CN116075592A - 用于沉默gpam(线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1)表达的sirna组合物和方法 - Google Patents
用于沉默gpam(线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1)表达的sirna组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及靶向GPAM基因的双链核糖核酸(dsRNA)组合物,以及抑制GPAM表达的方法,和使用这类dsRNA组合物治疗受益于GPAM表达降低的受试者(例如患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者)的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月9日提交的美国临时申请第63/036,820号的优先权利益,并要求2020年10月2日提交的美国临时申请第63/087,130号的优先权利益。前述申请的全部内容在此引入作为参考。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交,并在此通过引用整体并入的序列表。2021年6月9日创建的ASCII副本名为A108868_1100WO_SL.txt,且大小为331,362字节。
发明背景
线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)是酰基转移酶家族的成员,特别是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)家族,其催化甘油-3-磷酸与源自饮食或从头脂肪生成的活化脂肪酸(酰基辅酶A或酰基-CoA)之间酯键的形成,从而产生溶血磷脂酸(LPA)。GPAM是四种GPAT同功酶之一,是位于线粒体外膜中的两种同功酶之一。GPAM负责肝脏中30-50%的GPAT活性,但仅肝外组织中GPAT活性的10%。GPAM参与脂质代谢,特别是甘油脂质合成,包括甘油三酯、甘油磷脂和胆固醇酯的合成。
形成肝实质组织的肝细胞负责动员用于能量的脂质并以脂滴(LDs)的形式储存多余的脂质,从而使肝脏成为负责脂质体内平衡的主要器官。LDs积累增加与许多代谢性疾病和慢性纤维炎性肝病相关,例如肝纤维化、NASH和NAFLD。
目前没有慢性纤维炎性肝病的治疗方法。当前患有慢性纤维炎性肝病的受试者的标准疗法包括改变生活方式和管理相关的共病,例如高血压、高脂血症、糖尿病、肥胖等。因此,随着慢性纤维炎性肝病的流行率在过去10年中逐渐增加并且预计将提高,本领域需要对患有慢性纤维炎性肝病的受试者的替代治疗。
发明内容
本发明提供了实现RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)基因的RNA转录物切割的iRNA组合物。GPAM基因可以在细胞内,例如受试者(例如人)体内的细胞。本发明还提供了使用本发明的iRNA组合物抑制GPAM基因表达和/或治疗受益于抑制或减少GPAM基因表达的受试者的方法,例如患有或易患GPAM相关疾病(例如慢性纤维炎性肝病)的受试者。
因此,在一个方面,本发明提供了用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括有义链和反义链,其中有义链包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,和反义链包含与SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA剂包括有义链和反义链,其中有义链包含来自SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸,和反义链包含来自SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在另一方面,本发明提供了一种用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括形成双链区的有义链和反义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的互补区,该互补区包含与表3-6任一个中所列的任何一个反义序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA剂包括形成双链区的有义链和反义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的互补区,其包含来自表3-6任一个中所列的任何一个反义序列的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中,互补区包含与位于SEQ ID NO:3的核苷酸122-144、137-159、170-192、220-242、247-269、326-348、342-364、379-401、458-480、473-495、514-536、573-595、676-698、705-727、793-815、808-830、870-892、885-907、908-930、957-979、983-1005、1059-1081、1087-1109、1201-1223、1226-1248、1246-1268、1299-1321、1347-1369、1399-1421、1417-1439、1481-1503、1541-1563、1578-1600、1713-1735、1776-1798、1889-1911、1921-1943、1964-1986、2127-2149、2250-2272、2342-2364、2436-2458、2456-2478、2473-2495、2518-2540、2535-2557、2589-2611、2655-2677、2714-2736、2930-2952、2987-3009、3047-3069、3083-3105、3101-3123、3131-3153、3154-3176、3204-3226、3273-3295、3302-3324、3335-3357、3360-3382、3385-3407、3424-3446、3448-3470、3466-3488、3558-3580、3576-3598、3607-3629、3777-3799、3835-3857、3862-3884、3890-3912、3929-3951、3944-3966、3988-4010、4021-4043、4056-4078、4091-4113、4128-4150、4148-4170、4182-4204、4205-4227、4220-4242、4236-4258、4262-4284、4303-4325、4328-4350、4347-4369、4363-4385、4502-4524、4521-4543、4626-4648、4656-4678、4771-4793、4836-4858、4857-4879、4876-4898、4908-4930、4937-4959、4957-4979、4991-5013、5013-5035、5043-5065、5154-5176、5201-5223、5244-5266、5283-5305、5315-5337、5339-5361、5356-5378、5445-5467、5564-5586、5610-5632、5648-5670、5669-5691、5718-5740、5749-5771、5780-5802、5863-5885、5900-5922、5917-5939、5963-5985、6001-6023、6051-6073、6075-6097、6097-6119、6115-6137、6148-6170、6167-6189、6186-6208、6212-6234、6242-6264、6275-6297、6304-6326或6324-6346内的任何15个连续核苷酸完全互补的核苷酸相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中,互补区包含与位于SEQ ID NO:3的核苷酸122-144、137-159、170-192、220-242、247-269、326-348、342-364、379-401、458-480、473-495、514-536、573-595、676-698、705-727、793-815、808-830、870-892、885-907、908-930、957-979、983-1005、1059-1081、1087-1109、1201-1223、1226-1248、1246-1268、1299-1321、1347-1369、1399-1421、1417-1439、1481-1503、1541-1563、1578-1600、1713-1735、1776-1798、1889-1911、1921-1943、1964-1986、2127-2149、2250-2272、2342-2364、2436-2458、2456-2478、2473-2495、2518-2540、2535-2557、2589-2611、2655-2677、2714-2736、2930-2952、2987-3009、3047-3069、3083-3105、3101-3123、3131-3153、3154-3176、3204-3226、3273-3295、3302-3324、3335-3357、3360-3382、3385-3407、3424-3446、3448-3470、3466-3488、3558-3580、3576-3598、3607-3629、3777-3799、3835-3857、3862-3884、3890-3912、3929-3951、3944-3966、3988-4010、4021-4043、4056-4078、4091-4113、4128-4150、4148-4170、4182-4204、4205-4227、4220-4242、4236-4258、4262-4284、4303-4325、4328-4350、4347-4369、4363-4385、4502-4524、4521-4543、4626-4648、4656-4678、4771-4793、4836-4858、4857-4879、4876-4898、4908-4930、4937-4959、4957-4979、4991-5013、5013-5035、5043-5065、5154-5176、5201-5223、5244-5266、5283-5305、5315-5337、5339-5361、5356-5378、5445-5467、5564-5586、5610-5632、5648-5670、5669-5691、5718-5740、5749-5771、5780-5802、5863-5885、5900-5922、5917-5939、5963-5985、6001-6023、6051-6073、6075-6097、6097-6119、6115-6137、6148-6170、6167-6189、6186-6208、6212-6234、6242-6264、6275-6297、6304-6326或6324-6346内的任何15个连续核苷酸完全互补的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中,dsRNA剂包含至少一个修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,有义链的基本上所有核苷酸包含修饰。在另一个实施方案中,反义链的基本上所有核苷酸包含修饰。在又一个实施方案中,有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸包含修饰。
在一个方面,本发明提供了一种用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括形成双链区的有义链和反义链,其中有义链包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,和反义链包含与SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为修饰的核苷酸,且其中有义链与在3’-末端连接的配体缀合。在一些实施方案中,dsRNA剂包括形成双链区的有义链和反义链,其中有义链包含来自SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸,和反义链包含来自SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸,其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为修饰的核苷酸,并且其中有义链与在3’-末端连接的配体缀合。
在一个实施方案中,有义链的所有核苷酸包含修饰。在另一个实施方案中,反义链的所有核苷酸包含修饰。在又一个实施方案中,有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸包含修饰。
在一个实施方案中,至少一个所述修饰的核苷酸选自脱氧核苷酸、3'-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构象受限的核苷酸、约束的乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-失水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸基团的核苷酸、包含甲基膦酸基团的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸、包含5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸,及其组合。
在一个实施方案中,核苷酸修饰是2’-O-甲基和/或2’-氟修饰。
互补区的长度可以为至少17个核苷酸;长度为19-30个核苷酸;长度为19-25个核苷酸;或长度为21-23个核苷酸。
每条链的长度可以不超过30个核苷酸,例如,每条链的长度独立地为19-30个核苷酸;每条链的长度独立地为19-25个核苷酸;每条链的长度独立地为21-23个核苷酸。
dsRNA可包括至少一条包含至少1个核苷酸的3’突出端的链;或至少一条包含至少2个核苷酸的3’突出端的链。
在一些实施方案中,dsRNA剂进一步包含配体。
在一个实施方案中,配体与dsRNA剂的有义链的3’端缀合。
在一个实施方案中,配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一个实施方案中,配体是
在一个实施方案中,dsRNA剂如下式所示与配体缀合:
并且,其中X是O或S。
在一个实施方案中,X是O。
在一个实施方案中,互补区包含表3-6任一个中的任何一个反义序列。
在一个方面,本发明提供了用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括与反义链互补的有义链,其中反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p’、q和q’各自独立地为0-6;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
np、np′、nq和nq′,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中有义链与至少一个配体缀合。
在一个实施方案中,i为0;j为0;i为1;j为1;i和j均为0;或者i和j均为1。在另一实施方案中,k为0;l为0;k为1;l为1;k和l均为0;或者k和l均为1。
在一个实施方案中,XXX与X’X’X’互补,YYY与Y’Y’Y’互补,且ZZZ与Z’Z’Z’互补。
在一个实施方案中,YYY基序出现在有义链的切割部位处或其附近,例如,Y’Y’Y’基序出现在反义链的从5’端起的11、12和13位。
在一个实施方案中,式(III)由式(IIIa)表示:
有义:5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'(IIIa)。
在另一实施方案中,式(III)由式(IIIb)表示:
有义:5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'(IIIb),
其中Nb和Nb’各自独立地代表包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在又一实施方案中,式(III)由式(IIIc)表示:
有义:5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'(IIIc),
其中Nb和Nb’各自独立地代表包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在另一实施方案中,式(III)由式(IIId)表示:
有义:5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'(IIId),
其中Nb和Nb’各自独立地代表包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,并且Na和Na’各自独立地代表包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
互补区的长度可以为至少17个核苷酸;长度19-30个核苷酸;长度19-25个核苷酸;或长度21-23个核苷酸。
每条链的长度可以不超过30个核苷酸,例如,每条链的长度独立地为19-30个核苷酸。
在一个实施方案中,核苷酸上的修饰选自LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2’-O-甲基、2′-脱氧、2’-羟基及其组合。
在一个实施方案中,核苷酸上的修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
在一个实施方案中,Y’是2’-O-甲基或2’-氟修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,dsRNA剂的至少一条链可包含至少1个核苷酸的3’突出端;或至少2个核苷酸的3’突出端。
在一个实施方案中,dsRNA剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
在一个实施方案中,硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的3’-末端。在一个实施方案中,该链是反义链。在另一个实施方案中,该链是有义链。
在一个实施方案中,硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的5’-末端。在一个实施方案中,该链是反义链。在另一个实施方案中,该链是有义链。
在一个实施方案中,该链是反义链。在另一个实施方案中,该链是有义链。
在一个实施方案中,硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的5’-末端和3’-末端。
在一个实施方案中,双链体的反义链的5′端1位的碱基对是AU碱基对。
在一个实施方案中,p’>0。在另一实施方案中,p’=2。
在一个实施方案中,q’=0,p=0,q=0和p’突出端核苷酸与靶mRNA互补。在另一个实施方案中,q’=0,p=0,q=0和p’突出端核苷酸与靶mRNA不互补。
在一个实施方案中,有义链具有总共21个核苷酸,和反义链具有总共23个核苷酸。
在一个实施方案中,至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。在另一个实施方案中,其中所有np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。
在一个实施方案中,有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸包含修饰。
在一个实施方案中,配体与dsRNA剂的有义链的3’端缀合。
在一个实施方案中,配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一个实施方案中,配体是
在一个实施方案中,dsRNA剂如下式所示与配体缀合:
并且,其中X是O或S。
在一个实施方案中,X是O。
在一个方面,本发明提供了用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括与反义链互补的有义链,其中反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p’、q和q’各自独立地为0-6;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
np、np’、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中有义链与至少一个配体缀合。
在一个方面,本发明提供了一种用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括与反义链互补的有义链,其中反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中有义链与至少一个配体缀合。
在一个方面,本发明提供了用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括与反义链互补的有义链,其中反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中有义链与至少一个配体缀合,其中所述配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个方面,本发明提供了用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括与反义链互补的有义链,其中反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;
其中有义链包含至少一个硫代磷酸酯键;和
其中有义链与至少一个配体缀合,其中所述配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个方面,本发明提供了用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括与反义链互补的有义链,其中反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'(IIIa)
其中:
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
YYY和Y′Y′Y′各自独立地代表在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序,并且其中修饰是2′-O-甲基和/或2′-氟修饰;
其中有义链包含至少一个硫代磷酸酯键;和
其中有义链与至少一个配体缀合,其中所述配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个方面,本发明提供了用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂。dsRNA剂包括形成双链区的有义链和反义链,其中有义链包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,和反义链包含与SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,其中有义链的基本上所有核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰,其中有义链在5’-末端包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键,其中反义链的基本上所有核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰,其中反义链包含在5’-末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键和在3’-末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键,并且其中有义链与一个或多个通过单价、二价或三价分支接头在3’-末端连接的GalNAc衍生物缀合。在一些实施方案中,dsRNA剂包括形成双链区的有义链和反义链,其中有义链包含来自SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸,和反义链包含来自SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸,其中有义链的基本上所有核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰,其中有义链在5’-末端包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键,其中反义链的基本上所有核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰,其中反义链包含在5’-末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键和在3’-末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键,并且其中有义链与一个或多个通过单价、二价或三价分支接头在3’-末端连接的GalNAc衍生物缀合。
在一个实施方案中,有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,互补区包含表3-6任一个中所列的任何一个反义序列。在一个实施方案中,试剂选自AD-1245828、AD-1245842、AD-1245875、AD-1245925、AD-1245952、AD-1246013、AD-1246029、AD-1246066、AD-1246105、AD-1246112、AD-1246153、AD-1246211、AD-1246314、AD-1246338、AD-1246426、AD-1246441、AD-1246503、AD-1246518、AD-1246541、AD-1246590、AD-1246616、AD-1246673、AD-1246701、AD-1246815、AD-1246840、AD-1246860、AD-1246913、AD-1246961、AD-1246995、AD-1247011、AD-1247075、AD-1247135、AD-1247172、AD-1247307、AD-1247352、AD-1247436、AD-1247450、AD-1247493、AD-1247605、AD-1247728、AD-1247802、AD-1247896、AD-1247916、AD-1247932、AD-1247977、AD-1247994、AD-1248024、AD-1248087、AD-1248146、AD-1248339、AD-1248364、AD-1248424、AD-1248458、AD-1248476、AD-1248499、AD-1248522、AD-1248572、AD-1248641、AD-1248665、AD-1248698、AD-1248717、AD-1248742、AD-1248781、AD-1248805、AD-1248823、AD-1248895、AD-1248913、AD-1248944、AD-1249094、AD-1249143、AD-1249170、AD-1249190、AD-1249229、AD-1249237、AD-1249258、AD-1249291、AD-1249319、AD-1249343、AD-1249380、AD-1249400、AD-1249432、AD-1249455、AD-1249470、AD-1249486、AD-1249512、AD-1249530、AD-1249555、AD-1249574、AD-1249590、AD-1249682、AD-1249701、AD-1249806、AD-1249828、AD-1249925、AD-1249972、AD-1249993、AD-1250012、AD-1250018、AD-1250047、AD-1250067、AD-1250101、AD-1250123、AD-1250141、AD-1250208、AD-1250253、AD-1250294、AD-1250333、AD-1250365、AD-1250388、AD-1250405、AD-1250476、AD-1250595、AD-1250641、AD-1250679、AD-1250700、AD-1250731、AD-1250762、AD-1250773、AD-1250835、AD-1250851、AD-1250868、AD-1250914、AD-1250952、AD-1250983、AD-1251007、AD-1251019、AD-1251037、AD-1251070、AD-1251089、AD-1251108、AD-1251134、AD-1251163、AD-1251196、AD-1251225和AD-1251245。在一个实施方案中,试剂选自AD-1371956、AD-1372921、AD-1373128、AD-1374116、AD-1374118、AD-1374646、AD-1374648、AD-1376755、AD-1377594、AD-1378587和AD-1378591。
在一个实施方案中,有义链和反义链包含选自表3-6任一个中所列的任一试剂的核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供了包含本发明的任何dsRNA剂的细胞、载体和药物组合物。dsRNA剂可在未缓冲溶液(例如盐水或水)中配制,或在缓冲溶液(例如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合的溶液)中配制。在一个实施方案中,缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个方面,本发明提供了抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的方法。该方法包括使细胞与本发明的dsRNA剂或药物组合物接触,从而抑制GPAM在细胞中的表达。
细胞可以在受试者(例如人类受试者)体内。
在一个实施方案中,GPAM表达被抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%,或至低于GPAM表达的检测水平。
在一个实施方案中,人类受试者患有GPAM相关疾病、障碍或病症。在一个实施方案中,GPAM相关疾病、障碍或病症为慢性纤维炎性肝病。在一个实施方案中,慢性纤维炎性肝病选自肝脏的炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、HCV相关肝硬化、药物诱导的肝损伤和肝细胞坏死。
在一个方面,本发明提供了一种抑制受试者中GPAM表达的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而抑制在受试者中的GPAM表达。
在一个方面,本发明提供了一种抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的肝脏中的脂滴累积的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的肝脏中脂肪的积累
在另一方面,本发明提供了一种治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者。
在另一方面,本发明提供了一种预防患有受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者的至少一种症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效量的本发明dsRNA剂或药物组合物,从而预防患有受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者的至少一种症状。
在另一方面,本发明提供了降低受试者中发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险的方法。该方法包括向受试者施用预防有效量或治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而降低受试者中发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险。
在另一方面,本发明提供了一种增加受试者的肝胰岛素敏感性的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而增加受试者的肝胰岛素敏感性。
在另一方面,本发明提供了一种增加受试者中游离脂肪酸的β氧化的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而增加受试者中游离脂肪酸的β氧化。
在另一方面,本发明提供了一种降低患有脂肪变性的受试者中发生慢性肝病的风险的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而降低患有脂肪变性的受试者发生慢性肝病的风险。
在又一方面,本发明提供了一种抑制患有脂肪变性的受试者中脂肪变性进展为脂肪性肝炎的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,从而抑制受试者中脂肪变性进展为脂肪性肝炎。
在一个方面,本发明提供了一种抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的肝脏中的脂滴累积的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的肝脏中的脂肪积累。
在另一方面,本发明提供了一种治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者。
在另一方面,本发明提供了一种预防患有受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者的至少一种症状的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而预防患有受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者的至少一种症状。
在另一方面,本发明提供了降低受试者发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而降低受试者发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险。
在另一方面,本发明提供了一种提高受试者的肝胰岛素敏感性的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而提高受试者的肝胰岛素敏感性。
在另一方面,本发明提供了一种增加受试者中游离脂肪酸的β氧化的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而增加受试者中游离脂肪酸的β氧化。
在另一方面,本发明提供了一种降低患有脂肪变性的受试者发生慢性肝病风险的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而降低患有脂肪变性的受试者发生慢性肝病的风险。
在另一方面,本发明提供了一种抑制患有脂肪变性的受试者中脂肪变性进展为脂肪性肝炎的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的dsRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而抑制受试者中脂肪变性向脂肪性肝炎的进展。
在一个实施方案中,向受试者施用dsRNA剂或药物组合物导致在受试者肝脏中GPAM酶活性降低、GPAM蛋白积累减少、HSD17B13酶活性降低、HSD17B13蛋白积累减少和/或脂肪积累减少和/或脂滴扩张。
在一个实施方案中,GPAM相关疾病、障碍或病症为慢性纤维炎性肝病。
在一个实施方案中,慢性纤维炎性肝病选自肝脏中的脂肪积累、肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、HCV相关肝硬化、药物诱导的肝损伤和肝细胞坏死。
在一个实施方案中,慢性纤维炎性肝病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在一个实施方案中,受试者是肥胖的。
在一个实施方案中,本发明的方法和用途进一步包括对受试者施用另外的治疗剂。
在一个实施方案中,dsRNA剂以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于受试者。
该试剂可以静脉内、肌肉内或皮下施用于受试者。在一个实施方案中,试剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中,本发明的方法和用途进一步包括确定受试者中的GPAM水平。
在一个方面,本发明提供了一种用于抑制细胞中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链,其中有义链包含表3-6任一个中的任一试剂的核苷酸序列,并且反义链包含表3-6任一个中的任一试剂的核苷酸序列,其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为修饰的核苷酸,并且其中dsRNA剂与配体缀合。
附图说明
图1显示了使用选择的GPAM dsRNA剂对肝脏中GPAM敲减的体内筛选的结果。
具体实施方式
本发明提供了实现RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的GPAM基因的RNA转录物的切割的iRNA组合物。GPAM基因可以在细胞内,例如受试者(例如人)体内的细胞。本发明还提供了使用本发明的iRNA组合物抑制GPAM基因表达的方法,以及用于治疗受益于GPAM基因表达抑制或减少的受试者的方法,例如受益于肝脏炎症减轻的受试者,例如患有或易患GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者,如患有或易患肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、肝硬化、HCV相关肝硬化、药物诱导的肝损伤和肝细胞坏死的受试者。
靶向GPAM的本发明iRNA可包括具有长度约30个核苷酸或更短的区域的RNA链(反义链),例如长度15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸,该区域与GPAM基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。
在一些实施方案中,本发明的双链RNAi剂的一条或两条链的长度为最多66个核苷酸,例如36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸,具有与GPAM基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补的至少19个连续核苷酸的区域。在一些实施方案中,具有较长反义链的这类iRNA剂可包括长度20-60个核苷酸的第二RNA链(有义链),其中有义链和反义链形成18-30个连续核苷酸的双链体。
本文所述的iRNA剂的使用在哺乳动物中实现GPAM基因的mRNA的靶向降解。
特别地,极低剂量的iRNA可特异性地和有效地介导RNA干扰(RNAi),从而导致GPAM基因的表达的显著抑制。因此,包括这些iRNA的方法和组合物可用于治疗受益于GPAM基因表达抑制或减少的受试者,例如受益于减轻肝脏炎症的受试者,例如患有或易患GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者,如患有或易患肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、肝硬化、HCV相关肝硬化、药物诱导的肝损伤和肝细胞坏死的受试者。
以下详细描述公开了如何制备和使用含有iRNA的组合物来抑制GPAM基因的表达,以及用于治疗患有受益于该基因表达的抑制和/或减少的疾病和障碍的受试者的组合物和方法。
I.定义
为了使本发明可更容易理解,首先定义某些术语。此外,应该注意的是,每当陈述参数的值或值范围时,其意图是这些陈述值中间的值和范围也是本发明的部分。
在此处使用的冠词“一”和“一个”是指一个或超过一个(即,至少一个)该冠词的语法宾语。举例来说,“一个要素”是指一个要素或超过一个要素,例如多个要素。
术语“包括”在本文中用于指短语“包括但不限于”并且可与之互换使用。
术语“或”在本文中用于指术语“和/或”并且可与之互换使用,除非上下文清楚的另外指明。
术语“约”在本文中用于表示在本领域中典型的容差范围内。例如,“约”可以理解为与平均值的约2个标准差。在某些实施方案中,约是指±10%。在某些实施方案中,约是指±5%。当“约”出现在一系列数字或范围之前时,应理解“约”可以修饰系列或范围中的每个数字。
术语“GPAM”,也称为“线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1”、“GPAT”、“GPAT1”、“mtGPAM”和“mtGPAT1”,指众所周知的编码来自任何脊椎动物或哺乳动物来源的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1的基因,包括但不限于人、牛、鸡、啮齿动物、小鼠、大鼠、猪、羊、灵长动物、猴和豚鼠,除非另有说明。
该术语还指维持天然GPAM的至少一种体内或体外活性的天然GPAM片段和变体。该术语包括GPAM的全长未加工前体形式以及信号肽的翻译后切割产生的成熟形式和蛋白水解加工产生的形式。
先前已鉴定人GPAM基因的两个变体,转录物变体1(或转录物1)和转录物变体2(或转录物2)。转录物1和2各具有22个外显子,共享21个相同的外显子,但通过选择性剪接导致转录物1包含相对于转录物2中包含的可选外显子包括4个附加核苷酸的外显子。人GPAM转录物1的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:NM_001244949.2(SEQ ID NO:1;反向互补序列,SEQ ID NO:2)中找到;且人GPAM转录物2的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:NM_020918.6(SEQ ID NO:3;反向互补序列,SEQ ID NO:4)中找到。
GPAM基因位于染色体区域10q25.2中。携带GPAM基因的人类染色体基因组区域的核苷酸序列可在例如GenBank提供的Genome Reference Consortium Human Build 38(也称为人类基因组构建38或GRCh38)中找到。携带GPAM基因的人类染色体10基因组区域的核苷酸序列也可在例如GenBank登录号NC_000010.11中找到,对应于人类染色体10的核苷酸112149865-112216306。
小鼠GPAM基因有两种变体;小鼠GPAM转录物变体1的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:NM_008149.4(SEQ ID NO:5;反向互补序列,SEQ ID NO:6);和小鼠GPAM转录物变体2的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:NM_001356285.1(SEQID NO:7;反向互补序列,SEQ ID NO:8)中找到。大鼠GPAM基因的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:NM_017274.1(SEQ ID NO:9;反向互补序列,SEQ ID NO:10)中找到。猕猴GPAM基因的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:NM_001266771.1(SEQ IDNO:11;反向互补序列,SEQ ID NO:12)中找到。食蟹猴GPAM基因有四种变体;食蟹猴GPAM转录物变体X1的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:XM_005566424.2(SEQ IDNO:13;反向互补序列,SEQ ID NO:14)中找到;食蟹猴GPAM转录物变体X2的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:XM_005566426.2(SEQ ID NO:15;反向互补,SEQ ID NO:16)中找到;食蟹猴GPAM转录变体X3的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:XM_005566425.2(SEQ ID NO:17;反向互补序列,SEQ ID NO:18)中找到;食蟹猴GPAM转录物变体X4的核苷酸和氨基酸序列可在例如GenBank参考序列:XM_015456672.1(SEQ ID NO:19;反向互补序列,SEQ ID NO:20)中找到。
GPAM mRNA序列的另外实例可使用公开可得的数据库(例如GenBank、UniProt和OMIM)容易地获得。关于GPAM的其他信息可在例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/57678找到。本文中使用的术语GPAM也指GPAM基因的变异,包括临床变体数据库中提供的变体,例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=GPAM[gene]。
本文中使用的术语“GPAM”还指通过GPAM基因的天然存在的DNA序列变异(例如GPAM基因中的单核苷酸多态性)在细胞中表达的特定多肽。GPAM基因内的许多SNP已被鉴定,并可在例如NCBI dbSNP中找到(参见www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。
线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)家族的成员,其包括GPAT1(即GPAM,定位于线粒体外膜中)、GPAT2(也定位于线粒体外膜中)、GPAT3(定位于内质网中)和GPAT4(也定位于内质网中)。GPAM是唯一一种对N-乙基马来酰亚胺(NEM)不敏感的GPAT酶。与其他GPAT同功型一样,GPAT1具有保守的酰基转移酶结构域和两个跨膜结构域,其中NH2-和COOH-端结构域面向胞质溶胶,并在线粒体膜间空间中形成茎环结构。酰基转移酶的活性位点靠近朝向胞质溶胶的NH2-端结构域,而COOH-端结构域被提出具有调节功能。(Yu等(2018)Nutr.Diabetes 8:34)GPAM在肝脏和脂肪组织中大量表达。GPAT酶催化甘油三酯合成的第一和限速步骤。具体地,GPAM催化甘油-3-磷酸和活化脂肪酸(酰基辅酶A或酰基-CoA)之间酯键的形成,从而产生溶血磷脂酸(LPA)。脂肪酸前体可源于饮食或从头脂肪生成。
GPAM负责肝脏中30-50%的GPAT活性,但仅负责肝外组织中10%的GPAT活性。GPAM参与脂质代谢,特别是甘油三酯合成,包括甘油三酯、甘油磷脂和胆固醇酯的合成,但主要驱动甘油三酯的合成。饱和脂肪酸,特别是棕榈酰-CoA,是GPAM的优选底物。肝脏通过调节脂质和碳水化合物代谢来管理瞬时的能量波动,且失调可导致障碍,例如肥胖相关的血脂异常和NAFLD。GPAM活性受激素和营养的调节,表明其作为脂质生物合成的传感器和调节剂的作用。在餐后状态中,GPAM表达由胰岛素诱导,而在具有高cAMP水平的禁食状态中,GPAM表达是低的。GPAM与GPAT4相比受到营养状态的更紧密调节。GPAM可能与肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT1)竞争,肉毒碱棕榈酰转移酶1是脂肪酸氧化的限速酶。GPAM使脂肪酸进入脂肪生成途径,其中甘油三酯合成在GPAM活性后通过内质网进行。GPAM活性的增加驱动肝代谢朝向脂质合成代谢(增加的脂肪酸吸收和甘油三酯合成)和偏离脂质分解代谢(脂肪酸的β-氧化)(Alvez-Bezerra等,(2017)Compr.Physiol.8(1):1-8)。
GPAM表达在肥胖小鼠中增加。肝GPAM在瘦小鼠中的过度表达导致肝脂肪变性、增加的甘油三酯分泌和降低的脂肪酸氧化。GPAM缺陷的小鼠具有改善的脂质分布(特别是降低的C16:0或棕榈酸)。在肝GPAM缺陷的肥胖小鼠中观察到降低的肝甘油三酯、甘油二酯、游离脂肪酸、血浆胆固醇和血糖。GPAM敲除可降低体重、肝甘油三酯水平、血浆胆固醇(例如,VLDL分泌)和血浆β-羟基丁酸水平,并可防止胰岛素抵抗和/或脂肪变性。LPA和甘油二酯(其为GPAM的下游产物)可降低通过蛋白激酶Cε激活的胰岛素受体信号传导,表明GPAM的下调可提高肝胰岛素敏感性。GPAM的缺乏不导致肝脏大小、肝细胞数量或线粒体形态的变化(Nagle等(2007)J.Biol.Chem.282(20):148-7-14815;Xu等(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.349:439:448;U.S.2012/0004276)。
如本文所用,“靶序列”指在GPAM基因的转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分,包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。在一个实施方案中,序列的靶部分至少足够长以用作在GPAM基因转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分处或其附近的iRNA指导切割的底物。
GPAM基因的靶序列长度可以为约9-36个核苷酸,例如长度约15-30个核苷酸。例如,靶序列可以是长度约15-30个核苷酸、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的部分。
如本文所用,术语“包含序列的链”指包含由使用标准核苷酸命名法指称的序列描述的核苷酸链的寡核苷酸。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而,应当理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修饰的核苷酸,如下文进一步详述的,或代理的替代部分(例如,参见表2)。本领域技术人员清楚地知道,鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替代,而不显著改变包含带有这种替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如,但不限于,包含肌苷作为碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此,在本发明所述的dsRNA的核苷酸序列中,含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被含有例如肌苷的核苷酸替代。在另一个实例中,寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶可分别被鸟嘌呤和尿嘧啶替代,以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。包含这类替代部分的序列适用于本发明所述的组合物和方法。
术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”,在本文中可互换使用,指包含如本文中术语定义的RNA的试剂,且其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割。iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导序列特异性的mRNA降解。iRNA调节(例如抑制)细胞(例如受试者(例如哺乳动物受试者)内的细胞)中的GPAM基因表达。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂包括与靶RNA序列(例如GPAM靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割的单链RNA。不希望受理论约束,据信引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(Sharp等(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer,一种核糖核酸酶III样酶,将dsRNA加工成19-23个碱基对的短干扰RNA,具有特征性的两碱基3’突出端(Bernstein等(2001)Nature409:363)。siRNA随后被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中,其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体,从而使互补的反义链能够指导靶标识别(Nykanen等(2001)Cell 107:309)。一旦与适当的靶mRNA结合,RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等(2001)Genes Dev.15:188)。因此,在一个方面,本发明涉及在细胞内产生的单链RNA(sssiRNA),其促进RISC复合物的形成以实现靶基因(即GPAM基因)的沉默。因此,术语“siRNA”在本文中也用于指如上所述的RNAi。
在另一个实施方案中,RNAi剂可以是被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA的单链RNAi剂。单链RNAi剂(ssRNAi)与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合,其然后切割靶mRNA。单链siRNA通常为15-30个核苷酸,并经过化学修饰。单链RNAi剂的设计和测试在美国专利第8,101,348号和Lima等(2012)Cell 150:883-894中描述,其全部内容在此引入作为参考。本文所述的任何反义核苷酸序列可用作本文所述的单链siRNA或通过Lima等(2012)Cell150:883-894中所述的方法进行化学修饰。
在另一个实施方案中,用于本发明组合物和方法中的“iRNA”是双链RNA,并且本文中是指“双链RNAi剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合体,其具有包括两条反向平行的和基本上互补的核酸链的双链体结构,被称为相对于靶RNA(即GPAM基因)具有“有义的”和“反义的”定向。在本发明的一些实施方案中,双链RNA(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(在此是指RNA干扰或RNAi)引发靶RNA(例如,mRNA)的降解。
一般而言,dsRNA分子每条链的大部分核苷酸是核糖核苷酸,但如本文中详细描述的,每条或两条链还可以包含一个或多个非核糖核苷酸,例如,脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。此外,如本说明书中使用的,“RNAi剂”可以包含具有化学修饰的核糖核苷酸;RNAi剂可以在多个核苷酸处包括实质的修饰。如本文所用,术语“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间连接和/或修饰的核碱基的核苷酸。因此,术语修饰的核苷酸包括对于核苷酸间键、糖部分或核碱基的(例如,官能团或原子的)置换、添加或去除。适用于本发明的试剂的修饰包括本文中公开的或本领域已知的所有类型的修饰。任何这样的修饰,如siRNA型分子中使用的,出于本说明书和权利要求的目的包括在“RNAi剂”中。
双链体区可以是允许通过RISC途径特异性降解所需靶RNA的任何长度,并且长度范围可以为约9-36个碱基对,例如约15-30个碱基对,例如约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对,例如长度15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的部分。
形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分,或者其可以是单独的RNA分子。在这两条链是一个较大分子的部分并且因此通过一条链的3’-末端与形成该双链体结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链而连接的情况下,该连接的RNA链称作“发夹环”。发夹环可以包括至少一个非配对的核苷酸。在一些实施方案中,发夹环可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸。
