加新鲜蛋白酶抑制剂在4℃下孵育10分钟。将细胞核以1350rcf，4℃离心5分钟，并重悬于1mL超声处理缓冲液(50mM Hepes-KOH，pH 7.5，140mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0，1％ Triton X-100，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)加新鲜蛋白酶抑制剂中。使用Covaris聚焦超声仪破碎染色质，条件为：10分钟时间，填充水平5，占空比5，峰值入射功率140，循环/突发200。将破碎的染色质在4℃下以20,000rcf离心5分钟，并将上清液转移到DNA低结合管中。保存50μL用于输入。前一天将5μg抗H3K27ac(abcam#ab4729)与封闭的(0.5％ BSA/1XPBS)蛋白A缀合磁珠一起预孵育。将染色质和珠-抗体结合复合物合并并孵育过夜，在4℃下旋转。第二天，使用1mL以下缓冲液在4℃下将结合的染色质珠洗涤2次，每次5分钟：超声处理缓冲液、洗涤缓冲液2(50mM He pes-KOH pH7.5，350mMNaCl，1mM EDTA pH8.0，1％ Triton X-100，0.2％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)和洗涤缓冲液3(20mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，250mM LiCl，0.5％脱氧胆酸钠)。用TE+0.2％Triton X-100洗涤样品1次，然后用TE洗涤2次。染色质在SDS洗脱缓冲液(50mM Tri-HClpH8.0，10mM EDTA pH8.0，1％ SDS)中于65℃下洗脱并反向交联过夜。将ChIP样品置于磁铁上并将洗脱物(反向交联染色质)转移到新管中。将样品(ChIP和输入)在37℃用RNA酶A处理30分钟，然后用蛋白酶K(20mg/mL)在55℃处理90分钟。通过向每个样品中添加600uL苯酚/氯仿/异戊醇来纯化DNA并使用MaXtract高密度凝胶管(Qiagen#129056)在4℃，16,000rcf下离心5分钟。上清液用乙酸钠和乙醇在-20℃下沉淀过夜，4℃下以20,000rcf离心，用1mL75％乙醇洗涤并在25μL无核酸酶的水中洗脱。按照制造商的指南，使用NEBNext DNA文库制备试剂盒对ChIP DNA和输入DNA进行文库合成，以进行高通量测序。对由两个技术重复组成的两个生物重复(每个ASO处理4个样品)进行该测定。

使用Novoseq SP(150bp)对ChIP-seq文库进行配对末端测序并使用Bowtie2与人hg38基因组比对，使用SamTools处理比对文件并使用MACS2调用峰值(图25B)。通过归一化方法并使用DESeq2鉴定hOTC-ASOe1-10和NTC ASO处理之间OTC增强子、OTC启动子和控制区(GAPDH、RPGR、TSPAN7)处的差异峰(图25C)。

图25A示出了在48小时处理后与NTC ASO和未处理的肝细胞相比，hOTC-ASOe1-10使OTC mRNA上调，表明ASO处理对于OTC mRNA的上调是成功的。这些样品用于随后的H3K27ac ChIP-seq实验。

图25B描绘了OTC增强子、OTC启动子和邻近基因RPGR的基因组浏览器轨迹图像。在实验hOTC-ASOe1-10和NTC ASO处理的肝细胞中，增强子和启动子区域均通过组蛋白H3K27乙酰化标记，这表明OTC增强子在培养的人肝细胞中具有活性。

图25C显示与非靶向ASO处理相比，hOTC-ASOe1-10处理的H3K27ac表观遗传标记的倍数变化(FC)定量以及错误发现率(FDR)。数据显示，与非靶向ASO处理相比，hOTC-ASOe1-10处理48小时显著增加了OTC增强子处的组蛋白乙酰化(FC，1.72-1.93)。阴性控制区(例如GAPDH、邻近基因、RPGR和TSPAN7启动子)没有表现出H3K27ac沉积的显著增加。不希望受理论束缚，该结果表明从hOTC-ASOe1-10观察到的表观遗传效应(增加的H3K27ac)对于靶区域(OTC增强子)是特异性的，该靶区被预测调节OTC基因。因此，不希望受理论束缚，本文所述的ASO通过修饰OTC增强子处的表观基因组特征来调控OTC基因表达。

实施例6：ASO处理不会改变OTC增强子的染色质可及性

接下来，评估了hOTC-ASOe1-10结合regRNA直接或间接增加了ASO靶向的增强子的染色质可及性。

在体外培养来自单个供体(HUM181371，Lonza)的原代人肝细胞。涂铺后四小时将涂铺培养基更换为生长培养基，并且每48小时更换一次生长培养基，持续6天。第五天，更换培养基并将2μM ASO在生长培养基中稀释。用非靶向ASO或hOTC-ASOe1-10处理肝细胞24小时。使用Omni-ATAC方案进行ATAC-seq，该方案针对单一培养的原代人肝细胞进行了优化。在板上进行DNase处理后，使用磁性死细胞去除试剂盒(Miltenyi#130-090-101)分离肝细胞并富集活细胞。Omni-ATAC方案每次重复使用约50,000个活细胞。每个处理产生三个技术重复。

使用Novoseq SP(150bp)对ATAC-seq文库进行配对末端测序，并与人类基因组hg38进行比对。相应地处理比对的读数，并使用Corces等人,2017使用的方法中所述的MACS2管道来鉴定可及染色质区域。

图26示出了OTC启动子和增强子以及邻近的RPGR启动子(由框出的区域指示)处的可及染色质区域。这些结果表明hOTC-ASOe1-10不会导致OTC增强子或启动子处的染色质可及性发生变化，表明ASO在转录因子(激活子)结合的下游发挥作用。

实施例7：ASO对regRNA的影响先于OTC mRNA转录爆发

接下来，评估ASO处理诱导OTC mRNA，以及增强子组蛋白修饰“记忆”的激活后regRNA激活的时间反应。

在体外培养来自单个供体(HUM181371，Lonza)的原代人肝细胞。涂铺后四小时将涂铺培养基更换为生长培养基，并且每48小时更换一次生长培养基，持续6天。在第4-5天，在收获前在不同的时间点(图27A-C中所示)用稀释于生长培养基中的5μM ASO处理细胞。所有孔同时用细胞裂解缓冲液收获，用于随后的RNA分离(MagMax MirVana，ThermoFisher)、cDNA合成(随机六聚体)、晶体数字PCR(cdPCR；regRNA检测)和定量PCR(qPCR；mRNA检测)。实验以生物三次重复进行，每个具有技术三次重复。

使用来自Stilla Technologies的Crystal Digital PCR^TM***进行cdPCR。使用定制TaqMan测定法测定regRNA浓度，并将其归一化为内源性对照HPRT1(TaqMan测定法#4326321E，ThermoFis her)。通过在每个各自的时间点归一化为NTC ASO处理的细胞来计算相对倍数变化。

使用对OTC mRNA特异的TaqMan探针#Hs00166892_m1进行定量PCR，并将每个值归一化为内源性对照PPIA(TaqMan内源性对照测定#4326316E，ThermoFisher)。通过在每个各自的时间点归一化为NTC ASO处理的细胞来计算相对倍数变化。对每个生物三次重复的技术三次重复进行平均，并将这些值绘制在条形图中(n＝2个生物)。误差条指示标准偏差。

如上文实例5中所述，对培养的原代肝细胞进行H3K27ac ChIP，然后进行qPCR，不同之处在于使用5μM ASO并在第4天或第5天处理并在第6天收获。ChIP-qPCR实验在生物单峰和重复(分别为24小时和48小时)进行。使用SYBR和设计用于扩增OTC增强子基因组区域的引物进行qPCR。绘制的值是hOTC-ASOe1-10处理的肝细胞相对于NTC ASO处理的肝细胞归一化的相对倍数变化。

增强子(regRNA)生成的eRNA是双向转录的，增强子活性已被证明与转录的eRNA量相关。ASO处理后随时间获得从OTC增强子转录的两种regRNA的相对表达水平(图27A和图27B)。