当dsRNA的两个基本上互补的链由单独的RNA分子构成时,这些分子不需要,但是可以共价地连接。在这两条链是通过除了一条链的3’-末端与形成该双链体结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链以外的方式而共价连接的情况下,该连接结构称作“接头”。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去存在于双链体中的任何突出端。除了双链体结构,RNAi可以包括一个或多个核苷酸突出端。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂是dsRNA,其每条链包含少于30个核苷酸,例如17-27、19-27、17-25、19-25或19-23个,其与靶RNA序列(例如GPAM靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。在另一个实施方案中,本发明的RNAi剂是dsRNA,其每条链包含19-23个核苷酸,其与靶RNA序列(例如GPAM靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。在一个实施方案中,有义链长度为21个核苷酸。在另一个实施方案中,反义链的长度为23个核苷酸。
如本文所用,术语“核苷酸突出端”是指至少一个未配对的核苷酸,其从iRNA的双链体结构(例如dsRNA)突出。例如,当dsRNA的一条链的3’-端延伸超出另一条链的5’-端时或反之亦然,存在核苷酸突出端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的突出端;可选地,突出端可以包括至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个或更多个核苷酸。核苷酸突出端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。突出端可以处于有义链、反义链或其任意组合上。另外,突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义或有义链的5’-端、3’-端或两端上。
在一个实施方案中,dsRNA的反义链在3’-端和/或5’-端具有1-10个核苷酸的突出端,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一个实施方案中,dsRNA的有义链在3’-端和/或5’-端具有1-10个核苷酸的突出端,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在另一个实施方案中,突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
在某些实施方案中,在有义链或反义链或者两者上的突出端可以包括长于10个核苷酸的延长长度,例如,10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸或10-15个核苷酸的长度。在某些实施方案中,延长的突出端是在双链体的有义链上。在某些实施方案中,延长的突出端存在于双链体的有义链的3’端上。在某些实施方案中,延长的突出端存在于双链体的有义链的5’端上。在某些实施方案中,延长的突出端是在双链体的反义链上。在某些实施方案中,延长的突出端存在于双链体的反义链的3’端上。在某些实施方案中,延长的突出端存在于双链体的反义链的5’端上。在某些实施方案中,在延长的突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
本文中涉及dsRNA使用的术语“钝端”或“平端”意指dsRNA的给定末端处不存在未配对的核苷酸或核苷类似物,即不存在核苷酸突出端。dsRNA的一端或两端可以是钝的。当dsRNA的两端均为钝端时,则称dsRNA为平端的。明确地说,“平端”dsRNA是指两端均为钝端的dsRNA,即分子任一端均无核苷酸突出端。这种分子最通常在其整个长度上是双链的。
术语“反义链”或“引导链”指iRNA(例如dsRNA)的链,其包括与靶序列例如GPAMmRNA基本上互补的区域。
如本文所用,术语“互补区”指反义链上与序列(例如靶序列,如本文定义的GPAM核苷酸序列)基本互补的区域。当互补区与靶序列不完全互补时,错配可以在分子的内部或末端区域。一般而言,最耐受的错配在末端区域中,例如,在iRNA的5’和/或3’末端的5、4、3或2个核苷酸内。
如本文所用,术语“有义链”或“随从链”是指含有与在此所定义的该术语的反义链区域基本上互补的区域的iRNA链。
如本文所用,术语“切割区”是指位置紧邻切割位点的区域。切割位点是靶标上发生切割的位点。在一些实施方案中,切割区在切割位点任一侧上且紧邻切割位点包含三个碱基。在一些实施方案中,切割区在切割位点任一侧上且紧邻切割位点包含两个碱基。在一些实施方案中,切割位点特别地出现在由反义链的核苷酸10和11限定的位点处,并且切割区包含核苷酸11、12和13。
如本文所用,且除非另有陈述,术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时,是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力,如本领域技术人员所理解的。这类条件可以例如是严格条件,其中严格条件可以包括:400mM NaCl,40mM PIPESpH 6.4,1mM EDTA,50℃或70℃持续12-16小时,随后洗涤(参见,例如,“MolecularCloning:A Laboratory Manual,Sambrook等,(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。可以使用其他条件,如在如生物内部可能遭遇的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交的核苷酸的最终应用来确定最适于两条序列的互补性测试的条件集。
在iRNA内(例如,在如本文所述的dsRNA内)的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度上的碱基配对。此类序列在本文中可以称作相对于彼此“完全互补”。然而,在本文中第一序列被称作相对于第二序列“基本上互补”的情况下,两个序列可以是完全互补的,或者对于多达30个碱基对的双链体其可以在杂交时形成一个或多个,但是一般不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对,同时保留了在与其的最终应用最相关的条件下杂交的能力,例如通过RISC途径抑制基因表达。然而,在两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下,此类突出端不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如,出于在本文中描述的目的,包含长度为21个核苷酸的一个寡核苷酸以及长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸的dsRNA(其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列)也可以称作“完全互补”。
如本文所用,就满足以上相对于其杂交的能力而言的要求来说,“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的有义链与反义链之间,或iRNA剂的反义链与靶序列之间的碱基配对使用,如将从其使用的上下文理解的。
如本文所用,与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸指与感兴趣的mRNA(例如,编码GPAM的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如,如果多核苷酸与编码GPAM的mRNA的非间断部分基本上互补,则该序列与GPAM mRNA的至少一部分互补。
因此,在一些实施方案中,本文公开的反义链多核苷酸与靶GPAM序列(例如人GPAM序列)完全互补。在其他实施方案中,本文公开的反义链多核苷酸基本上与靶GPAM序列(例如人GPAM序列)互补,并且包含与SEQ ID NO:1或3或者SEQ ID NO:1或3的片段的核苷酸序列的等同区域在其整个长度上至少约80%互补的连续核苷酸序列,例如约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%互补。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂包括与反义多核苷酸基本上互补的有义链,该反义多核苷酸又与靶GPAM序列(例如人GPAM序列)互补,并且其中有义链多核苷酸包含在其整个长度上与SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列或者SEQ ID NO:2或4任一的片段的等同区域至少约80%互补的连续核苷酸序列,例如约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%互补。
在一些实施方案中,本文公开的反义链多核苷酸与目标小鼠GPAM序列完全互补。在其他实施方案中,本文公开的反义链多核苷酸与小鼠GPAM序列基本上互补,并且包含在其整个长度上与SEQ ID NO:5或7的核苷酸序列或者SEQ ID NO:5或7的片段的等同区域至少约80%互补的连续核苷酸序列,例如约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%互补。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂包括与反义多核苷酸基本上互补的有义链,该反义多核苷酸又与小鼠GPAM序列互补,并且其中有义链多核苷酸包含在其整个长度上与SEQ ID NO:6或8的核苷酸序列或者SEQ ID NO:6或8的片段的等同区域至少约80%互补的连续核苷酸序列,例如约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%互补。
在一些实施方案中,本发明的iRNA包括与靶GPAM序列基本上互补的反义链,并且包含在其整个长度上与表3-6任一个中的任一有义链的核苷酸序列或者表3-6任一个中的任一有义链的片段的等同区域至少约80%互补的连续核苷酸序列,例如约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%互补,或者100%互补。
本文中使用的术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、“阻抑”和其他类似术语可互换使用,且包括任何水平的抑制。
本文中使用的短语“抑制GPAM基因的表达”包括抑制任何GPAM基因(例如,小鼠GPAM基因、大鼠GPAM基因、猴GPAM基因或人GPAM基因)以及编码GPAM蛋白的GPAM基因的变体或突变体的表达。
“抑制GPAM基因的表达”包括对GPAM基因的任何水平的抑制,例如至少部分抑制GPAM基因的表达,例如抑制至少约20%。在某些实施方案中,抑制为至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%。
GPAM基因的表达可基于与GPAM基因表达相关的任何变量的水平进行评估,例如,GPAM mRNA水平或GPAM蛋白水平。GPAM基因的表达也可间接地基于例如循环丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平或者组织样品(例如肝样品)中的GPAM酶活性评估。抑制可通过与对照水平相比这些变量中的一个或多个的绝对或相对水平的降低来评估。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平,例如,给药前基线水平,或从未处理的或用对照(例如,仅缓冲液对照或非活性剂对照)处理的类似受试者、细胞或样品确定的水平。
在一个实施方案中,GPAM基因表达的至少部分抑制是通过可从第一细胞或第一细胞组(其中GPAM基因被转录并且已经被处理以使得GPAM基因的表达被抑制)中分离或检测的GPAM mRNA的量与第二细胞或第二细胞组(其与第一细胞或细胞组基本上相同但未如此处理)(对照细胞)相比的减少来评估。
抑制程度可通过以下方式表示:
如本文所用,短语“使细胞与RNAi剂(例如dsRNA)接触”包括通过任何可能的方式接触细胞。使细胞与RNAi剂接触包括在体外使细胞与iRNA接触或在体内使细胞与RNAi接触。该接触可以直接或间接地进行。因此,例如,RNAi剂可通过执行该方法的个体与细胞形成物理接触,或者可替代地,RNAi剂可置于许可或导致其随后与该细胞形成接触的情况中。
体外接触细胞可例如通过将细胞与RNAi剂一起孵育来进行。体内接触细胞可以例如通过将RNAi剂注射到细胞所在的组织中或其附近,或通过将RNAi剂注射到另一区域(例如血液或皮下空间)中以使得RNAi剂随后到达待接触细胞所在的组织来进行。例如,RNAi剂可包含和/或偶联至配体,例如GalNAc3,该配体将RNAi剂指引到感兴趣的部位,例如肝脏。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如,细胞也可以在体外与RNAi剂接触,然后移植到受试者体内。
在一个实施方案中,使细胞与iRNA接触包括通过促进或影响细胞摄取或吸收到细胞中来将iRNA“引入”或“递送至细胞中”。iRNA的吸收或摄取可通过无辅助扩散或主动的细胞过程或通过辅助试剂或装置发生。将iRNA引入细胞中可以是在体外和/或体内。例如,对于体内导入,可将iRNA注射到组织部位中或***性施用。体内递送也可通过β-葡聚糖递送***进行,例如美国专利号5,032,401和5,607,677以及美国公开号2005/0281781中所述的那些,其全部内容通过引用并入本文。在体外引入细胞中包括本领域已知的方法,例如电穿孔和脂质转染。进一步的方法在下文中描述和/或是本领域已知的。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包括包封药物活性分子(如核酸分子,例如iRNA或iRNA从其转录的质粒)的脂质层的囊泡。LNP描述在例如美国专利号6,858,225、6,815,432、8,158,601和8,058,069中,其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用,“受试者”是动物,例如哺乳动物,包括灵长动物(例如人、非人类灵长动物,例如猴子和黑猩猩)、非灵长动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马和鲸鱼)或鸟(例如鸭或鹅)。
在一个实施方案中,受试者是人,例如因受益于GPAM表达减少的疾病、障碍或病症而接受治疗或评估的人;具有受益于GPAM表达减少的疾病、障碍或病症的风险的人;患有受益于GPAM表达减少的疾病、障碍或病症的人;和/或因受益于GPAM表达减少的疾病、障碍或病症正接受治疗的人,如本文所述。
在另一实施方案中,受试者是GPAM基因纯合的。该基因的每个等位基因可编码功能性GPAM蛋白。在又一实施方案中,受试者是GPAM基因杂合的。受试者可具有编码功能性GPAM蛋白的等位基因和编码GPAM的失能变体的等位基因。在另一实施方案中,受试者携带GPAM rs2792759变体。在另一实施方案中,受试者携带rs2792751变体。在一些实施方案中,具有rs2792751变体的受试者携带I43V错义突变(即在氨基末端起的第43个残基处缬氨酸置换异亮氨酸)。
在一个实施方案中,受试者是HSD17B13基因纯合的。该基因的每个等位基因可编码功能性HSD17B13蛋白。在另一实施方案中,受试者是HSD17B13基因杂合的。受试者可具有编码功能性HSD17B13蛋白的等位基因和编码HSD17B13的失能变体的等位基因。在另一实施方案中,受试者不是HSD17B13 rs72613567变体的携带者,例如HSD17B13 rs72613567:TA。
在一些实施方案中,受试者对于编码含patatin样磷脂酶结构域蛋白3(PNPLA3)的基因是杂合的。在一个实施方案中,等位基因之一编码I148M变异(例如,由rs738409C>G编码的)。在一个实施方案中,等位基因之一编码I144M变异。在一些实施方案中,受试者对于编码PNPLA3的基因是纯合的。在一个实施方案中,基因的每个等位基因编码I148M变异。在一个实施方案中,基因的每个等位基因编码PNPLA3 I144M变异。在一个实施方案中,基因的每个等位基因编码功能性PNPLA3蛋白。
如本文所用,术语“治疗”或“疗法”指有益或期望的结果,包括但不限于减轻或改善与GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生相关的一种或多种症状。在一些实施方案中,与GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生相关的症状可以是其中疾病或障碍的病理或病因与GPAM表达和/或GPAM蛋白产生无关,但其仍可以通过抑制GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生而补偿/治疗/抵消的疾病或障碍的症状,例如GPAM相关疾病,例如慢性纤维炎性肝病,例如肝脏的炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、HCV相关肝硬化、药物诱导的肝损伤、肝细胞坏死和/或肝细胞癌。“治疗”也可以指与不存在治疗时的预期生存相比延长生存时间。
在GPAM相关疾病的上下文中,术语“较低”指该水平中统计学显著的降低。降低可以是例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多。在某些实施方案中,降低是至少20%。在受试者的GPAM水平的上下文中,“较低”优选降低至公认为在无这种障碍的个体的正常范围内的水平。
当用于指受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症时,如本文所用的“预防”或“防止”是指受试者发生与这种疾病、障碍或病症相关的症状的可能性的降低,例如GPAM基因表达的症状,如肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、HCV相关肝硬化、药物诱导的肝损伤、肝细胞坏死和/或肝细胞癌。不发生疾病、障碍或病症,或与该疾病、障碍或病症相关的症状发生的减少(例如,在该疾病或病症的临床可接受的尺度上减少至少约10%),或延迟症状(例如,肝脏中的脂质积累和/或肝脏中的脂滴扩张的减少)的表现延迟(例如,数天、数周、数月或数年)被视为有效预防。
本文中使用的术语“GPAM相关疾病”是由GPAM基因表达或GPAM蛋白产生引起或与之相关的疾病或障碍。术语“GPAM相关疾病”包括受益于GPAM基因表达或蛋白质活性降低的疾病、障碍或病症。例如,“GPAM相关疾病”包括并非因GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生而引起,但其中GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生的减少仍可减轻疾病或障碍的症状或者抵消或补偿疾病或障碍的不利生理效应的疾病或障碍。患有GPAM相关疾病或障碍或者具有GPAM相关疾病或障碍的风险的受试者可包括表达野生型GPAM基因和/或另外表现出GPAM基因的正常/健康表达水平和GPAM蛋白产生水平的受试者。
在一个实施方案中,“GPAM相关疾病”是慢性纤维炎性肝病。“慢性纤维炎性肝病”是与慢性肝脏炎症和/或纤维化相关的任何疾病、障碍或病症。慢性纤维炎性肝病的非限制性实例包括,例如,肝脏炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、HCV相关的肝硬化、药物诱导的肝损伤、肝细胞坏死和/或肝细胞癌。
本文中使用的“治疗有效量”旨在包括当施用于患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者时足以有效治疗该疾病(例如通过减少、改善或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)的RNAi剂的量。“治疗有效量”可根据RNAi剂、该试剂如何施用、疾病及其严重程度,以及待治疗受试者的病史、年龄、体重、家族史、遗传构成、先前或伴随治疗的类型(如果有)和其他个体特征而变化。
本文中使用的“预防有效量”旨在包括当施用患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的iRNA的量。改善疾病包括减缓疾病的过程或降低后发生疾病的严重程度。“预防有效量”可根据iRNA、该试剂如何施用、疾病风险程度,以及待治疗患者的病史、年龄、体重、家族史、遗传构成、先前或伴随治疗的类型(如果有)和其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以适用于任何治疗的合理利益/风险比产生某些期望的局部或***性效果的RNAi剂的量。本发明方法中使用的iRNA可以以足以产生适用于这种治疗的合理利益/风险比的量施用。
本文中使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内,适合用于与人类受试者和动物受试者的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症(与合理的利益/风险比相称)的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文中使用的短语“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组合物或溶媒,例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋型剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、钙或锌或者硬脂酸)或溶剂包封材料,其参与将所述化合物从一个器官或身体的部分运送或运输至另一器官或身体的部分。每种载体在与制剂的其他成分相容,且对被治疗受试者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学上可接受载体的材料的一些实例包括:(1)糖,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素;(4)黄蓍粉;(5)麦芽;(6)明胶;(7)润滑剂,如硬脂酸镁(magnesium state)、十二烷基硫酸钠和滑石;(8)赋形剂,如可可脂和栓剂蜡;(9)油类,如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;(10)二醇,例如丙二醇;(11)多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯,例如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)海藻酸;(16)无热原水;(17)等渗盐水;(18)林格氏溶液;(19)乙醇;(20)pH缓冲溶液;(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐;(22)膨胀剂,如多肽和氨基酸;(23)血清成分,如血清白蛋白、HDL和LDL;和(22)药物制剂中使用的其他非毒性相容物质。
本文中使用的术语“样品”包括从受试者分离的类似液体、细胞或组织的集合,以及受试者体内存在的液体、细胞或组织。生物液体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊液、眼液体、淋巴、尿液、唾液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如,样品可源自特定器官、器官部分或这些器官内的液体或细胞。在某些实施方案中,样品可源自肝脏(例如,全肝或肝脏的某些节段或肝脏中某些类型的细胞,例如,肝细胞)。在一些实施方案中,“源自受试者的样品”指从受试者抽取的血液或血浆。
II.本发明的iRNA
本文描述了抑制靶基因表达的iRNA。在一个实施方案中,iRNA抑制GPAM基因的表达。在一个实施方案中,iRNA剂包括用于抑制细胞中GPAM基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子,例如肝细胞,例如受试者(例如哺乳动物,例如患有慢性纤维炎性肝疾病、障碍或病症,例如,与例如肝内脂滴的积累和/或扩张和/或肝纤维化相关的疾病、障碍或病症的人)内的肝细胞。
dsRNA包括具有与GPAM基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补的互补区的反义链。互补区的长度为约30个核苷酸或更短(例如,长度约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个核苷酸或更短)。当与表达靶基因的细胞接触时,iRNA抑制靶基因(例如人、灵长动物、非灵长动物或鸟的靶基因)的表达至少约10%,如通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法或通过基于蛋白质的方法(例如通过免疫萦光分析,使用例如Western印迹或流式细胞技术)测定的。
dsRNA包括两条互补的RNA链,并在dsRNA使用的条件下杂交以形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列可源自GPAM基因表达过程中形成的mRNA的序列。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域,使得两条链在合适的条件下组合时杂交并形成双链体结构。如本文其他地方所述和本领域中已知的,dsRNA的互补序列也可以作为单一核酸分子的自身互补区包含,而不是在单独的寡核苷酸上。
通常,双链体结构的长度在15-30个碱基对之间,例如,长度在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对之间。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的部分。
类似地,与靶序列的互补区长度为15-30个核苷酸,例如长度15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的部分。
在一些实施方案中,dsRNA的有义链和反义链各自独立地为约15至约30个核苷酸的长度,或约25至约30个核苷酸的长度,例如,每条链长度独立地在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸之间。在一些实施方案中,dsRNA的长度为约15至约23个核苷酸,或约25至约30个核苷酸。一般地,dsRNA足够长以用作Dicer酶的底物。例如,本领域众所周知,长于约21-23个核苷酸的dsRNA可用作Dicer的底物。本领域普通技术人员也认识到,靶向用于切割的RNA区域最通常是较大的RNA分子(通常mRNA分子)的部分。在相关的情况下,mRNA靶标的“部分”是具有足够长度的mRNA靶标的连续序列,以使其成为RNAi指导的切割(即通过RISC途径的切割)的底物。
本领域技术人员还将认识到,双链体区域是dsRNA的主要功能性部分,例如约9至36个碱基对的双链体区域,例如约10-36、11-36、12-36、13-36、14-36、15-36、9-35、10-35、11-35、12-35、13-35、14-35、15-35、9-34、10-34、11-34、12-34、13-34、14-34、15-34、9-33、10-33、11-33、12-33、13-33、14-33、15-33、9-32、10-32、11-32、12-32、13-32、14-32、15-32、9-31、10-31、11-31、12-31、13-32、14-31、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。因此,在一个实施方案中,当其被加工成靶向用于切割的所需RNA的(例如15-30个碱基对的)功能性双链体时,具有大于30个碱基对的双链体区域的RNA分子或RNA分子复合物为dsRNA。因此,普通技术人员将认识到,在一个实施方案中,miRNA是dsRNA。在另一个实施方案中,dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施方案中,可用于靶向GPAM表达的iRNA剂不是通过较大dsRNA的切割在靶细胞中产生的。
本文所述的dsRNA可进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端,例如1、2、3或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于其平端的对应物具有出乎意料优异的抑制性能。核苷酸突出端可包含或由核苷酸/核苷类似物组成,包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任意组合上。此外,突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5’端、3’端或两端。
dsRNA可通过本领域已知的标准方法合成,如下文进一步讨论的,例如通过使用自动DNA合成仪,如可从例如Biosearch,Applied Biosystems,Inc.商购获得的。
本发明的iRNA化合物可使用两步法制备。首先,单独制备双链RNA分子的单个链。然后,对组分链进行退火。siRNA化合物的单个链可使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。有机合成提供的优势在于可以容易地制备包含非天然或修饰的核苷酸的寡核苷酸链。本发明的单链寡核苷酸可使用溶液相或固相有机合成或两者制备。
在一个方面,本发明的dsRNA包括至少两个核苷酸序列,有义序列和反义序列。有义链序列选自表3-6任一个中提供的序列的组,且有义链的反义链的相应核苷酸序列选自表3-6任一个中的序列的组。在这一方面,两个序列之一与两个序列中的另一个互补,其中一个序列基本上与GPAM基因表达中产生的mRNA的序列互补。因此,在该方面,dsRNA包括两个寡核苷酸,其中一个寡核苷酸在表3-6的任一个中被描述为有义链(随从链),而第二寡核苷酸在表3-6的任一个中被描述为有义链的相应反义链(引导链)。在一个实施方案中,dsRNA的基本上互补的序列包含在单独的寡核苷酸上。在另一个实施方案中,dsRNA的基本上互补的序列包含在单个寡核苷酸上。
应当理解,尽管表3-6中的序列被描述为修饰的、未修饰的、未缀合的和/或缀合的序列,本发明的iRNA(例如本发明的dsRNA)的RNA可以包含表3-6任一个中示出的任一序列,其未修饰、未缀合,和/或与其中所述不同地修饰和/或缀合。
本领域技术人员很清楚,具有约20至23个碱基对(例如21个碱基对)的双链体结构的dsRNA被认为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等,(2001)EMBO J.,20:6877-6888)。然而,其他人发现较短或较长的RNA双链体结构也可能有效(Chu和Rana(2007)RNA14:1714-1719;Kim等(2005)Nat Biotech 23:222-226)。在上述实施方案中,由于本文提供的寡核苷酸序列的性质,本文描述的dsRNA可包括至少一条长度最少21个核苷酸的链。可以合理预期,与上述dsRNA相比,较短的双链体在一个或两个末端仅减去几个核苷酸可能同样有效。因此,具有源自本文提供的序列之一的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的序列,并且其抑制GPAM基因表达的能力与包含完全序列的dsRNA相差不超过约5%、10%、15%、20%、25%或30%抑制的dsRNA被设想在本发明的范围内。
另外,表3-6中描述的RNA在GPAM转录物中鉴定了易受RISC介导的切割的位点。因此,本发明进一步特征为靶向该位点内的iRNA。如本文所用,如果iRNA促进转录物在特定部位内的任何位置的切割,则iRNA被称为靶向RNA转录物的该特定位点内。这种iRNA通常包含来自本文提供的序列之一的至少约15个连续核苷酸,其与从基因中与选定序列连续的区域获得的另外核苷酸序列偶联。
尽管靶序列的长度通常为约15-30个核苷酸,该范围内特定序列对指导任何给定靶RNA的切割的适用性存在大的差异。本文中列出的各种软件包和指南为任何给定基因靶标的最佳靶序列的识别提供了指导,但是也可以采用经验方法,其中给定大小(作为非限制性示例,21个核苷酸)的“窗口”或“掩模”文字地或图形地(包括,例如,在计算机上)放置在靶RNA序列上,以识别该大小范围内可用作靶序列的序列。通过将序列“窗口”在初始靶序列位置上游或下游逐渐移动一个核苷酸,可以识别下一个潜在的靶序列,直至针对任何选定的给定靶标大小识别出可能序列的完整集。这一过程,与所鉴定序列的***合成和测试(使用本文所述或本领域已知的分析法)结合以鉴定那些表现最佳的序列,可以鉴定当用iRNA剂靶向时介导对靶基因表达的最佳抑制的那些RNA序列。因此,尽管在此鉴定的序列代表有效的靶序列,但预期通过在给定序列的上游或下游逐步“步移窗口”一个核苷酸以鉴定具有相同或更好抑制特性的序列,可以实现抑制效率的进一步优化。
此外,预期对于本文鉴定的任何序列,可通过***地添加或移除核苷酸以产生更长或更短的序列并测试通过从该点沿靶RNA上下步移更长或更短尺寸的窗口而产生的那些序列实现进一步优化。同样,在本领域已知的和/或如本文所述的抑制试验中,将产生新候选靶标的这种方法与基于这些靶序列的iRNA的有效性的测试相结合可以导致抑制效率的进一步提高。再此外,这种优化的序列可以通过例如引入本文所述或本领域已知的修饰的核苷酸、突出端的增加或改变或者本领域已知和/或本文所述的其他修饰来进一步优化作为表达抑制剂的分子(例如,增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加自内体的释放)来调整。
本文所述的iRNA剂可包含与靶序列的一个或多个错配。在一个实施方案中,本文所述的iRNA包含不超过3个错配。如果iRNA的反义链含有与靶序列的错配,优选错配区域不位于互补区的中心。如果iRNA的反义链含有与靶序列的错配,优选错配被限制在互补区5’或3’端起的最后5个核苷酸内。例如,对于23个核苷酸的iRNA剂,与GPAM基因的区域互补的链通常在中心13个核苷酸内不包含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可用于确定包含与靶序列的错配的iRNA是否有效抑制GPAM基因的表达。考虑具有错配的iRNA在抑制GPAM基因表达方面的效力非常重要,尤其是如果已知GPAM基因中的特定互补区在群体中具有多态性序列变异。
III.本发明的修饰的iRNA
在一个实施方案中,本发明的iRNA(例如dsRNA)的RNA未被修饰,并且不包含例如本领域已知的和本文所述的化学修饰和/或缀合。在另一个实施方案中,本发明的iRNA(例如dsRNA)的RNA被化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。在本发明的某些实施方案中,本发明的iRNA的基本上所有核苷酸被修饰。在本发明的其他实施方案中,本发明的iRNA的所有核苷酸被修饰。其中“基本上所有的核苷酸被修饰”的本发明的iRNA大部分但非全部被修饰,并且可以包括不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
在本发明的一些方面,本发明的iRNA的基本上所有核苷酸被修饰,并且iRNA剂包含不超过10个包含2’-氟修饰的核苷酸(例如,不超过9个2′-氟修饰、不超过8个2′-氟修饰、不超过7个2′-氟修饰、不超过6个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2-氟修饰或不超过2个2-氟修饰)。例如,在一些实施方案中,有义链包含不超过4个含2′-氟修饰的核苷酸(例如,不超过3个2′-氟修饰或不超过2个2′-氟修饰)。在其他实施方案中,反义链包含不超过6个含2′-氟修饰的核苷酸(例如,不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰或不超过2个2′-氟修饰)。
在本发明的其他方面,本发明的iRNA的所有核苷酸被修饰,并且iRNA剂包含不超过10个包含2’-氟修饰的核苷酸(例如,不超过9个2′-氟修饰、不超过8个2′-氟修饰、不超过7个2′-氟修饰、不超过6个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2-氟修饰或不超过2个2-氟修饰)。
在一个实施方案中,本发明的双链RNAi剂进一步在反义链的5’核苷酸处包含5’-磷酸酯或5’-磷酸酯模拟物。在另一个实施方案中,双链RNAi剂进一步在反义链的5’核苷酸处包含5’-磷酸酯模拟物。在具体实施方案中,5’-磷酸酯模拟物是5’-乙烯基磷酸酯(5’-VP)。
本发明所述的核酸可以通过本领域内充分确立的方法来进行合成和/或修饰,如在“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.等(编著),JohnWiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA中描述的那些,其通过引用并入本文。修饰包括例如末端修饰,例如5’端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)或3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等);碱基修饰,例如替换为稳定化碱基、去稳定化碱基或与扩充的伴体库碱基配对的碱基、移除碱基(脱碱基核苷酸)或缀合的碱基;糖修饰(例如,在2’-位置或4’-位置)或糖的替换;和/或骨架修饰,包括修饰或替换磷酸二酯键。在本文所述的实施方案中有用的iRNA化合物的具体实例包括但不限于含有修饰骨架或无天然核苷间连接的RNA。具有修饰骨架的RNA特别地包括在骨架中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的和如有时本领域中提及,也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰RNA视为寡核苷。在一些实施方案中,修饰的iRNA将在其核苷间骨架中具有磷原子。
修饰的RNA骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯,包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯,包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯、这些酯的2’-5’连接的类似物和具有反转极性的那些,其中相邻对的核苷单元为3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接。还可以包括各种不同盐、混合盐以及游离酸形式。在本发明的一些实施方案中,本发明的dsRNA剂是游离酸形式。在本发明的其他实施方案中,本发明的dsRNA剂是盐形式。在一个实施方案中,本发明的dsRNA剂是钠盐形式。在某些实施方案中,当本发明的dsRNA剂是钠盐形式时,钠离子作为存在于dsRNA剂中的基本上所有的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子存在于dsRNA剂中。其中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键都具有钠抗衡离子的dsRNA剂包含不超过5、4、3、2或1个没有钠抗衡离子的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,当本发明的dsRNA剂是钠盐形式时,钠离子作为dsRNA剂中存在的所有的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子存在于dsRNA剂中。
教导制备以上含磷键的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,195;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,316;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;5,625,050;6,028,188;6,124,445;6,160,109;6,169,170;6,172,209;6,239,265;6,277,603;6,326,199;6,346,614;6,444,423;6,531,590;6,534,639;6,608,035;6,683,167;6,858,715;6,867,294;6,878,805;7,015,315;7,041,816;7,273,933;7,321,029;以及美国专利RE39464,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
其中不包括磷原子的修饰的RNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代连接的那些(部分地从核苷的糖部分形成);硅氧烷骨架;硫化物、亚砜和砜骨架;甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架;亚甲基甲乙酰基(methylene formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架;含烯的骨架;氨基磺酸酯骨架;亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架;磺酸酯和磺酰胺骨架;酰胺骨架;和其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
教导以上的寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,64,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;和5,677,439,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中,考虑将适宜的RNA模拟物用于iRNA中,其中核苷酸单元的糖和核苷间键(即,骨架)均被新基团替代。保持碱基单元以与适当的核酸靶标化合物杂交。一种此类寡聚化合物(已经显示具有优异杂交特性的RNA模拟物)称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中,RNA的糖骨架替换为含酰胺的骨架,尤其氨基乙基甘氨酸骨架。核碱基被保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082;5,714,331;和5,719,262,其每一个的全部内容通过引用并入本文。适于在本发明的iRNA中使用的其他PNA化合物描述在例如Nielsen等,Science,1991,254,1497-1500中。
本发明中所述的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有杂原子骨架的寡核苷,并且尤其上文所述美国专利号5,489,677的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯骨架表述为--O--P--O--CH2--],和上文所参考美国专利号5,602,240的酰胺骨架。在一些实施方案中,在此表征的RNA具有上文所参考美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。
修饰的RNA也可以含有一个或多个取代的糖部分。本文所述的iRNA(例如,dsRNA)可以在2’位置包含以下之一:OH;F;O-、S-或N-烷基;O-、S-或N-烯基;O-、S-或N-炔基;或O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的适合的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2,其中n和m是1至约10。在其他实施方案中,dsRNA在2’位置包含以下之一:C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善iRNA的药代动力学特性的基团或用于改善iRNA的药效特征的基团,和具有相似特性的其他取代基。在一些实施方案中,修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3,也称作2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504),即,烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基,即,O(CH2)2ON(CH3)2基团,也称作2’-DMAOE,如下文的实例中所述的,以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE),即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。更多示例性修饰包括:5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-脱氧核苷酸,(这三个家族的R和S异构体);2’-烷氧基烷基;和2’-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。也可以在iRNA的RNA上的其他位置处作出相似的修饰,尤其在3’末端核苷酸上或在2’-5’连接的dsRNA中糖的3’位置,和5’末端核苷酸的5’位置。iRNA也可以具有糖模拟物,如替代呋喃戊糖的环丁基部分。教导制备此类修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;和5,700,920,其中某些由本申请共同所有。特此通过引用将前述的每个的全部内容并入本文。
本发明的iRNA还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用,“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C),5-羟甲基胞嘧啶,黄嘌呤,次黄嘌呤,2-氨基腺嘌呤,腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物,腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物,2-硫尿嘧啶,2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶,5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶,5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶,6-偶氮尿嘧啶,胞嘧啶和胸腺嘧啶,5-尿嘧啶(假尿嘧啶),4-硫尿嘧啶,8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤,5-卤基(尤其是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶,7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤,8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤,7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤,以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的哪些,在Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P编著,Wiley-VCH,2008中公开的那些;在TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.L编著,John Wiley&Sons,1990中公开的那些;在Englisch等,(1991)Angewandte Chemie,International Edition,30:613中公开的那些和在Sanghvi,Y S.,第15章,dsRNA Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著,CRC Press,1993中公开的那些。这些核碱基中的某些对提高本发明所述的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6以及O-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代提高核酸双链体的稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278),并且是示例性的碱基取代,甚至更加特别地是与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述的美国专利号3,687,808,4,845,205;5,130,30;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121,5,596,091;5,614,617;5,681,941;5,750,692;6,015,886;6,147,200;6,166,197;6,222,025;6,235,887;6,380,368;6,528,640;6,639,062;6,617,438;7,045,610;7,427,672;和7,495,088,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
本发明的iRNA也可以被修饰以包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸,其中所述核糖部分包含连接2’碳和4’碳的额外桥。这个结构有效地将核糖“锁”在3’-内结构构象中。向siRNA添加锁核酸已经显示增加血清中的siRNA稳定性并且减少脱靶效应(Elmen,J.等,(2005)Nucleic Acids Research33(1):439-447;Mook,OR.等,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843;Grunweller,A.等,(2003)Nucleic AcidsResearch 31(12):3185-3193)。
本发明的iRNA也可以被修饰以包括一个或多个双环糖部分。“双环糖”是通过两个原子的桥接修饰的呋喃基(furanosyl)环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷,该糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥,由此形成双环环***。在某些实施方案中,桥连接糖环的4’-碳和2’-碳。因此,在一些实施方案中,本发明的dsRNA剂可以包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸,其中核糖部分包含连接2’和4’碳的额外桥。换句话说,LNA是包含双环糖部分的核苷酸,所述糖部分包含4’-CH2-O-2’桥。这个结构有效地将核糖“锁”在3’-内结构构象中。将锁核酸添加至siRNA已经显示出提高siRNA在血清中的稳定性,并且降低脱靶效应(Elmen,J.等,(2005)Nucleic Acids Research 33(1):439-447;Mook,OR.等,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843;Grunweller,A.等,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸中的双环核苷的实例包括但不限于在4’和2’核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中,本发明的反义多核苷酸剂包括一个或多个双环核苷,其包含4’-2’桥。这样的4’-2’桥接的双环核苷的实例包括但不限于4’-(CH2)-O-2’(LNA);4’-(CH2)-S-2’;4’-(CH2)2-O-2’(ENA);4’-CH(CH3)-O-2’(也称为“约束性乙基”或“cEt”)和4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其类似物;参见,例如,美国专利号7,399,845);4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其类似物;参见,例如,美国专利号8,278,283);4’-CH2-N(OCH3)-2’(及其类似物;参见,例如,美国专利号8,278,425);4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见,例如,美国专利公开号2004/0171570);4’-CH2-N(R)-O-2’,其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见,例如,美国专利号7,427,672);4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(参见,例如,Chattopadhyaya等,J.Org.Chem.,2009,74,118-134);和4’-CH2-C(=CH2)-2’(及其类似物;参见,例如,美国专利号8,278,426)。将前述每一个的全部内容通过引用并入本文。
教导锁核酸核苷酸制备的其他代表性美国专利和美国专利公开包括,但不限于以下:美国专利号6,268,490;6,525,191;6,670,461;6,770,748;6,794,499;6,998,484;7,053,207;7,034,133;7,084,125;7,399,845;7,427,672;7,569,686;7,741,457;8,022,193;8,030,467;8,278,425;8,278,426;8,278,283;US 2008/0039618;和US 2009/0012281,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
可以制备具有一个或多个立体化学糖构象的任何上述双环核苷,包括,例如,α-L-核糖呋喃糖和β-D-核糖呋喃糖(参见WO 99/14226)。
本发明的iRNA也可以修饰以包括一个或多个约束性乙基核苷酸。如本文中使用的,“约束性乙基核苷酸”或“cEt”是包含双环糖部分的锁核酸,该糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。在一个实施方案中,约束性乙基核苷酸是S构象,在本文中称为“S-cEt”。
本发明的iRNA还可以包括一个或多个“构象限制核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2’和C4’碳或核糖的C3和-C5’碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁成稳定的构象并且提高与mRNA的杂交亲和力。接头足够长以将氧置于对于稳定性和亲和力的最佳位置而导致较少核糖环折叠。
教导上述特定CRN的制备的代表性公开包括,但不限于,美国专利公开号2013/0190383和PCT公开WO 2013/036868,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中,本发明的iRNA包含一个或多个是UNA(非锁核酸)核苷酸的单体。UNA是非锁无环核酸,其中糖的任何键被去除,从而形成非锁“糖”残基。在一个实例中,UNA还包括C1’-C4’之间的键被去除的单体(即,C1’和C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中,糖的C2’-C3’键(即,C2’和C3’碳之间的共价碳碳键)被去除(参见Nuc.AcidsSymp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter等,Mol.Biosyst.,2009,10,1039,通过引用在此并入)。
教导UNA制备的代表性美国公开包括,但不限于,美国专利号8,314,227;和美国专利公开号2013/0096289;2013/0011922;和2011/0313020,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