图27A示出了ASO处理后随时间的靶向(负链)regRNA的相对水平。处理后2小时即可测量效果，在8-16小时效果大小会减少。18小时时再次观察到上调(红色箭头)，表明这些基因座经历了转录爆发，如先前文献⁶中所述。

图27B显示了对非靶向(正)链的类似影响，具有早期(1小时)和晚期(18小时)的双峰上调(红色箭头)。

图27C示出hOTC-ASOe1-10 ASO处理后随时间的OTC mRNA效应。OTC mRNA在12小时上调，随后在24/48小时再次上调(箭头)。这种影响模拟了用regRNA(负和正)观察到的类似转录“爆发”现象。正如预期的那样，regRNA上调先于OTC mRNA上调，表明regRNA浓度增加的影响导致OTC mRNA水平增加。

H3K27ac ChIP-qPCR结果(图27D)证明H3K27ac在hOTC-ASOe1-10ASO处理后较晚(24小时)沉积，表明对RNA的影响先于该增强子处的表观遗传变化。hOTC-ASOe1-10处理导致H3K27ac ChIP信号从24小时增加到48小时。不希望受理论束缚，这些结果表明组蛋白H3上残基K27的乙酰化对于维持初始regRNA/mRNA诱导后的增强子活性可能是重要的。图27E显示了对OTC ASO的转录和染色质反应的时间模型。

实施例8：ASO处理减少负调节蛋白结合

接下来，评估在人肝细胞中用hOTC-ASOe1-10处理后，OTC增强子处阻遏蛋白复合物相互作用的扰动。用hOTC-ASOe1-10处理没有观察到染色质可及性的显著变化(图26)。不希望受理论束缚，这表明任何影响可能是由于其他蛋白质例如负调节因子的置换引起的。

使用来自HepG2细胞的公开可用ENCODE ChIP-seq数据选择候选负调节因子。简而言之，对HepG2细胞中的ENCODE转录因子(TF)数据进行过滤，以获得OTC增强子处的TF占用，并且进一步的过滤标准消除与负调控机制不相关的所有TF。在HepG2细胞中总共发现5种负调节蛋白(ARID1、BCL6、HDAC1、HDAC5和NCOR1)与OTC增强子结合。SP1是一种涉及一般转录激活的转录因子，并发现与OTC增强子结合并用作对照。

在体外培养来自单个供体(HUM181371，Lonza)的原代人肝细胞。使用10cm²胶原包被的板在涂铺培养基中涂铺7.5x10⁶个细胞，并且每15分钟搅拌一次板以确保整个板上的细胞密度均匀。涂铺后四小时将涂铺培养基更换为生长培养基，并且每48小时更换一次生长培养基，持续6天。第五天更换培养基并在生长培养基中稀释5μMASO。用NTC ASO或靶向从OTC增强子转录(负链)的非编码RNA(regRNA)的hOTC-ASOe1-10处理1.5x10⁷个肝细胞(2x10cm²板)。第六天，用指定ASO处理肝细胞24小时，并通过向培养基中添加11％甲醛(最终1％)交联15分钟。通过添加200mM甘氨酸使甲醛淬灭5分钟，刮下细胞并用冰冷的1XPBS洗涤3次。

在交联之前，收集小的外周细胞刮片用于RNA分离，以验证hOTC-ASOe1-10处理的肝细胞中与NTC ASO处理相比的OTC mRNA上调，如实施例1中所述(图1A)。

用ASO处理肝细胞24小时，然后对每个阻遏物TF ChIP'd以生物学三次重复进行ChIP qPCR。

如实施例1(图1B)中所述，使用ARID1、BCL6、HDAC1、HDAC5、NCOR1和SP1的特异性抗体(分别为sc-32761X、PA527390、40967ACTMOTIF、40970ACTMOTIF、#A301145A、sc-17824X)对培养的原代肝细胞进行ChIP，随后针对每个相应负调节因子进行qPCR。ChIP-qPCR实验以生物学三次重复进行。使用SYBR和设计用于扩增OTC增强子基因组区域的引物进行qPCR。绘制的值是hOTC-ASOe1-10处理的肝细胞相对于NTC ASO处理的肝细胞归一化的相对倍数变化。