RNA分子末端的潜在稳定化修饰可以包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇)(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2’-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二碳酰基-尿苷-3’-磷酸、反向碱基dT(idT)和其他。这个修饰的公开可以在PCT公开号WO2011/005861中找到。
本发明的iRNA的其他修饰包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物,例如,RNAi剂的反义链上的5’-末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物公开于,例如,美国专利公开号2012/0157511中,其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中,本发明的RNAi剂是抑制GPAM基因表达的试剂,其选自表3-6任一个中所列的试剂的组。这些试剂中的任一个可进一步包含配体。在某些特定实施方案中,RNAi剂是选自表3或4的试剂。在某些特定实施方案中,RNAi剂是选自表5或6的试剂。
A.包含本发明的基序的修饰的iRNA
在本发明的某些方面,本发明的双链RNAi剂包括具有化学修饰的试剂,如在例如2012年11月16日提交的WO 2013/075035中所公开的,其全部内容通过引用结合于此。
因此,本发明提供了能够抑制体内的靶基因(即GPAM基因)表达的双链RNAi剂。RNAi剂包括有义链和反义链。RNAi剂的每条链的长度范围可以为12-30个核苷酸。例如,每条链可以为14-30个核苷酸的长度、17-30个核苷酸的长度、25-30个核苷酸的长度、27-30个核苷酸的长度、17-23个核苷酸的长度、17-21个核苷酸的长度、17-19个核苷酸的长度、19-25个核苷酸的长度、19-23个核苷酸的长度、19-21个核苷酸的长度、21-25个核苷酸的长度或21-23个核苷酸的长度。在一个实施方案中,有义链的长度为21个核苷酸。在一个实施方案中,反义链的长度为23个核苷酸。
有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”),在本文中也称为“RNAi剂”。RNAi剂的双链体区长度可为12-30个核苷酸对。例如,双链体区可以长度为14-30个核苷酸对、长度17-30个核苷酸对、长度27-30个核苷酸对、长度17-23个核苷酸对、长度17-21个核苷酸对、长度17-19个核苷酸对、长度19-25个核苷酸对、长度19-23个核苷酸对、长度19-21个核苷酸对、长度21-25个核苷酸对或长度21-23个核苷酸对。在另一个实例中,双链体区的长度选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸。
在一个实施方案中,RNAi剂可以在一条或两条链的3’-端、5’-端或两端含有一个或多个突出端区域和/或加帽基团。突出端可以是1-6个核苷酸的长度,例如,2-6个核苷酸的长度、1-5个核苷酸的长度、2-5个核苷酸的长度、1-4个核苷酸的长度、2-4个核苷酸的长度、1-3个核苷酸的长度、2-3个核苷酸的长度或1-2个核苷酸的长度。突出端可以是一条链长于另一条的结果,或相同长度的两条链交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成错配或者其可以与所靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。第一和第二条链也可以接合,例如,通过另外的碱基,以形成发夹,或通过其他非碱基接头。
在一个实施方案中,RNAi剂的突出端区域中的核苷酸可以各自独立地是修饰或未修饰的核苷酸,包括,但不限于,2’-糖修饰的,如,2’-F、2’-O甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲基氧乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任意组合。例如,TT可以是任一条链上任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配或者其可以与靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。
RNAi剂的有义链、反义链或两条链的5’-或3’-突出端可以是磷酸化的。在一些实施方案中,突出端区域含有两个核苷酸,在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯,其中这两个核苷酸可以相同或不同。在一个实施方案中,突出端存在于有义链、反义链或者这两条链的3’端。在一个实施方案中,该3’-突出端存在于反义链中。在一个实施方案中,该3’-突出端存在于有义链中。
RNAi剂可以只含有单一突出端,其可以增强RNAi的干扰活性,而不影响其整体稳定性。例如,单链突出端可以位于有义链的3’-末端,或可选地,在反义链的3’-末端。RNAi还可以具有平末端,位于反义链的5’-端(或有义链的3’-端),反之亦然。通常,RNAi的反义链在3’-端具有核苷酸突出端,而5’-端是平端的。尽管不希望受到理论的束缚,反义链的5’-端的不对称平末端和反义链的3’-端突出端有利于引导链载入RISC过程中。
在一个实施方案中,RNAi剂是19个核苷酸长的双端bluntmer,其中有义链含有至少一个从5’端起的位置7、8、9处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个从5’端起的位置11、12、13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在另一个实施方案中,RNAi剂是20个核苷酸长的双端bluntmer,其中有义链含有至少一个从5’端起的位置8、9、10处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个从5’端起的位置11、12、13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在又一个实施方案中,RNAi剂是21个核苷酸长的双端bluntmer,其中有义链含有至少一个从5’端起的位置9、10、11处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个从5’端起的位置11、12、13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施方案中,RNAi剂包含21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链,其中有义链含有至少一个从5’端起的位置9、10、11处三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序;反义链含有至少一个从5’端起的位置11、12、13处三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序,其中RNAi剂的一端是平端,而另一端包含2个核苷酸的突出端。优选地,2个核苷酸的突出端在反义链的3’端。
当2个核苷酸的突出端位于反义链的3’-端时,在末端三个核苷酸之间可以存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键,其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸,而第三个核苷酸是紧邻突出端核苷酸的配对核苷酸。在一个实施方案中,RNAi剂另外在有义链的5’端和反义链的5’端的末端三个核苷酸之间具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸,包括是基序的部分的核苷酸,是修饰的核苷酸。在一个实施方案中,用2’-O-甲基或3’-氟独立修饰各个残基,例如,在交替基序中。任选地,RNAi剂进一步包含配体(优选GalNAc3)。
在一个实施方案中,RNAi剂包含有义链和反义链,其中有义链是25-30个核苷酸残基长,其中从5’末端核苷酸(位置1)开始,第一条链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸;反义链是36-66个核苷酸残基长,并且从3’末端核苷酸开始,在与有义链的位置1-23配对以形成双链体的位置中包含至少8个核糖核苷酸;其中反义链的至少3’末端核苷酸与有义链未配对,并且多达6个连续的3’末端核苷酸与有义链未配对,由此形成1-6个核苷酸的3’单链突出端;其中反义链的5’末端包含10-30个连续核苷酸,其与有义链未配对,由此形成10-30个核苷酸的单链5’突出端;其中将有义链和反义链为了最大互补性比对时,至少有义链5’末端和3’末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对,由此在有义链和反义链之间形成基本上双链的区域;并且在将双链核酸引入哺乳动物细胞中时,反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补以降低靶基因表达;并且其中有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序,其中至少一个基序出现在切割位点处或附近。反义链在切割位点处或附近含有至少一个在三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施方案中,RNAi剂包含有义链和反义链,其中RNAi剂包含具有至少25个和至多29个核苷酸长的第一条链和具有至多30个核苷酸长的第二条链,其具有至少一个从5’端起的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序;其中第一条链的3’端和第二条链的5’端形成平末端,并且第二条链在其3’端比第一条链长1-4个核苷酸,其中双链体区域为至少25个核苷酸长,并且在将RNAi剂引入哺乳动物细胞中时,第二条链沿着第二条链长度的至少19个核苷酸与靶RNA充分互补以降低靶基因表达,并且其中RNAi剂的dicer切割优先导致包含第二条链的3’端的siRNA,由此降低哺乳动物中靶基因的表达。任选地,RNAi剂进一步包含配体。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序,其中基序之一出现在有义链中的切割位点处。
在一个实施方案中,RNAi剂的反义链也可以含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序,其中基序之一出现在反义链中的切割位点处或附近。
对于具有长度为17-23个核苷酸的双链体区的RNAi剂,反义链的切割位点通常大约在从5’端起的10、11和12位。因此,三个相同修饰的基序可以出现在反义链的9、10、11位;10、11、12位;11、12、13位;12、13、14位;或13、14、15位,计数从反义链的5’端的第1核苷酸开始,或计数从反义链的5’端在双链体区内的第1配对核苷酸开始。反义链中的切割位点也可以根据从5’端的RNAi双链体区的长度而改变。
RNAi剂的有义链可以在链的切割位点处含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序;和反义链可以在链的切割位点处或附近具有至少一个三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时,有义链和反义链可以如此对齐以使得有义链上的三个核苷酸的一个基序和反义链上的三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠,即,有义链中基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中基序的三个核苷酸中的至少一个形成碱基对。或者,至少两个核苷酸可以重叠,或全部三个核苷酸可以重叠。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链可以含有超过一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序。第一基序可以出现在链的切割位点处或附近和其他基序可以是翼修饰(wing modification)。本文中的术语“翼修饰”是指与相同链的切割位点处或附近的基序分开的链的另一个部分处出现的基序。翼修饰可以邻接第一基序或由至少一个或多个核苷酸分隔。在基序彼此直接邻接时,那么基序的化学性彼此不同,并且在基序分隔一个或多个核苷酸时,那么化学性可以相同或不同。可以存在两个或更多个翼修饰。例如,存在两个翼修饰时,每个翼修饰可以出现在相对于第一基序的一端,其在切割位点处或附近或者在前导基序的任一侧。
与有义链一样,RNAi剂的反义链可以含有超过一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序,其中至少一个基序出现在链的切割位点处或附近。该反义链也可以含有与有义链上可能存在的翼修饰相似对齐的一个或多个翼修饰。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包括链的3’-端、5’-端或两端的前一个或两个末端核苷酸。
在另一个实施方案中,RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包括链的3’-端、5’-端或两端处双链体区内的前一个或两个配对的核苷酸。
当RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时,翼修饰可以落在双链体区的相同端,并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时,有义链和反义链可以如此对齐以使得各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的一端,从而具有一个、两个或三个核苷酸的重叠;各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的另一端,从而具有一个、两个或三个核苷酸的重叠;一条链上的两个修饰落在前导基序的每一侧,从而在双链体区域中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸,包括是该基序的部分的核苷酸,可以是修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同修饰来进行修饰,其可以包括一个或两个非连接磷酸酯氧的和/或一个或多个连接磷酸酯氧的一个或多个改变;核糖的组分的改变,例如,核糖上2’-羟基的改变;磷酸部分被“去磷酸”接头整体替代;天然产生的碱基的修饰或替代;和核糖-磷酸骨架的替代或修饰。
因为核酸是亚单元的聚合物,很多修饰出现在核酸内重复的位置处,例如,碱基的修饰,或磷酸酯部分,或磷酸酯部分的非连接O。在一些情况中,修饰将出现在核酸的全部所述位置,但在许多情况中,其不会。例如,修饰可以只出现在3’或5’末端位置,可以只出现在末端区域,例如,末端核苷酸上的位置处或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可以出现在双链区、单链区或两者中。修饰可以只出现在RNA的双链区中或可以只出现在RNA的单链区中。例如,非连接O位置的硫代磷酸酯修饰可以只出现在一个或两个末端,可以只出现在末端区域中,例如,末端核苷酸的位置处链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中,或可以出现在双链和单链区中,特别在末端。一个或多个5’端可以是磷酸化的。
有可能例如为增强稳定性,在突出端中包括特定碱基,或在单链突出端中,例如,在5’或3’突出端或两者中,包括修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如,可能希望在突出端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施方案中,3’或5’突出端中的全部或一些碱基可以是修饰的,例如,具有本文中所述的修饰。修饰可以包括,例如,使用在具有本领域已知的修饰的核糖的2’位置处的修饰,例如,使用脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修饰的,而非核碱基的核糖,以及磷酸酯基团中的修饰,例如,硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列是同源的。
在一个实施方案中,用LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-羟基或2’-氟来独立地修饰有义链和反义链的每个残基。链可以含有超过一个修饰。在一个实施方案中,用2’-O-甲基或2’-氟独立地修饰有义链和反义链的每个残基。
有义链和反义链上通常存在至少两个不同的修饰。这两个修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟修饰或其他。
在一个实施方案中,Na和/或Nb包含交替模式的修饰。如本文中使用的术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰的基序,每个修饰出现在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个,或相似的模式。例如,如果A、B和C各自表示一种类型的核苷酸修饰,交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…” 、“AABAABAABAAB…” 、“AAABAAABAAAB…” 、 “AAABBBAAABBB…” 或“ABCABCABCABC…”等。
交替基序中含有的修饰类型可以相同或不同。例如,如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种类型的修饰,交替模式,即,每隔一个核苷酸上的修饰,可以相同,但有义链或反义链各自可以选自交替基序内的几种修饰可能性,如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂包含有义链上的交替基序的修饰模式,相对于反义链上的交替基序的修饰模式是偏移的(shifted)。偏移可以使得有义链的核苷酸的修饰基团对应于反义链的核苷酸的不同修饰的基团,反之亦然。例如,有义链在dsRNA双链体中与反义链配对时,有义链中的交替基序可以在双链体区域内从链的5’-3’以“ABABAB”开始并且反义链中的交替基序可以从链的5’-3’以“BABABA”开始。作为另一个实例,有义链中的交替序列可以在双链体区域内从链的5’-3’以“AABBAABB”开始并且反义链中的交替基序可以从双链区的5’-3’以“BBAABBAA”开始,使得有义链和反义链之间存在修饰模式的完全或部分偏移。
在一个实施方案中,RNAi剂包含有义链上2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序的模式,最初具有相对于反义链上最初的2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序模式的偏移,即,有义链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2’-F修饰的核苷酸碱基配对,且反之亦然。有义链的1位可以以2’-F修饰开始,而反义链的1位可以以2’-O-甲基修饰开始。
将三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个或多个基序引入有义链和/或反义链中断了有义链和/或反义链中存在的初始修饰模式。通过将三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序引入有义和/或反义链上的这种有义和/或反义链修饰模式的中断令人惊讶地增强了对靶基因的基因沉默活性。
在一个实施方案中,在将三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序引入任一条链时,紧邻该基序的核苷酸的修饰是不同于基序修饰的修饰。例如,含有基序的序列部分是“…NaYYYNb…”,其中“Y”表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序的修饰,而“Na”和“Nb”表示紧邻基序“YYY”的核苷酸的修饰,其不同于Y的修饰,并且其中Na和Nb可以是相同或不同的修饰。或者,当存在翼修饰时,Na和/或Nb可以存在或不存在。
RNAi剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以在链的任何位置出现在有义链或反义链或两条链的任一核苷酸上。例如,核苷酸间键修饰可以出现在有义链和/或反义链上的每一个核苷酸上;每个核苷酸间键修饰可以以交替模式出现在有义链和/或反义链上;或有义链或反义链可以含有交替模式的两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同,并且有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间键修饰的交替模式具有偏移。在一个实施方案中,双链RNAi剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中,反义链包含5’末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键和3’末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键,而有义链包含5’-末端或3’-末端的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一个实施方案中,RNAi在突出端区域中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如,突出端区域可以含有两个在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的核苷酸。还可以形成核苷酸间键修饰来连接突出端核苷酸与双链区内的末端配对的核苷酸。例如,至少2、3、4或全部突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键来连接,并且任选地,可存在连接突出端核苷酸与紧邻突出端核苷酸的配对核苷酸的另外硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。例如,在末端三个核苷酸之间存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键,其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸,并且第三个是紧邻突出端核苷酸的配对核苷酸。这些末端的三个核苷酸可以在反义链的3’-端、有义链的3’-端、反义链的5’-端和/或反义链的5’-端。
在一个实施方案中,2个核苷酸的突出端是在反义链的3’-端,并且在末端三个核苷酸之间存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键,其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸,并且第三个核苷酸是紧邻突出端核苷酸的配对核苷酸。任选地,RNAi剂可以在有义链的5’-端和反义链的5’-端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一个实施方案中,RNAi剂包含与靶标的错配(在双链体内)或其组合。错配可以出现在突出端区域或双链体区域中。可以基于其促进解离或解链的倾向将碱基对分级(例如,基于特定配对的缔合或解离的自由能,最简单的方法是单个对地检查该对,尽管也可以使用次近邻或相似分析)。就促进解离而言:A:U优于G:C;G:U优于G:C;和I:C优于G:C(I=肌苷)。错配例如非标准的或标准配对以外的(如本文中别处所述的)优于标准的(A:T、A:U、G:C)配对;并且包括通用碱基的配对优于标准的配对。
在一个实施方案中,RNAi剂包含独立地选自:A:U、G:U、I:C和错配的对(例如,非标准或标准以外的配对或包括通用碱基的配对)的在反义链的5’末端的双链体区内前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个,以促进反义链在双链体的5’-端解离。
在一个实施方案中,反义链的5’端的双链体区内1位的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。或者,反义链的5’端的双链体区内的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如,反义链的5’-端的双链体区内的第一碱基对是AU碱基对。
在另一个实施方案中,有义链3’-端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在另一个实施方案中,反义链的3’-端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在一个实施方案中,存在短的脱氧胸腺嘧啶核苷酸的序列,例如,在有义链和/或反义链的3’-端的两个dT核苷酸。
在一个实施方案中,有义链序列可由式(I)表示:
5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'(I)
其中:
i和j各自独立地为0或1;
p和q各自独立地为0-6;
每个Na独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
每个Nb独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸;
每个np和nq独立地表示突出端核苷酸;
其中Nb和Y不具有相同修饰;和
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。优选地,YYY全部是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,Na和/或Nb包含交替模式的修饰。
在一个实施方案中,YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如,当RNAi剂具有17-23个核苷酸长的双链体区域时,YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或附近(例如,可以出现在有义链的位置6、7、8,7、8、9,8、9、10,9、10、11,10、11、12或11、12、13处),计数从5’-端的第1核苷酸开始;或任选地,计数从5’-在双链体区域内的第1个配对核苷酸开始。
在一个实施方案中,i是1和j是0,或i是0和j是1,或i和j都是1。有义链因此可以通过以下式来表示:
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Ib);
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'(Ic);或
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Id)。
在有义链由式(Ib)表示时,Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在有义链由式(Ic)表示时,Nb表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在有义链由式(Id)表示时,每个Nb独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。优选地,Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
在其他实施方案中,i是0和j是0,并且有义链可以由下式来表示:
5'np-Na-YYY-Na-nq 3'(Ia)。
在有义链由式(Ia)表示时,每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方案中,RNAi的反义链序列可以由式(II)来表示:
5'nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3'(II)
其中:
k和l各自独立地为0或1;
p’和q’各自独立地为0-6;
每个Na’独立地表示包含0-25个修饰核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
每个Nb’独立地表示包含0-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列;
每个np’和nq’各自独立地表示突出端核苷酸;
其中Nb’和Y’不具有相同修饰;和
X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。
在一个实施方案中,Na’和/或Nb’包含交替模式的修饰。
Y’Y’Y’基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如,当RNAi剂具有17-23个核苷酸长的双链体区时,Y’Y’Y’基序可以出现在反义链的位置9、10、11;10、11、12;11、12、13;12、13、14;或13、14、15处,计数从5’-端的第1核苷酸开始;或任选地,计数从5’-端在双链体区内的第1配对核苷酸开始。优选地,Y’Y’Y’基序出现在位置11、12、13处。
在一个实施方案中,Y’Y’Y’基序全部是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,k是1和l是0,或k是0和l是1,或k和l都是1。
因此,反义链可由以下式表示:
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3'(IIb);
5'nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3'(IIc);或
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3'(IId)。
当反义链由式(IIb)来表示时,Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IIc)来表示时,Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IId)来表示时,每个Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。优选地,Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施方案中,k是0和l是0,并且反义链可以由以下式来表示:
5'np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3'(Ia)。
当反义链由式(IIa)来表示时,每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’和Z’中的每个可以彼此相同或不同。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、CRN、UNA、cEt、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基或2’-氟来修饰。例如,有义链和反义链的每个核苷酸独立地用2’-O-甲基或2’-氟来修饰。特别地,每个X、Y、Z、X’、Y’和Z’可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟修饰。
在一个实施方案中,当双链体区域为21nt时,RNAi剂的有义链可以含有在链的9、10和11位出现的YYY基序,计数从5’-端的第1核苷酸开始,或任选地,计数从5’-端在双链体区内的第1配对核苷酸开始;并且Y表示2’-F修饰。有义链可以另外含有XXX基序或ZZZ基序作为双链体区相对端的翼修饰;并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施方案中,反义链可以含有在链的11、12、13位出现的Y’Y’Y’基序,计数从5’-端的第1核苷酸开始,或任选地,计数从5’-端在双链体区内的第1配对核苷酸开始;并且Y’表示2’-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X’X’X’基序或Z’Z’Z’基序作为在双链体区相对端的翼修饰;并且X’X’X’和Z’Z’Z’各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
通过以上式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链分别与通过式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。
因此,用于本发明方法的RNAi剂可包含有义链和反义链,每条链具有14至30个核苷酸,由式(III)表示的RNAi双链体:
有义:5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3’
反义:3’np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’5’
(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p’、q和q’各自独立地为0-6;
Na和Na’各自独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列;
其中每个np’、np、nq’和nq,其各自可以存在或不存在,独立地表示突出端核苷酸;和
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。
在一个实施方案中,i是0和j是0;或i是1和j是0;或i是0和j是1;或i和j都是0;或i和j都是1。在另一个实施方案中,k是0和l是1;或k是1或l是0;k是0和l是1;或k和l都是0;或k和l都是1。
形成RNAi双链体的有义链和反义链的示例性组合包括下式:
5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5'
(IIIa)
5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5'
(IIIb)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5'
(IIIc)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5'
(IIId)
在RNAi剂由式(IIIa)表示时,每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在RNAi剂由式(IIIb)表示时,每个Nb独立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在RNAi剂由式(IIIc)表示时,每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在RNAi剂由式(IIId)表示时,每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每个独立地包含交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中X、Y和Z的每一个可以彼此相同或不同。
在RNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示时,Y核苷酸中的至少一个可以与Y’核苷酸中的一个形成碱基对。或者,Y核苷酸中的至少两个与相应的Y’核苷酸形成碱基对;或全部三个Y核苷酸都与相应的Y’核苷酸形成碱基对。
在RNAi剂由式(IIIb)或(IIId)表示时,Z核苷酸中的至少一个可以与Z’核苷酸中的一个形成碱基对。或者,Z核苷酸中的至少两个与相应的Z’核苷酸形成碱基对;或全部三个Z核苷酸都与相应的Z’核苷酸形成碱基对。
在RNAi剂由式(IIIc)或(IIId)表示时,X核苷酸中的至少一个可以与X’核苷酸中的一个形成碱基对。或者,X核苷酸中的至少两个与相应的X’核苷酸形成碱基对;或全部三个X核苷酸都与相应的X’核苷酸形成碱基对。
在一个实施方案中,Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰,Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰,和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。
在一个实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰为2′-O-甲基或2′-氟修饰。在另一个实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰为2′-O-甲基或2′-氟修饰,且np′>0和至少一个np′通过硫代磷酸酯键连接至相邻的核苷酸。在又一个实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰为2′-O-甲基或2′-氟修饰,np′>0和至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接,并且有义链与通过二价或三价分支接头(如下所述)连接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。在另一个实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰为2′-O-甲基或2′-氟修饰,np′>0和至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接,有义链包含至少一个硫代磷酸酯键,并且有义链与通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在一个实施方案中,当RNAi剂由式(IIIa)表示时,Na修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰,np’>0和至少一个np’通过硫代磷酸酯键连接相邻核苷酸,有义链包含至少一个硫代磷酸酯键,并且有义链与通过二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在一个实施方案中,RNAi剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体,其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割或不可切割的。任选地,多聚体进一步包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同基因;或每个双链体可以在两个不同靶位点靶向相同基因。
在一个实施方案中,RNAi剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体,其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割或不可切割的。任选地,多聚体进一步包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同基因;或每个双链体可以在两个不同靶位点靶向相同基因。
在一个实施方案中,由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两个RNAi剂在5’端以及在一个或两个3’端彼此连接并且任选地与配体缀合。每个RNAi剂可以靶向相同基因或两个不同基因;或每个RNAi剂可以在两个不同靶位点靶向相同基因。
在某些实施方案中,本发明的RNAi剂可以包含少量含有2’-氟修饰的核苷酸,例如,10个或更少的具有2’-氟修饰的核苷酸。例如,RNAi剂可以含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或0个具有2’-氟修饰的核苷酸。在特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含10个具有2’-氟修饰的核苷酸,例如,在有义链中4个具有2’-氟修饰的核苷酸和在反义链中6个具有2’-氟修饰的核苷酸。在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含6个具有2’-氟修饰的核苷酸,例如,在有义链中4个具有2’-氟修饰的核苷酸和在反义链中2个具有2’-氟修饰的核苷酸。
在其他实施方案中,本发明的RNAi剂可以含有极少量的含有2’-氟修饰的核苷酸,例如,2个或更少的含有2’-氟修饰的核苷酸。例如,RNAi剂可以含有2、1或0个具有2’-氟修饰的核苷酸。在特定实施方案中,RNAi剂可以含有2个具有2’-氟修饰的核苷酸,例如,在有义链中0个具有2’-氟修饰的核苷酸和在反义链中2个具有2’-氟修饰的核苷酸。
各种公开出版物描述了可用于本发明方法的多聚体RNAi剂。这类公开出版物包括WO2007/091269、美国专利7858769号、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520,其全部内容在此引入作为参考。
如以下更详细地描述的,含有一个或多个碳水化合物部分与RNAi缀合的RNAi剂可以优化RNAi的一种或多种特性。在很多情况中,碳水化合物部分将连接于RNAi剂的修饰的亚基。例如,dsRNA剂的一个或多个核糖核苷酸亚单元的核糖可以被另一个部分替代,例如,碳水化合物配体与其连接的非碳水化合物(优选环状)载体。其中亚单元的核糖如此被替代的核糖核苷酸亚单元在本文中称为核糖替代修饰亚单元(RRMS)。环状载体可以是碳环的环***,即,所有环原子是碳原子,或杂环的环***,即一个或多个环原子可以是杂原子,例如,氮、氧、硫。环状载体可以是单环环***,或可以含有两个或更多个环,例如,稠合环。环状载体可以是完全饱和的环***,或其可以含有一个或多个双键。
配体可以通过载体连接于多核苷酸。载体包括(i)至少一个“骨架连接点”,优选两个“骨架连接点”,和(ii)至少一个“栓系连接点“。如本文中使用的“骨架连接点”是指官能团,例如,羟基,或通常,可用于并且适用于将载体结合至核糖核酸骨架中的键,例如,磷酸酯骨架或修饰的磷酸酯骨架,例如含硫骨架。“栓系连接点”(TAP)在一些实施方案中是指连接选定部分的环状载体的组成环原子,例如,碳原子或杂原子(不同于提供骨架连接点的原子)。所述部分可以是例如碳水化合物,例如,单糖、双糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地,选择的部分通过中间栓系连接于环状载体。因此,环状载体通常包括官能团,例如,氨基基团,或通常,提供键,其适用于结合或栓系另一化学实体,例如,将配体结合或栓系于组成环。
RNAi剂可以通过载体与配体缀合,其中载体可以是环状基团或无环基团;优选地,环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和萘烷;优选地,无环基团选自丝氨醇骨架或二乙醇胺骨架。
在本发明的另一个实施方案中,iRNA剂包含有义链和反义链,每条链具有14至40个核苷酸。RNAi剂可以由式(L)表示:
在式(L)中,B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’和B4’各自独立地是包含选自以下的修饰的核苷酸:2’-O-烷基、2’-取代的烷氧基、2’-取代的烷基、2’-卤代、ENA和BNA/LNA。在某些实施方案中,B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’和B4’各自含有2’-OMe修饰。在某些实施方案中,B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’和B4’各自含有2’-OMe或2’-F修饰。在某些实施方案中,至少一个B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’和B4’含有2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰。
C1是热不稳定核苷酸,位于与反义链种子区相对的位点(即,反义链5’-端的2-8位)。例如,C1位于有义链与反义链5’-端2-8位的核苷酸配对的位置处。在一个实例中,C1位于有义链5’-端的15位。C1核苷酸带有热不稳定修饰,其可以包括无碱基修饰;与双链体中的相对核苷酸的错配;和糖修饰,如2’-脱氧修饰或无环核苷酸,例如,非锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。在某些实施方案中,C1具有选自以下的热不稳定修饰:i)与反义链中相对核苷酸的错配;ii)选自以下的无碱基修饰:
和iii)选自以下的糖修饰: 其中B是修饰的或未修饰的核碱基,R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基;和R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。在某些实施方案中,在C1中的热不稳定修饰是选自以下的错配:G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T和U:T;以及任选地在错配对中的至少一个核碱基是2’-脱氧核碱基。在一个实例中,在C1中的热不稳定修饰是GNA或
T1、T1’、T2’和T3’各自独立地代表包含修饰的核苷酸,所述修饰对核苷酸提供空间体积(steric bulk),其小于或等于2’-OMe修饰的空间体积。位阻效应指修饰的空间效应(steric effect)的总和。用于确定核苷酸修饰的空间效应的方法是本领域技术人员已知的。修饰可以在核苷酸的核糖的2’位置,或对非核糖核苷酸、无环核苷酸或与核糖2’位置相似或等同的核苷酸骨架的修饰,并为核苷酸提供小于或等于2’-OMe修饰的空间体积的空间体积。例如,T1、T1’、T2’和T3’各自独立地选自DNA、RNA、LNA、2’-F和2’-F-5’-甲基。在某些实施方案中,T1是DNA。在某些实施方案中,T1’是DNA、RNA或LNA。在某些实施方案中,T2’是DNA或RNA。在某些实施方案中,T3’是DNA或RNA。
n1、n3和q1独立地长度为4至15个核苷酸。
n5、q3和q7独立地长度为1-6个核苷酸。
n4、q2和q6独立地长度为1-3个核苷酸;或者,n4是0。
q5独立地是长度为0-10个核苷酸。
n2和q4独立地长度为0-3个核苷酸。
或者,n4长度为0-3个核苷酸。
在某些实施方案中,n4可以是0。在一个实例中,n4是0,以及q2和q6是1。在另一个实例中,n4是0,以及q2和q6是1,在有义链的位置1-5(从有义链5’-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,n4、q2和q6各自是1。
在某些实施方案中,n2、n4、q2、q4和q6各自是1。
在某些实施方案中,当有义链长度为19-22个核苷酸且n4是1时,C1在有义链5’-端的位置14-17处。在某些实施方案中,C1在有义链5’-端的位置15处。
在某些实施方案中,T3’从反义链5’端的位置2处开始。在一个实例中,T3’在反义链5’端的位置2处,且q6等于1。
在某些实施方案中,T1’从反义链5’端的位置14处开始。在一个实例中,T1’在反义链5’端的位置14处,且q2等于1。
在示例性实施方案中,T3’从反义链5’端的位置2处开始和T1’从反义链5’端的位置14处开始。在一个实例中,T3’从反义链5’端的位置2处开始且q6等于1和T1’从反义链5’端的位置14处开始且q2等于1。
在某些实施方案中,T1’和T3’由长度11个核苷酸所分隔(即,不计数T1’和T3’核苷酸)。
在某些实施方案中,T1’在反义链5’端的位置14处。在一个实例中,T1’在反义链5’端的位置14处且q2等于1,以及在2’位置或在非核糖、无环或骨架中的位置处的修饰(其提供小于2’-OMe核糖的空间体积)。
在某些实施方案中,T3’在反义链5’端的位置2处。在一个实例中,T3’在反义链5’端的位置2处且q6等于1,以及在2’位置处或在非核糖、无环或骨架的位置处的修饰(其提供小于2’-OMe核糖的空间体积)。
在某些实施方案中,T1在有义链的切割位点处。在一个实例中,当有义链长度为19-22个核苷酸且n2是1时,T1在有义链5’端的位置11处。在示例性实施方案中,当有义链长度为19-22个核苷酸且n2是1时,T1在有义链5’端的位置11处的有义链切割位点处。
在某些实施方案中,T2’从反义链5’端的位置6处开始。在一个实例中,T2’在反义链5’端的位置6-10处,且q4是1。
在示例性实施方案中,T1在有义链的切割位点处,例如,当有义链长度为19-22个核苷酸且n2是1时,在有义链5’端的位置11处;T1’在反义链5’端的位置14处,且q2等于1,以及T1’的修饰在核糖的2’位处,或在非核糖、无环或骨架中的位置(其提供小于2’-OMe核糖的空间体积)处;T2’在反义链5’端的位置6-10处,且q4是1;以及T3’在反义链5’端的位置2处,且q6等于1,以及T3’的修饰在核糖的2’位处,或在非核糖、无环或骨架中的位置(其提供小于2’-OMe核糖的空间体积)处。
在某些实施方案中,T2’从反义链5’端的位置8处开始。在一个实例中,T2’从反义链5’端的位置8处开始,且q4是2。
在某些实施方案中,T2’从反义链5’端的位置9处开始。在一个实例中,T2’在反义链5’端的位置9处,且q4是1。
在某些实施方案中,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是1,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是6,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是1,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是6,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是6,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是7,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是6,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是7,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是1,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是6,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是1,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是6,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是5,T2’是2’-F,q4是1,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;任选地在反义链3’端处具有至少2个另外的TT。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是5,T2’是2’-F,q4是1,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;任选地在反义链3’端处具有至少2个另外的TT;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F或q7是1。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
RNAi剂可以在有义链或反义链的5’端处包含含磷基团。5’端含磷基团可以是5’-端磷酸酯(5’-P)、5’-端硫代磷酸酯(5’-PS)、5’-端二硫代磷酸酯(5’-PS2)、5’-端乙烯基膦酸酯(5’-VP)、5’-端甲基膦酸酯(MePhos)或5’-脱氧-5’-C-丙二酰基当5’-端含磷基团是5’-端乙烯基膦酸酯(5’-VP)时,5’-VP可以是5’-E-VP异构体(即,反式乙烯基膦酸酯,)、5’-Z-VP异构体(即,顺式乙烯基膦酸酯,)或其混合物。
在某些实施方案中,RNAi剂在有义链的5’-端包含含磷基团。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链的5’-端包含含磷基团。
在某些实施方案中,RNAi剂包含5’-P。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链中包含5’-P。
在某些实施方案中,RNAi剂包含5’-PS。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链中包含5’-PS。
在某些实施方案中,RNAi剂包含5’-VP。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链中包含5’-VP。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链中包含5’-E-VP。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链中包含5’-Z-VP。
在某些实施方案中,RNAi剂包含5’-PS2。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链中包含5’-PS2。
在某些实施方案中,RNAi剂包含5’-PS2。在某些实施方案中,RNAi剂在反义链中包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。dsRNA RNA剂还可以包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P和靶向配体。在某些实施方案中,5’-P在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP(例如,5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)和靶向配体。
在某些实施方案中,5’-VP在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS2在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链的5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在某些实施方案中,5’-脱氧-5’-C-丙二酰基在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P和靶向配体。在某些实施方案中,5’-P在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP(例如,5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)和靶向配体。在某些实施方案中,5’-VP在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS2在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-OMe和q7是1;在有义链的位置1-5(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在某些实施方案中,5’-脱氧-5’-C-丙二酰基在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P和靶向配体。在某些实施方案中,5’-P在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP(例如,5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)和靶向配体。在某些实施方案中,5’-VP在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS2在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,T2’是2’-F,q4是2,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是5,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在某些实施方案中,5’-脱氧-5’-C-丙二酰基在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-P和靶向配体。在某些实施方案中,5’-P在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-VP(例如,5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)和靶向配体。在某些实施方案中,5’-VP在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-PS2和靶向配体。在某些实施方案中,5’-PS2在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在某些实施方案中,B1是2’-OMe或2’-F,n1是8,T1是2’F,n2是3,B2是2’-OMe,n3是7,n4是0,B3是2’-OMe,n5是3,B1’是2’-OMe或2’-F,q1是9,T1’是2’-F,q2是1,B2’是2’-OMe或2’-F,q3是4,q4是0,B3’是2’-OMe或2’-F,q5是7,T3’是2’-F,q6是1,B4’是2’-F和q7是1;在有义链的位置1-5(从有义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,和在位置1和2处具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰,以及在反义链的位置18-23(从反义链5’端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在某些实施方案中,5’-脱氧-5’-C-丙二酰基在反义链5’端处和靶向配体在有义链3’端处。