图28A和图28B中绘制的值是hOTC-ASOe1-10与NTC ASO相比的相对倍数变化(n＝3)并且误差条指示标准偏差。

进行rChIP-qPCR来评估靶向蛋白-染色质相互作用对RNA的需求。使用标准ChIP方案进行测定，并在染色质-蛋白质复合物免疫纯化后为添加Rna酶A处理步骤。

图28A示出了所指示负调节因子的结合的相对损失。与NTC ASO处理相比，在用hOTC-ASOe1-10处理的肝细胞中，在五个负调节因子中，只有HDAC5和NCOR显示出与OTC增强子的结合减少。这表明hOTC-ASOe1-10与regRNA结合(直接或间接)抑制这些regRNA和相关染色质(增强子)与包括HDAC5和NCOR的阻遏物复合物相互作用。

图28B表明负调节因子不需要RNA分子与其靶标结合。当用RNA酶处理交联染色质以降解RNA时，肝细胞中OTC增强子处的HDAC5和NCOR1结合不会减少(未处理)。这结果并不表明regRNA不与阻遏蛋白相互作用，而是这种相互作用对于它们被募集到OTC增强子来说并不是必需的。

实施例9：阻遏物复合物的敲低降低了ASO处理对OTC mRNA上调的影响

接下来，评估了OTC增强子处结合阻遏物复合物的敲低，以减少ASO处理所观察到的影响。

使用48孔胶原包被的组织培养板在体外培养来自单个供体(HUM181371，Lonza)的原代人肝细胞。涂铺后四小时将涂铺培养基更换为生长培养基，并且每48小时更换一次生长培养基，持续6天。第3天，使用Lipofectamine RNAiMax和制造商推荐的方案(ThermoFisher，13778150)，用10nM靶向HDAC5和NCOR1的siRNA(分别为Dharmacon M-003498-02-0005和M-003518-01-0005)转染细胞18小时。第二天(第4天)用生长培养基中稀释的5μM NTC ASO或hOT C-ASOe1-10更换培养基，并培养48小时，收获肝细胞用于RNA分离(MagMax MirVana试剂盒，ThermoFisher#A27828)，使用随机六聚体合成cDNA和qPCR分析以评估敲低效率和对OTC mRNA的影响(TaqMan探针#Hs01094541_m1、Hs00608351_m1、Hs00166892_m1)。与ASO处理相结合的敲低实验以生物学三次重复进行，每个具有三次技术重复(每个处理)。图中绘制的值是每个生物实验的技术重复的平均值(n＝3)。

HDAC5或NCOR1 siRNA加工的敲低效率是通过将每个样品的相对CT值归一化为内源性对照(PPIA)并基于未经siRNA加工的样品计算倍数变化来确定的。

为了了解siHDAC5或siNCOR1对hOTC-ASOe1-10活性的影响，在各自的siRNA实验中，所有处理均归一化为NTC ASO，以减少敲低的混杂影响。

图29A-29C中绘制的值是来自三次生物重复实验的技术三次重复的平均值。误差条指示标准偏差。P值是通过未配对的学生t检验使用每次生物重复的平均值计算得出的(n＝3)。

与未处理的肝细胞相比，siHDAC5或siNCOR1处理导致靶mRNA水平降低至少50％，如图29A所示。

图29B显示HDAC5或NCOR1敲低对OTC mRNA的影响。对这些因素中的任一个进行siRNA加工都会导致肝细胞中OTC mRNA表达增加，表明这些复合物参与了OTC mRNA抑制。减轻OTC增强子处的这种抑制机制会导致基础OTC水平的边际增加。

敲低对hOTC-ASOe1-10的影响显示在图29C中。hOTC-ASOe1-10显著(p值＝0.0154)上调OTC mRNA(FC＝1.81，无siRNA加工)。与NTC ASO相比，用siHDAC5或siNCOR1处理的肝细胞显示hOTC-ASOe1-10使OTC mRNA显著上调(分别为FC＝1.41和1.28)。该实验表明，当阻遏复合物蛋白被敲低时，hOTC-ASOe1-10对OTC mRNA具有影响，因为OTC mRNA水平已经略有增加。

不希望受理论束缚，在正常稳态细胞条件下，分别从OTC增强子和基因体转录的regRNA和mRNA水平较低。发现诸如HDAC5和NCOR1的负调节因子与增强子结合，可能调控其低活性，以及转录激活物，引发基因座。hOTC-ASOe1-10处理可能通过抑制阻遏复合物结合导致regRNA水平增加。OTC增强子的这种激活促进OTC基因的正转录反应，从而导致OTC增强子和启动子处的转录爆发(图30)。

实施例10：非人灵长类动物中ASO的表征

材料和方法

15N-氯化铵获自Cambridge isotopes(Tewksbury,MA)。

NHP的氨测量和尿素生成

食蟹猴[NHP]中的氨攻击和尿素生成测定是在禁食状态下进行的，即在氨攻击之前禁食过夜。将15N-氯化铵溶液皮下注射到NHP，并在0-120分钟内进行多次抽血，并立即通过离心获得血浆。将等分试样血浆在4度下运送到IDEXX以测量氨水平。将其他等分试样速冻并运送到NovaBioAssays(Woburn,MA)以测量15N-尿素/总尿素水平。

NHP的ASO处理

2～4岁雄性食蟹猴在第0天皮下注射单次50mg/kg ASO，在第21天给予第二剂。PBS作为阴性对照。

结果

CO-5318(hOTC-ASOe1-1as)和CO-5319(hOTC-ASOe2-2w)减少NHP中的氨并增加尿素(图31)。因此，ASO在NHP中显示出治疗功效。

实施例11：人源化小鼠中ASO的表征

材料和方法

人源化Yecuris FRG小鼠研究的氨测量和尿素生成

在具有C57Bl/6背景，重新填充健康人肝细胞的雌性肝脏人源化Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-[FRG]小鼠中，在禁食状态下进行氨攻击和尿素生成测定，即在氨攻击之前禁食过夜。在第1、8、15和22天(最终收获)禁食过夜后，通过腹膜内注射用15NH4Cl(15N-氨)攻击动物。30分钟后，收集尿液和血液(加工成血浆)。将等分试样血浆在4度下运送到IDEXX(NorthGrafton,MA)以测量氨水平。将其他等分试样速冻并运送到NovaBioAssays(Woburn,MA)以测量15N尿素/总尿素水平。

小鼠研究的ASO处理

约5个月大的雌性人源化Yecuris FRG小鼠在第8、12、15和19天皮下注射50mg/kg/周ASO。PBS作为对照。

Otc^spf/ash小鼠研究的氨测量和尿素生成

野生型C57BL/6J[WT]和a/A-Otc^spf-ash/J,[OTCD]中的氨攻击和尿素生成测定均在禁食状态下进行，即在氨攻击之前禁食过夜。将15N-氯化氨溶液皮下注射到WT和OTCD小鼠中，注射氯化氨后30分钟抽血，并立即通过离心获得血浆。将等分试样血浆在4度下运送到IDEXX以测量氨水平。将其他等分试样速冻并运送到NovaBioAssays(Woburn,MA)以测量15N尿素/总尿素水平。

小鼠研究的ASO处理

约6-7周龄雄性C57BL/6J[WT]和a/A-Otc^spf-ash/J,[OTCD]在第1、3、5、8、10、12、15和17天皮下注射50或100mg/kg/周ASO。PBS作为阴性对照。

Taqman探针(全部来自Thermofisher)

结果

对人源化小鼠进行NH4Cl攻击，以测量ASO对尿素生成的影响。如图32所示，CO-5318和CO-5319均未改变OTC和CPS1 mRNA表达。然而，如图33所示，人源化小鼠中的CO-5318和CO-5319处理显示氨随时间减少，尿素相应增加双向ANOVA，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001。