在特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;和
(iii)在位置1、3、5、7、9-11、13、17、19和21处的2’-F修饰和在位置2、4、6、8、12、14-16、18和20处的2’-OMe修饰(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3、5、9、11-13、15、17、19、21和23处的2’-OMe修饰和在位置2、4、6-8、10、14、16、18、20和22处的2’F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置21和22之间,以及在核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中所述dsRNA剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1、3、5、7、9-11、13、17、19和21处的2’-F修饰和在位置2、4、6、8、12、14、16、18和20处的2’-OMe修饰(从5’端计数);和
(iv)在核苷酸位置1和2之间,以及在核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3、5、9、11-13、15、17、19和21-23处的2’-OMe修饰和在位置2、4、6、8、10、14、16、18和20处的2’F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1-6、8、10和12-21处的2’-OMe修饰,在位置7和9处的2’-F修饰及在位置11处的脱氧核苷酸(例如,dT)(从5’端计数);和
(iv)核苷酸位置1和2之间,以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3、7、9、11、13、15、17和19-23处的2’-OMe修饰和在位置2、4-6、8、10、12、14、16和18处的2’-F修饰(从5’端计数);和
(iii)核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1-6、8、10、12、14和16-21处的2’-OMe修饰和在位置7、9、11、13和15处的2’-F修饰;和
(iv)在核苷酸位置1和2,以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、5、7、9、11、13、15、17、19和21-23处的2’-OMe修饰和在位置2-4、6、8、10、12、14、16、18和20处的2’-F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置1和2、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’末端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1-9和12-21处的2’-OMe修饰和在位置10和11处的2’-F修饰;和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3、5、7、9、11-13、15、17、19和21-23处的2’-OMe修饰和在位置2、4、6、8、10、14、16、18和20处的2’-F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1、3、4、5、9-11和13处的2’-F修饰和在位置2、4、6、8、12和14-21处的2’-OMe修饰;和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及在核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3、5-7、9、11-13、15、17-19和21-23处的2’-OMe修饰和在位置2、4、8、10、14、16和20处的2’-F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’末端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17和19-21处的2’-OMe修饰和在位置3、5、7、9-11、13、16和18处的2’-F修饰;和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及在核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)25个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、4、6、7、9、11-13、15、17和19-23处的2’-OMe修饰,在位置2、3、5、8、10、14、16和18处的2’-F修饰及在位置24和25处的脱氧核苷酸(例如,dT)(从5’端计数);和
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的四个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1-6、8和12-21处的2’-OMe修饰和在位置7和9-11处的2’-F修饰;和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3-5、7、8、10-13、15和17-23处的2’-OMe修饰和在位置2、6、9、14和16处的2’-F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1-6、8和12-21处的2’-OMe修饰和在位置7和9-11处的2’-F修饰;和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)23个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3-5、7、10-13、15和17-23处的2’-OMe修饰和在位置2、6、8、9、14和16处的2’-F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置1和2、核苷酸位置2和3、核苷酸位置21和22以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’端处的平端。
在另一个特定实施方案中,本发明的RNAi剂包含:
(a)有义链,其具有:
(i)19个核苷酸的长度;
(ii)附接至3’端的ASGPR配体,其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物;
(iii)在位置1-4、6和10-19处的2’-OMe修饰和在位置5和7-9处的2’-F修饰;和
(iv)在核苷酸位置1和2以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
和
(b)反义链,其具有:
(i)21个核苷酸的长度;
(ii)在位置1、3-5、7、10-13、15和17-21处的2’-OMe修饰和在位置2、6、8、9、14和16处的2’-F修饰(从5’端计数);和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置19和20之间以及核苷酸位置20和21之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5’端计数);
其中RNAi剂具有在反义链3’端处的两个核苷酸的突出端,以及在反义链5’末端处的平端。
在某些实施方案中,用于本发明方法的iRNA是选自表3-6任一个中所列试剂的试剂。在一个实施方案中,试剂是AD-1245828、AD-1245842、AD-1245875、AD-1245925、AD-1245952、AD-1246013、AD-1246029、AD-1246066、AD-1246105、AD-1246112、AD-1246153、AD-1246211、AD-1246314、AD-1246338、AD-1246426、AD-1246441、AD-1246503、AD-1246518、AD-1246541、AD-1246590、AD-1246616、AD-1246673、AD-1246701、AD-1246815、AD-1246840、AD-1246860、AD-1246913、AD-1246961、AD-1246995、AD-1247011、AD-1247075、AD-1247135、AD-1247172、AD-1247307、AD-1247352、AD-1247436、AD-1247450、AD-1247493、AD-1247605、AD-1247728、AD-1247802、AD-1247896、AD-1247916、AD-1247932、AD-1247977、AD-1247994、AD-1248024、AD-1248087、AD-1248146、AD-1248339、AD-1248364、AD-1248424、AD-1248458、AD-1248476、AD-1248499、AD-1248522、AD-1248572、AD-1248641、AD-1248665、AD-1248698、AD-1248717、AD-1248742、AD-1248781、AD-1248805、AD-1248823、AD-1248895、AD-1248913、AD-1248944、AD-1249094、AD-1249143、AD-1249170、AD-1249190、AD-1249229、AD-1249237、AD-1249258、AD-1249291、AD-1249319、AD-1249343、AD-1249380、AD-1249400、AD-1249432、AD-1249455、AD-1249470、AD-1249486、AD-1249512、AD-1249530、AD-1249555、AD-1249574、AD-1249590、AD-1249682、AD-1249701、AD-1249806、AD-1249828、AD-1249925、AD-1249972、AD-1249993、AD-1250012、AD-1250018、AD-1250047、AD-1250067、AD-1250101、AD-1250123、AD-1250141、AD-1250208、AD-1250253、AD-1250294、AD-1250333、AD-1250365、AD-1250388、AD-1250405、AD-1250476、AD-1250595、AD-1250641、AD-1250679、AD-1250700、AD-1250731、AD-1250762、AD-1250773、AD-1250835、AD-1250851、AD-1250868、AD-1250914、AD-1250952、AD-1250983、AD-1251007、AD-1251019、AD-1251037、AD-1251070、AD-1251089、AD-1251108、AD-1251134、AD-1251163、AD-1251196、AD-1251225或AD-1251245。在一个实施方案中,试剂是AD-1371956、AD-1372921、AD-1373128、AD-1374116、AD-1374118、AD-1374646、AD-1374648、AD-1376755、AD-1377594、AD-1378587和AD-1378591。这些试剂可进一步包含配体。
IV.与配体缀合的iRNA
本发明的iRNA的RNA的另一种修饰包括将一个或多个配体、部分或缀合物化学连接到RNA上,其增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取。这类部分包括但不限于脂质部分,例如胆固醇部分(Letsinger等,(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA,86:6553-6556)、胆酸(Manoharan等,(1994)Biorg.Med.Chem.Let.,4:1053-1060)、硫醚,例如己基-S-三苯甲基硫醇(beryl-S-tritylthiol)(Manoharan等,(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306-309;Manoharan等,(1993)Biorg.Med.Chem.Let.,3:2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等,(1992)Nucl.Acids Res.,20:533-538)、脂族链,例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等,(1991)EMBO J,10:1111-1118;Kabanov等,(1990)FEBS Lett.,259:327-330;Svinarchuk等,(1993)Biochimie,75:49-54)、磷脂,例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等,(1995)Tetrahedron Lett.,36:3651-3654;Shea等,(1990)Nucl.Acids Res.,18:3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等,(1995)Nucleosides&Nucleotides,14:969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等,(1995)Tetrahedron Lett.,36:3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等,(1995)Biochim.Biophys.Acta,1264:229-237)或者十八烷胺或己基氨基-碳酰氧基胆固醇部分(Crooke等,(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923-937)。
在一个实施方案中,配体改变向其中引入该配体的iRNA剂的分布、靶向或寿命。在优选的实施方案中,与例如不存在此类配体的种类相比,这种配体提供针对所选靶标(例如,分子、细胞或细胞类型、区室(例如,细胞或器官区室、身体的组织、器官或区域))的增强的亲和力。优选的配体不参与双链化核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质,如蛋白质(例如,人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白);碳水化合物(例如,葡聚糖、普鲁兰多糖、甲壳素、壳聚糖、菊糖、环糊精、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺或透明质酸);或脂质。配体也可以是重组或合成分子,如合成聚合物,例如,合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸:聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括:聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟聚胺、树状聚合物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团,例如,与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂,例如,凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质,例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如,吖啶)、交联剂(例如,补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如,吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如,EDTA)、亲脂性分子,例如,胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如,触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如,PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如,生物素)、转运/吸收促进剂(例如,阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如,咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环类的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质,例如,糖蛋白或肽,例如,对辅助配体具有特异性亲和力的分子,或抗体,例如,与指定细胞类型如肝细胞结合的抗体。配体也可以包括激素和激素受体。其也可以包括非肽类物质,如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖,p38 MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞细胞骨架(例如,通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA剂摄取到细胞中的物质,例如,药物。药物可以例如是紫杉醇(taxon)、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、杰斯内酯(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、印丹诺辛(indanocine)或myoservin。
在一些实施方案中,与如本文所述的iRNA附接的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。包含许多硫代磷酸酯键的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合,因此骨架中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸,例如,约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸,也适用于本发明作为配体(例如,作为PK调节配体)。此外,结合血清组分(例如,血清蛋白)的适体也适合用作本文所述的实施方案中的PK调节配体。
本发明的配体缀合的寡核苷酸可以通过使用携带侧接反应性官能团的寡核苷酸合成,如由连接分子附接到该寡核苷酸上衍生的(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体、携带多种保护基团中的任一种的合成的配体或具有附接于其上的连接部分的配体发生反应。
在本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过公知的固相合成技术方便且常规地制备。用于这类合成的设备由多个零售商(包括,例如,Applied Biosystems(FosterCity,Calif.)销售。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这类合成的任何其他方式。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。
在本发明的配体缀合的寡核苷酸和带有序列特异性连接核苷的配体分子中,寡核苷酸以及寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体,或已经具有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体,已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体,或带有非核苷配体的结构单元。
当使用已经携带连接部分的核苷酸-缀合物前体时,典型地完成该序列特异性连接的核苷的合成,并且然后配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸或连接核苷通过自动合成仪合成,除了可商购的和寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺以及非标准亚磷酰胺之外,其还使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺。
A.脂质缀合物
在一个实施方案中,配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白,例如,人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布至靶组织,例如,身体的非肾脏靶组织。例如,靶组织可以是肝脏,包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如,可以使用neproxin或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性,(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中,和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如,HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用来抑制(例如,控制)缀合物与靶组织的结合。例如,与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体较少可能被靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使缀合物靶向肾。
在优选的实施方案中,基于脂质的配体结合HSA。优选地,其以足够的亲和力结合HSA,从而缀合物优选地分布至非肾组织。然而,优选的是这种亲和力并不是强到使得HSA-配体结合不能逆转。
在另一个优选的实施方案中,基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA,从而缀合物优选地分布至肾。替代基于脂质的配体或在其之外,也可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一方面,配体是由靶细胞(例如,增殖的细胞)摄取的部分,例如,维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如,恶性或非恶性类型,例如,癌细胞)增殖为特征的障碍。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括是B维生素,例如,叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或其他维生素或由靶细胞如肝细胞摄取的营养素。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
在另一方面,配体是细胞渗透剂,优选地螺旋形细胞渗透剂。优选地,渗透剂是两亲性的。示例性试剂是肽如tat或触角足蛋白。如果试剂是肽,则其可以是修饰的,包括肽酰基模拟物、反转异构体(invertomer)、非肽或假肽键和D-氨基酸的使用。螺旋试剂优选为α-螺旋试剂,其优选具有亲脂性和亲油性相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物附接于iRNA剂可以影响iRNA的药代动力学分布,如通过增强细胞识别与吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长,例如,约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如,主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中,肽部分可以包含疏水性膜转位序列(MTS)。示例性含疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:21)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如,氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:22))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽,其可携带大的极性分子,包括肽、寡核苷酸和跨细胞膜的蛋白质。例如,已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:23))和果萧触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:24))的序列能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以由随机DNA序列编码,如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等,Nature,354:82-84,1991)。通过为了细胞靶向的目的并入的单体单元系留于dsRNA剂的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以是约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰,如增加稳定性或指导构象性质。可以利用下文描述的任何结构修饰。
用于在本发明的组合物和方法中使用的RGD肽可以是线性或环状的,并且可以是修饰的,例如,糖基化或甲基化,以促进靶向特定组织。含RGD的肽和肽模拟物可以包括D-氨基酸及合成的RGD模拟物。除了RGD之外,可使用靶向整联蛋白配体的其他部分。该配体的优选缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞,例如,微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如,LL-37或CeropinP1)、含二硫键的肽(例如,α-防卫素、β-防卫素或牛抗菌肽)或只包含一种或两种主导性氨基酸的肽(例如,PR-39或吲哚力西丁)。细胞渗透肽也可以包含核定位信号(NLS)。例如,细胞渗透肽可以是二分两亲肽,如MPG,其源自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等,Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
C.碳水化合物缀合物
在本发明的组合物和方法的一些实施方案中,iRNA寡核苷酸进一步包含碳水化合物。碳水化合物缀合的iRNA对于核酸的体内递送以及适合于体内治疗用途的组合物是有利的,如本文所述。如本文中使用的,“碳水化合物”指本身由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元(其可以是线性的、支链的或环状的)构成的碳水化合物的化合物,其中氧、氮或硫原子键合至每个碳原子;或者具有由一个或多个具有至少六个碳原子的单糖单元(其可以是线性的、支链的或环状的)构成的碳水化合物部分作为其一部分的化合物,其中氧、氮或硫原子键合至每一碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及含约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖),以及多糖如淀粉、糖原、纤维素以及多糖胶。具体的单糖包括C5以及以上(例如,C5、C6、C7或C8)糖;二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(例如,C5、C6、C7或C8)的糖。
在一个实施方案中,用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物选自:
在另一个实施方案中,用于本发明组合物和方法中的碳水化合物缀合物是单糖。在一个实施方案中,单糖是N-乙酰半乳糖胺,例如
用于本文所述实施方案中的另一代表性碳水化合物缀合物包括但不限于:
当X或Y之一是寡核苷酸时,另一个是氢。
在本发明的某些实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头附接至本发明的iRNA剂。在一些实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头附接至本发明的iRNA剂。在本发明的又一个实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头附接至本发明的iRNA剂。
在一个实施方案中,本发明的双链RNAi剂包含附接于iRNA剂(例如本文所述dsRNA剂的有义链的3’或5’端)的一个GalNAc或GalNAc衍生物。在另一个实施方案中,本发明的双链RNAi剂包含多个(例如,2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物,其各自通过多个单价接头独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在一些实施方案中,例如,当本发明iRNA剂的两条链是由一条链的3’端和相应的另一条链的5’端之间的不间断核苷酸链连接而形成包含多个未配对核苷酸的发夹环的较大分子的部分时,在发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包含通过单价接头附接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些实施方案中,碳水化合物缀合物进一步包含一个或多个如上文所述的另外的配体,如但不限于PK调节剂和/或细胞渗透肽。
适用于本发明中的另外的碳水化合物缀合物(和接头)包括PCT公开号WO 2014/179620和WO 2014/179627中所述的那些,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
D.接头
在一些实施方案中,本文所述的缀合物或配体可以用各种接头与iRNA寡核苷酸附接,所述接头可以是可切割的或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”指连接化合物的两个部分,例如,共价地附接化合物的两个部分的有机部分。接头典型地包含直接键或原子如氧或硫,单元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或者原子的链,例如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基,其中一个或多个亚甲基可以O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中断或封端;其中R8是氢、酰基、脂族或取代的脂族。在一个实施方案中,接头是大约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子、7-17、8-17、6-16、7-16或8-16个原子。
可切割的连接基团在细胞外是足够稳定的,但其在进入靶细胞中时被切割以释放由该接头保持在一起的两个部分。在优选的实施方案中,可切割的连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下的切割比在受试者的血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择为模拟或代表在血液或血清中存在的条件)快至少大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多,或至少约100倍。
可切割的连接基团易于受到切割剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。一般地,切割剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此类降解剂的实例包括:氧化还原剂,其被选择用于特定底物或者无底物特异性,包括例如氧化或还原酶或者在细胞中出现的还原剂例如硫醇(其可以通过还原作用降解可氧化还原切割的连接基团);酯酶;核内体或可以建立酸性环境的试剂,例如,可以导致5或更低的pH的那些;可以通过作为广义酸起作用而水解或降解酸可切割的连接基团的酶,肽酶(其可以是底物特异性的)以及磷酸酶。
可切割的连接基团,如二硫键可以对pH敏感。人血清的pH是7.4,而平均细胞内pH稍低,范围为大约7.1-7.3。核内体具有更酸的pH,范围在5.5-6.0,并且溶酶体具有甚至更酸的pH,大约在5.0。一些接头将具有可切割的连接基团,其在优选的pH下被切割,由此将阳离子脂质从配体释放到细胞内,或释放到所希望的细胞区室中。
接头可以包括可被特定酶切割的可切割连接基团。并入接头中的可切割连接基团的类型可以取决于待靶向的细胞。例如,肝靶向的配体可以通过包括酯基团的接头连接至阳离子脂质。肝细胞富含酯酶,并且因此与不富含酯酶的细胞相比,接头在肝细胞中被更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(如肝细胞与滑膜细胞)时,可以使用包含肽键的接头。
在通常情况下,候选的可切割连接基团的适合性可以通过测试降解剂(或条件)切割候选的连接基团的能力来评估。还希望的是也测试候选的可切割连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此,可以确定在第一条件与第二条件之间切割的相对敏感性,其中第一条件被选择为指示在靶细胞中的切割并且第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如,血液或血清)中的切割。评估可以在无细胞***中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。可能有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评价并且通过在整个动物中的进一步评价来确认。在优选的实施方案中,有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在被选择为模拟细胞外条件的体外条件下)中的切割快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。
i.氧化还原可切割连接基团
在一个实施方案中,可切割的连接基团是氧化还原可切割的连接基团,其在还原或氧化时被切割。还原可切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选的可切割连接基团是否是合适的“还原可切割的连接基团”,或者例如是否适合于与特定的iRNA部分以及特定的靶向剂一起使用,可以参考本文描述的方法。例如,可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或使用本领域内已知的试剂的其他还原剂孵育来对候选物进行评估,这模拟在细胞(例如,靶细胞)内观察到的切割的速率。还可以在被选择为模拟血液或血清条件的条件下对这些候选物进行评估。在一个实施方案中,候选化合物在血液中被切割最多约10%。在其他实施方案中,有用的候选化合物在细胞中(或在被选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。可以在被选择为模拟细胞内介质的条件下使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的切割速率,并且将其与被选择为模拟细胞外介质的条件下的速率相比较。
ii.基于磷酸酯的可切割连接基团
在另一个实施方案中,可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团通过降解或水解磷酸酯基团的试剂而被切割。在细胞中切割磷酸酯基团的试剂的实例是酶,如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施方案是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。优选的实施方案是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评价这些候选物。
iii.酸可切割连接基团
在另一个实施方案中,可切割接头包括酸可切割的连接基团。酸可切割的连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在优选的实施方案中,酸可切割的连接基团在具有大约6.5或更低(例如,大约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的pH的酸性环境中被切割,或者被试剂(如可以作为广义酸起作用的酶)切割。在细胞中,特定的低pH细胞器(如核内体或溶酶体)可以提供针对酸可切割连接基团的切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。优选的实施方案是当附接至酯的氧的碳(烷氧基基团)是芳基基团、取代的烷基基团或叔烷基基团(如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评价这些候选物。
iv.基于酯的连接基团
在另一个实施方案中,可切割接头包括基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团通过酶(如细胞中的酯酶与酰胺酶)而被切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评价这些候选物。
v.基于肽的切割基团
在又一个实施方案中,可切割接头包括基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割连接基团通过酶(如细胞中的肽酶与蛋白酶)而被切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如,二肽、三肽,等等)以及多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的特定类型的酰胺键。基于肽的切割基团总体上限于在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的肽键(即,酰胺键),并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-,其中RA与RB是这两个邻接氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评价这些候选物。
在一个实施方案中,本发明的iRNA通过接头与碳水化合物缀合。本发明的组合物与方法的具有接头的iRNA碳水化合物缀合物的非限制性实例包括但不限于,
当X或Y之一是寡核苷酸时,另一个是氢。
在本发明的组合物和方法的某些实施方案中,配体是通过二价或三价分支接头附接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。
在一个实施方案中,本发明的dsRNA与选自式(XLIII)-(XLVI)中任一所示的结构的二价或三价分支接头缀合:
其中:
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C对于每次出现独立地表示0-20和其中重复单元可以相同或不同;
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C对于每次出现独立地表示不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O;
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C对于每次出现独立地表示不存在、亚烃基、取代的亚烃基,其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)中的一个或多个中断或终止;
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C对于每次出现独立地表示不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、 或杂环基;
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体;即,对于每次出现各自独立地为单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖;和Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合GalNAc衍生物对于与RNAi剂一起使用来抑制靶基因表达特别有用,如(XLVII)的那些:
其中L5A、L5B和L5C表示单糖,如GalNAc衍生物。
缀合GalNAc衍生物的合适的二价和三价分支接头基团的例子包括但不限于上述式I、VI、X、IX和XII的结构。
教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241,5,391,723;5,416,203;5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928;和5,688,941;6,294,664;6,320,017;6,576,752;6,783,931;6,900,297;7,037,646;8,106,022,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
给定化合物中的全部位置不必要统一修饰,并且实际上可以在单个化合物中或甚至在iRNA内部的单一核苷处引入多于一个前述修饰。本发明也包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中,“嵌合的”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物,优选dsRNA,其包含两个或更多个化学上不同的区域,每一者由至少一种单体单元构成,即,在dsRNA化合物的情况中的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区域,其中RNA被修饰,从而赋予iRNA增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA的其他区域可以充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。举例而言,RNase H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。因此,RNase H的激活导致RNA靶的切割,因而大大增强iRNA基因表达抑制的效率。因此,相比于与相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧dsRNA,可以在使用嵌合dsRNA时,通常用较短的iRNA获得相当的结果。可以常规地通过凝胶电泳和如果必要,本领域内已知的相关核酸杂交技术来检测RNA靶的切割。
在某些情况下,iRNA的RNA可以通过非配体基团进行修饰。多种非配体分子已经与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取,并且用于进行此类缀合的程序在科学文献中是可得的。这种非配体部分包括脂南部分如胆固醇(Kubo,T.等,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61;Letsinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)、胆酸(Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)、硫醚,例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306;Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等,Nucl.Acids Res.,1992,20:533)、脂肪链,例如,十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等,EMBO J.,1991,10:111;Kabanov等,FEBS Lett.,1990,259:327;Svinarchuk等,Biochimie,1993,75:49)、磷脂,例如,二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1,2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651;Shea等,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777)、聚胺或聚乙烯二醇链(Manoharan等,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan等,TetrahedronLett.,1995,36:3651)、棕榈基部分(Mishra等,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)或十八胺或己胺-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。教导制备这类RNA缀合物的代表性美国专利已经在上文列出。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置处携带氨基接头的RNA的合成。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被缀合的分子进行反应。缀合反应可以用仍与固相支持物结合或在切割RNA后处于溶液相中的RNA进行。一般通过HPLC纯化RNA缀合物提供纯的缀合物。
V.本发明的iRNA的递送
可以通过多种不同方式将本发明的iRNA递送至细胞,例如受试者(例如,需要的受试者,如具有脂代谢障碍的受试者)体内的细胞。例如,递送可通过将细胞在体外或体内与本发明的iRNA接触来进行。也可以通过向受试者施用包含iRNA(例如,dsRNA)的组合物,直接进行体内递送。可选地,可以通过施用编码和指导iRNA表达的一种或多种载体间接地进行体内递送。这些替代方案在后文进一步论述。
一般地,递送(体外或体内)核酸分子的任何方法可以适应用于本发明的iRNA(参见例如,Akhtar S.和Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144和WO94/02595,其全部内容通过引用并入本文)。对于体内递送,为了递送iRNA分子考虑的因素包括,例如,所递送的分子的生物学稳定性、防止非特异性作用和所递送分子在靶组织中的积累。通过局部施用,例如通过直接注射或植入组织中或局部施用制剂,可以将iRNA的非特异性效应最小化。对治疗部位的局部施用最大化药剂的局部浓度,限制药剂的全身组织(其可能会受到药剂的伤害或使药剂降解)暴露,并允许施用较低总剂量的iRNA分子。几项研究表明,当局部施用iRNA时,基因产物被成功敲减。例如,在食蟹猴中通过玻璃体内注射眼内递送VEGFdsRNA(Tolentino,MJ.等,(2004)Retina 24:132-138)和在小鼠中视网膜下注射(Reich,SJ.等(2003)Mol.Vis.9:210-216)在年龄相关性黄斑变性的实验模型中均显示防止新血管形成。另外,在小鼠中直接肿瘤内注射dsRNA减小肿瘤体积(Pille,J.等(2005)Mol.Ther.11:267-274)和可延长荷瘤小鼠的存活期(Kim,WJ.等,(2006)Mol.Ther.14:343-350;Li,S.等,(2007)Mol.Ther.15:515-523)。RNA干扰也显示成功地通过直接注射局部递送至CNS(Dorn,G.等,(2004)Nucleic Acids 32:e49;Tan,PH.等(2005)Gene Ther.12:59-66;Makimura,H.等(2002)BMC Neurosci.3:18;Shishkina,GT.等(2004)Neuroscience129:521-528;Thakker,ER.等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17270-17275;Akaneya,Y.等(2005)J.Neurophysiol.93:594-602)和通过鼻内施用递送至肺(Howard,KA.等,(2006)Mol.Ther.14:476-484;Zhang,X.等,(2004)J.Biol.Chem.279:10677-10684;Bitko,V.等,(2005)Nat.Med.11:50-55)。为了***性施用iRNA以治疗疾病,RNA可以进行修饰或可选地使用药物递送***递送;这两种方法均防止dsRNA在体内通过内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。RNA或药物载体的修饰还可以使iRNA组合物靶向目标组织并避免不希望的脱靶效应。iRNA分子可以通过与胆固醇等亲脂基团化学缀合进行修饰,以增强细胞摄取并防止降解。例如,将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的iRNA全身注射到小鼠体内,和导致肝脏和空肠中的apoB mRNA敲低(Soutschek,J.等,(2004)Nature 432:173-178)。在小鼠***癌模型中,iRNA与适体的缀合已证明抑制肿瘤生长并介导肿瘤退化(McNamara,JO.等,(2006)Nat.Biotechnol.24:1005-1015)。在替代实施方案中,可以使用药物递送***如纳米颗粒、树状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送***递送iRNA。带正电荷的阳离子递送***促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜处增强相互作用以允许iRNA由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状聚合物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包裹iRNA的囊泡或胶束(参见例如,Kim SH等,(2008)Journal of ControlledRelease 129(2):107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身施用时iRNA的降解。用于制备和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如,Sorensen,DR等,(2003)J.Mol.Biol 327:761-766;Verma,UN等,(2003)Clin.CancerRes.9:1291-1300;Arnold,AS等,(2007)J.Hypertens.25:197-205,其全部内容通过引用并入本文)。对全身递送iRNA有用的药物递送***的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen,DR.等,(2003),同上;Verma,UN等,(2003),同上),Oligofectamine,“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann,TS等,(2006)Nature 441:111-114),心磷脂(Chien,PY等,(2005)CancerGene Ther.12:321-328;Pal,A等,(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091),聚乙烯亚胺(Bonnet ME等,(2008)Pharm.Res.Aug 16,印刷之前电子出版;Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659),Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3:472-487)和聚酰胺胺(Tomalia,DA等,(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67;Yoo,H.等,(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在一些实施方案中,iRNA与环糊精形成用于全身性施用的复合物。用于iRNA和环糊精施用的方法和药物组合物可以在美国专利号7,427,605中找到,其全部内容通过引用并入本文。
A.编码本发明的iRNA的载体
靶向GPAM基因的iRNA可以从***DNA或RNA载体中的转录单元表达(参见,例如,Couture,A等,TIG.(1996),12:5-10;Skillern,A等,国际PCT公开号WO 00/22113,Conrad,国际PCT公开号WO 00/22114,以及Conrad,美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型,表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持续的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。转基因也可以构建以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1292)。
iRNA的一个或多个单独链可从表达载体上的启动子转录。当表达两条独立的链以产生例如dsRNA时,可以将两个独立的表达载体共同引入(例如通过转染或感染)到靶细胞中。或者,dsRNA的每条单独链可通过两者位于同一表达质粒上的启动子转录。在一个实施方案中,dsRNA被表达为由接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸,使得dsRNA具有茎和环结构。
iRNA表达载体通常为DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体,优选与脊椎动物细胞相容的那些表达载体,可用于产生表达本文所述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体在本领域是众所周知的,并且可从多个商业来源获得。通常,提供的这类载体包含用于***所需核酸节段的方便的限制性位点。iRNA表达载体的递送可以是***性的,如通过静脉内或肌内施用、通过施用于从患者外植的靶细胞和然后重新引入患者体内,或通过允许引入所需靶细胞中的任何其他方式。