以引用的方式并入

除非另有相反说明，否则本文引用的每一个专利文献和科技文章的全部公开内容出于全部目的以引用的方式并入。

等效方案

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他具体形式来实施。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为说明性的，而非是对本文描述的本发明的限制。因此，本发明的范围是由随附权利要求而非由上述描述来指示，并且属于权利要求的等效性的含义和范围内的所有变化都意图包括在本文中。

Claims (43)

1.一种与人鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的调节RNA的至少8个连续核苷酸互补的反义寡核苷酸(ASO)，其中所述调节RNA具有选自由SEQ ID NO:1-4或1077组成的组的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的ASO，其中所述ASO与所述regRNA中距regRNA 3'末端不超过200个核苷酸的序列互补。

3.根据权利要求1所述的ASO，其中所述ASO与所述regRNA中距regRNA 5'末端不超过200个核苷酸的序列互补。

4.根据权利要求1-3所述的ASO，其中所述regRNA不是聚腺苷酸化RNA。

5.根据权利要求1-3所述的ASO，其中所述ASO不诱导RNA酶H介导的所述regRNA的降解。

6.根据权利要求1、2、4或5中任一项所述的ASO，其中所述调节RNA具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，并且所述ASO包含选自由SEQ ID NO:6-14、18-35、39、41、75、76、77、78、87-124或143-892组成的组的核苷酸序列。

7.根据权利要求1、2、4或5中任一项所述的ASO，其中所述调节RNA具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，并且所述ASO包含SEQ ID NO:15-17、36-38、64-74、125-142或893-1029的核苷酸序列。

8.根据权利要求1或3-5中任一项所述的ASO，其中所述调节RNA具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，并且所述ASO包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的ASO，其中所述ASO的长度不超过50、40、30或25个核苷酸。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的ASO，其中所述ASO包含含有一个或多个化学修饰的RNA多核苷酸。

11.根据权利要求10所述的ASO，其中所述ASO的5'端的至少3、4或5个核苷酸和3'端的至少3、4或5个核苷酸包含具有一个或多个化学修饰的核糖核苷酸。

12.根据权利要求10或11所述的ASO，其中所述一个或多个化学修饰包括核苷酸糖修饰，所述核苷酸糖修饰包括2′-O—C1-4烷基如2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-脱氧(2'-H)、2′-O—C1-3烷基-O—C1-3烷基如2'-甲氧基乙基(“2'-MOE”)、2'-氟(“2'-F”)、2'-氨基(“2'-NH2”)、2'-***糖基(“2′-***糖”)核苷酸、2'-F-***糖基(“2′-F-***糖”)核苷酸、2'-锁定核酸(“LNA”)核苷酸、2'-酰胺桥核酸(AmNA)、2'-未锁定核酸(“ULNA”)核苷酸、L型糖(“L-糖”)、4'-硫代核糖基核苷酸、受限乙基(cET)、2'-氟-***糖基(FANA)或硫代吗啉代中的一个或多个。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的ASO，其中所述一个或多个化学修饰包括核苷酸间键修饰，所述核苷酸间键修饰包括硫代磷酸酯(“PS”或(P(S)))、氨基磷酸酯(P(NR1R2)例如二甲氨基氨基磷酸酯(P(N(CH3)2))、膦酰基羧酸酯(P(CH2)nCOOR)例如膦酰基乙酸酯“PACE”(P(CH2COO-))、硫代膦酰基羧酸酯((S)P(CH2)nCOOR)例如硫代膦酰基乙酸酯“硫代PACE”((S)P(CH2COO-))、烷基膦酸酯(P(C1-3烷基)例如甲基膦酸酯-P(CH3)、硼基膦酸酯(P(BH3))或二硫代磷酸酯(P(S)2)中的一个或多个。