可以与本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体***包括但不限于(a)腺病毒载体;(b)逆转录病毒载体,包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等;(c)腺相关病毒载体;(d)单纯疱疹病毒载体;(e)SV 40载体;(f)多瘤病毒载体;(g)***瘤病毒载体;(h)小核糖核酸病毒载体;(i)痘病毒载体,如正痘病毒,例如痘苗病毒载体或禽痘病毒,例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒;和(j)辅助细胞依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体并入或不并入细胞的基因组中。如果需要,构建体可以包含病毒序列以用于转染。可选地,构建体可以并入能够附加型复制的载体(例如,EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常需要调控元件,例如,启动子、增强子等,以确保iRNA在靶细胞中的表达。对于载体和构建体要考虑的其他方面是本领域已知的。
VI.本发明的药物组合物
本发明还包括包含本发明的iRNA的药物组合物和制剂。因此,在一个实施方案中,本文提供了包含抑制细胞(例如肝细胞)中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂和药学上可接受的载体的药物组合物,其中dsRNA剂包含有义链和反义链,其中有义链包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,和反义链包含与SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA剂包含有义链和反义链,其中有义链包含来自SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸,和反义链包含来自SEQID NO:2或4的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在另一个实施方案中,本发明提供了包含抑制细胞(例如肝细胞)中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂和药学上可接受的载体的药物组合物,其中dsRNA剂包含有义链和反义链,其中有义链包含与SEQ ID NO:5或7的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,和反义链包含与SEQ ID NO:6或8的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA剂包含有义链和反义链,其中有义链包含来自SEQ ID NO:5或7的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸,和所述反义链包含来自SEQ ID NO:6或8的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在另一个实施方案中,本发明提供了包含抑制细胞(例如肝细胞)中线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的dsRNA剂和药学上可接受的载体的药物组合物,其中dsRNA剂包含有义链和反义链,该反义链包含互补区,其包含与表3-6任一个中所列的任一反义序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA剂包含有义链和反义链,该反义链包含互补区,其包含来自表3-6任一个中所列的任一反义序列的至少15个连续核苷酸。
包含本发明的iRNA的药物组合物可用于治疗与GPAM基因的表达或活性相关的疾病或障碍,例如慢性纤维炎性疾病。
这类药物组合物基于递送方式进行配制。一个实例是配制用于通过肠胃外递送(例如通过静脉内(IV)、肌肉内(IM)或皮下递送)进行***施用的组合物。另一个实例是配制用于直接递送至肝脏中的组合物,例如通过输注至肝脏中,例如通过连续泵输注。本发明的药物组合物可以以足以抑制GPAM基因表达的剂量施用。一般地,本发明的iRNA的合适剂量为每天每千克接受者体重约0.001至约200.0毫克的范围,通常为每天每千克体重约1至50毫克的范围。通常,本发明的iRNA的合适剂量为约0.1毫克/千克至约5.0毫克/千克,优选约0.3毫克/千克至约3.0毫克/千克的范围。
重复剂量方案可包括定期(例如每隔一天至一年一次)地施用治疗量的iRNA。在某些实施方案中,约每周一次、每7-10天一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次(每季度一次)、每4个月一次、每5个月一次或每6个月一次施用iRNA。
在初始治疗方案后,治疗可以较低频率施用。
本领域技术人员将理解,某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时机,包括但不限于疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外,用治疗有效量的组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。本发明所涵盖的单个iRNA的有效剂量和体内半衰期的估算可使用常规方法或使用适当动物模型基于体内测试进行,如本文其他地方所述。
小鼠遗传学的进展已经产生了多种用于研究各种人类疾病的小鼠模型,例如受益于GPAM表达减少的GPAM相关疾病、障碍或病症。这类模型可用于iRNA的体内测试以及用于确定治疗有效剂量。这类模型可用于iRNA的体内测试以及确定治疗有效剂量。合适的小鼠模型在本领域中是已知的,且包括,例如,喂食高脂肪饮食(HFD;也称为西方饮食)的小鼠和大鼠、甲硫氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食或高脂肪(15%)、高胆固醇(1%)饮食(HFHC)、含肥胖(ob/ob)基因突变的肥胖(ob/ob)小鼠(Wiegman等,(2003)Diabetes,52:1081-1089);含有LDL受体纯合敲除的小鼠(LDLR-/-小鼠;Ishibashi等,(1993)J Clin Invest92(2):883-893);饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型(Ishida等,(1991)J.Lipid.Res.,32:559-568);杂合脂蛋白脂肪酶敲除小鼠模型(Weistock等,(1995)J.Clin.Invest.96(6):2555-2568);喂食缺乏胆碱、L-氨基酸限定、高脂饮食(CDAHFD)的小鼠和大鼠(Matsumoto等(2013)Int.J.Exp.Path.94:93-103);喂食高反式脂肪、胆固醇饮食(HTF-C)的小鼠和大鼠(Clapper等(2013)Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.305:G483-G495);喂食高脂肪、高胆固醇、胆盐饮食(HF/HC/BS)的小鼠和大鼠(Matsuzawa等(2007)Hepatology 46:1392-1403);及喂食高脂饮食+果糖(30%)水的小鼠和大鼠(Softic等(2018)J.Clin.Invest.128(1)-85-96)。还开发了用于在oblob小鼠的肝脏中GPAM的腺病毒shRNA敲减的模型(Xu等,(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.349:439:448)。
根据是否需要局部或全身治疗以及根据待治疗的区域,本发明的药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部(例如通过透皮贴剂)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂,包括通过喷雾器);气管内、鼻内、表皮和经皮、口服或胃肠外。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注;皮下,例如通过植入的装置;或颅内,例如通过脑实质内、鞘内或脑室内,施用。
iRNA可以以靶向特定细胞或组织如肝脏(例如,肝脏的肝细胞)的方式递送。
在一些实施方案中,本发明的药物组合物适合于对受试者肌肉内施用。在其他实施方案中,本发明的药物组合物适合于对受试者静脉内施用。在本发明的一些实施方案中,本发明的药物组合物适合于对受试者皮下施用,例如使用29g或30g针。
本发明的药物组合物可在未缓冲溶液(例如盐水或水)或缓冲溶液(例如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合的缓冲溶液)中包含本发明的RNAi剂。
在一个实施方案中,本发明的药物组合物,例如适合于皮下施用的组合物,包含在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的本发明RNAi剂。适当浓度的PBS包括例如1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、6.5mM、7mM、7.5mM、9mM、8.5mM、9mM、9.5mM或约10mM的PBS。在本发明的一个实施方案中,本发明的药物组合物包含溶解在约5mM PBS的溶液(例如,0.64mMNaH2PO4、4.36mM NaH2PO4、85mM NaCl)中的本发明的RNAi剂。上述范围和值中间的值也意图是本发明的部分。另外,使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围意图包括在内。
本发明的药物组合物的pH可在约5.0至约8.0、约5.5至约8.0、约6.0至约8.0、约6.5至约8.0、约7.0至约8.0、约5.0至约7.5、约5.5至约7.5、约6.0至约7.5、约6.5至约7.5、约5.0至约7.2、约5.25至约7.2、约5.5至约7.2、约5.75至约7.2、约6.0至约7.2、约6.5至约7.2或约6.8至约7.2。上述范围和值中间的范围和值也意图是本发明的部分。
本发明药物组合物的渗透压浓度可适合于皮下施用,例如不超过约400mOsm/kg,例如50-400mOsm/kg、75-400mOsm/kg、100-400mOsm/kg、125-400mOsm/kg、150-400mOsm/kg、175-400mOsm/kg、200-400mOsm/kg、250-400mOsm/kg、300-400mOsm/kg、50-375mOsm/kg、75-375mOsm/kg、100-375mOsm/kg、125-375mOsm/kg、150-375mOsm/kg、175-375mOsm/kg、200-375mOsm/kg、250-375mOsm/kg、300-375mOsm/kg、50-350mOsm/kg、75-350mOsm/kg、100-350mOsm/kg、125-350mOsm/kg、150-350mOsm/kg、175-350mOsm/kg、200-350mOsm/kg、250-350mOsm/kg、50-325mOsm/kg、75-325mOsm/kg、100-325mOsm/kg、125-325mOsm/kg、150-325mOsm/kg、175-325mOsm/kg、200-325mOsm/kg、250-325mOsm/kg、300-325mOsm/kg、300-350mOsm/kg、50-300mOsm/kg、75-300mOsm/kg、100-300mOsm/kg、125-300mOsm/kg、150-300mOsm/kg、175-300mOsm/kg、200-300mOsm/kg、250-300、50-250mOsm/kg、75-250mOsm/kg、100-250mOsm/kg、125-250mOsm/kg、150-250mOsm/kg、175-350mOsm/kg、200-250mOsm/kg,例如约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、295、300、305、310、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395或约400mOsm/kg。上述范围和值中间的范围和值也意图是本发明的部分。
包含本发明RNAi剂的本发明药物组合物可存在于包含约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2.0mL药物组合物的小瓶中。本发明药物组合物中RNAi剂的浓度可为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、130、125、130、135、140、145、150、175、180、185、190、195、200、205、210、215、230、225、230、235、240、245、250、275、280、285、290、295、300、305、310、315、330、325、330、335、340、345、350、375、380、385、390、395、400、405、410、415、430、425、430、435、440、445、450、475、480、485、490、495或约500mg/mL。在一个实施方案中,本发明药物组合物中RNAi剂的浓度为约100mg/mL。上述范围和值中间的值也意图是本发明的部分。
本发明的药物组合物可以包含游离酸形式的本发明dsRNA剂。在本发明的其他实施方案中,本发明的药物组合物可以包含盐形式的本发明的dsRNA剂,例如钠盐形式。在某些实施方案中,当本发明的dsRNA剂为钠盐形式时,钠离子作为试剂中存在的几乎所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基的抗衡离子存在于试剂中。其中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键具有钠抗衡离子的试剂包括不超过5、4、3、2或1个没有钠抗衡离子的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,当本发明的dsRNA剂为钠盐形式时,钠离子作为试剂中存在的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基的抗衡离子存在于试剂中。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或希望的。涂层避孕套、手套等也是有用的。适当的局部制剂包括其中本发明所述的iRNA与局部递送剂混合的那些制剂,所述局部递送剂例如是脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。适当的脂质和脂质体包括中性的(例如,二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如,二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如,二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明所述的iRNA可以包封于脂质体内,或可以与其形成复合物,特别是与阳离子脂质体。或者,iRNA可以与脂质特别是阳离子脂质复合。适当的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如,异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂详细描述在美国专利号6,747,014中,其通过引用并入本文。
A.包含膜性分子组件的iRNA制剂
用于本发明组合物和方法的iRNA可配制用于在膜性分子组件中递送,例如脂质体或胶束。除了已被研究并用于药物制剂中的微乳液外,还存在许多组织化的表面活性剂结构。它们包括单层、胶束、双层和囊泡。囊泡例如脂质体因为其特异性和其在药物递送方面提供的持久作用,因而吸引了巨大兴趣。如本发明所使用,术语“脂质体”指的是由以一个或多个球状双层排列的两亲性脂质组成的囊泡。
脂质体包括单层或多层囊泡,其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。水性部分包含待递送的组合物(例如iRNA)。亲脂性材料将水性内部与水性外部隔离,水性外部通常不包括iRNA组合物,尽管在一些实例中,它可以包括iRNA组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优点。非阳离子脂质体虽然不能与细胞壁有效地融合,但在体内被巨噬细胞摄取。
为了穿过完整的哺乳动物皮肤,脂质囊泡必须在适当的透皮梯度的影响下穿过一系列细孔,每个细孔的直径小于50nm。因此,需要使用高度可变形并能够穿过这种细孔的脂质体。
脂质体可用于转移和递送活性成分到作用部位。因为脂质体膜结构上类似于生物膜,当脂质体应用于组织时,脂质体开始与细胞膜融合,且随着脂质体和细胞融合的进行,脂质体内容物排空到细胞中,在其中活性剂可以起作用。
脂质体制剂作为许多药物的递送模式已经成为广泛研究的焦点。越来越多的证据表明,对于局部施用,脂质体存在着优于其他制剂的多种优点。这些优点包括与施用药物的高度***吸收有关的副作用减少、施用药物在所需靶点的积聚增加以及能够将广泛多样药物(包括亲水性和疏水性药物)施用于皮肤中。
若干报告详述了脂质体将包括高分子量DNA的药剂递送到皮肤中的能力。包括止痛剂、抗体、激素和高分子量DNA的化合物已经施用于皮肤。大多数应用导致靶向上表皮。
含有iRNA剂的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中,脂质体的脂质组分溶解在去垢剂中,使得与脂质组分形成胶束。例如,脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。去垢剂可以具有高临界胶束浓度,并且可以是非离子的。示例性去垢剂包括胆盐、CHAPS、辛基葡萄糖苷、去氧胆盐和月桂酰肌氨酸。然后将iRNA剂制剂加入到包含脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与iRNA剂相互作用,并在iRNA剂周围凝聚以形成脂质体。浓缩后,例如通过透析除去去垢剂,以得到iRNA剂的脂质体制剂。
如有必要,可在缩合反应过程中加入有助于缩合的载体化合物,例如通过受控添加。例如,载体化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如精胺或亚精胺)。还可以调节pH值以利于缩合。
在例如WO 96/37194中进一步描述了用于产生稳定的多核苷酸递送媒介的方法,该载体结合多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒介的结构组分,其全部内容在此引入作为参考。脂质体形成还可包括Felgner,P.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8:7413-7417,1987;美国专利号4,897,355;美国专利号5,171,678;Bangham等M.Mol.Biol.23:238,1965;Olson等,Biochim.Biophys.Acta 557:9,1979;Szoka等Proc.Natl.Acad.Sci.75:4194,1978;Mayhew等,Biochim.Biophys.Acta 775:169,1984;Kim等Biochim.Biophys.Acta 728:339,1983;和Fukunaga等,Endocrinol.115:757,1984中描述的示例性方法的一个或多个方面。制备用作递送媒介的适当大小的脂质聚集体的常用技术包括超声处理和冷冻-解冻加挤出(例如参见Mayer等Biochim.Biophys.Acta 858:161,1986)。当需要始终小(50-200纳米)且相对均匀的聚集体时,可以使用微流化(Mayhew等Biochim.Biophys.Acta 775:169,1984)。这些方法易于适用于将iRNA剂制剂包装到脂质体中。
脂质体分成两个主要种类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体,其与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定复合物。带正电荷的DNA/脂质体复合物结合带负电荷的细胞表面并内化于内体中。由于内体内的酸性pH,脂质体破裂,从而释放其内容物到细胞质中(Wang等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
pH敏感的或带负电荷的脂质体诱捕DNA而不是与其复合。因为DNA和脂质两者所带的电荷相似,因此发生排斥而不是形成复合物。然而,一些DNA被诱捕在这些脂质体的水性内部中。pH敏感的脂质体用于递送编码胸苷激酶基因的DNA到培养的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等,Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
脂质体组合物的一种主要类型包括天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如,中性脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)组成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成,而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)例如大豆PC和卵PC形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
在体外和体内将脂质体引入细胞中的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185和5,171,678;wo94/00569;WO 94/00569;WO 93/24640;WO 91/16024;Felgner,J.Biol.Chem.269:2550,1994;Nabel,Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307,1993;Nabel,HumanGene Ther.3:649,1992;Gershon,Biochem.32:7143,1993;和Strauss EMBO J.11:417,1992。
还检验了非离子脂质体***(特别是含有非离子型表面活性剂和胆固醇的***)以测定其在将药物递送至皮肤中的用途。含有NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂醚)和NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂醚)的非离子脂质体制剂用于递送环孢菌素-A到小鼠皮肤的真皮中。结果显示这种非离子脂质体***有效促进环孢菌素-A沉积到皮肤的不同层中(Hu等,S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466)。
脂质体也包括“空间稳定的”脂质体,如本文使用的指含有一种或多种特定脂质的脂质体的术语,当该脂质掺入脂质体中时,相对于缺乏这种特定脂质的脂质体导致提高的循环寿命。空间稳定脂质体的实例是其中脂质体的囊泡形成脂质部分的部分(A)包含一种或多种糖脂,例如单唾液酰神经节苷脂GM1,或(B)由一种或多种亲水性聚合物衍生化,例如聚乙二醇(PEG)部分,的脂质体。不希望被任何特定理论束缚,本领域认为,至少对于包含神经节苷脂、鞘磷脂或PEG-衍生化脂质的空间稳定脂质体,这些空间稳定脂质体的提高的循环半衰期是由于向网状内皮***(RES)细胞中的摄取减少(Allen等,FEBS Letters,1987,223,42;Wu等,Cancer Research,1993,53,3765)。
含有一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)报导了单唾液酰神经节苷脂GM1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷酯酰肌醇提高脂质体的血液半衰期的能力。这些发现也由Gabizon等详细说明(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)。美国专利号4,837,028和WO 88/04924(均属于Allen等)公开了含有(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷酯的脂质体。美国专利号5,543,152(Webb等)公开了含有鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等)公开了含有1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
在一些实施方案中,使用了阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优点。非阳离子脂质体虽然不能与质膜有效融合,但在体内被巨噬细胞摄取,且可用于向巨噬细胞递送iRNA剂。
脂质体的进一步优点包括:从中性磷脂获得的脂质体是生物相容的和可生物降解的;脂质腰带可结合广泛的水和脂质可溶药物;脂质体可保护在其内容区室中的包封iRNA免于代谢和降解(Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.245)。制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
带正电的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可用于形成小的脂质体,其与核酸自发相互作用以形成脂质-核酸复合物,该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电的脂质融合,从而导致iRNA剂的递送(例如参见Felgner,P.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8:7413-7417,1987和美国专利号4,897,355中DOTMA及其与DNA的使用的描述)。
DOTMA类似物1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可与磷脂结合使用以形成DNA复合囊泡。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)是有效的用于将高阴离子的核酸递送至活组织培养细胞中的试剂,其包含带正电的DOTMA脂质体,该脂质体与带负电的多核苷酸自发相互作用以形成复合物。当使用足够的带正电的脂质体时,所得复合物上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电的复合物自发地附着于带负电的细胞表面,与质膜融合,并有效地将功能性核酸递送至例如组织培养细胞中。另一种商业上可获得的阳离子脂质,1,2-双(油酰氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)与DOTMA的不同之处在于,油酰基部分通过酯键而非醚键连接。
其他报道的阳离子脂质化合物包括与多种部分缀合的那些化合物,包括例如与两种类型的脂质之一缀合的羧精胺,并且包括如5-羧精胺基二-十八烷酰胺(“DOGS”)(TransfectamTM,Promega,Madison,Wisconsin)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧精胺基-酰胺(“DPPES”)(参见例如美国专利号5,171,678)的化合物。
另一种阳离子脂质缀合物包括脂质用胆固醇衍生化(“DC-Chol”),其与DOPE组合配制成脂质体(参见Gao,X.和Huang,L.,Biochim.Biophys.Res.Commun.179:280,1991)。据报道,通过将聚赖氨酸与DOPE缀合制备的脂质聚赖氨酸在血清存在的情况下对转染有效(Zhou,X.等,Biochim.Biophys.Acta 1065:8,1991)。对于某些细胞系,与含DOTMA的组合物相比,这些含缀合的阳离子脂质的脂质体据称显示出较低的毒性并提供更有效的转染。其他商业上可得的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)和Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。WO 98/39359和WO 96/37194中描述了适用于递送寡核苷酸的其他阳离子脂质。
脂质体制剂特别适合于局部施用。与其他制剂相比,脂质体呈现几种优势。这些优势包括减少与所施用药物的高***性吸收相关的副作用,增加所施用药物在所需靶标处的累积以及将iRNA剂施用至皮肤中的能力。在一些实施方式中,脂质体用于将iRNA剂递送至表皮细胞,并且还用于增强iRNA剂至皮肤组织中,例如皮肤中的渗透。例如,脂质体可以局部应用。已证明配制为脂质体的药物局部递送至皮肤(例如,参见Weiner等,Journal ofDrug Targeting,1992,vol.2,405-410和du Plessis等,Antiviral Research,18,1992,259-265;Mannino,R.J.和Fould-Fogerite,S.,Biotechniques 6:682-690,1988;Itani,T.等Gene 56:267-276.1987;Nicolau,C.等Meth.Enz.149:157-176,1987;Straubinger,R.M.和Papahadjopoulos,D.Meth.Enz.101:512-527,1983;Wang,C.Y.和Huang,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851-7855,1987)。
还检验了非离子脂质体***(特别是含有非离子型表面活性剂和胆固醇的***)以测定其在将药物递送至皮肤中的用途。含有NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂醚)和NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂醚)的非离子脂质体制剂用于递送环孢菌素-A到小鼠皮肤的真皮中。这种iRNA剂的制剂可用于治疗皮肤障碍。
包含iRNA的脂质体可制备为高度可变形。这种变形性可使得脂质体能够穿透小于脂质体平均半径的孔隙。例如,传递体(transfersome)是可变形的脂质体的类型。可通过向标准脂质体组合物中加入表面边缘激活剂(通常为表面活性剂)来制备传递体。包含iRNA的传递体可例如通过感染进行皮下递送,以便将iRNA递送至皮肤中的角质细胞。为了跨过完整的哺乳动物皮肤,脂质囊泡必须在适当的经皮梯度的影响下穿过一系列细孔,每个细孔的直径小于50纳米。另外,由于脂质性质,这些传递体可以自身优化(适应于例如皮肤中的孔形状)、自修复,并且可以经常达到其靶标而不碎裂,且通常自加载。
WO 2008/042973中描述了适用于本发明的其他制剂。
传递体是又一种类型的脂质体,且是高度可变形的脂质聚集体,其是药物递送媒介的有吸引力的候选者。传递体可以描述为脂质小滴,其是如此高度可变形的使得其能够容易地穿透小于所述小滴的小孔。传递体适应于使用其的环境,例如,其是自优化的(适应皮肤中小孔的形状)、自修复的、频繁到达其靶标而无破裂以及通常自加载。为制备传递体,有可能将表面边缘活化剂,通常表面活性剂,添加到标准的脂质体组合物中。传递体用于递送血清白蛋白到皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送显示为与含有血清白蛋白的溶液的皮下注射一样有效。
表面活性剂在制剂例如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中具有广泛应用。分类和排序许多不同类型的表面活性剂(天然和合成的)的性质的最常用的方式是使用亲水/亲油平衡(HLB)。亲水性基团(又名“头部”)的性质提供用于分类制剂中使用的不同表面活性剂的最有用的方式(Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果表面活性剂分子未离子化,其被归类为非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂在药物和化妆品产品中有广泛应用,且可在很宽的pH值范围内使用。通常,取决于其结构,HLB值为2到约18的范围。非离子型表面活性剂包括非离子酯例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子的烷醇酰胺和醚例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段共聚物也包括在这一种类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子型表面活性剂种类中最常用的成员。
如果当表面活性剂分子溶解或分散在水中时携带负电荷,该表面活性剂归类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧酸酯,例如皂、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸的酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸酯例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基丁二酸酯,以及磷酸酯。阴离子型表面活性剂种类的最重要成员是烷基硫酸酯和皂。
如果当表面活性剂分子溶解或分散在水中时携带正电荷,该表面活性剂被归类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这一种类的最常用的成员。
如果表面活性剂分子能够携带正或负电荷,该表面活性剂被归类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
药物产品、制剂以及乳剂中表面活性剂的使用已有综述(Rieger,PharmaceuticalDosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用于本发明方法的iRNA也可以作为胶束制剂提供。“胶束”在本文中被定义为特殊类型的分子组装,其中两亲性分子以球形结构排列,使得分子的所有疏水部分指向内部,而亲水部分与周围的水性相接触。如果环境是疏水的,则存在相反的排列。
适合于通过透皮膜递送的混合胶束制剂可通过混合iRNA水溶液、碱金属C8-C22烷基硫酸盐和胶束形成化合物来制备。示例性的胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆酰基甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅去氧胆酸、去氧胆酸,及其混合物。胶束形成化合物可在加入碱金属烷基硫酸盐的同时或之后加入。混合胶束通过基本上任何种类的成分混合而非剧烈混合来形成以提供较小尺寸的胶束。
在一种方法中,制备第一胶束组合物,其包含RNAi和至少碱金属烷基硫酸盐。然后将第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合以形成混合的胶束组合物。在另一种方法中,通过混合RNAi、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成化合物,随后伴随剧烈混合加入剩余的胶束形成化合物来制备胶束组合物。
可以向混合胶束组合物中加入苯酚或间甲酚以稳定制剂并防止细菌生长。或者,苯酚或间甲酚可与胶束形成成分一起加入。在混合胶束组合物形成后,也可加入等渗剂如甘油。
为了以喷雾递送胶束制剂,可以将制剂置于气溶胶分配器中,并且分配器加载推进剂。处于压力下的推进剂在分配器中呈液体形式。调整成分的比率,使得水相和推进剂相成为一个相,即存在一个相。如果有两个相,则有必要在分配一部分内容物之前摇动分配器,例如通过计量阀。药物剂的分配剂量以精细喷雾的形式从计量阀排出。
推进剂可包括含氢氯氟烃、含氢碳氟化合物、二甲醚和二***。在某些实施方案中,可以使用HFA 134a(1,1,1,2-四氟乙烷)。
必需成分的具体浓度可通过相对简单的实验确定。对于通过口腔吸收,通常希望通过注射或通过胃肠道施用提高剂量,例如至少两倍或三倍。
B.脂质颗粒
iRNA(例如,本发明的dsRNA剂)可完全包封在脂质制剂(例如,LNP)或其他核酸-脂质颗粒中。
如本文所用,术语“LNP”指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质和阻止颗粒聚集的脂质(例如,PEG-脂质缀合物)。LNP对于全身应用极其有用,因为其在静脉内(i.v.)注射后显示延长的循环寿命并聚集在远端部位(例如,在物理上与施用部位分离的部位)。如本文所用,术语“SPLP”指包含包封在脂囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。LNP包括“pSPLP”,其包括PCT公开号WO 00/03683中所列的包封的缩合剂-核酸复合物。通常本发明的颗粒的平均直径为约50nm到约150nm,更通常为约60nm到约130nm,更通常为约70nm到约110nm,最通常为约70nm到约90nm,且基本上无毒。另外,当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时,核酸在水性溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法描述在例如美国专利号5,976,567;5,981,501;6,534,484;6,586,410;6,815,432;和PCT公开号WO 96/40964中。
在某些实施方案中,脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如,脂质与dsRNA比率)为约1∶1到约50∶1、约1∶1到约25∶1、约3∶1到约15∶1、约4∶1到约10∶1、约5∶1到约9∶1或约6∶1到约9∶1。上述范围中间的范围也被认为是本发明的部分。
阳离子脂质例如可以是N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧戊环-5-胺(ALN100)、4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1’-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约20mol%到约50mol%或约40mol%。
在某些实施方案中,化合物2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可用于制备脂质-siRNA纳米颗粒。2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环的合成描述在2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中,其以引用方式合并于此。
在某些实施方案中,脂质-siRNA颗粒包含40%的2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环∶10%DSPC∶40%胆固醇∶10%PEG-C-DOMG(摩尔百分比),粒径为63.0±20nm,且siRNA/脂质比率为0.027。
非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质,包括但不限于:二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷酯酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。非阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约5mol%到约90mol%、约10mol%、或约58mol%(如果包括胆固醇)。
抑制颗粒聚集的缀合脂质例如可以是聚乙二醇(PEG)脂质,包括但不限于:PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物例如可以是PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧基丙基(Ci8)。抑制颗粒聚集的缀合脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的0mol%到约20mol%或约2mol%。
在一些实施方式中,核酸-脂质颗粒还包含胆固醇,例如是存在于颗粒中的总脂质的约10mol%到约60mol%或约48mol%。
LNP01
在某些实施方案中,可用类脂质(lipidoid)ND98·4HCl(MW 1487)(参见于3/26/2008提交的美国专利申请号12/056,230,其通过引用并入本文)、胆固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-神经酰胺C16(Avanti Polar Lipids)制备脂质-siRNA纳米颗粒(例如,LNP01颗粒)。各自在乙醇中的原液可以如下制备:ND98,133mg/ml;胆固醇,25mg/ml,PEG-神经酰胺C16,100mg/ml。然后例如以42∶48∶10的摩尔比混合ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16原液。合并的脂质溶液可以与水性dsRNA(例如,在pH5的醋酸钠中)混合,使得最终乙醇浓度约为35-45%且最终醋酸钠浓度约为100-300mM。在混合时,脂质-dsRNA纳米颗粒通常自发形成。取决于所需的粒径分布,所得的纳米颗粒混合物可以使用例如热熔挤出机例如Lipex挤出机(Northern Lipids,Inc)通过聚碳酸酯膜(例如,100nm截止值)挤出。在一些情况下,挤出步骤可以省略。除去乙醇和同时的缓冲液交换可以通过例如透析或切向流过滤完成。缓冲液可以例如用pH约7、例如,pH约6.9、pH约7.0、pH约7.1、pH约7.2、pH约7.3或pH约7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)交换。
LNP01制剂例如描述在国际申请公开号WO 2008/042973中,其通过引用并入本文。
在下表中提供了其他示例性脂质-dsRNA制剂。
表1.示例性脂质制剂
DSPC:双硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC:二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG:PEG-二肉豆蔻酰基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(PEG平均分子量2000)
PEG-DSG:PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(PEG平均分子量2000)
PEG-cDMA:PEG-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻氧基丙胺(PEG平均分子量2000)
在2009年04月15日提交的国际公开号WO2009/127060中描述了包含SNALP(l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的制剂,其通过引用并入本文。
例如,在以下中描述了包含XTC的制剂:2009年01月29日提交的美国临时申请系列号61/148,366;2009年03月02日提交的美国临时申请系列号61/156,851;2009年06月10日提交的美国临时申请系列号61/185,712;2009年07月24日提交的美国临时申请系列号61/228,373;2009年09月03日提交的美国临时申请系列号61/239,686,以及2010年01月29日提交的国际申请号PCT/US2010/022614,其通过引用并入本文。
例如,在以下中描述了包含MC3的制剂:2009年09月22日提交的美国临时申请系列号61/244,834,2009年06月10日提交的美国临时申请系列号61/185,800,以及2010年06月10日提交的国际申请号PCT/US10/28224,其通过引用并入本文。
例如,在2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US09/63933中描述了包含ALNY-100的制剂,其通过引用并入本文。
在2009年05月05日提交的美国临时申请系列号61/175,770和2010年05月05日提交的国际申请号PCT/US10/33777中描述了包含C12-200的制剂,其通过引用并入本文。
用于口服施用的组合物和制剂包含粉末或颗粒、微颗粒、纳米颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、扁囊剂、片剂或小片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。在一些实施方式中,口服制剂是其中本发明所述的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂和螯合剂结合施用的制剂。适当的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。适当的胆汁酸/盐包含鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、谷氨胆酸(glucholic acid)、甘氨胆酸(glycholic acid)、甘脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠和甘二氢夫西地酸钠。适当的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或甘油单酯、甘油二酯或其药学可接受盐(例如,钠盐)。在一些实施方式中,使用渗透增强剂的组合,例如,脂肪酸/盐和胆汁酸/盐组合。一种示例性的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧化乙烯-9-月桂基醚、聚氧化乙烯-20-十六烷基醚。本发明所述的dsRNA可以以颗粒形式口服递送,所述颗粒形式包括喷雾干燥的颗粒,或复合以形成微米颗粒或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚氨基酸;聚亚胺;聚丙烯酸酯;聚烷基丙烯酸酯、聚环氧乙烷(polyoxethane)、聚烷基腈基丙烯酸酯;阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉;聚烷基腈基丙烯酸酯;DEAE-衍生的聚亚胺、支链淀粉、纤维素和淀粉。适当的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如,对-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-羟乙酸)(PLGA)、藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。用于dsRNA的口服制剂及其制备详细描述在美国专利6,887,906、美国申请公开号20030027780和美国专利号6,747,014中,其每一个通过引用并入本文。
用于胃肠外、脑实质内(进入脑中)、鞘内、脑室内或肝内施用的组合物和制剂可包括无菌水性溶液,其也可包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂,例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分产生,包括但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。特别优选的是在治疗肝障碍如肝癌时靶向肝脏的制剂。
本发明的药物制剂(其可以方便地以单位剂型存在)可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。这些技术包括使活性成分和药物载体或赋形剂结合的步骤。通常,通过均匀和紧密地使活性成分和液体载体或细分的固体载体或两者结合,然后如有必要,使产物成形来制备制剂。
本发明的组合物可以配制成任何可能的剂型,例如但不限于:片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以在水、非水或混合介质中配制成悬浮液。水性悬浮液还可以包含增加该悬浮液粘性的物质,例如包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
包含用一种或多种亲水性聚合物衍生的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778)描述了包含非离子去垢剂2C1215G的脂质体,其包含PEG部分。Illum等(FEBS Lett.,1984,167,79)指出,用聚合二醇对聚苯乙烯颗粒进行亲水性涂覆导致显著提高的血液半衰期。Sears(美国专利号4,426,330和4,534,899)描述了通过连接聚亚烷基二醇(例如PEG)的羧基而改性的合成磷脂。Klibanov等(FEBS Lett.,1990,268,235)描述的实验表明,包含用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体具有显著增加的血液循环半衰期。Blume等(Biochimica etBiophysica Acta,1990,1029,91)将该观察结果扩展至其他PEG衍生的磷脂,例如由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成的DSPE-PEG。Fisher的欧洲专利号EP 0 445 131B1和WO 90/04384中描述了在其外表面上具有共价结合的PEG部分的脂质体。Woodle等(美国专利号5,013,556和5,356,633)和Martin等(美国专利号5,213,804和欧洲专利号EP 0496 813 B1)描述了含有1-20摩尔%的PEG衍生的PE的脂质体组合物及其使用方法。WO 91/05545和美国专利号5,225,212(两者均属于Martin等)中和WO 94/20073号(Zalipsky等)中公开了包含许多其他脂质-聚合物缀合物的脂质体。WO 96/10391(Choi等)中描述了包含PEG修饰的神经酰胺脂质的脂质体。美国专利号5,540,935(Miyazaki等)和美国专利号5,556,948(Tagawa等)描述了含PEG的脂质体,其可进一步在其表面上用功能性部分衍生化。
多种包含核酸的脂质体是本领域中已知的。Thierry等的WO 96/40062公开了用于将高分子量核酸包封在脂质体中的方法。Tagawa等的美国专利号5,264,221公开了蛋白质结合的脂质体,并声称这种脂质体的内容物可包括dsRNA。Rahman等的美国专利号5,665,710描述了将寡脱氧核苷酸包封在脂质体中的某些方法。Love等的WO 97/04787公开了包含靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
C.另外的制剂
i.乳液
本发明的组合物可以制备和配制成乳液。乳液通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的小滴形式分散在另一种液体中的非均相体系(参见例如,Ansel’s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Idson,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.199;Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.245;Block,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第2卷,p.335;Higuchi等,Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常是含有紧密混合并互相分散的两种不混溶液相的两相***。通常,乳液可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)类。当水相作为细小液滴精细分割并分散在大体积油相中,所得组合物称为油包水(w/o)乳液。或者,当油相作为细小液滴精细分离并分散在大体积水相中,所得组合物称为水包油(o/w)乳液。乳液可以包含除分散相之外的另外的组分,活性药物可以在水相、油相中以溶液存在或它本身作为游离相存在。药物赋形剂例如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是由超过两个相组成的多重乳液,例如,油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况。这种复杂制剂通常提供简单二元乳液没有的某些优点。o/w乳液的单个油滴围绕小的水滴的多重乳液组成w/o/w乳液。同样地,油连续相中稳定的水滴围绕的油滴的体系提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常,乳液的分散相或非连续相良好分散在外相或连续相中并通过乳化剂或制剂的粘性的方式维持在该形式中。乳液的任一相可以是半固体或固体,软乳液类型的软膏基质和乳膏就是这样。稳定乳液的其他方式需要使用可以结合入乳液的任一相中的乳化剂。乳化剂可以大体分为四个类别:合成的表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(参见例如,Ansel’sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.199)。
合成的表面活性剂,又名表面活性试剂,在乳剂制剂中具有广泛的适用性并在文献中综述(参见例如,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.285;Idson,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,第1卷,p.199)。表面活性剂通常是两性的并包含亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率称为亲水/亲油平衡(HLB),且其是分类以及在制备制剂时选择表面活性剂的重要工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的种类:非离子、阴离子、阳离子和两性的(参见例如,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.285)。
用于乳液制剂的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和***树胶。吸收基质具有亲水性,使得其可以吸收水以形成w/o乳液,仍然保持其半固体稠度,例如无水羊毛脂和亲水性矿脂。精细分散的固体也可用作良好的乳化剂,特别是与表面活性剂结合和在粘性制剂中。这些包括极性无机固体,如重金属氢氧化物、不溶胀的粘土如皂土、坡缕石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱土、胶体硅酸铝和胶体镁铝硅酸盐、颜料和非极性固体如碳或三硬脂酸甘油酯。
广泛多样的非乳化材料也包括在乳液制剂中,并有助于乳液的性质。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.335;Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.199)。
亲水性胶体或水性胶体包括天然存在的树胶和合成聚合物,例如多糖(例如,***树胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如,羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成聚合物(例如,卡波姆、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些在水中分散或溶胀以形成胶体溶液,其通过形成围绕分散相小滴的强界面膜和通过增加外相粘性来使乳液稳定。
因为乳液通常包含多种可能容易支持微生物生长的成分例如碳水化合物、蛋白质、甾醇和磷脂,这些制剂通常加入防腐剂。乳液制剂中包含的常用防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、杀藻铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也加入抗氧化剂到乳液制剂中以防止制剂退化。所用抗氧化剂可以是自由基清除剂例如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯,或还原剂例如抗坏血酸和焦亚硫酸钠,以及抗氧化剂协同剂例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
乳液制剂经由皮肤、口和非肠道途径应用及其制备方法在文献中综述(参见例如,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.199)。口服递送的乳液制剂广泛使用,因为其易于制备以及从吸收和生物利用率角度的功效(参见例如,Ansel’s Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Rosoff,Pharmaceutical DosageForms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.245;Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.199)。矿物油基轻泻剂、油溶的维生素和高脂肪营养制剂是通常作为o/w乳液口服施用的材料。
ii.微乳液
在本发明的一个实施方案中,iRNA和核酸的组合物配制成微乳液。微乳液可定义为水、油和两性物质的***,其是单光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.245)。通常微乳液是如下制备的体系:通过首先将油分散在水性表面活性剂溶液中,然后添加足够量的第四组分,通常中等链长度的醇,以形成透明***。因此,微乳液也被描述为通过表面活性分子的界面膜稳定的两种不混溶液体的热力学稳定的、各向同性的澄清分散体(Leung和Shah,Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.编辑,1989,VCH Publishers,New York,第185-215页)。通常微乳液通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质的三到五个组分的组合来制备。该微乳液是油包水(w/o)类型还是水包油(o/w)类型取决于所用的油和表面活性剂的性质以及表面活性剂分子的极性头部和烃尾部的结构和几何包装(Schott,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相位图的现象学方法已被广泛研究并对本领域技术人员提供如何配制微乳液的全面知识(参见例如,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版),New York,NY;Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.245;Block,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.335)。与传统乳液相比,微乳液具有在自发形成的热力学稳定的小滴的制剂中增溶水不溶性药物的优点。
用于制备微乳液的表面活性剂包括但不限于:离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油烯基醚、聚甘油脂肪酸酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750),其单独或与助表面活性剂组合。助表面活性剂,通常是短链醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇,用于通过渗透入表面活性剂膜并因此由于在表面活性剂分子间产生空隙体积而生成无序膜来增加界面流动性。然而,微乳液可以在不使用助表面活性剂的情况下制备,且无醇自乳化微乳液体系是本领域已知的。通常水相可以是但不限于:水、药物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于:例如Captex300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯化甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化甘油酯、饱和的聚二醇化C8-C10甘油酯、植物油和硅油的材料。
从药物增溶和提高药物吸收观点而言,微乳液是特别感兴趣的。已经提出脂质基微乳液(o/w和w/o两者)来提高药物(包括肽)的口服生物利用率(参见例如,美国专利号6,191,105;7,063,860;7,070,802;7,157,099;Constantinides等,PharmaceuticalResearch,1994,11,1385-1390;Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供以下优点:改善的药物溶解、保护药物免于酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流体性和渗透性的变化而可能提高药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、改善的临床效能和降低的毒性(参见例如,美国专利号6,191,105;7,063,860;7,070,802;7,157,099;Constantinides等,Pharmaceutical Research,1994,11,1385;Ho等,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。通常当其组分在环境温度下会合到一起时,微乳液可以自发形成。当配制热不稳定的药物、肽或iRNA时,这可能是特别有利的。微乳液在化妆品和药物应用两者的有效成分透皮递送中也是有效的。预期本发明的微乳液组合物和制剂将促进提高iRNA和核酸从胃肠道的***性吸收,以及提高iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本发明微乳液也可以包含其他组分和添加剂例如失水山梨醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol和渗透增强剂以提高制剂的性能并提高本发明dsRNA和核酸的吸收。用于本发明微乳液的渗透增强剂可以分类为属于五大类别之一--表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等,Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems,1991,p.92)。这些分类的每一种已经在上文论述。
iii.微粒
本发明的RNAi剂可被掺入颗粒,例如微粒中。微粒可通过喷雾干燥生产,但也可通过其他方法产生,包括冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合。
iv.渗透增强剂
在一个实施方案中,本发明使用各种渗透增强剂来实现核酸特别是iRNA有效递送至动物皮肤。大多数药物以离子化和非离子化形式存在于溶液中。然而,通常仅脂溶性或亲脂性药物容易跨过细胞膜。已经发现,如果用渗透增强剂处理需要跨过的细胞膜,则甚至非亲脂性药物也可以跨过细胞膜。除帮助非亲脂性药物跨细胞膜扩散之外,渗透增强剂也提高亲脂性药物的渗透性。
渗透增强剂可以分类为属于五大类之一,即表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如,Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery,Informa Health Care,New York,NY,2002;Lee等,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述渗透增强剂种类的每一种更详细描述如下。
表面活性剂(或“表面活性试剂”)是当溶解在水性溶液中时降低溶液的表面张力或水溶液与另一液体之间的界面张力,从而提高iRNA通过黏膜吸收的化学实体。除胆盐和脂肪酸之外,这些渗透增强剂包括例如,月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(参见例如,Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002;Lee等,Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems,1991,p.92);和全氟化学乳剂,如FC-43(Takahashi等,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
用作渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物例如包括油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯(1-单油酰-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如,甲基、异丙基和叔丁基酯)及其单-和二-甘油酯(即,油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如,Touitou,E.等,Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006;Lee等,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33;El Hariri等,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素的扩散和吸收(参见例如,Malmsten、M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,NewYork,NY,2002;Brunton,第38章,Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第8版,Hardman等编著,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。各种天然胆盐及其合成衍生物可用作渗透增强剂。因此术语“胆盐”包括任何天然存在的胆汁组分及其任何合成衍生物。适当的胆盐例如包括胆酸(其药学可接受的钠盐,胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、谷氨胆酸(谷氨胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠(STDHF)、甘二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如,Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002;Lee等,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,第92页;Swinyard,第39章,Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Gennaro编辑,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1990,第782-783页;Muranishi,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33;Yamamoto等,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25;Yamashita等,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
根据本发明使用的螯合剂可以定义为通过与其形成络合物将金属离子从溶液中除去,从而提高iRNA通过黏膜的吸收的化合物。当用作本发明的渗透增强剂时,螯合剂具有同时作为DNase抑制剂的额外优点,因为大多数表征的DNA核酸酶需要二价金属离子作为催化剂,因此可被螯合剂抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。适当的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如,水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如,Katdare,A.等,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006;Lee等,CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,第92页;Muranishi,CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33;Buur等,J.ControlRel.,1990,14,43-51)。
如本文所使用,非螯合非表面活性剂渗透促进化合物可以定义为显示微不足道的作为螯合剂或作为表面活性剂的活性,但仍然提高iRNA通过消化粘膜吸收的化合物(参见例如,Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。这类渗透增强剂例如包括不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,第92页);和非甾体抗炎剂例如双氯芬酸钠、吲哚美辛和苯基丁氮酮(Yamashita等,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
在细胞水平上增强iRNA摄取的试剂也可以添加到本发明的药物和其他组合物中。例如,还已知阳离子脂质,如lipofectin(Junichi等,美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子,如聚赖氨酸(Lollo等,PCT申请WO 97/30731)增强细胞摄取dsRNA。可商购的转染试剂的实例包括例如LipofectamineTM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、293fectinTM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、CellfectinTM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、DMRIE-CTM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、FreeStyleTMMAX(Invitrogen;Carlsbad,CA)、LipofectamineTM 2000CD(Invitrogen;Carlsbad,CA)、LipofectamineTM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、RNAiMAX(Invitrogen;Carlsbad,CA)、OligofectamineTM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、OptifectTM(Invitrogen;Carlsbad,CA)、X-tremeGENE Q2转染试剂(Roche;Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOTAP脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOSPER脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse,Switzerland)或Fugene(Grenzacherstrasse,Switzerland)、试剂(Promega;Madison,WI)、TransFastTM转染试剂(Promega;Madison,WI)、TfxTM-20试剂(Promega;Madison,WI)、TfxTM-50试剂(Promega;Madison,WI)、DreamFectTM(OZ Biosciences;Marseille,France)、EcoTransfect(OZ Biosciences;Marseille,France)、TransPassa D1转染试剂(New England Biolabs;Ipswich,MA,USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(Invivogen;San Diego,CA,USA)、PerFectin转染试剂(Genlantis;SanDiego,CA,USA)、NeuroPORTER转染试剂(Genlantis;San Diego,CA,USA)、GenePORTER转染试剂(Genlantis;San Diego,CA,USA)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis;San Diego,CA,USA)、Cytofectin转染试剂(Genlantis;San Diego,CA,USA)、BaculoPORTER转染试剂(Genlantis;San Diego,CA,USA)、TroganPORTERTM转染试剂(Genlantis;San Diego,CA,USA)、RiboFect(Bioline;Taunton,MA,USA)、PlasFect(Bioline;Taunton,MA,USA)、UniFECTOR(B-Bridge International;Mountain View,CA,USA)、SureFECTOR(B-BridgeInternational;Mountain View,CA,USA)或HiFectTM(B-Bridge International,MountainView,CA,USA)等。
其他试剂可用于增强所施用核酸的渗透,包括二醇类,如乙二醇和丙二醇,吡咯类,如2-吡咯,氮酮类和萜类,如柠檬烯和薄荷酮。
v.载体
本发明的某些组合物也在制剂中加入载体化合物。如本文所用,“载体化合物”或“载体”可指核酸或其类似物,其是惰性的(即,本身不具有生物活性),但被例如通过降解生物活性核酸或促进其从循环中去除而降低核酸的生物利用的体内过程识别为核酸。核酸和载体化合物的共同施用(通常后一物质过量)可导致肝脏、肾脏或其他循环外贮库中回收的核酸量明显减少,这推测是由于载体化合物和核酸之间对共同受体的竞争。例如,当和聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酸胺基-4’异硫氰基-二苯乙烯-2,2’-二磺酸共施用时,部分硫代磷酸酯dsRNA在肝组织中的回收可减少(Miyao等,DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121;Takakura等,DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183)。
vi.赋形剂
与载体化合物相反,“药物载体”或“赋形剂”是用于将一种或多种核酸递送到动物的药学可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药理学惰性媒介。赋形剂可以是液体或固体,并考虑计划施用的方式进行选择,使得当与给定的药物组合物的核酸和其他组分组合时,提供所需体积、稠度等。典型的药用载体包括但不限于:粘合剂(例如,预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等);填充剂(例如,乳糖及其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等);润滑剂(例如,硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等);崩解剂(例如,淀粉、淀粉羟基乙酸钠等);和湿润剂(例如,十二烷基硫酸钠等)。
也可以使用与核酸没有有害反应的适于非肠胃外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂来配制本发明组合物。适当的药学可接受载体包括但不限于:水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于核酸的局部施用的制剂可以包含无菌和非无菌的水溶液、常用溶剂例如醇中的非水溶液,或核酸在液体或固体油基质中的溶液。该溶液也可以包含缓冲剂、稀释剂及其他适当添加剂。可以使用与核酸没有有害反应的适于非肠胃外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学可接受赋形剂包括但不限于:水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本发明的组合物可以以其本领域确定的使用水平另外包含通常在药物组合物中存在的其他辅助组分。因此,例如,该组合物可以包含另外的相容的药学活性物质例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂,或可以包含可用于物理配制本发明组合物的各种剂型的其他材料,例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而,当添加这样的材料时,其应当不会不适当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。该制剂可以灭菌,并且如有必要,与不会不利地与制剂的核酸相互作用的助剂混合,所述助剂例如是润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
水性悬浮液可以包含增加悬浮液粘性的物质,例如包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
在一些实施方案中,本发明所述的药物组合物包括(a)一种或多种iRNA化合物和(b)一种或多种通过非RNAi机制发挥作用并可用于治疗GPAM相关疾病、障碍或病症的药剂。这类药剂的实例包括但不限于吡哆醇、ACE抑制剂(血管紧张素转换酶抑制剂),例如贝那普利(Lotensin);血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)(例如,氯沙坦钾,如Merck&Co.'s),例如坎地沙坦(Atacand);HMG-CoA还原酶抑制剂(例如他汀类);钙结合剂,例如磷酸纤维素钠(Calcibind);利尿剂,例如噻嗪类利尿剂,如氢***(Microzide);胰岛素增敏剂,例如PPARγ激动剂吡格列酮、glp-1r激动剂,如利拉鲁肽、维生素E、SGLT2抑制剂、DPPIV抑制剂和肾/肝移植;或任何前述的组合。
这些化合物的毒性和治疗功效可以通过例如用于测定LD50(50%的群体死亡的剂量)和ED50(50%的群体治疗有效的剂量)的细胞培养物或实验动物中的标准药学过程来测定。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数,其可用比率LD50/ED50来表示。优选显示高治疗指数的化合物。
由细胞培养试验和动物研究获得的数据可被用于制定供人使用的剂量范围。本文中本发明所述的组合物的剂量通常在包含ED50但几乎没有或没有毒性的循环浓度的范围内。根据使用的剂型和使用的施用途径,剂量可以在该范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物,治疗有效剂量可以最初从细胞培养试验估计。可以在动物模型中制定剂量以达到该化合物的循环血浆浓度范围,或者,适当时,达到靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如,达到降低的多肽浓度),该范围包含在细胞培养中测定的IC50(即,实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可用于更精确地确定人类中的有用剂量。血浆中水平例如可以通过高效液相色谱法测定。
除了施用本发明中所述的iRNA之外,如上所述,其可与其他已知的有效治疗由GPAM表达介导的病理过程的药剂组合施用。在任何情况下,给药医生可基于使用本领域已知的或本文所述的标准功效测量方法观察到的结果调整iRNA施用的量和时机。
阳离子脂质的合成:
可通过已知的有机合成技术制备用于本发明所述的核酸-脂质颗粒中的任何化合物,例如,阳离子脂质等。除非另有说明,否则所有取代基的定义如下。
“烷基”指含有1-24个碳原子的直链或支链、非环状或环状饱和脂族烃。代表性的饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等;而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等;而不饱和的环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
“烯基”指在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上文所定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”是指如上文定义的任何烷基或烯基,其在相邻碳之间另外包含至少一个三键。代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”是指其中连接点处的碳如下定义被氧代基团取代的任何烷基、烯基或炔基。例如,-C(=O)烷基、-C(=O)烯基和-C(=O)炔基是酰基基团。
“杂环”是指饱和、不饱和或芳族的5至7元单环或7至10元双环杂环,且其包含1或2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子,并且其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化,并且氮杂原子可以任选地被季铵化,包括其中任何上述杂环稠合至苯环的双环。杂环可以通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如下定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基(tetrahydroprimidinyl)、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”、“任选取代的烯基”、“任选取代的炔基”、“任选取代的酰基”和“任选取代的杂环”是指,当被取代时,至少一个氢原子被取代基取代。在氧代取代基(=O)的情况下,两个氢原子被取代。在这方面,取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy,其中n是0、1或2,Rx和Ry是相同或不同的且独立地为氢、烷基或杂环,并且每个所述烷基和杂环取代基可以进一步被一个或多个以下取代:氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy。
“卤素”指氟、氯、溴和碘。
在一些实施方案中,本发明所述的方法可能需要使用保护基团。保护基方法是本领域技术人员熟知的(参见例如,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,Green,T.W.等,Wiley-Interscience,New York City,1999)。简言之,本发明的背景中的保护基团是降低或消除官能团不希望的反应性的任何基团。可以将保护基团添加到官能团以掩盖其在某些反应期间的反应性,然后将其移除以显示原始官能团。在一些实施方式中,使用“醇保护基团”。“醇保护基团”是降低或消除醇官能团不希望的反应性的任何基团。可以使用本领域熟知的技术添加和除去保护基团。
式A的合成:
在某些实施方案中,本发明中所述的核酸-脂质颗粒使用式A的阳离子脂质配制:
其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基,每个可以任选地被取代,以及R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以在一起以形成任选取代的杂环的环。在一些实施方式中,阳离子脂质是XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)。在通常情况下,上述式A的脂质可以通过以下反应路线1或2制备,其中所有取代基如上文所定义,除非另有说明。
方案1
脂质A,其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基,每个可以任选地被取代,以及R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以在一起形成任选取代的杂环的环,可以根据路线1制备。酮1和溴化物2可以购买或根据本领域普通技术人员公知的方法制备。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化为相应的铵盐,其中X是选自卤素、氢氧根、磷酸根、硫酸根等的阴离子抗衡离子。
方案2
或者,酮1原料可以根据路线2制备。格氏试剂6和氰化物7可以购买或根据本领域普通技术人员公知的方法制备。6和7的反应产生酮1。酮1向相应的式A的脂质的转化如路线1中所述。
MC3的合成:
如下制备DLin-M-C3-DMA(即,(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N,N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。溶液用稀盐酸洗涤,然后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。有机部分用无水硫酸镁干燥,过滤并在旋转蒸发仪上除去溶剂。使用1-5%甲醇/二氯甲烷洗脱梯度将残留物通过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并除去溶剂,得到无色油状物(0.54g)。
ALNY-100的合成:
缩酮519[ALNY-100]的合成采用以下方案3进行:
515的合成:
向双颈RBF(1L)中搅拌的LiAlH4(3.74g,0.09852mol)在200ml无水THF中的悬浮液,在0℃氮气氛下缓慢加入514(10g,0.04926mol)在70mL THF的溶液。完全加入后,将反应混合物升温至室温,然后加热回流4h。通过TLC监测反应进展。反应完成后(通过TLC),将混合物冷却至0℃,并小心加入饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温下搅拌4h并滤出。残留物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合,并用400ml二噁烷和26mL浓盐酸稀释,在室温下搅拌20分钟。在真空下汽提挥发物以提供作为白色固体的515的盐酸盐。收率:7.12g。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ=9.34(宽,2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H)。
516的合成:
向化合物515在250mL双颈RBF中的100mL干燥DCM中的搅拌溶液中加入NEt3(37.2mL,0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在50mL干燥DCM中缓慢加入N-(苄氧基-羰基氧基)-琥珀酰亚胺(20g,0.08007mol)后,使反应混合物升温至室温。反应完成后(2-3小时,通过TLC),混合物依次用1N HCl溶液(1x 100mL)和饱和NaHCO3溶液(1x50mL)洗涤。然后将有机层用无水Na2SO4干燥,并蒸发溶剂得到粗物质,将其通过硅胶柱色谱纯化得到516,为粘性物质。收率:11g(89%)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ=7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(br.,1H)2.74(s,3H),2.60(m,2H),2.30-2.25(m,2H).LC-MS[M+H]-232.3(96.94%)。
517A和517B的合成:
将环戊烯516(5g,0.02164mol)溶于单颈500mL RBF中的220mL丙酮和水(10:1)溶液中,并向其中加入N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g,0.06492mol),然后在室温下加入4.2mL7.6%OsO4(0.275g,0.00108mol)的叔丁醇溶液。反应完成后(~3h),混合物通过加入固体Na2SO3淬灭,所得混合物在室温下搅拌1.5h。将反应混合物用DCM(300mL)稀释并用水(2x100mL)洗涤,然后用饱和NaHCO3(1x50mL)溶液、水(1x30mL)和最后用盐水(1x50mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥并真空除去溶剂。粗物质的硅胶柱色谱纯化得到非对映异构体的混合物,其通过制备型HPLC分离。收率:-6g粗品。517A-峰-1(白色固体),5.13g(96%)。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ=7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H).LC-MS-[M+H]-266.3,[M+NH4+]-283.5存在,HPLC-97.86%。通过X-射线确认立体化学。
518的合成:
使用类似于对化合物505的合成所述的程序,获得无色油状的化合物518(1.2g,41%)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ=7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H).HPLC-98.65%。
化合物519合成的一般程序:
将化合物518(1eq)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加到LAH在THF(1M,2eq)中的冰***液中。添加完成后,将混合物在40℃加热0.5小时,然后再次在冰浴上冷却。混合物用饱和Na2SO4水溶液小心水解,然后通过硅藻土过滤并缩减成油状物。柱色谱得到纯的519(1.3g,68%),其为无色油状物。13C NMR=130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1;电喷雾MS(+ve):C44H80NO2的分子量(M+H)+计算值654.6,实测值654.6。
通过标准或无挤出方法制备的制剂可以类似方式表征。例如,制剂通常以肉眼观察进行表征。其应该是发白的半透明的溶液,没有聚集或沉淀。脂质-纳米颗粒的粒径和粒度分布可以例如使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern,USA)通过光散射测量。颗粒大小应该约为20-300nm,如40-100nm。粒度分布应该是单峰的。制剂中dsRNA总浓度以及诱捕的部分使用染料排除试验来评估。配制的dsRNA的样品可以与RNA结合染料例如(Molecular Probes)在存在或不存在制剂干扰表面活性剂例如0.5%Triton-X100的情况下孵育。制剂中的总dsRNA可根据从包含表面活性剂的样品发出的信号相对于标准曲线进行确定。诱捕的部分通过从总dsRNA含量中减去“游离”dsRNA含量(根据当不存在表面活性剂时的信号测定)来确定。诱捕dsRNA的百分比通常>85%。对于SNALP制剂,粒径至少为30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm和至少120nm。适当的范围通常为约至少50nm到约至少110nm、约至少60nm到约至少100nm或约至少80nm到约至少90nm。
VII.本发明的方法
本发明还提供了使用本发明的iRNA和/或本发明的组合物降低和/或抑制细胞(例如受试者的细胞,例如肝细胞)中GPAM表达的方法。该方法包括使细胞与本发明的iRNA剂或包含RNAi剂的药物组合物接触。在一些实施方案中,细胞维持足够长的时间以获得GPAM基因的mRNA转录物的降解。
本发明还提供了使用本发明的iRNA和/或本发明的组合物以及靶向13型17β-羟基类固醇脱氢酶(HSD17B13)基因的iRNA剂和/或包含HSD17B13的iRNA剂的药物组合物以降低和/或抑制细胞(例如受试者的细胞,例如肝细胞)中GPAM表达的方法。
另外,本发明提供了抑制细胞(例如受试者的细胞,例如肝细胞)中脂滴积累和/或扩张的方法。该方法包括使细胞与本发明的iRNA剂或包含RNAi剂的药物组合物及靶向HSD17B13基因的iRNA剂和/或包含靶向HSD17B13的iRNA剂的药物组合物接触。在一些实施方案中,细胞维持足够长的时间以获得GPAM基因和HSD17B13基因的mRNA转录物的降解。
基因表达的减少可通过本领域已知的任何方法进行评估。例如,GPAM表达的减少可通过使用对于本领域普通技术人员常规的方法(例如RNA印迹、qRT-PCR)确定GPAM的mRNA表达水平;通过使用对于本领域普通技术人员的常规方法(例如蛋白质印迹法、免疫技术)确定GPAM的蛋白质水平来确定。GPAM表达的降低也可以通过测量GPAM生物活性的降低(例如GPAM酶活性的降低和/或脂质、甘油三酯、胆固醇(包括LDL-C、HDL-C、VLDL-C、IDL-C和总胆固醇)中的一种或多种或血浆中的游离脂肪酸或组织样品(例如血清三酯的提高或胆固醇的降低)和/或脂肪积累的减少和/或肝中脂滴的扩张)来间接评估。
例如,PCT国际专利申请公开号WO 2011/162821中描述了靶向HSD17B13基因的合适试剂,其全部内容在此引入作为参考。在一些实施方案中,在靶向HSD17B13的试剂之外或替代靶向HSD17B13的试剂,包含本发明的iRNA剂的本发明的组合物可包含靶向PNPLA3基因的iRNA剂和/或包含靶向PNPLA3的iRNA剂的药物组合物。例如,美国专利公开号2017/0340661中描述了靶向含patatin样磷脂酶结构域蛋白3(PNPLA3)基因的合适试剂,其全部内容在此引入作为参考。PNPLA3的沉默减少脂肪变性(即肝脂肪)时使HSD17B13沉默减少了炎症和纤维变性。全基因组关联研究表明,沉默PNPLA3和HSD17B13对降低NASH病理学具有加性作用。事实上,发现保护性失能HSD17B13等位基因与具有致病性PNPLA3等位基因的受试者中较低的NASH发病率相关。在NASH风险较低的具有野生型PNPLA3等位基因的受试者中,失能HSD17B13等位基因的附加存在赋予了甚至更大的保护。
在本发明的方法中,细胞可以在体外或体内接触,即细胞可以在受试者体内。
适合于使用本发明方法进行治疗的细胞可以是表达GPAM基因(以及在一些实施方案中,HSD17B13基因)的任何细胞。适用于本发明方法的细胞可以是哺乳动物细胞,例如灵长动物细胞(例如人细胞或非人灵长动物细胞,例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长动物细胞(例如牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔细胞、绵羊细胞、仓鼠、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮细胞、虎细胞、熊细胞或水牛细胞)、鸟细胞(例如鸭细胞或鹅细胞)或鲸细胞。在一个实施方案中,细胞是人细胞,例如人肝细胞。
GPAM表达在细胞中抑制至少约5%、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或约100%。在优选实施方案中,GPAM表达被抑制至少20%。
在一些实施方案中,HSD17B13表达在细胞中也被抑制至少约5%、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或约100%。在优选实施方案中,HSD17B13表达被抑制至少20%。
在一个实施方案中,本发明的体内方法可包括向受试者施用包含iRNA的组合物,其中iRNA包含与待治疗哺乳动物GPAM基因RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。
在另一个实施方案中,本发明的体内方法可包括向受试者施用包含第一iRNA剂和第二iRNA剂的组合物,其中第一iRNA包含与待治疗哺乳动物的GPAM基因RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列,和第二iRNA包含与待治疗哺乳动物的HSD17B13基因RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。
当待治疗的生物体为哺乳动物如人时,该组合物可通过本领域已知的任何方式施用,包括但不限于口服、腹膜内或胃肠外途径,包括颅内(例如脑室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、经鼻、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。在某些实施方案中,组合物通过静脉内输注或注射施用。在某些实施方案中,组合物通过皮下注射施用。
在一些实施方案中,施用通过积存注射进行。积存注射可在较长时间内以持续方式释放iRNA。因此,积存注射可减少获得所需效果(例如HSD17B13的所需抑制或者治疗或预防效果)所需的给药频率。积存注射也可以提供更一致的血清浓度。积存注射可包括皮下注射或肌肉内注射。在优选实施方案中,积存注射是皮下注射。
在一些实施方案中,通过泵进行施用。泵可以是外部泵或手术植入泵。在某些实施方案中,泵是皮下植入的渗透泵。在其他实施方案中,泵是输注泵。输注泵可用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施方案中,输注泵是皮下输注泵。在其他实施方案中,泵是将iRNA递送至肝脏的手术植入的泵。
本发明的iRNA可以存在于药物组合物中,例如在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐,或其任何组合。在一个实施方案中,缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节含有iRNA的缓冲溶液的pH和渗透压浓度,使得其适合于对受试者施用。
或者,本发明的iRNA可以作为药物组合物施用,例如dsRNA脂质体制剂。
施用方式可基于是否需要局部或全身治疗以及基于待治疗的区域进行选择。施用途径和位点可选择以增强靶向。
在一个方面,本发明还提供了抑制哺乳动物中HSD17B13基因表达的方法。该方法包括向哺乳动物施用包含针对哺乳动物细胞中GPAM基因的dsRNA的组合物,从而抑制细胞中GPAM基因的表达。
在一些实施方案中,所述方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物细胞中的GPAM基因的dsRNA的组合物,从而抑制细胞中GPAM基因的表达。在另一个实施方案中,所述方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物细胞中GPAM基因的dsRNA剂的药物组合物。
在另一方面,本发明提供了本发明的iRNA剂或药物组合物在抑制哺乳动物的GPAM基因表达中的用途。
在又一方面,本发明提供了靶向GPAM基因的本发明的iRNA剂或包含该试剂的药物组合物在制备用于抑制哺乳动物的GPAM基因表达的药物中的用途。
在另一方面,本发明还提供了抑制哺乳动物的GPAM基因和HSD17B13基因表达的方法。该方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物细胞中GPAM基因的dsRNA的组合物和包含靶向哺乳动物细胞中HSD17B13基因的dsRNA的组合物,从而抑制细胞中GPAM基因和HSD17B13基因的表达。在一个实施方案中,所述方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物细胞中GPAM基因和HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物。
在一个方面,本发明提供了本发明的iRNA剂或药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA或包含该试剂的药物组合物在哺乳动物中抑制GPAM基因和HSD17B13基因表达的用途。
在又一方面,本发明提供了靶向GPAM基因的本发明iRNA剂或包含该试剂的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA或包含该试剂的药物组合物在制备用于抑制哺乳动物中GPAM基因和HSD17B13基因表达的药物中的用途。
基因表达的减少可通过本领域已知的任何方法和本文所述的方法(例如qRT-PCR)进行评估。蛋白质产生的减少可通过本领域已知的任何方法和本文所述的方法(例如ELISA、酶活性)进行评估。
本发明还提供了治疗和预防方法,其包括向患有或易发生脂肪肝相关疾病、障碍或病症的受试者施用本发明的iRNA剂、包含iRNA剂的药物组合物或包含iRNA的载体。
在一个方面,本发明提供了治疗患有受益于GPAM表达降低的疾病(例如GPAM相关疾病)的受试者的方法。
本发明的治疗方法(和用途)包括向受试者(例如人)施用治疗有效量的抑制GPAM表达的dsRNA剂或包含抑制GPAM表达的dsRNA的药物组合物,从而治疗受试者。
在一个方面,本发明提供了预防患有受益于GPAM表达降低的障碍(例如,慢性纤维炎性疾病)的受试者的至少一种症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效量的dsRNA剂或包含dsRNA的药物组合物,从而预防受试者的至少一种症状。
在一个实施方案中,GPAM相关疾病、障碍或病症为慢性纤维炎性肝病。慢性纤维炎性肝病的非限制性实例包括,例如,癌症(例如,肝细胞癌)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏炎症、肝细胞坏死、肝纤维化和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
本发明还提供了治疗和预防方法,其包括向患有或倾向于发生脂肪肝相关疾病、障碍或病症的受试者施用本发明的iRNA剂、包含iRNA剂的药物组合物或包含iRNA和靶向HSD17B13的iRNA剂、包含这种iRNA剂的药物组合物或包含这种iRNA的载体。
本发明还提供了治疗有效量的本发明的iRNA剂或包含抑制GPAM表达的dsRNA的药物组合物用于治疗受试者(例如受益于GPAM表达减少和/或抑制的受试者)的例如GPAM相关疾病(例如慢性纤维炎性疾病)的用途。
另一方面,本发明提供了靶向GPAM基因的本发明iRNA剂(例如dsRNA)或包含靶向GPAM基因的iRNA剂的药物组合物在制备用于治疗受试者(例如受益于GPAM表达减少和/或抑制的受试者)的例如GPAM相关疾病的药物中的用途。
本发明还提供了预防有效量的本发明的iRNA剂或包含抑制GPAM表达的dsRNA的药物组合物用于预防患有受益于GPAM表达降低的疾病(例如,慢性纤维炎性疾病)的受试者的至少一种症状的用途。
在另一方面,本发明提供了靶向GPAM基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含靶向GPAM基因的iRNA剂的药物组合物在制备用于预防患有受益于GPAM表达降低的障碍(例如慢性纤维炎性疾病)的受试者的至少一种症状的药物中的用途。
在一个方面,本发明还提供了治疗有效量的本发明的iRNA剂或包含抑制GPAM表达的dsRNA与靶向HSD17B13基因的dsRNA组合的药物组合物或包含这种试剂的药物组合物用于治疗受试者(例如受益于GPAM表达减少和/或抑制的受试者)的例如GPAM相关疾病(例如慢性纤维炎性疾病)的用途。
在一个方面,本发明还提供了靶向GPAM基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含靶向GPAM基因的iRNA剂与靶向HSD17B13基因的dsRNA组合的药物组合物或包含这种药剂的药物组合物用于预防患有受益于GPAM表达降低的疾病(例如慢性纤维炎性疾病)的受试者的至少一种症状的用途。
用于治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症(例如慢性纤维炎性肝病,例如NASH)的受试者(例如人类受试者)的本发明的组合方法可用于治疗这些受试者,因为GPAM的沉默降低了脂肪变性(即肝脂肪),而HSD17B13的沉默可提供累加的益处(例如降低炎症和纤维化)。
因此,在一个方面,本发明提供了治疗患有受益于GPAM表达减少的障碍(例如GPAM相关疾病)的受试者的方法,所述疾病例如慢性纤维炎性肝病(例如,癌症,例如,肝细胞癌、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏炎症、肝细胞坏死、肝纤维化和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD))。在一个实施方案中,慢性纤维炎性肝病为NASH。
本发明的组合治疗方法(和用途)包括向受试者(例如人类受试者)施用治疗有效量的抑制GPAM表达的dsRNA剂或包含抑制GPAM表达的dsRNA的药物组合物,以及抑制HSD17B13表达的dsRNA剂或包含抑制HSD17B13表达的dsRNA的药物组合物,从而治疗受试者。
在一个方面,本发明提供了预防患有受益于GPAM表达降低的障碍(例如慢性纤维炎性疾病,例如NASH)的受试者的至少一种症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效量的dsRNA剂或包含抑制GPAM表达的dsRNA的药物组合物和抑制HSD17B13表达的dsRNA剂或包含抑制HSD17B13表达的dsRNA的药物组合物,从而预防受试者的至少一种症状。
在另一个实施方案中,受试者是GPAM基因纯合的。该基因的每个等位基因可编码功能性GPAM蛋白。在又一个实施方案中,受试者是GPAM基因杂合的。受试者可具有编码功能性GPAM蛋白的等位基因和编码GPAM的失能变体的等位基因。在另一实施方案中,受试者携带GPAM rs2792759变体。在另一实施方案中,受试者携带rs2792751变体。在一些实施方案中,具有rs2792751变体的受试者携带I43V错义突变(即在氨基末端起的第43残基处用缬氨酸置换异亮氨酸)。
在一个实施方案中,受试者为HSD17B13基因纯合的。该基因的每个等位基因可编码功能性HSD17B13蛋白。在另一个实施方案中,受试者是HSD17B13基因杂合的。受试者可具有编码功能性HSD17B13蛋白的等位基因和编码HSD17B13失能变体的等位基因。在另一个实施方案中,受试者不是HSD17B13 rs72613567变体的携带者。
在一些实施方案中,受试者是编码含patatin样磷脂酶结构域蛋白3(PNPLA3)的基因杂合的。在一个实施方案中,等位基因之一编码I148M变异。在一个实施方案中,等位基因之一编码I144M变异。在一些实施方案中,受试者对于编码PNPLA3的基因是纯合的。在一个实施方案中,基因的每个等位基因编码I148M变异。在一个实施方案中,基因的每个等位基因编码I144M变异。在一个实施方案中,该基因的每个等位基因编码功能性PNPLA3蛋白。
在本发明的某些实施方案中,该方法可包括识别受益于GPAM表达减少的受试者。该方法可包括确定来自受试者的样品是否包含编码PNPLA3 Ile148Met变体或PNPLA3Ile144Met变体的核酸。该方法还可包括通过确定来自受试者的样品是否包含编码含有I148M变体的PNPLA3蛋白的第一核酸和编码功能性HSD17B13蛋白的第二核酸和/或包含I148M变异和功能性HSD17B13蛋白的PNPLA3蛋白,以及当检测到第一和第二核酸时和/或当检测到两种蛋白质时和将受试者分类为通过抑制GPAM而治疗或抑制肝疾病的候选者,来将受试者分类为用于通过抑制GPAM的表达而治疗或抑制肝病的候选者。
变体PNPLA3 Ile148Met变体或PNPLA3 Ile144Met变体可以是本文所述的任何PNPLA3 Ile148Met变体和PNPLA3 Ile144Met变体。PNPLA3 Ile148Met变体或PNPLA3Ile144Met变体可通过任何合适的方式检测,例如ELISA分析、RT-PCR、测序。
在一些实施方案中,所述方法进一步包括确定受试者对于PNPLA3 Ile148Met变体或PNPLA3 Ile144Met变体是纯合还是杂合的。在一些实施方案中,受试者对于PNPLA3Ile148Met变体或PNPLA3 Ile144Met变体是纯合的。在一些实施方案中,受试者对于PNPLA3Ile148Met变体或PNPLA3 Ile144Met变体是杂合的。在一些实施方案中,受试者对于PNPLA3Ile148Met变体是纯合的。在一些实施方案中,受试者对于PNPLA3 Ile148Met变体是杂合的。在一些实施方案中,受试者对于PNPLA3 Ile144Met变体是纯合的。在一些实施方案中,受试者对于PNPLA3 Ile144Met变体是杂合的。
在一些实施方案中,受试者不包含任何编码HSD17B13蛋白的失能变异的基因。据信HSD17B13蛋白的失能变异,包括PCT国际专利申请公开号WO 2011/162821和2017年10月11日提交的美国临时申请序列号62/570,985中所述的那些,赋予了肝病保护作用,并且还据信该保护作用在存在变体PNPLA3 Ile148M变异的情况下得到增强。
在一些实施方案中,该方法进一步包括确定受试者是否肥胖。在一些实施方案中,如果受试者的身体质量指数(BMI)超过30kg/m2,则该受试者是肥胖的。肥胖可能是患有或可能发生肝病的受试者的特征。在一些实施方案中,该方法进一步包括确定受试者是否具有脂肪肝。脂肪肝可能是患有或可发生肝病的受试者的特征。在一些实施方案中,该方法进一步包括确定受试者是否肥胖并具有脂肪肝。
如本文所用,“非酒精性脂肪性肝病”与术语“NAFLD”可互换使用,指每天摄入酒精少于20克时由大血管性脂肪变性存在定义的疾病。NAFLD是美国最常见的肝病,且通常与胰岛素抵抗/2型糖尿病和肥胖相关。NAFLD表现为脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化,且有时表现为肝细胞癌。对于NAFLD的综述,参见Tolman和Dalpiaz(2007)Ther.Clin.Risk.Manag.,3(6):1153-1163,其全部内容通过引用结合于此。
如本文所用,术语“脂肪变性”、“肝脂肪变性”和“脂肪性肝病”是指在肝细胞中甘油三酯和其他脂肪的积累。
如本文所用,术语“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”指由肝脏中脂肪累积引起的肝脏炎症和损害。NASH是一组称为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的疾病。NASH类似于酒精性肝病,但发生在很少饮酒或不饮酒的人群中。NASH的主要特征是肝脏中的脂肪以及炎症和损害。大多数NASH患者感觉良好,而并未意识到他们存在肝脏问题。尽管如此,NASH可能是严重的,并可能导致肝硬化,其中肝脏永久性受损和结疤,因而不再能够正常工作。NASH通常首先被怀疑存在于常规血液检测项目中的肝脏检验(如丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST))被发现升高的人中。当进一步评估显示无明显的肝病原因(如药物治疗、病毒性肝炎或过度饮酒)时以及当x射线或肝脏成像研究显示脂肪时,怀疑为NASH。证明NASH的诊断并将其与单纯脂肪肝相分离的唯一方式是肝脏活组织检查。
如本文所用,在组织学上定义的术语“肝硬化”为以纤维化和正常肝结构转化为结构异常的结节为特征的弥漫性肝过程。
如本文所用,术语“血清脂质”指血液中存在的任何主要脂质。血清脂质可以以游离形式或作为蛋白质复合物(例如脂蛋白复合物)的一部分存在于血液中。血清脂质的非限制性实例可包括甘油三酯(TG)、胆固醇如总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)和中密度脂蛋白胆固醇(IDL-C)。
在一个实施方案中,受益于GPAM(和在一些实施方案中,HSD17B13)表达减少的受试者为例如患有2型糖尿病和前驱糖尿病或肥胖的受试者;血液中脂肪含量高(如胆固醇)或血压高的受试者;患有某些代谢障碍(包括代谢综合征)的受试者;体重迅速减轻的受试者;具有某些感染(例如丙型肝炎感染)的受试者,或已暴露于某些毒素的受试者。在一个实施方案中,受益于GPAM(和在一些实施方案中,HSD17B13)表达减少的受试者为例如中年或老年受试者;作为西班牙裔、非西班牙裔白人或非裔美国人的受试者;服用某些药物(如皮质类固醇和癌症药物)的受试者。