14.根据权利要求10-13中任一项所述的ASO，其中所述一个或多个化学修饰包括核碱基修饰，所述核碱基修饰包括2-硫尿嘧啶(“2-硫代U”)、2-硫胞嘧啶(“2-硫代C”)、4-硫尿嘧啶(“4-硫代U”)、6-硫鸟嘌呤(“6-硫代G”)、2-氨基腺嘌呤(“2-氨基A”)、2-氨基嘌呤、假尿嘧啶、次黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(“5-甲基C”)、5-甲基尿嘧啶(“5-甲基U”)、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5,6-脱氢尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-烯丙基尿嘧啶(“5-烯丙基U”)、5-烯丙基胞嘧啶(“5-烯丙基C”)、5-氨基烯丙基尿嘧啶(“5-氨基烯丙基U”)、5-氨基烯丙基-胞嘧啶(“5-氨基烯丙基C”)、脱碱基核苷酸、Z碱基、P碱基、非结构核酸(“UNA”)、异鸟嘌呤(“异G”)、异胞嘧啶(“异C”)、甘油核酸(GNA)、甘油核酸(GNA)，或硫代磷酰胺吗啉(TMO)中的一个或多个。

15.根据权利要求10-14中任一项所述的ASO，其中所述一个或多个化学修饰包含2'-O-甲氧基乙基、胞苷上的5-甲基、锁定核酸(LNA)、磷酸二酯(PO)核苷酸间键或硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键。

16.根据权利要求10-15中任一项所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ ID NO:18-39或67-74的核苷酸序列。

17.根据权利要求10-15中任一项所述的ASO，其中所述ASO不包含未修饰DNA的10个或更多个连续核苷酸。

18.根据权利要求17所述的ASO，其中所述ASO不包含脱氧核糖核苷酸。

19.根据权利要求10-18中任一项所述的ASO，其中所述ASO不包含未修饰的核糖核苷酸。

20.根据权利要求10-19中任一项所述的ASO，其中所述ASO的长度为5×n+5个核苷酸(n是3或更大的整数)，其中5×m位置处的核苷酸是经LNA修饰的核糖核苷酸(m是1至n的整数)，并且其余位置的核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸。

21.根据权利要求20所述的ASO，其中所述ASO进一步包含GalNAc部分，任选地GalNAc3部分。

22.根据权利要求20或21所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ ID NO:142的核苷酸序列。

23.根据权利要求10-19中任一项所述的ASO，其中所述ASO的长度为3×n+2个核苷酸(n是6或更大的整数)，其中3×m位置处的核苷酸是经LNA修饰的核糖核苷酸(m是1至n的整数)，并且其余位置的核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸。

24.根据权利要求23所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列。

25.根据权利要求23或24所述的ASO，其中所述ASO进一步包含GalNAc部分，任选地GalNAc3部分。

26.根据权利要求25所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ ID NO:122的核苷酸序列。

27.根据权利要求10-19中任一项所述的ASO，其中所述ASO的每个核糖核苷酸均被2'-O-甲氧基乙基修饰。

28.根据权利要求27所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。

29.根据权利要求10-19中任一项所述的ASO，其中所述ASO的每个核苷酸是被2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸。

30.根据权利要求29所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列。

31.根据权利要求10-15中任一项所述的ASO，其中所述ASO包含未修饰DNA的10个或更多个连续核苷酸，其在5'端和3'端各侧接修饰核糖核苷酸的至少3个核苷酸。

32.根据权利要求31所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ IDNO:18的核苷酸序列。

33.根据权利要求10-32中任一项所述的ASO，其中所述ASO中的每个胞苷均被5-甲基修饰。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的ASO，其中所述regRNA是eRNA。

35.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-34中任一项所述的ASO以及药学上可接受的载体或赋形剂载体。

36.一种增加人细胞中OTC转录的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-34中任一项所述的ASO或根据权利要求35所述的药物组合物接触。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞为肝细胞。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述ASO增加所述细胞中调节RNA的量。

39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述ASO增加所述细胞中调节RNA的稳定性。

40.一种治疗尿素循环障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1-34中任一项所述的ASO或根据权利要求35所述的药物组合物。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述ASO增加所述受试者的细胞中调节RNA的量。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述ASO增加所述受试者的细胞中调节RNA的稳定性。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述细胞为肝细胞。