在本发明的方法(和用途)中,其包括向受试者施用靶向GPAM的第一dsRNA剂和靶向HSD17B13的第二dsRNA剂,第一和第二dsRNA剂可以在相同的组合物或不同的组合物中配制,并且可以在相同的组合物或单独的组合物中施用于受试者。
在一个实施方案中,用于本发明方法的“iRNA”是“双重靶向RNAi剂”。术语“双重靶向RNAi剂”指与包含第二dsRNA剂的分子共价连接的包含第一dsRNA剂的分子,该第一dsRNA剂包含核糖核酸分子的复合物,具有包含两条反平行且基本互补的核酸链的双链体结构,关于第一靶标RNA(即GPAM基因)被称为具有“有义”和“反义”取向,该第二dsRNA剂包含核糖核酸分子的复合物,具有包含两条反平行且基本互补的核酸链的双链体结构,关于第二靶RNA(即HSD17B13基因)被称为具有“有义”和“反义”取向。在本发明的一些实施方案中,双重靶向RNAi剂通过转录后基因沉默机制(在本文称为RNA干扰或RNAi)触发第一和第二靶RNA(例如,mRNA)的降解。
dsRNA剂可以以约0.1mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于受试者。通常,合适的剂量范围为约0.1mg/kg至约5.0mg/kg,优选约0.3mg/kg至约3.0mg/kg。
iRNA可通过在一段时间内静脉输注施用。在某些实施方案中,在初始治疗方案后,可以较低频率施用。
施用iRNA可将例如患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中的GPAM水平降低至少约5%、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、39、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或至少约99%或更多。在优选的实施方案中,施用iRNA可以将例如患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中的GPAM水平降低至少20%。
施用iRNA可将例如患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中的HSD17B13水平降低至少约5%、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、39、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或至少约99%或更多。在优选的实施方案中,施用iRNA可将例如在患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中的HSD17B13水平降低至少20%。
在施用完全剂量的iRNA之前,患者可以施用较小的剂量,例如5%的输注反应,并监测不良反应,例如过敏反应。在另一个实例中,可以监测患者的不希望的免疫刺激效应,例如细胞因子(例如,TNF-α或INF-alpha)水平的增加。
或者,可皮下施用iRNA,即通过皮下注射。一次或多次注射可用于向受试者递送所需日剂量的iRNA。注射可在一段时间内重复进行。施用可定期重复进行。在某些实施方案中,在初始治疗方案后,治疗可以较低频率进行。重复剂量方案可包括定期(例如每隔一天或一年一次)施用治疗量的iRNA。在某些实施方案中,iRNA约每周一次、每7-10天一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次(每季度一次)、每4个月一次、每5个月一次或每6个月一次施用。
在一个实施方案中,该方法包括施用本文所述的组合物,使得靶GPAM基因的表达降低,例如持续约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24小时、28、32或约36小时。在一个实施方案中,靶GPAM基因的表达在延长的持续时间内降低,例如至少约两天、三天、四天或更长时间,例如约一周、两周、三周或四周或更长时间。
在另一个实施方案中,该方法包括施用本文所述的组合物,使得靶HSD17B13基因的表达降低,例如持续约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24小时、28、32或约36小时。在一个实施方案中,靶HSD17B13基因的表达在延长的持续时间内降低,例如至少约两天、三天、四天或更长时间,例如约一周、两周、三周或四周或更长时间。
优选地,可用于本文所述方法和组合物的iRNA特别地靶向靶GPAM基因(以及在一些实施方案中,HSD17B13基因)的靶RNA(初级或加工的)。使用iRNA抑制这些基因表达的组合物和方法可以如本文所述制备和实施。
根据本发明的方法施用dsRNA可导致患有脂代谢障碍的患者中这些疾病或障碍的严重性、体征、症状和/或标志物的降低。在该情况中,“减少”指该水平的统计学显著的降低。减少可以是例如至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或约100%。
疾病的治疗或预防功效可通过例如测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物治疗剂量、疾病标志物水平或适用于正在治疗的或作为预防目标的特定疾病的任何其他可测量参数来评估。本领域技术人员完全有能力通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效。例如,可以通过定期监测一种或多种血清脂质水平(例如甘油三酯水平)来评估治疗脂代谢障碍的治疗功效。后续读数与初始读数的比较为医生提供了治疗是否有效的指示。本领域技术人员完全有能力通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效。关于iRNA或其药物组合物的施用,“有效对抗”脂代谢障碍表明,以临床上适当的方式施用导致至少有统计学显著的患者部分的有益效果,例如症状改善、治愈、减少疾病、延长寿命、改善生活质量或熟悉治疗脂代谢障碍及相关原因的医生通常认为积极的其他效果。
当疾病状态的一项或多项参数有统计学显著的改善,或通过否则所预期的症状的不恶化或出现,治疗或预防效果是明显的。例如,疾病的可测量参数的至少10%的有利变化,且优选至少20%、30%、40%、50%或以上的有利变化可指示有效治疗。也可以使用本领域已知的特定疾病的实验动物模型来判断特定iRNA药物或该药物的制剂的效力。
本发明进一步提供了使用本发明的iRNA剂或药物组合物的方法,例如,用于治疗受益于GPAM表达或GPAM的减少和/或抑制的受试者(例如,患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者),其与其他药物和/或其他治疗方法(例如,与已知药物和/或已知治疗方法,例如,目前用于治疗这些障碍的药物和/或治疗方法)组合。在一些实施方案中,本发明提供了使用本发明的iRNA剂或药物组合物以及靶向HSD17B13的iRNA剂的方法,例如用于治疗受益于GPAM表达和HSD17B13表达的减少和/或抑制的受试者,例如具有GPAM相关疾病、障碍或病症(例如NASH)的受试者,其与其他药物和/或其他治疗方法,例如已知的药物和/或已知的治疗方法,例如目前用于治疗这些障碍的那些。例如,在某些实施方案中,本发明的iRNA剂或药物组合物与例如吡哆醇、ACE抑制剂(血管紧张素转换酶抑制剂),例如贝那普利;降低血压的药剂,例如利尿剂、β-阻断剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、钙通道阻断剂、α-阻断剂、α-2受体拮抗剂、组合的α-和β-阻断剂、中枢激动剂、外周肾上腺素能抑制剂和血管扩张剂;或降低胆固醇的药剂,例如他汀类、选择性胆固醇吸收抑制剂、树脂;降脂治疗;胰岛素增敏剂,例如PPARγ激动剂吡格列酮;glp-1r激动剂,如利拉鲁肽;维生素E;SGLT2抑制剂;或DPPIV抑制剂;或任何前述的组合。在一个实施方案中,本发明的iRNA剂或药物组合物与抑制含patatin样磷脂酶结构域蛋白3(PNPLA3)基因的表达和/或活性的药剂(例如,抑制PNPLA3基因表达的RNAi剂)组合施用。在一个实施方案中,本发明的iRNA剂或药物组合物与抑制跨膜6超家族成员2(TM6SF2)基因表达和/或活性的药剂(例如,抑制TM6SF2基因表达的RNAi剂)组合施用。
iRNA剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或以相同的组合施用,例如皮下,或者另外的治疗剂可以作为单独组合物的部分或在单独的时间和/或通过本领域已知的或本文所述的另一方法施用。
VIII.试剂盒
本发明还提供了用于实施本发明任何方法的试剂盒。这些试剂盒包括一种或多种RNAi剂和使用说明,例如,通过使细胞与有效抑制GPAM表达的量的本发明RNAi剂或药物组合物接触来抑制细胞中GPAM表达的说明。试剂盒可任选地进一步包括用于使细胞与RNAi剂接触的装置(例如,注射装置),或用于测量GPAM的抑制的装置(例如,用于测量GPAM mRNA和/或GPAM蛋白的抑制的装置)。这种用于测量GPAM抑制的装置可包括用于从受试者获得样品的装置,例如,血浆样品。本发明的试剂盒可任选地进一步包括用于向受试者施用RNAi剂的装置或用于确定治疗有效量或预防有效量的装置。
除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明所述的iRNA和方法,但下文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有公开出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文中。如有冲突,应以本说明书(包括定义)为准。另外,材料、方法和实例仅为示例性的,而非意图是限制性的。
实施例
实施例1.GPAM iRNA设计、合成和选择
本文提供的核酸序列使用标准命名法表示。参见表2的缩写。
表2.用于核酸序列表示的核苷酸单体的缩写。
应当理解,当存在于寡核苷酸中时,这些单体通过5’-3’-磷酸二酯键相互连接。
1L96的化学结构如下:
实验方法
本实施例描述了用于GPAM iRNA剂的设计、合成和选择的方法。
生物信息学
试剂来源
如果本文未明确给出试剂的来源,则该试剂可从任何分子生物学试剂供应商处获得,其质量/纯度标准适用于分子生物学。
转录物
一组靶向人线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)基因(人NCBI refseqID NM_020918.6;NCBI GeneID:57678)以及小鼠GPAM基因(小鼠NCBI refseqID NM_008149.4;NCBI Gene ID:14732)的siRNA是使用自定义R和Python脚本设计的。所有siRNA设计与人GPAM转录物(转录物变体2)或小鼠GPAM转录物(转录物变体1)完全匹配。从小鼠GPAM设计的siRNA可与人和/或食蟹猴GPAM交叉反应。人NM_020918REFSEQ mRNA,第6版的长度为6368个碱基,小鼠REFSEQ mRNA,第4版的长度为5956个碱基。
siRNA合成
使用本领域公知的常规方法对siRNA进行合成和退火。
简言之,siRNA序列以1μmol规模,在Mermade 192合成仪(BioAutomation)上,使用固相支持物介导的亚磷酰胺化学合成。固相支持物是载有定制GalNAc配体的受控孔玻璃(500A)或通用固相支持物(AM biochemical)。辅助合成试剂2’-F和2’-O-甲基RNA以及脱氧亚磷酰胺获自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)和Hongene(China)。使用相应亚磷酰胺引入2’F 2’-O-甲基、GNA(二醇核酸)、5’磷酸和其他修饰。在GalNAc修饰的CPG支持物上进行3’GalNAc缀合的单链的合成。将定制CPG通用固相支持物用于合成反义单链。所有亚磷酰胺(在乙腈中100mM)的偶联时间为5min,使用5-乙基硫代-1H-四唑(ETT)作为活化剂(在乙腈中0.6M)。使用3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT,购自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))的50mM无水乙腈/吡啶溶液(1:1v/v)产生硫代磷酸酯连接。氧化时间3分钟。合成所有序列,最后去除DMT基团(“脱除DMT”)。
固相合成完成后,将寡核糖核苷酸从固相支持物上切割下来,并且在密封的96孔深孔板中使用200μL甲胺水溶液试剂在60℃下脱保护20分钟。对于含有用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护的2’核糖残基(2’-OH)的序列,使用TEA.3HF(三乙胺三氢氟化物)试剂进行第二步脱保护。向甲胺脱保护溶液中加入200μL二甲亚砜(DMSO)和300μl TEA.3HF试剂,并将溶液在60℃再孵育20min。在切割和去保护步骤结束时,使合成板达到室温并通过添加1mL乙腈:乙醇混合物(9:1)来沉淀。将板在-80℃冷却2hr,借助多通道移液器小心倾析上清液。将寡核苷酸沉淀重新悬浮在20mM NaOAc缓冲液中,并在配备A905自动进样器和Frac 950级分收集器的AKTA Purifier System上使用5mL HiTrap体积排阻柱(GEHealthcare)脱盐。将脱盐的样品收集到96孔板中。来自每条序列的样品通过LC-MS进行分析以确认身份,将UV(260nm)用于量化,并通过IEX色谱分析一组选定的样品以确定纯度。
在Tecan液体处理机器人上进行单链退火。将有义和反义单链的等摩尔混合物在96孔板中合并和退火。在结合互补单链后,将96孔板良好密封,在100℃的烘箱中加热10分钟,并在2-3小时内缓慢恢复至室温。每个双链体的浓度在1X PBS中针对10μM标准化,然后提交用于体外筛选测定。
表3显示了人类未修饰的有义链和反义链序列的核苷酸序列的详细列表。
表4显示了人类修饰的有义链和反义链序列的核苷酸序列的详细列表。
表5显示了小鼠未修饰的有义链和反义链序列的核苷酸序列的详细列表。
表6显示了小鼠修饰的有义链和反义链序列的核苷酸序列的详细列表。。
表3人GPAM dsRNA剂的未修饰的有义和反义链序列
表4.人GPAM dsRNA剂的修饰的有义和反义链序列
表5.小鼠GPAM dsRNA剂的未修饰的有义和反义链序列
表6.小鼠GPAM dsRNA剂的修饰的有义和反义链序列
实施例2.体外筛选方法
体外HEP G2、Cos-7(双萦光素酶psiCHECK2载体)、原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞筛选
细胞培养和转染:
Hep G2细胞(ATCC,Manassas,VA)在补充了10%FBS(ATCC)的Eagle’s最低必需培养基(Gibco)中于37℃下和5%CO2的气氛中生长至接近汇合,然后通过胰蛋白酶化从平板释放。通过向96孔板中的单个孔的5μl各siRNA双链体加入每孔14.8μl Opti-MEM加0.2μlLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)进行转染,每个siRNA双链体4个重复。然后将混合物在室温下孵育15分钟。然后将含约2×104个Hep G2细胞的80μl不含抗生素的完全生长培养基加入到siRNA混合物中。在RNA纯化前,细胞孵育24小时。在10nM和0.1nM最终双链体浓度下进行单剂量实验。
Cos-7(ATCC)通过向384孔平板中每孔5μl siRNA双链体(每种siRNA双链体4个重复)加入5μl的每孔1ng/l(在Opti-MEM中稀释)GPAM psiCHECK2载体(Blue HeronBiotechnology)、4.9μl的Opti-MEM加0.1μl的Lipofectamine 2000(invitrogen,CarlsbadCA.cat#11668-019)中转染。cat#11668-019),并在室温下孵育15分钟进行转染。然后将含有约5×103个细胞的35μl Dulbecco’s Modified Eagle Medium(ThermoFisher)加入siRNA混合物中。将细胞孵育48小时,然后进行萤火虫(转染对照)和Renilla(融合至靶序列)萦光素酶测量。单剂量实验在50nM、10nM、1nM和0.1nM下进行。
原代人肝细胞(BioIVT)通过向384孔板的每孔5μl siRNA双链体(每种siRNA双链体4个重复)加入每孔4.9μl的Opti-MEM加0.1μl Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150),并在室温下孵育15分钟进行转染。然后向siRNA混合物中加入含有约15×103个细胞的35μl InVitroGRO CP铺板培养基(BioIVT)。细胞在RNA纯化前孵育48小时。单剂量实验在50nM下进行。
食蟹猴原代肝细胞(BioIVT)通过向384孔板中的每孔5μl siRNA双链体(每种siRNA双链体4个重复)加入每孔4.9μl的Opti-MEM加0.1μl RNAiMAX(Invitrogen,CarlsbadCA.cat#13778-150),并在室温下孵育15分钟转染。然后向siRNA混合物中加入含有约5×103个细胞的35μl InVitroGRO CP铺板培养基(BioIVT)。在进行RNA纯化前,将细胞孵育48小时。单剂量实验在50nM下进行。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒的总RNA分离:
在BioTek-EL406平台上使用DYNABEAD(Invitrogen,cat#61012)采用自动化方案分离RNA。简而言之,将70μl裂解/结合缓冲液和10μl含有3μl磁珠的裂解缓冲液加入到具有细胞的平板中。平板在电磁摇床上于室温下孵育10分钟,然后捕获磁珠并去除上清液。然后用150μl洗涤缓冲液A洗涤珠结合的RNA两次,用洗涤缓冲液B洗涤一次。然后用150μl洗脱缓冲液洗涤珠,再次捕获并去除上清液。
使用ABI高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems,Foster
City,CA,Cat#
4368813)的cDNA合成:
向上述分离的RNA中加入每反应10μl含有1μl 10X缓冲液、0.4μl 25X dNTPs、1μl10x随机引物、0.5μl反转录酶、0.5μl RNase抑制剂和6.6μl H2O的主混合物。将平板密封、混合,并在室温下在电磁摇床上孵育10分钟,随后在37℃下2小时。
实时PCR:
向384孔板(RocheTM Cat#04887301001)中的每孔0.5μl人GAPDH TaqManTM探针(4326317E)和0.5μl GPAM人探针(Hs00326039_m1,Thermo)或者0.5μl GAPDH Cyno(定制)和0.5μl GPAM Cyno探针中加入2μl cDNA和5μl LightcyclerTM 480探针主混合物(RocheTMCat#04887301001)。实时PCR在LightCyclerTM 480实时PCR***(RocheTM)中进行。每种双链体测试至少两次,并将数据针对用非靶向对照siRNA转染的细胞标准化。为计算相对倍数变化,实时数据使用ΔΔCt方法分析,并将其针对用非靶向对照siRNA转染的细胞进行的分析标准化。
结果
使用示例性人GPAM siRNA的Hep G2细胞的双剂量筛选结果见表7。实验在10nM和0.1nM最终双链体浓度下进行,且数据以相对于非靶向对照(GAPDH)的剩余GPAM mRNA百分比表示。
表7.在Hep G2细胞中人GPAM siRNA的体外筛选
实施例3.肝脏脂肪与GPAM的全基因组关联
UK biobank收集了约9,894名参与者的MRI成像数据。在英国白人人群中次要等位基因频率(MAF)大于0.1%的阵列变体(直接基因分型和估算)上进行了肝脏质子密度脂肪分数测量的全基因组关联研究(GWAS)。表8显示了GWAS的在先命中,且包括GPAM内含子变体rs2792759。
表9和表10显示了rs2792751的结果,RS 2792751是GPAM中的错义变体(I43V),其与rs2792759完全连锁不平衡(R2=1)。变体rs2792751与丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、LDL胆固醇、HDL胆固醇和肝脂肪的水平增加以及包括脂肪性肝疾病的肝疾病风险增加相关。在表9和表10中,效应等位基因为rs2792751-T,其携带者在GPAM蛋白的43位氨基酸处具有异亮氨酸。
对约300000名UK biobank参与者进行了Exome测序,并在GPAM中鉴定了罕见的功能丧失(即预测的蛋白质截短)变体。使用负荷试验对这些变异体进行汇总并测试其与肝脏生物标记物和脂质的相关性。GPAM功能丧失的负荷试验结果揭示与ALT、AST和ALP降低,但甘油三酯增加的相关性(显示于表11中)。这些结果显示了与常见GPAM变体rs2792759和rs2792751相反的作用方向,表明GPAM的功能丧失变体防止脂肪肝和慢性纤维炎性疾病。
GPAM在肝细胞中高表达,且因此,是使用抑制GPAM的表达并模拟功能丧失变体的dsRNA剂的脂肪肝、NASH和/或其他慢性肝病治疗的有吸引力的靶标。
表8.肝脏质子密度分数测量的GWAS在先命中
基因 | 变体(rsid)/类型 | MAF | P-值 | Beta | <![CDATA[N<sub>obs</sub>]]> |
PNPLA3 | rs738409(错义) | 21.63% | 1.91E-39 | 0.26 | 7019 |
TM6SF2 | rs58542926(错义) | 7.42% | 2.87E-29 | 0.35 | 7019 |
RN7SL251P | rs113201811(上游基因) | 13.56% | 1.80E-07 | -0.13 | 7019 |
GPAM | rs2792759(内含子) | 26.99% | 2.58E-07 | 0.09 | 7019 |
表9.rs2792751I43V变体与相关生物标志物的关联性
生物标志物 | P-值 | 效应(SD) |
丙氨酸氨基转移酶(ALT) | 3.78E-24 | 0.03 |
天冬氨酸氨基转移酶(AST) | 1.93E-08 | 0.02 |
碱性磷酸酶(ALP) | 1.49E-31 | 0.03 |
肝脏脂肪 | 4.71E-07 | 0.09 |
甘油三酯(TG) | 1.21E-10 | -0.02 |
LDL胆固醇 | 2.22E-18 | 0.02 |
HDL胆固醇 | 1.09E-44 | 0.04 |
表10.rs2792751I43V变体与肝病的关联性
疾病 | P-值 | 效应(OR) |
ICD10 K70-K77肝病 | 2.07E-05 | 1.07 |
ICD10K76非指定脂肪肝病 | 1.48E-04 | 1.08 |
ICD10K75其他炎性肝病 | 0.0017 | 1.12 |
ICD10K70酒精性肝病 | 0.0077 | 1.13 |
ICD10K74肝纤维化和肝硬化 | 0.0291 | 1.10 |
表11.聚集的GPAM中失能变体与相关生物标志物的关联性
生物标志物 | Beta | p-值 | 测量的携带者N |
碱性磷酸酶(ALP) | -0.40 | 3.48E-06 | 127 |
丙氨酸氨基转移酶(ALT) | -0.22 | 0.008 | 127 |
门冬氨酸氨基转移酶(AST) | -0.15 | 0.07 | 127 |
甘油三酯(TG) | 0.05 | 0.55 | 127 |
实施例4.GPAM siRNA的体内筛选
评估实施例1中设计的选定dsRNA剂降低C57Bl/6小鼠肝脏中GPAM水平的能力。
简而言之,6-8周龄雌性C57Bl/6小鼠皮下施用单剂量的10mg/kg选定的GalNAc缀合dsRNA剂,包括双链体AD-1371956、AD-1372921、AD-1373128、AD-1374116、AD-1374118、AD-1374646、AD-1374648、AD-1376755、AD-1377594、AD-1378587和AD-1378591,或安慰剂(PBS)。施用后14天,处死动物并收集组织和血液样品,包括肝脏。将肝脏在液态氮中速冻并研磨成粉末。
按照制造商的指示,约25g的肝脏粉末使用96试剂盒分离肝核糖核酸RNA而无DNase处理。根据制造商的指示,cDNA在具有1μg RNA的20μl升反应中使用具有RNA酶抑制剂的高容量cDNA反转录试剂盒(Applied BiosystemsTM)从分离的肝脏RNA产生,并用无核酸酶的水稀释至100μl。根据制造商的指示,通过在RocheTM LightCyclerTM480II上使用LightCyclerTM 480Probes Master在10μL反应中产生的cDNA进行RT-qPCR来测量相对GPAM表达。使用TaqManTM探针Mm00833328_m1(FAM)与小鼠GAPDH内源性对照(VIC)多重测量小鼠GPAM RNA水平。
使用Δ-Δct方法计算小鼠GPAM表达:将每只小鼠的重复GPAM ct值针对相应的重复GAPDH ct值标准化,以计算各单个小鼠的GPAM RNA水平。然后通过将GPAM核糖核酸水平针对PBS处理组的平均GPAM RNA水平标准化来计算相对表达。结果显示于图1。
等同
本领域技术人员将认识到或能够仅通过常规实验确定与本文所述具体实施方案和方法的许多等同物。这类等同物旨在包含在以下权利要求的范围内。
GPAM序列
SEQ ID NO:1
>NM_001244949.2人线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),转录物变体1,mRNAGCGCCACTGCAGCTGGCATTGGCCGGGACTGGAAGTGCGGGCTTCTGCAGCAGCCGAAGCTGGAGCTGCTAGGGCAGCAGCGGCTCCCCTGTTGTATGGACATTCTGCACCCGAAACTGATAGCTGAGTCCTGAAGTTTTATGTTATGAAACAGAAGAACTTTCATCCCAGCACATGATTTGGGAATTACACTTTGTGACATGGATGAATCTGCACTGACCCTTGGTACAATAGATGTTTCTTATCTGCCACATTCATCAGAATACAGTGTTGGTCGATGTAAGCACACAAGTGAGGAATGGGGTGAGTGTGGCTTTAGACCCACCATCTTCAGATCTGCAACTTTAAAATGGAAAGAAAGCCTAATGAGTCGGAAAAGGCCATTTGTTGGAAGATGTTGTTACTCCTGCACTCCCCAGAGCTGGGACAAATTTTTCAACCCCAGTATCCCGTCTTTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAATGAAACTCACACAAGACACCGCGGATGGCTTGCAAGACGCCTTTCTTACGTTCTTTTTATTCAAGAGCGAGATGTGCATAAGGGCATGTTTGCCACCAATGTGACTGAAAATGTGCTGAACAGCAGTAGAGTACAAGAGGCAATTGCAGAAGTGGCTGCTGAATTAAACCCTGATGGTTCTGCCCAGCAGCAATCAAAAGCCGTTAACAAAGTGAAAAAGAAAGCTAAAAGGATTCTTCAAGAAATGGTTGCCACTGTCTCACCGGCAATGATCAGACTGACTGGGTGGGTGCTGCTAAAACTGTTCAACAGCTTCTTTTGGAACATTCAAATTCACAAAGGTCAACTTGAGATGGTTAAAGCTGCAACTGAGACGAATTTGCCGCTTCTGTTTCTACCAGTTCATAGATCCCATATTGACTATCTGCTGCTCACTTTCATTCTCTTCTGCCATAACATCAAAGCACCATACATTGCTTCAGGCAATAATCTCAACATCCCAATCTTCAGTACCTTGATCCATAAGCTTGGGGGCTTCTTCATACGACGAAGGCTCGATGAAACACCAGATGGACGGAAAGATGTTCTCTATAGAGCTTTGCTCCATGGGCATATAGTTGAATTACTTCGACAGCAGCAATTCTTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACACGTTCTAGGAGTGGAAAAACCTCTTGTGCTCGGGCAGGACTTTTGTCAGTTGTGGTAGATACTCTGTCTACCAATGTCATCCCAGACATCTTGATAATACCTGTTGGAATCTCCTATGATCGCATTATCGAAGGTCACTACAATGGTGAACAACTGGGCAAACCTAAGAAGAATGAGAGCCTGTGGAGTGTAGCAAGAGGTGTTATTAGAATGTTACGAAAAAACTATGGTTGTGTCCGAGTGGATTTTGCACAGCCATTTTCCTTAAAGGAATATTTAGAAAGCCAAAGTCAGAAACCGGTGTCTGCTCTACTTTCCCTGGAGCAAGCGTTGTTACCAGCTATACTTCCTTCAAGACCCAGTGATGCTGCTGATGAAGGTAGAGACACGTCCATTAATGAGTCCAGAAATGCAACAGATGAATCCCTACGAAGGAGGTTGATTGCAAATCTGGCTGAGCATATTCTATTCACTGCTAGCAAGTCCTGTGCCATTATGTCCACACACATTGTGGCTTGCCTGCTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATTGATCTCTCCACATTGGTCGAAGACTTCTTTGTGATGAAAGAGGAAGTCCTGGCTCGTGATTTTGACCTGGGGTTCTCAGGAAATTCAGAAGATGTAGTAATGCATGCCATACAGCTGCTGGGAAATTGTGTCACAATCACCCACACTAGCAGGAACGATGAGTTTTTTATCACCCCCAGCACAACTGTCCCATCAGTCTTCGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAGGCCATCATAGCTTGCAGCCTTTATGCAGTTCTGAACAAGAGGGGACTGGGGGGTCCCACTAGCACCCCACCTAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGCGGAAGGCGGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCCAATGAAGGCACCATCTCACTGCCTTGCCAGACATTTTACCAAGTCTGCCATGAAACAGTAGGAAAGTTTATCCAGTATGGCATTCTTACAGTGGCAGAGCACGATGACCAGGAAGATATCAGTCCTAGTCTTGCTGAGCAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCAGAACCTTTGTCTTGGAGAAGTGATGAAGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGGGAGGAACAGCGAGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAATCCAAGGAGCACCAGCAGTTTATCACCTTCTTACAGAGACTCCTTGGGCCTTTGCTGGAGGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTTCACAACTTCAGTGGTCCTGTTCCAGAACCTGAGTATCTGCAAAAGTTGCACAAATACCTAATAACCAGAACAGAAAGAAATGTTGCAGTATATGCTGAGAGTGCCACATATTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGATATTGGGGTTTTCAAGGAGACCAAACAAAAGAGAGTGTCTGTTTTAGAACTGAGCAGCACTTTTCTACCTCAATGCAACCGACAAAAACTTCTAGAATATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGGTAACGTGTGGCACTGCTGGCAAATGAAGGTCATGAGATGAGTTCCTTGTAGGTACCAGCTTCTGGCTCAAGAGTTGAAGGTGCCATCGCAGGGTCAGGCCTGCCCTGTCCCGAAGTGATCTCCTGGAAGACAAGTGCCTTCTCCCTCCATGGATCTGTGATCTTCCCAGCTCTGCATCAACACAGCAGCCTGCAGATAACACTTGGGGGGACCTCAGCCTCTATTCGCAACTCATAATCCGTAGACTACAAGATGAAATCTCAATAAATTATTTTTGAGTTTATTAAAGATTGACATTTTAAGTACAACTTTTAAGGACTAATTACTGTGATGGACACAGAAATGTAGCTGTGTTCTGGAACTGAATCTTACATGGTATACTTAGTGCTGCTGGGTAATTTGTTGGTATATTATCTGGTTAGTGGTTAATGCTTCCTTTAAAAATAATTGAGTCATCCATTCACTCTTTTTCAGTTTTATCTGTCAATAGTAGCTACATTTTTAATGGGAGCACCTTTTATCCCAAAGTGCTTTATAAATTGAGTG GACTGATATATATCACACCCAGGTATCACTGTGCTGTCCTTTGCTGTCAGATTTAGAAATGTTTTTAAGAGCTATGTGAAAACAGACAATATTAGTTTAGGTCGGGAACTGAGATATTGTAATCAAATAGTTAACATCAGGAAGTTAATTTGGCTGGCAAAATTCTAGGGAAACTTGGCCAGAAAACTGGTGTTGAAGGCTTTTGCTCATATAAACAAGTGCCATTGAGTTTCAAATGACCAGCAAATATATTTAGAACCCTTCCTGTTTTATGTCTGTACCTCGTCCACCCCTCAGGTAATACCTGCCTCTCACAGGTACAGCTGTTTCTTGGAAATCCTCCAACCAAATAGCAGTTTTCCTAACTTGATTAGCTTGAGCTGACAGACTGTTAGAATACAGTTCTCTGGCCACAGCTGATGAGGGCTTTCTGTACTGCACACAGATTGTGTACTGCACCCCAGTCCAGGTGACTGGTACCCACTCGAGTTGTGCCGTGCACAACCTGTCCAGTATATGCATGTGGTGGCCCTACTGACTGGTAATGGTTAGAGGCATTTATGGATTTTTAGCTTTGAGGAAAAACCATGACTTTTAACAAATTTTTATGGGTTATATGCCTAAACCCTTATGCCACATAGTGGTAAATAATTATGAAAAATGGTCTGTTCATAATTGGTAGGTGCCTTTTGTGAGCAGGGAGCATAATTATTGGTTTATTATGGTAATTATGGTGATTTTTTAAATATCATGTAATGTTAAAACGTTTTCTAACAGTTTACTGTTGCTTATCTCCAAGATATTATGGAATTAAGAATTTTTCCAGATGAGTGTTACATAGATTCTTTGAATTTAGTATAAAAGTACTGAGAATTAAGTTTGTACTTCCATAAGCTTGGATTTTAAACACTGATAGTATCTCATGAGTAATGTGTGTTTTGGGAGAGGGAGGGATGCTGATTGATATTTCACATTGTATGAAATACCATGTTTGAAACTCATAGCAATAATGCTATGCTGTTGTGATCCCTCTCAAGTTCTGCATTTAAAATATATTTTTTCTTTATAGGAATTGATGTATACCATGAAGTCATTGTCAGTTGTAGTAGCTCTGATGTTGAATGAGATATCATGTTTTAGCATTCCATTTTACTGACTAGGGTAGAAGAACACTTTTCTTGGCTACATTTGGAGGATACCCAGGGAGTCTTGGGTGTTCCTTATCTGGGGAAGCAAACATTTCACTAGTCTCTTTTTTTCATCCTTTAAATTGTAAATTAAGGATTACTCAAGCTCACCATTATTCAAGATTGGGACTCGCTTCCCAGTCGACACTCTGCCCTGCCTGTCATTGCTGCAAAGAGCTGCTGCTTTGCCAACCTAAGCAAAGAAAATACGGCTTCTCTTGCATTATTTTCCCTTTTGGTTGGTTTGTTTTCTAGAAGTACGTTCAGATGCTTTGGGGAATGCAATGTATGATTTGCTAGCTCTCTCACCACTTAACTCACTGTGAGGATAAATATGCATGCTTTTTGTAATTAACTGGTGCTTTGAAAATCTTTTTTAAGGGAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCATCCAGACAAGCTGACCTTTGAGTTAATTTCAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATGACTGAAAACAAAAAACAAAAAAACGAAAGCATCTTCACAATGAAGCTTCCAGATAGCACCGTTTTGCTAAAAGATACATTCTCATTGTTTTCCAACAGTGATGGCTTCCACATAAGGTTAAACAAACTAGGTGCTTGTAAATAATTTATTACAGTTTACTCTATCGCATTTCTGTAACATGAAATGCATGCCCTTCTTCAGGGGAAGACTGTGGTCAAGTTAAAAAAAAAAAACAATATTAAACAACATGAAACTGCAGTCTGTTTTTGAAAATGAGAATGTCCTAAGTGATTCAGAAGAGAGGAGGGAAGTTGTGCACTCTGAAAATGCATGAAAAACAAAGGCAAAAACTAGTGGGAAATGTGTAGAACTGTTAACTGAGATGGCTTCGAGTCTTCCTTCTGGAATCTGTTAAATTTCACAAAGTCATGAGGGTAAATGGAGAAAATATTTCTGGGATTACAATGAATGTAAGCCCAAATTGTGGAATTGCCAGTAACCTGGATGGGGAAAAGCATTTCCCATAGCACTCCATGTAATATGAGTGCTCTGTGAGATGTTCATCAGTGTTTTATAGAAATGGTGTTGCTGGGAAACCAAGTTTGCACCTGGAAACTTACAATGCACTTTAGCGCAGTAAGGGCTTGGCATCCGGTAGTGAAAAACTGTCTAACCCAGCATTGCCCAAACTATTTTGACACCAGGACCTTTTTCTCCTTTGGGATACTTATGAACCTCTCACTAATGTCCTGTGGAGAACATTTTGGGAAACACTATGTTAGATAGTTCTTTAAGGAGACAAAACGGTAATGAACAGATAGCACTGGGGCAGAATATGCATGCATTTTGTAACGTCCAGTGTGGCGTTGAATAGATGTGTATTTCCTCCCCTGCAGAAAATAAGCACAGAAAATTATAATGTAGGTGATCGGAGCTCTTTCCTTTGATAGAGAGAACAGCCCCAATGATCCTGGCTTTTTCACTGAACGTATCAGAATACATGGATGAATTGGGGTAAATAAGGTTTTAATTCAGATCTAGAAGAAAGTATTGTACGTTTGAATGCAGATTTTTATCCACAGATAGTTGTAGTGTTTAGACATGACAGGACCTATCGTTGAGGTTTCTAAGACTTACTATGGGCTGTAAACCTGTTTTTTAAAACTATTTTAGAAACCTGAGACTTGCCGTCTGGCATTTTAGTTTAATACAAACTAATGATTGCATTTGAAAGAGATTCTTGACCTTATTTCTAAACGTCTAGAGCTCTGAAATGTCTTGATGGAAGGTATTAAACTATTTGCCTGTTGTACAAAGAAATGTTAAGACTCGTGAAAAGAATTACTATAAGGTACTGTGAAATAACTGCGATTTTGTGAGCAAAACATACTTGGAAATGCTGATTGATTTTTATGCTTGTTAGTGTATTGCAAGAAACACAGAAAATGTAGTTTTGTTTTAATAAACCAAAAATTGAACATA
SEQ ID NO:2
>SEQ ID NO:1的反向互补序列
TATGTTCAATTTTTGGTTTATTAAAACAAAACTACATTTTCTGTGTTTCTTGCAATACACTAACAAGCATAAAAATC
AATCAGCATTTCCAAGTATGTTTTGCTCACAAAATCGCAGTTATTTCACAGTACCTTATAGTAATTCTTTTCACGAG
TCTTAACATTTCTTTGTACAACAGGCAAATAGTTTAATACCTTCCATCAAGACATTTCAGAGCTCTAGACGTTTAGA
AATAAGGTCAAGAATCTCTTTCAAATGCAATCATTAGTTTGTATTAAACTAAAATGCCAGACGGCAAGTCTCAGGTT
TCTAAAATAGTTTTAAAAAACAGGTTTACAGCCCATAGTAAGTCTTAGAAACCTCAACGATAGGTCCTGTCATGTCT
AAACACTACAACTATCTGTGGATAAAAATCTGCATTCAAACGTACAATACTTTCTTCTAGATCTGAATTAAAACCTT
ATTTACCCCAATTCATCCATGTATTCTGATACGTTCAGTGAAAAAGCCAGGATCATTGGGGCTGTTCTCTCTATCAA
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TTTGGGCTTACATTCATTGTAATCCCAGAAATATTTTCTCCATTTACCCTCATGACTTTGTGAAATTTAACAGATTC
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GTTGGAAAACAATGAGAATGTATCTTTTAGCAAAACGGTGCTATCTGGAAGCTTCATTGTGAAGATGCTTTCGTTTT
TTTGTTTTTTGTTTTCAGTCATGAGGCACTGAAGAATGAGTTGTGCTGAAATTAACTCAAAGGTCAGCTTGTCTGGA
TGAGCATAACTTTGGTTGAGATTTTTCTCCCTTAAAAAAGATTTTCAAAGCACCAGTTAATTACAAAAAGCATGCAT
ATTTATCCTCACAGTGAGTTAAGTGGTGAGAGAGCTAGCAAATCATACATTGCATTCCCCAAAGCATCTGAACGTAC
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GAGTAATCCTTAATTTACAATTTAAAGGATGAAAAAAAGAGACTAGTGAAATGTTTGCTTCCCCAGATAAGGAACAC
CCAAGACTCCCTGGGTATCCTCCAAATGTAGCCAAGAAAAGTGTTCTTCTACCCTAGTCAGTAAAATGGAATGCTAA
AACATGATATCTCATTCAACATCAGAGCTACTACAACTGACAATGACTTCATGGTATACATCAATTCCTATAAAGAA
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TAAAATCCAAGCTTATGGAAGTACAAACTTAATTCTCAGTACTTTTATACTAAATTCAAAGAATCTATGTAACACTC
ATCTGGAAAAATTCTTAATTCCATAATATCTTGGAGATAAGCAACAGTAAACTGTTAGAAAACGTTTTAACATTACA
TGATATTTAAAAAATCACCATAATTACCATAATAAACCAATAATTATGCTCCCTGCTCACAAAAGGCACCTACCAAT
TATGAACAGACCATTTTTCATAATTATTTACCACTATGTGGCATAAGGGTTTAGGCATATAACCCATAAAAATTTGT
TAAAAGTCATGGTTTTTCCTCAAAGCTAAAAATCCATAAATGCCTCTAACCATTACCAGTCAGTAGGGCCACCACAT
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GTGTGCAGTACAGAAAGCCCTCATCAGCTGTGGCCAGAGAACTGTATTCTAACAGTCTGTCAGCTCAAGCTAATCAA
GTTAGGAAAACTGCTATTTGGTTGGAGGATTTCCAAGAAACAGCTGTACCTGTGAGAGGCAGGTATTACCTGAGGGG
TGGACGAGGTACAGACATAAAACAGGAAGGGTTCTAAATATATTTGCTGGTCATTTGAAACTCAATGGCACTTGTTT
ATATGAGCAAAAGCCTTCAACACCAGTTTTCTGGCCAAGTTTCCCTAGAATTTTGCCAGCCAAATTAACTTCCTGAT
GTTAACTATTTGATTACAATATCTCAGTTCCCGACCTAAACTAATATTGTCTGTTTTCACATAGCTCTTAAAAACAT
TTCTAAATCTGACAGCAAAGGACAGCACAGTGATACCTGGGTGTGATATATATCAGTCCACTCAATTTATAAAGCAC
TTTGGGATAAAAGGTGCTCCCATTAAAAATGTAGCTACTATTGACAGATAAAACTGAAAAAGAGTGAATGGATGACT
CAATTATTTTTAAAGGAAGCATTAACCACTAACCAGATAATATACCAACAAATTACCCAGCAGCACTAAGTATACCA
TGTAAGATTCAGTTCCAGAACACAGCTACATTTCTGTGTCCATCACAGTAATTAGTCCTTAAAAGTTGTACTTAAAA
TGTCAATCTTTAATAAACTCAAAAATAATTTATTGAGATTTCATCTTGTAGTCTACGGATTATGAGTTGCGAATAGA
GGCTGAGGTCCCCCCAAGTGTTATCTGCAGGCTGCTGTGTTGATGCAGAGCTGGGAAGATCACAGATCCATGGAGGG
AGAAGGCACTTGTCTTCCAGGAGATCACTTCGGGACAGGGCAGGCCTGACCCTGCGATGGCACCTTCAACTCTTGAG
CCAGAAGCTGGTACCTACAAGGAACTCATCTCATGACCTTCATTTGCCAGCAGTGCCACACGTTACCTACAGCACCA
CAAAACTCAGAATATATTCTAGAAGTTTTTGTCGGTTGCATTGAGGTAGAAAAGTGCTGCTCAGTTCTAAAACAGAC
ACTCTCTTTTGTTTGGTCTCCTTGAAAACCCCAATATCCTTAAACATTTTCACAGCATTCTTCACAAGACAATATGT
GGCACTCTCAGCATATACTGCAACATTTCTTTCTGTTCTGGTTATTAGGTATTTGTGCAACTTTTGCAGATACTCAG
GTTCTGGAACAGGACCACTGAAGTTGTGAACAAAGATGGCAGCAGAGCTGTAGGCCTCCAGCAAAGGCCCAAGGAGT
CTCTGTAAGAAGGTGATAAACTGCTGGTGCTCCTTGGATTGGCTCACCTTCAGGTAGCAATCTCGCTGTTCCTCCCC
AAAGTCACTGTCTTCATCTTCTTCATCACTTCTCCAAGACAAAGGTTCTGGAAGCTTCTTGTCCCACTGCTGCTCAG
CAAGACTAGGACTGATATCTTCCTGGTCATCGTGCTCTGCCACTGTAAGAATGCCATACTGGATAAACTTTCCTACT
GTTTCATGGCAGACTTGGTAAAATGTCTGGCAAGGCAGTGAGATGGTGCCTTCATTGGAGAGAAGGTAGCACAGGCT
GGCCGCCTTCCGCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTAGGTGGGGTGCTAGTGGGACCCCCCAGTCCCCTCTTGT
TCAGAACTGCATAAAGGCTGCAAGCTATGATGGCCTCCATGATAAAGACATGAAGTACCCCATTGCTGTAGAAGTTG
AGTTCGAAGACTGATGGGACAGTTGTGCTGGGGGTGATAAAAAACTCATCGTTCCTGCTAGTGTGGGTGATTGTGAC
ACAATTTCCCAGCAGCTGTATGGCATGCATTACTACATCTTCTGAATTTCCTGAGAACCCCAGGTCAAAATCACGAG
CCAGGACTTCCTCTTTCATCACAAAGAAGTCTTCGACCAATGTGGAGAGATCAATTCCCTGCCTGTGTCTGTAGAGG
AGCAGGCAAGCCACAATGTGTGTGGACATAATGGCACAGGACTTGCTAGCAGTGAATAGAATATGCTCAGCCAGATT
TGCAATCAACCTCCTTCGTAGGGATTCATCTGTTGCATTTCTGGACTCATTAATGGACGTGTCTCTACCTTCATCAG
CAGCATCACTGGGTCTTGAAGGAAGTATAGCTGGTAACAACGCTTGCTCCAGGGAAAGTAGAGCAGACACCGGTTTC
TGACTTTGGCTTTCTAAATATTCCTTTAAGGAAAATGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACACAACCATAGTTTTTTCG
TAACATTCTAATAACACCTCTTGCTACACTCCACAGGCTCTCATTCTTCTTAGGTTTGCCCAGTTGTTCACCATTGT
AGTGACCTTCGATAATGCGATCATAGGAGATTCCAACAGGTATTATCAAGATGTCTGGGATGACATTGGTAGACAGA
GTATCTACCACAACTGACAAAAGTCCTGCCCGAGCACAAGAGGTTTTTCCACTCCTAGAACGTGTGCCTTCCAGGAA
GATCTCCAAGAATTGCTGCTGTCGAAGTAATTCAACTATATGCCCATGGAGCAAAGCTCTATAGAGAACATCTTTCC
GTCCATCTGGTGTTTCATCGAGCCTTCGTCGTATGAAGAAGCCCCCAAGCTTATGGATCAAGGTACTGAAGATTGGG
ATGTTGAGATTATTGCCTGAAGCAATGTATGGTGCTTTGATGTTATGGCAGAAGAGAATGAAAGTGAGCAGCAGATA
GTCAATATGGGATCTATGAACTGGTAGAAACAGAAGCGGCAAATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTAACCATCTCAAGTT
GACCTTTGTGAATTTGAATGTTCCAAAAGAAGCTGTTGAACAGTTTTAGCAGCACCCACCCAGTCAGTCTGATCATT
GCCGGTGAGACAGTGGCAACCATTTCTTGAAGAATCCTTTTAGCTTTCTTTTTCACTTTGTTAACGGCTTTTGATTG
CTGCTGGGCAGAACCATCAGGGTTTAATTCAGCAGCCACTTCTGCAATTGCCTCTTGTACTCTACTGCTGTTCAGCA
CATTTTCAGTCACATTGGTGGCAAACATGCCCTTATGCACATCTCGCTCTTGAATAAAAAGAACGTAAGAAAGGCGT
CTTGCAAGCCATCCGCGGTGTCTTGTGTGAGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAAAGACGGGATACT
GGGGTTGAAAAATTTGTCCCAGCTCTGGGGAGTGCAGGAGTAACAACATCTTCCAACAAATGGCCTTTTCCGACTCA
TTAGGCTTTCTTTCCATTTTAAAGTTGCAGATCTGAAGATGGTGGGTCTAAAGCCACACTCACCCCATTCCTCACTT
GTGTGCTTACATCGACCAACACTGTATTCTGATGAATGTGGCAGATAAGAAACATCTATTGTACCAAGGGTCAGTGC
AGATTCATCCATGTCACAAAGTGTAATTCCCAAATCATGTGCTGGGATGAAAGTTCTTCTGTTTCATAACATAAAAC
TTCAGGACTCAGCTATCAGTTTCGGGTGCAGAATGTCCATACAACAGGGGAGCCGCTGCTGCCCTAGCAGCTCCAGC
TTCGGCTGCTGCAGAAGCCCGCACTTCCAGTCCCGGCCAATGCCAGCTGCAGTGGCGC
SEQ ID NO:3
>NM_020918.6人线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),转录物变体2,mRNA GCGCCACTGCAGCTGGCATTGGCCGGGACTGGAAGTGCGGGCTTCTGCAGCAGCCGAAGCTGGAGCTGCTAGGCAGCGGCTCCCCTGTTGTATGGACATTCTGCACCCGAAACTGATAGCTGAGTCCTGAAGTTTTATGTTATGAAACAGAAGAACTTTCATCCCAGCACATGATTTGGGAATTACACTTTGTGACATGGATGAATCTGCACTGACCCTTGGTACAATAGATGTTTCTTATCTGCCACATTCATCAGAATACAGTGTTGGTCGATGTAAGCACACAAGTGAGGAATGGGGTGAGTGTGGCTTTAGACCCACCATCTTCAGATCTGCAACTTTAAAATGGAAAGAAAGCCTAATGAGTCGGAAAAGGCCATTTGTTGGAAGATGTTGTTACTCCTGCACTCCCCAGAGCTGGGACAAATTTTTCAACCCCAGTATCCCGTCTTTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAATGAAACTCACACAAGACACCGCGGATGGCTTGCAAGACGCCTTTCTTACGTTCTTTTTATTCAAGAGCGAGATGTGCATAAGGGCATGTTTGCCACCAATGTGACTGAAAATGTGCTGAACAGCAGTAGAGTACAAGAGGCAATTGCAGAAGTGGCTGCTGAATTAAACCCTGATGGTTCTGCCCAGCAGCAATCAAAAGCCGTTAACAAAGTGAAAAAGAAAGCTAAAAGGATTCTTCAAGAAATGGTTGCCACTGTCTCACCGGCAATGATCAGACTGACTGGGTGGGTGCTGCTAAAACTGTTCAACAGCTTCTTTTGGAACATTCAAATTCACAAAGGTCAACTTGAGATGGTTAAAGCTGCAACTGAGACGAATTTGCCGCTTCTGTTTCTACCAGTTCATAGATCCCATATTGACTATCTGCTGCTCACTTTCATTCTCTTCTGCCATAACATCAAAGCACCATACATTGCTTCAGGCAATAATCTCAACATCCCAATCTTCAGTACCTTGATCCATAAGCTTGGGGGCTTCTTCATACGACGAAGGCTCGATGAAACACCAGATGGACGGAAAGATGTTCTCTATAGAGCTTTGCTCCATGGGCATATAGTTGAATTACTTCGACAGCAGCAATTCTTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACACGTTCTAGGAGTGGAAAAACCTCTTGTGCTCGGGCAGGACTTTTGTCAGTTGTGGTAGATACTCTGTCTACCAATGTCATCCCAGACATCTTGATAATACCTGTTGGAATCTCCTATGATCGCATTATCGAAGGTCACTACAATGGTGAACAACTGGGCAAACCTAAGAAGAATGAGAGCCTGTGGAGTGTAGCAAGAGGTGTTATTAGAATGTTACGAAAAAACTATGGTTGTGTCCGAGTGGATTTTGCACAGCCATTTTCCTTAAAGGAATATTTAGAAAGCCAAAGTCAGAAACCGGTGTCTGCTCTACTTTCCCTGGAGCAAGCGTTGTTACCAGCTATACTTCCTTCAAGACCCAGTGATGCTGCTGATGAAGGTAGAGACACGTCCATTAATGAGTCCAGAAATGCAACAGATGAATCCCTACGAAGGAGGTTGATTGCAAATCTGGCTGAGCATATTCTATTCACTGCTAGCAAGTCCTGTGCCATTATGTCCACACACATTGTGGCTTGCCTGCTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATTGATCTCTCCACATTGGTCGAAGACTTCTTTGTGATGAAAGAGGAAGTCCTGGCTCGTGATTTTGACCTGGGGTTCTCAGGAAATTCAGAAGATGTAGTAATGCATGCCATACAGCTGCTGGGAAATTGTGTCACAATCACCCACACTAGCAGGAACGATGAGTTTTTTATCACCCCCAGCACAACTGTCCCATCAGTCTTCGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAGGCCATCATAGCTTGCAGCCTTTATGCAGTTCTGAACAAGAGGGGACTGGGGGGTCCCACTAGCACCCCACCTAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGCGGAAGGCGGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCCAATGAAGGCACCATCTCACTGCCTTGCCAGACATTTTACCAAGTCTGCCATGAAACAGTAGGAAAGTTTATCCAGTATGGCATTCTTACAGTGGCAGAGCACGATGACCAGGAAGATATCAGTCCTAGTCTTGCTGAGCAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCAGAACCTTTGTCTTGGAGAAGTGATGAAGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGGGAGGAACAGCGAGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAATCCAAGGAGCACCAGCAGTTTATCACCTTCTTACAGAGACTCCTTGGGCCTTTGCTGGAGGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTTCACAACTTCAGTGGTCCTGTTCCAGAACCTGAGTATCTGCAAAAGTTGCACAAATACCTAATAACCAGAACAGAAAGAAATGTTGCAGTATATGCTGAGAGTGCCACATATTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGATATTGGGGTTTTCAAGGAGACCAAACAAAAGAGAGTGTCTGTTTTAGAACTGAGCAGCACTTTTCTACCTCAATGCAACCGACAAAAACTTCTAGAATATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGGTAACGTGTGGCACTGCTGGCAAATGAAGGTCATGAGATGAGTTCCTTGTAGGTACCAGCTTCTGGCTCAAGAGTTGAAGGTGCCATCGCAGGGTCAGGCCTGCCCTGTCCCGAAGTGATCTCCTGGAAGACAAGTGCCTTCTCCCTCCATGGATCTGTGATCTTCCCAGCTCTGCATCAACACAGCAGCCTGCAGATAACACTTGGGGGGACCTCAGCCTCTATTCGCAACTCATAATCCGTAGACTACAAGATGAAATCTCAATAAATTATTTTTGAGTTTATTAAAGATTGACATTTTAAGTACAACTTTTAAGGACTAATTACTGTGATGGACACAGAAATGTAGCTGTGTTCTGGAACTGAATCTTACATGGTATACTTAGTGCTGCTGGGTAATTTGTTGGTATATTATCTGGTTAGTGGTTAATGCTTCCTTTAAAAATAATTGAGTCATCCATTCACTCTTTTTCAGTTTTATCTGTCAATAGTAGCTACATTTTTAATGGGAGCACCTTTTATCCCAAAGTGCTTTATAAATTGAGTGGACTGATATATATCACACCCAGGTATCACTGTGCTGTCCTTTGCTGTCAGATTTAGAAATGTTTTTAAGAGCTATGTGAAAACAGACAATATTAGTTTAGGTCGGGAACTGAGATATTGTAATCAAATAGTTAACATCAGGAAGTTAATTTGGCTGGCAAAATTCTAGGGAAACTTGGCCAGAAAACTGGTGTTGAAGGCTTTTGCTCATATAAACAAGTGCCATTGAGTTTCAAATGACCAGCAAATATATTTAGAACCCTTCCTGTTTTATGTCTGTACCTCGTCCACCCCTCAGGTAATACCTGCCTCTCACAGGTACAGCTGTTTCTTGGAAATCCTCCAACCAAATAGCAGTTTTCCTAACTTGATTAGCTTGAGCTGACAGACTGTTAGAATACAGTTCTCTGGCCACAGCTGATGAGGGCTTTCTGTACTGCACACAGATTGTGTACTGCACCCCAGTCCAGGTGACTGGTACCCACTCGAGTTGTGCCGTGCACAACCTGTCCAGTATATGCATGTGGTGGCCCTACTGACTGGTAATGGTTAGAGGCATTTATGGATTTTTAGCTTTGAGGAAAAACCATGACTTTTAACAAATTTTTATGGGTTATATGCCTAAACCCTTATGCCACATAGTGGTAAATAATTATGAAAAATGGTCTGTTCATAATTGGTAGGTGCCTTTTGTGAGCAGGGAGCATAATTATTGGTTTATTATGGTAATTATGGTGATTTTTTAAATATCATGTAATGTTAAAACGTTTTCTAACAGTTTACTGTTGCTTATCTCCAAGATATTATGGAATTAAGAATTTTTCCAGATGAGTGTTACATAGATTCTTTGAATTTAGTATAAAAGTACTGAGAATTAAGTTTGTACTTCCATAAGCTTGGATTTTAAACACTGATAGTATCTCATGAGT AATGTGTGTTTTGGGAGAGGGAGGGATGCTGATTGATATTTCACATTGTATGAAATACCATGTTTGAAACTCATAGCAATAATGCTATGCTGTTGTGATCCCTCTCAAGTTCTGCATTTAAAATATATTTTTTCTTTATAGGAATTGATGTATACCATGAAGTCATTGTCAGTTGTAGTAGCTCTGATGTTGAATGAGATATCATGTTTTAGCATTCCATTTTACTGACTAGGGTAGAAGAACACTTTTCTTGGCTACATTTGGAGGATACCCAGGGAGTCTTGGGTGTTCCTTATCTGGGGAAGCAAACATTTCACTAGTCTCTTTTTTTCATCCTTTAAATTGTAAATTAAGGATTACTCAAGCTCACCATTATTCAAGATTGGGACTCGCTTCCCAGTCGACACTCTGCCCTGCCTGTCATTGCTGCAAAGAGCTGCTGCTTTGCCAACCTAAGCAAAGAAAATACGGCTTCTCTTGCATTATTTTCCCTTTTGGTTGGTTTGTTTTCTAGAAGTACGTTCAGATGCTTTGGGGAATGCAATGTATGATTTGCTAGCTCTCTCACCACTTAACTCACTGTGAGGATAAATATGCATGCTTTTTGTAATTAACTGGTGCTTTGAAAATCTTTTTTAAGGGAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCATCCAGACAAGCTGACCTTTGAGTTAATTTCAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATGACTGAAAACAAAAAACAAAAAAACGAAAGCATCTTCACAATGAAGCTTCCAGATAGCACCGTTTTGCTAAAAGATACATTCTCATTGTTTTCCAACAGTGATGGCTTCCACATAAGGTTAAACAAACTAGGTGCTTGTAAATAATTTATTACAGTTTACTCTATCGCATTTCTGTAACATGAAATGCATGCCCTTCTTCAGGGGAAGACTGTGGTCAAGTTAAAAAAAAAAAACAATATTAAACAACATGAAACTGCAGTCTGTTTTTGAAAATGAGAATGTCCTAAGTGATTCAGAAGAGAGGAGGGAAGTTGTGCACTCTGAAAATGCATGAAAAACAAAGGCAAAAACTAGTGGGAAATGTGTAGAACTGTTAACTGAGATGGCTTCGAGTCTTCCTTCTGGAATCTGTTAAATTTCACAAAGTCATGAGGGTAAATGGAGAAAATATTTCTGGGATTACAATGAATGTAAGCCCAAATTGTGGAATTGCCAGTAACCTGGATGGGGAAAAGCATTTCCCATAGCACTCCATGTAATATGAGTGCTCTGTGAGATGTTCATCAGTGTTTTATAGAAATGGTGTTGCTGGGAAACCAAGTTTGCACCTGGAAACTTACAATGCACTTTAGCGCAGTAAGGGCTTGGCATCCGGTAGTGAAAAACTGTCTAACCCAGCATTGCCCAAACTATTTTGACACCAGGACCTTTTTCTCCTTTGGGATACTTATGAACCTCTCACTAATGTCCTGTGGAGAACATTTTGGGAAACACTATGTTAGATAGTTCTTTAAGGAGACAAAACGGTAATGAACAGATAGCACTGGGGCAGAATATGCATGCATTTTGTAACGTCCAGTGTGGCGTTGAATAGATGTGTATTTCCTCCCCTGCAGAAAATAAGCACAGAAAATTATAATGTAGGTGATCGGAGCTCTTTCCTTTGATAGAGAGAACAGCCCCAATGATCCTGGCTTTTTCACTGAACGTATCAGAATACATGGATGAATTGGGGTAAATAAGGTTTTAATTCAGATCTAGAAGAAAGTATTGTACGTTTGAATGCAGATTTTTATCCACAGATAGTTGTAGTGTTTAGACATGACAGGACCTATCGTTGAGGTTTCTAAGACTTACTATGGGCTGTAAACCTGTTTTTTAAAACTATTTTAGAAACCTGAGACTTGCCGTCTGGCATTTTAGTTTAATACAAACTAATGATTGCATTTGAAAGAGATTCTTGACCTTATTTCTAAACGTCTAGAGCTCTGAAATGTCTTGATGGAAGGTATTAAACTATTTGCCTGTTGTACAAAGAAATGTTAAGACTCGTGAAAAGAATTACTATAAGGTACTGTGAAATAACTGCGATTTTGTGAGCAAAACATACTTGGAAATGCTGATTGATTTTTATGCTTGTTAGTGTATTGCAAGAAACACAGAAAATGTAGTTTTGTTTTAATAAACCAAAAATTGAACATA
SEQ ID NO:4
>SEQ ID NO:3的反向互补序列
TATGTTCAATTTTTGGTTTATTAAAACAAAACTACATTTTCTGTGTTTCTTGCAATACACTAACAAGCATAAAAATC
AATCAGCATTTCCAAGTATGTTTTGCTCACAAAATCGCAGTTATTTCACAGTACCTTATAGTAATTCTTTTCACGAG
TCTTAACATTTCTTTGTACAACAGGCAAATAGTTTAATACCTTCCATCAAGACATTTCAGAGCTCTAGACGTTTAGA
AATAAGGTCAAGAATCTCTTTCAAATGCAATCATTAGTTTGTATTAAACTAAAATGCCAGACGGCAAGTCTCAGGTT
TCTAAAATAGTTTTAAAAAACAGGTTTACAGCCCATAGTAAGTCTTAGAAACCTCAACGATAGGTCCTGTCATGTCT
AAACACTACAACTATCTGTGGATAAAAATCTGCATTCAAACGTACAATACTTTCTTCTAGATCTGAATTAAAACCTT
ATTTACCCCAATTCATCCATGTATTCTGATACGTTCAGTGAAAAAGCCAGGATCATTGGGGCTGTTCTCTCTATCAA
AGGAAAGAGCTCCGATCACCTACATTATAATTTTCTGTGCTTATTTTCTGCAGGGGAGGAAATACACATCTATTCAA
CGCCACACTGGACGTTACAAAATGCATGCATATTCTGCCCCAGTGCTATCTGTTCATTACCGTTTTGTCTCCTTAAA
GAACTATCTAACATAGTGTTTCCCAAAATGTTCTCCACAGGACATTAGTGAGAGGTTCATAAGTATCCCAAAGGAGA
AAAAGGTCCTGGTGTCAAAATAGTTTGGGCAATGCTGGGTTAGACAGTTTTTCACTACCGGATGCCAAGCCCTTACT
GCGCTAAAGTGCATTGTAAGTTTCCAGGTGCAAACTTGGTTTCCCAGCAACACCATTTCTATAAAACACTGATGAAC
ATCTCACAGAGCACTCATATTACATGGAGTGCTATGGGAAATGCTTTTCCCCATCCAGGTTACTGGCAATTCCACAA
TTTGGGCTTACATTCATTGTAATCCCAGAAATATTTTCTCCATTTACCCTCATGACTTTGTGAAATTTAACAGATTC
CAGAAGGAAGACTCGAAGCCATCTCAGTTAACAGTTCTACACATTTCCCACTAGTTTTTGCCTTTGTTTTTCATGCA
TTTTCAGAGTGCACAACTTCCCTCCTCTCTTCTGAATCACTTAGGACATTCTCATTTTCAAAAACAGACTGCAGTTT
CATGTTGTTTAATATTGTTTTTTTTTTTTAACTTGACCACAGTCTTCCCCTGAAGAAGGGCATGCATTTCATGTTAC
AGAAATGCGATAGAGTAAACTGTAATAAATTATTTACAAGCACCTAGTTTGTTTAACCTTATGTGGAAGCCATCACT
GTTGGAAAACAATGAGAATGTATCTTTTAGCAAAACGGTGCTATCTGGAAGCTTCATTGTGAAGATGCTTTCGTTTT
TTTGTTTTTTGTTTTCAGTCATGAGGCACTGAAGAATGAGTTGTGCTGAAATTAACTCAAAGGTCAGCTTGTCTGGA
TGAGCATAACTTTGGTTGAGATTTTTCTCCCTTAAAAAAGATTTTCAAAGCACCAGTTAATTACAAAAAGCATGCAT
ATTTATCCTCACAGTGAGTTAAGTGGTGAGAGAGCTAGCAAATCATACATTGCATTCCCCAAAGCATCTGAACGTAC
TTCTAGAAAACAAACCAACCAAAAGGGAAAATAATGCAAGAGAAGCCGTATTTTCTTTGCTTAGGTTGGCAAAGCAG
CAGCTCTTTGCAGCAATGACAGGCAGGGCAGAGTGTCGACTGGGAAGCGAGTCCCAATCTTGAATAATGGTGAGCTT
GAGTAATCCTTAATTTACAATTTAAAGGATGAAAAAAAGAGACTAGTGAAATGTTTGCTTCCCCAGATAAGGAACAC
CCAAGACTCCCTGGGTATCCTCCAAATGTAGCCAAGAAAAGTGTTCTTCTACCCTAGTCAGTAAAATGGAATGCTAA
AACATGATATCTCATTCAACATCAGAGCTACTACAACTGACAATGACTTCATGGTATACATCAATTCCTATAAAGAA
AAAATATATTTTAAATGCAGAACTTGAGAGGGATCACAACAGCATAGCATTATTGCTATGAGTTTCAAACATGGTAT
TTCATACAATGTGAAATATCAATCAGCATCCCTCCCTCTCCCAAAACACACATTACTCATGAGATACTATCAGTGTT
TAAAATCCAAGCTTATGGAAGTACAAACTTAATTCTCAGTACTTTTATACTAAATTCAAAGAATCTATGTAACACTC
ATCTGGAAAAATTCTTAATTCCATAATATCTTGGAGATAAGCAACAGTAAACTGTTAGAAAACGTTTTAACATTACA
TGATATTTAAAAAATCACCATAATTACCATAATAAACCAATAATTATGCTCCCTGCTCACAAAAGGCACCTACCAAT
TATGAACAGACCATTTTTCATAATTATTTACCACTATGTGGCATAAGGGTTTAGGCATATAACCCATAAAAATTTGT
TAAAAGTCATGGTTTTTCCTCAAAGCTAAAAATCCATAAATGCCTCTAACCATTACCAGTCAGTAGGGCCACCACAT
GCATATACTGGACAGGTTGTGCACGGCACAACTCGAGTGGGTACCAGTCACCTGGACTGGGGTGCAGTACACAATCT
GTGTGCAGTACAGAAAGCCCTCATCAGCTGTGGCCAGAGAACTGTATTCTAACAGTCTGTCAGCTCAAGCTAATCAA
GTTAGGAAAACTGCTATTTGGTTGGAGGATTTCCAAGAAACAGCTGTACCTGTGAGAGGCAGGTATTACCTGAGGGG
TGGACGAGGTACAGACATAAAACAGGAAGGGTTCTAAATATATTTGCTGGTCATTTGAAACTCAATGGCACTTGTTT
ATATGAGCAAAAGCCTTCAACACCAGTTTTCTGGCCAAGTTTCCCTAGAATTTTGCCAGCCAAATTAACTTCCTGAT
GTTAACTATTTGATTACAATATCTCAGTTCCCGACCTAAACTAATATTGTCTGTTTTCACATAGCTCTTAAAAACAT
TTCTAAATCTGACAGCAAAGGACAGCACAGTGATACCTGGGTGTGATATATATCAGTCCACTCAATTTATAAAGCAC
TTTGGGATAAAAGGTGCTCCCATTAAAAATGTAGCTACTATTGACAGATAAAACTGAAAAAGAGTGAATGGATGACT
CAATTATTTTTAAAGGAAGCATTAACCACTAACCAGATAATATACCAACAAATTACCCAGCAGCACTAAGTATACCA
TGTAAGATTCAGTTCCAGAACACAGCTACATTTCTGTGTCCATCACAGTAATTAGTCCTTAAAAGTTGTACTTAAAA
TGTCAATCTTTAATAAACTCAAAAATAATTTATTGAGATTTCATCTTGTAGTCTACGGATTATGAGTTGCGAATAGA
GGCTGAGGTCCCCCCAAGTGTTATCTGCAGGCTGCTGTGTTGATGCAGAGCTGGGAAGATCACAGATCCATGGAGGG
AGAAGGCACTTGTCTTCCAGGAGATCACTTCGGGACAGGGCAGGCCTGACCCTGCGATGGCACCTTCAACTCTTGAG
CCAGAAGCTGGTACCTACAAGGAACTCATCTCATGACCTTCATTTGCCAGCAGTGCCACACGTTACCTACAGCACCA
CAAAACTCAGAATATATTCTAGAAGTTTTTGTCGGTTGCATTGAGGTAGAAAAGTGCTGCTCAGTTCTAAAACAGAC
ACTCTCTTTTGTTTGGTCTCCTTGAAAACCCCAATATCCTTAAACATTTTCACAGCATTCTTCACAAGACAATATGT
GGCACTCTCAGCATATACTGCAACATTTCTTTCTGTTCTGGTTATTAGGTATTTGTGCAACTTTTGCAGATACTCAG
GTTCTGGAACAGGACCACTGAAGTTGTGAACAAAGATGGCAGCAGAGCTGTAGGCCTCCAGCAAAGGCCCAAGGAGT
CTCTGTAAGAAGGTGATAAACTGCTGGTGCTCCTTGGATTGGCTCACCTTCAGGTAGCAATCTCGCTGTTCCTCCCC
AAAGTCACTGTCTTCATCTTCTTCATCACTTCTCCAAGACAAAGGTTCTGGAAGCTTCTTGTCCCACTGCTGCTCAG
CAAGACTAGGACTGATATCTTCCTGGTCATCGTGCTCTGCCACTGTAAGAATGCCATACTGGATAAACTTTCCTACT
GTTTCATGGCAGACTTGGTAAAATGTCTGGCAAGGCAGTGAGATGGTGCCTTCATTGGAGAGAAGGTAGCACAGGCT
GGCCGCCTTCCGCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTAGGTGGGGTGCTAGTGGGACCCCCCAGTCCCCTCTTGT
TCAGAACTGCATAAAGGCTGCAAGCTATGATGGCCTCCATGATAAAGACATGAAGTACCCCATTGCTGTAGAAGTTG
AGTTCGAAGACTGATGGGACAGTTGTGCTGGGGGTGATAAAAAACTCATCGTTCCTGCTAGTGTGGGTGATTGTGAC
ACAATTTCCCAGCAGCTGTATGGCATGCATTACTACATCTTCTGAATTTCCTGAGAACCCCAGGTCAAAATCACGAG
CCAGGACTTCCTCTTTCATCACAAAGAAGTCTTCGACCAATGTGGAGAGATCAATTCCCTGCCTGTGTCTGTAGAGG
AGCAGGCAAGCCACAATGTGTGTGGACATAATGGCACAGGACTTGCTAGCAGTGAATAGAATATGCTCAGCCAGATT
TGCAATCAACCTCCTTCGTAGGGATTCATCTGTTGCATTTCTGGACTCATTAATGGACGTGTCTCTACCTTCATCAG
CAGCATCACTGGGTCTTGAAGGAAGTATAGCTGGTAACAACGCTTGCTCCAGGGAAAGTAGAGCAGACACCGGTTTC
TGACTTTGGCTTTCTAAATATTCCTTTAAGGAAAATGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACACAACCATAGTTTTTTCG
TAACATTCTAATAACACCTCTTGCTACACTCCACAGGCTCTCATTCTTCTTAGGTTTGCCCAGTTGTTCACCATTGT
AGTGACCTTCGATAATGCGATCATAGGAGATTCCAACAGGTATTATCAAGATGTCTGGGATGACATTGGTAGACAGA
GTATCTACCACAACTGACAAAAGTCCTGCCCGAGCACAAGAGGTTTTTCCACTCCTAGAACGTGTGCCTTCCAGGAA
GATCTCCAAGAATTGCTGCTGTCGAAGTAATTCAACTATATGCCCATGGAGCAAAGCTCTATAGAGAACATCTTTCC
GTCCATCTGGTGTTTCATCGAGCCTTCGTCGTATGAAGAAGCCCCCAAGCTTATGGATCAAGGTACTGAAGATTGGG
ATGTTGAGATTATTGCCTGAAGCAATGTATGGTGCTTTGATGTTATGGCAGAAGAGAATGAAAGTGAGCAGCAGATA
GTCAATATGGGATCTATGAACTGGTAGAAACAGAAGCGGCAAATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTAACCATCTCAAGTT
GACCTTTGTGAATTTGAATGTTCCAAAAGAAGCTGTTGAACAGTTTTAGCAGCACCCACCCAGTCAGTCTGATCATT
GCCGGTGAGACAGTGGCAACCATTTCTTGAAGAATCCTTTTAGCTTTCTTTTTCACTTTGTTAACGGCTTTTGATTG
CTGCTGGGCAGAACCATCAGGGTTTAATTCAGCAGCCACTTCTGCAATTGCCTCTTGTACTCTACTGCTGTTCAGCA
CATTTTCAGTCACATTGGTGGCAAACATGCCCTTATGCACATCTCGCTCTTGAATAAAAAGAACGTAAGAAAGGCGT
CTTGCAAGCCATCCGCGGTGTCTTGTGTGAGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAAAGACGGGATACT
GGGGTTGAAAAATTTGTCCCAGCTCTGGGGAGTGCAGGAGTAACAACATCTTCCAACAAATGGCCTTTTCCGACTCA
TTAGGCTTTCTTTCCATTTTAAAGTTGCAGATCTGAAGATGGTGGGTCTAAAGCCACACTCACCCCATTCCTCACTT
GTGTGCTTACATCGACCAACACTGTATTCTGATGAATGTGGCAGATAAGAAACATCTATTGTACCAAGGGTCAGTGC
AGATTCATCCATGTCACAAAGTGTAATTCCCAAATCATGTGCTGGGATGAAAGTTCTTCTGTTTCATAACATAAAAC
TTCAGGACTCAGCTATCAGTTTCGGGTGCAGAATGTCCATACAACAGGGGAGCCGCTGCCTAGCAGCTCCAGCTTCG
GCTGCTGCAGAAGCCCGCACTTCCAGTCCCGGCCAATGCCAGCTGCAGTGGCGC
SEQ ID NO:5
>NM_008149.4小鼠线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),转录物变体1,mRNA GGCGCGCCGCTGCAGCAGGCGCAGAGCCGAAGCGCTGGCAGCTGCGTGCGCCCAGGCGCGAGCTGCCGGGCGGGTGGAGAGGAGCGCGGTGCGCTGTGCGCGGTGCGGGCTGCGGCTGCAGACGCCGCTGGGCCGGAGCGCGGGGTCAGCACATGGTTTGGGACTTGCACGTTCTGCCATGGAGGAGTCTTCAGTGACAGTTGGCACAATAGACGTTTCTTATCTGCCCAGTTCATCGGAATACAGCCTTGGCCGATGTAAACACACCAGTGAGGACTGGGTTGACTGTGGGTTCAAACCTACCTTCT
TCAGATCTGCAACACTGAAATGGAAGGAGAGCCTTATGAGCCGGAAGAGGCCCTTCGTGGGAAGGTGCTGCTATTCC
TGCACGCCACAGAGCTGGGAAAGGTTTTTCAACCCCAGTATCCCATCTCTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAA
TGAAACGCACACAAGGCACAGAGGATGGCTGGCGAGACGGCTGTCTTACATCCTTTTTGTTCAAGAGCGAGACGTCC
ATAAGGGCATGTTTGCCACCAGTGTTACTGAGAATGTACTGAGCAGCAGCAGAGTCCAAGAGGCAATTGCTGAAGTG
GCTGCGGAGTTGAACCCAGATGGATCTGCCCAGCAGCAGTCCAAAGCCATCCAGAAGGTGAAAAGGAAAGCCAGGAA
GATCCTCCAGGAGATGGTCGCCACCGTCTCCCCAGGGATGATCAGGCTGACTGGCTGGGTGTTACTAAAGCTCTTCA
ACAGCTTCTTCTGGAACATTCAGATTCACAAGGGTCAACTCGAGATGGTCAAGGCTGCAACTGAGACGAACCTGCCG
CTCTTGTTTCTGCCGGTGCACAGATCCCACATTGACTACCTGTTGCTCACCTTCATCCTCTTTTGCCACAACATCAA
GGCGCCGTACATCGCCTCGGGCAATAATCTCAACATCCCCGTCTTCAGTACCTTGATTCACAAGCTTGGGGGCTTTT
TCATAAGACGGAGGCTCGATGAAACCCCAGATGGACGCAAAGACATTCTGTACAGAGCGTTGCTCCATGGGCATGTA
GTTGAACTCCTCCGACAGCAGCAGTTCCTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACCCGCTCCCGCAGTGGCAAGACCTCCTG
TGCCCGGGCAGGGCTCCTCTCAGTGGTAGTGGATACTCTGTCGTCCAACACCATCCCCGACATCCTCGTCATACCCG
TGGGCATCTCGTATGATCGCATAATCGAAGGTCACTACAATGGCGAACAGTTGGGAAAGCCCAAGAAGAACGAGAGC
CTCTGGAGTGTGGCGAGAGGCGTTATCAGAATGCTGCGGAAAAACTACGGCTACGTCCGAGTGGATTTTGCACAGCC
ATTTTCCTTGAAGGAATATTTAGAAGGCCAGAGTCAGAAACCTGTATCTGCCCCCCTTTCTCTGGAGCAAGCACTGT
TACCAGCGATCCTTCCTTCAAGACCGAATGATGTTGCTGATGAACATCAAGACCTATCCAGTAACGAGTCCAGAAAC
CCAGCAGACGAAGCCTTCCGACGAAGGCTGATTGCAAACCTGGCTGAGCACATTCTCTTCACCGCCAGCAAGTCCTG
CGCTATCATGTCCACCCACATTGTGGCCTGTCTGCTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATCCATCTCTCCACGCTTG
TGGAAGACTTCTTTGTGATGAAGGAGGAAGTCCTAGCTCGCGATTTCGACCTAGGCTTCTCCGGGAATTCAGAAGAT
GTCGTCATGCATGCTATTCAGCTTCTGGGGAACTGTGTCACAATCACCCACACGAGCAGGAAAGATGAGTTTTTTAT
TACTCCCAGCACAACTGTCCCGTCAGTCTTTGAACTCAACTTCTACAGCAATGGCGTACTTCATGTGTTCATCATGG
AAGCCATCATAGCTTGCAGCATCTATGCAGTCCTGAATAAGAGGTGCTCTGGAGGGTCCGCTGGAGGCCTCGGCAAC
CTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGAGGAAGGCCGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCTAACGAAGGTACCATTTCTCT
GCCCTGCCAGACTTTTTACCAAGTTTGTCATGAGACAGTTGGCAAGTTCATCCAGTATGGCATTCTCACAGTGGCAG
AGCAAGATGACCAGGAAGATGTCAGTCCTGGCCTTGCAGAACAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCGGAACTGAACTGG
AGAAGTGACGAGGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGTGAGGAGCAGCGAGATTGCTATCTCAAGGTGAGCCAGTCCAA
GGAGCACCAGCAATTCATCACCTTTCTTCAGAGGCTTCTAGGTCCCCTGCTAGAAGCCTACAGCTCTGCTGCCATCT
TTGTCCACAACTTCAGCGGTCCAGTTCCCGAGTCTGAGTACCTGCAGAAACTGCACAGGTACCTTATCACCAGGACG
GAAAGGAACGTTGCCGTGTACGCTGAGAGTGCCACATACTGTCTCGTGAAGAACGCTGTGAAAATGTTTAAGGACAT
CGGGGTTTTCAAAGAGACCAAGCAAAAGCGAGTGTCTGTTCTAGAACTGAGCAGTACTTTCCTACCTCAGTGCAACC
GGCAGAAACTCCTAGAGTATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGCGATCTCTCAGCACCTATCTCGAGCGAGGAGCT
GATGAGTCCCTTGCAGCCTCCAGTCTGACCCAGAGTGGCAGGTATCCTGGCATGGCCCAGCCTGCCCTACCCCGAGG
AGACTTCCAGGAAGACACGTGCCTTCTGCCCCCGTGGACCTGCGCTCCTCCCAACACAGACGCAGTGGCCTGCGCAG
AGCACTCAGGGCCAGTGCCATCTGTGATTCATGATCACTAGGTTATAGGTGAAATCTCAGTAAGTTATTTTGGAGTT
TATTAAAGGTTCACATTTTAAGTACAACTTTTCAGGCTAGTTACTGTGATGGACATTGAGGTGTTTGTAGAACTGAC
TCTTATATAGTAAGTAATAATGTTTCCTTTAAAATAATTGGGCCATCCATTCTCTGTCTCCATTATCGCTGTCAACA
GAAGTTATGGTTTGTATGTGAGCCCTTTCCTCTCAACTGCTTTACTAAGGAGCAATGTTGTCCTGCGCCGGCACACT
CAAGATGTATCTGAGTAGCTGCCTGAAAGCAGATGACACTGCAGTCAGGAGGTGAGAGGCTGAGGAAAGAGCCAGCA
TCAGGAGGTGACTCTGGTTGGCAAGGGTGAGCTGTGCTTGGCCAGGAAGGTGGCATTAAAGGCTGTGCTCACGTGAC
AAGAGTGCCTTTGAGCTGTAATGACCAGTGTTTAGAGTCCCTGTTGCTGATACCTTTGAGTGATTGACACCTGCTGC
TTTTGAGGAGCTCGGCTGCAGTGATCACTGGCGTGTGGCACTCTGGCTACAAACTGCTGACCCAGGGGTTCCAGACA
CTGCTCACTCACTGGGTGCTGTGCTGTGGCTAGTGTATGGCTTGTACCCAGATGGCGCACTGTGCAGCCTGTGTAGC
ATGCACAGTGACCCAGCTGAGTGGCAGGTGGTTGGAGGCAAGGACATTTATGTGGGCCACATACCCAAACTTCCTGC
CATGTAAAGGCGAGTGATTGTGAAAGCACCTCTGTTGTAGTGGGTAGGTGCCTTTCTCATGAGCGGGGAGCATAACT
GTTAGTTATTTGTGGTGATTATGGCAGATTTCAAGATCACGTGACAATGCAGTCTCTAATTGTTCACTGTCCATATA
TATGATTTTACGGAATTATGAATTTTTCTGATGAGTGTTGTATAGATGATTTGAATTGATAAAAGTATTAGGGATGA
GGTTTGTACTTTCCTGAACTTGAATTTCAAACACTAACTGTATCCTATGAGTGACGTGTGTGTTGGGGGAGGGTGGG
CCTGCCTGGTGTTACACAGAGCATGGCGTGGCTGGTCTGGAGCGCATAGCAATAATACTGTGCTGTGGTGACCTCCG
CCCTTGCCTTGTGCATGTCACACCTCCTTTTCCTTTGCTTCACTTCTGTCAACTGTAGCGACTTTGGTGTGCAGTGA
GATGCTCACCTTTAGCCTCTGCTCCCCTAACTAGGCTGGCACTTCCCTTGGCTGTACTTGGGGGACACCCAGAGAGG
CTGGTGTACTCCCTTGGGTTTATCTGTGGGGACTCAAGCATTTTATTGGTCTCTGTTTTTTTTTTTTTCCCTCTAAA
TGGAAACTGTAGGTGGCTTCCTCTGATCTGTCTGCCAGTGGGTGTTGCTGCCCTGCTTGTCAGCTCTGCAAATGAGC
GCTGCTCCCCAGCTTGCGCAGAGACGTGTGCGTCCCACGTCCCTTGCCGTGCTCTCCCTTTTGGTAGGTGTTACTTT
AAGAACTGCAGTCAGACTTGCTGTTGCCTGACAATTAACTCACTGTGAGGATAGGCACGCACGCTTTTCATAATTAA
CTGGTGCTTTGAAACCTTTCTTATGGAAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCTTCCTGACAAGCTGACCCTTGAG
TTAATTTTAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATTATGAAAGACAAAAAGCATCACAATAAGGCTTCCAGGTAGCC
CTGTTCCCTAATAGAAACATTCCCCTTGTTTTCCAGCAGTGGGTGGCTTCCTCGAACGATTAAACAAACTAGGTGCT
TGTATATAATTTATTACAGTTTACTCTACTGCATTTCTGTCAAGTTGAAATGCATGCCCTTCAGGGGAAGACTGTGA
GTCAAGTTTAATAAATAAAAACCTAATACTAAGCAATATGAAGCTGCACTCTGCTTTTAAGTGAGGCCAAGCCAAGT
AAGCCAGAGGGGGAGGGGCATTTGCTTTCCAAATCCTAAGGAAAAATGAAGGCAAAACAAGTGTTATGTCCATTCAG
CCAGGAACACACTCTAGCCTTCCTGACTCTCTTAAACTGTGGACGTCAGGAGGCCGAATGCAGAAAAGTATATCTGG
GATGGATGGCAGGGAATAGAAGCTAGGACTGGAGTTCCTGTCCTGCCGCCTTGGTTCCTGCAGTATCGTGATGCCCT
GAGATGGGGATCCGTGGGAACATGCAGTGCCCTGCAGTGCCCTGCGGTGCGGACAGGACTGCATCTGATAGTACACA
GACTGATGCACGTAGCATTTCCCAAACTGTTTGGACCTCAGGACCTTTTCCCCTCTGGGACACTGCATGCCGTGGAA
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CAGTGCCTTCCTCATGAAGGATCTACCACAACCCTGGCCTTTTTAAAACTGAGAGTAGCAGAATTAATAGAGAAATT
AAAAAATTAAAATTGGGGTAAATAATAAAGGTTTTAATTCAGATCTAGAAGAAAACTGCACAGTTGAATGCAGATTT
TTATCCATAGATAACTGTAGTGTTTTGAAATGATAGGCCCTACCTTTGAAGTTTCTAAGACTTATTATGGGATGTAA
ATCTGTTTTTTAAAAACACTTTTTAGGGGCTTGAGAGCTGCCACCTGGCATTTAGTTTAGTGCGGCCAGTGACTGCT
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ACACTGCCTTGGAAATGTTGACTGACGTTTATGCCTGGTGATAGCATGTCCCGAGAAGCATGGACATGGAGTTTTGT
TTTAATAAACCAGAAAAAAAAAACCCG
SEQ ID NO:6
>SEQ ID NO:5的反向互补序列
CGGGTTTTTTTTTTCTGGTTTATTAAAACAAAACTCCATGTCCATGCTTCTCGGGACATGCTATCACCAGGCATAAA
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TGGGAAGCAAGGTCAGAAGTCTCTTGAAGCAGTCACTGGCCGCACTAAACTAAATGCCAGGTGGCAGCTCTCAAGCC
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ACAGATAAACCCAAGGGAGTACACCAGCCTCTCTGGGTGTCCCCCAAGTACAGCCAAGGGAAGTGCCAGCCTAGTTA
GGGGAGCAGAGGCTAAAGGTGAGCATCTCACTGCACACCAAAGTCGCTACAGTTGACAGAAGTGAAGCAAAGGAAAA
GGAGGTGTGACATGCACAAGGCAAGGGCGGAGGTCACCACAGCACAGTATTATTGCTATGCGCTCCAGACCAGCCAC
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AAATTCAAGTTCAGGAAAGTACAAACCTCATCCCTAATACTTTTATCAATTCAAATCATCTATACAACACTCATCAG
AAAAATTCATAATTCCGTAAAATCATATATATGGACAGTGAACAATTAGAGACTGCATTGTCACGTGATCTTGAAAT
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GCTTTCACAATCACTCGCCTTTACATGGCAGGAAGTTTGGGTATGTGGCCCACATAAATGTCCTTGCCTCCAACCAC
CTGCCACTCAGCTGGGTCACTGTGCATGCTACACAGGCTGCACAGTGCGCCATCTGGGTACAAGCCATACACTAGCC
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TGGTCATTACAGCTCAAAGGCACTCTTGTCACGTGAGCACAGCCTTTAATGCCACCTTCCTGGCCAAGCACAGCTCA
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AAGGGCTCACATACAAACCATAACTTCTGTTGACAGCGATAATGGAGACAGAGAATGGATGGCCCAATTATTTTAAA
GGAAACATTATTACTTACTATATAAGAGTCAGTTCTACAAACACCTCAATGTCCATCACAGTAACTAGCCTGAAAAG
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TCACAGATGGCACTGGCCCTGAGTGCTCTGCGCAGGCCACTGCGTCTGTGTTGGGAGGAGCGCAGGTCCACGGGGGC
AGAAGGCACGTGTCTTCCTGGAAGTCTCCTCGGGGTAGGGCAGGCTGGGCCATGCCAGGATACCTGCCACTCTGGGT
CAGACTGGAGGCTGCAAGGGACTCATCAGCTCCTCGCTCGAGATAGGTGCTGAGAGATCGCTACAGCACCACAAAAC
TCAGAATATACTCTAGGAGTTTCTGCCGGTTGCACTGAGGTAGGAAAGTACTGCTCAGTTCTAGAACAGACACTCGC
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GACTGACATCTTCCTGGTCATCTTGCTCTGCCACTGTGAGAATGCCATACTGGATGAACTTGCCAACTGTCTCATGA
CAAACTTGGTAAAAAGTCTGGCAGGGCAGAGAAATGGTACCTTCGTTAGAGAGAAGGTAGCACAGGCTGGCGGCCTT
CCTCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTGCCGAGGCCTCCAGCGGACCCTCCAGAGCACCTCTTATTCAGGACTG
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CAGAAGCTGAATAGCATGCATGACGACATCTTCTGAATTCCCGGAGAAGCCTAGGTCGAAATCGCGAGCTAGGACTT
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CCTTCTAAATATTCCTTCAAGGAAAATGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACGTAGCCGTAGTTTTTCCGCAGCATTCT
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CGATTATGCGATCATACGAGATGCCCACGGGTATGACGAGGATGTCGGGGATGGTGTTGGACGACAGAGTATCCACT
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GAATCTGAATGTTCCAGAAGAAGCTGTTGAAGAGCTTTAGTAACACCCAGCCAGTCAGCCTGATCATCCCTGGGGAG
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AGATCCATCTGGGTTCAACTCCGCAGCCACTTCAGCAATTGCCTCTTGGACTCTGCTGCTGCTCAGTACATTCTCAG
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AAACCTTTCCCAGCTCTGTGGCGTGCAGGAATAGCAGCACCTTCCCACGAAGGGCCTCTTCCGGCTCATAAGGCTCT
CCTTCCATTTCAGTGTTGCAGATCTGAAGAAGGTAGGTTTGAACCCACAGTCAACCCAGTCCTCACTGGTGTGTTTA
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CATGGCAGAACGTGCAAGTCCCAAACCATGTGCTGACCCCGCGCTCCGGCCCAGCGGCGTCTGCAGCCGCAGCCCGC
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TGAAGGAGGAAGTCCTAGCTCGCGATTTCGACCTAGGCTTCTCCGGGAATTCAGAAGATGTCGTCATGCATGCTATTCAGCTTCTGGGGAACTGTGTCACAATCACCCACACGAGCAGGAAAGATGAGTTTTTTATTACTCCCAGCACAACTGTCCCGTCAGTCTTTGAACTCAACTTCTACAGCAATGGCGTACTTCATGTGTTCATCATGGAAGCCATCATAGCTTGCAGCATCTATGCAGTCCTGAATAAGAGGTGCTCTGGAGGGTCCGCTGGAGGCCTCGGCAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGAGGAAGGCCGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCTAACGAAGGTACCATTTCTCTGCCCTGCCAGACTTTTTACCAAGTTTGTCATGAGACAGTTGGCAAGTTCATCCAGTATGGCATTCTCACAGTGGCAGAGCAAGATGACCAGGAAGATGTCAGTCCTGGCCTTGCAGAACAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCGGAACTGAACTGGAGAAGTGACGAGGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGTGAGGAGCAGCGAGATTGCTATCTCAAGGTGAGCCAGTCCAAGGAGCACCAGCAATTCATCACCTTTCTTCAGAGGCTTCTAGGTCCCCTGCTAGAAGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTCCACAACTTCAGCGGTCCAGTTCCCGAGTCTGAGTACCTGCAGAAACTGCACAGGTACCTTATCACCAGGACGGAAAGGAACGTTGCCGTGTACGCTGAGAGTGCCACATACTGTCTCGTGAAGAACGCTGTGAAAATGTTTAAGGACATCGGGGTTTTCAAAGAGACCAAGCAAAAGCGAGTGTCTGTTCTAGAACTGAGCAGTACTTTCCTACCTCAGTGCAACCGGCAGAAACTCCTAGAGTATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGCGATCTCTCAGCACCTATCTCGAGCGAGGAGCTGATGAGTCCCTTGCAGCCTCCAGTCTGACCCAGAGTGGCAGGTATCCTGGCATGGCCCAGCCTGCCCTACCCCGAGGAGACTTCCAGGAAGACACGTGCCTTCTGCCCCCGTGGACCTGCGCTCCTCCCAACACAGACGCAGTGGCCTGCGCAGAGCACTCAGGGCCAGTGCCATCTGTGATTCATGATCACTAGGTTATAGGTGAAATCTCAGTAAGTTATTTTGGAGTTTATTAAAGGTTCACATTTTAAGTACAACTTTTCAGGCTAGTTACTGTGATGGACATTGAGGTGTTTGTAGAACTGACTCTTATATAGTAAGTAATAATGTTTCCTTTAAAATAATTGGGCCATCCATTCTCTGTCTCCATTATCGCTGTCAACAGAAGTTATGGTTTGTATGTGAGCCCTTTCCTCTCAACTGCTTTACTAAGGAGCAATGTTGTCCTGCGCCGGCACACTCAAGATGTATCTGAGTAGCTGCCTGAAAGCAGATGACACTGCAGTCAGGAGGTGAGAGGCTGAGGAAAGAGCCAGCATCAGGAGGTGACTCTGGTTGGCAAGGGTGAGCTGTGCTTGGCCAGGAAGGTGGCATTAAAGGCTGTGCTCACGTGACAAGAGTGCCTTTGAGCTGTAATGACCAGTGTTTAGAGTCCCTGTTGCTGATACCTTTGAGTGATTGACACCTGCTGCTTTTGAGGAGCTCGGCTGCAGTGATCACTGGCGTGTGGCACTCTGGCTACAAACTGCTGACCCAGGGGTTCCAGACACTGCTCACTCACTGGGTGCTGTGCTGTGGCTAGTGTATGGCTTGTACCCAGATGGCGCACTGTGCAGCCTGTGTAGCATGCACAGTGACCCAGCTGAGTGGCAGGTGGTTGGAGGCAAGGACATTTATGTGGGCCACATACCCAAACTTCCTGCCATGTAAAGGCGAGTGATTGTGAAAGCACCTCTGTTGTAGTGGGTAGGTGCCTTTCTCATGAGCGGGGAGCATAACTGTTAGTTATTTGTGGTGATTATGGCAGATTTCAAGATCACGTGACAATGCAGTCTCTAATTGTTCACTGTCCATATATATGATTTTACGGAATTATGAATTTTTCTGATGAGTGTTGTATAGATGATTTGAATTGATAAAAGTATTAGGGATGAGGTTTGTACTTTCCTGAACTTGAATTTCAAACACTAACTGTATCCTATGAGTGACGTGTGTGTTGGGGGAGGGTGGGCCTGCCTGGTGTTACACAGAGCATGGCGTGGCTGGTCTGGAGCGCATAGCAATAATACTGTGCTGTGGTGACCTCCGCCCTTGCCTTGTGCATGTCACACCTCCTTTTCCTTTGCTTCACTTCTGTCAACTGTAGCGACTTTGGTGTGCAGTGAGATGCTCACCTTTAGCCTCTGCTCCCCTAACTAGGCTGGCACTTCCCTTGGCTGTACTTGGGGGACACCCAGAGAGGCTGGTGTACTCCCTTGGGTTTATCTGTGGGGACTCAAGCATTTTATTGGTCTCTGTTTTTTTTTTTTTCCCTCTAAATGGAAACTGTAGGTGGCTTCCTCTGATCTGTCTGCCAGTGGGTGTTGCTGCCCTGCTTGTCAGCTCTGCAAATGAGCGCTGCTCCCCAGCTTGCGCAGAGACGTGTGCGTCCCACGTCCCTTGCCGTGCTCTCCCTTTTGGTAGGTGTTACTTTAAGAACTGCAGTCAGACTTGCTGTTGCCTGACAATTAACTCACTGTGAGGATAGGCACGCACGCTTTTCATAATTAACTGGTGCTTTGAAACCTTTCTTATGGAAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCTTCCTGACAAGCTGACCCTTGAGTTAATTTTAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATTATGAAAGACAAAAAGCATCACAATAAGGCTTCCAGGTAGCCCTGTTCCCTAATAGAAACATTCCCCTTGTTTTCCAGCAGTGGGTGGCTTCCTCGAACGATTAAACAAACTAGGTGCTTGTATATAATTTATTACAGTTTACTCTACTGCATTTCTGTCAAGTTGAAATGCATGCCCTTCAGGGGAAGACTGTGAGTCAAGTTTAATAAATAAAAACCTAATACTAAGCAATATGAAGCTGCACTCTGCTTTTAAGTGAGGCCAAGCCAAGTAAGCCAGAGGGGGAGGGGCATTTGCTTTCCAAATCCTAAGGAAAAATGAAGGCAAAACAAGTGTTATGTCCATTCAGCCAGGAACACACTCTAGCCTTCCTGACTCTCTTAAACTGTGGACGTCAGGAGGCCGAATGCAGAAAAGTATATCTGGGATGGATGGCAGGGAATAGAAGCTAGGACTGGAGTTCCTGTCCTGCCGCCTTGGTTCCTGCAGTATCGTGATGCCCTGAGATGGGGATCCGTGGGAACATGCAGTGCCCTGCAGTGCCCTGCGGTGCGGACAGGACTGCATCTGATAGTACACAGACTGATGCACGTAGCATTTCCCAAACTGTTTGGACCTCAGGACCTTTTCCCCTCTGGGACACTGCATGCCGTGGAAAACCTTTTCAGAAACTACATTCATTGTTCTTTAAGCAGACCAAAAGTCACAACAGTGGCAGGCAGGCTGCATGCTTTTTGTATCGCTCACGATGCACTGTGGTGTGCTCGGGTATCTTTCCTCACTGGAGAGAGCAAGCACAGGAAGCTGGCTGCAGTGCCTTCCTCATGAAGGATCTACCACAACCCTGGCCTTTTTAAAACTGAGAGTAGCAGAATTAATAGAGAAATTAAAAAATTAAAATTGGGGTAAATAATAAAGGTTTTAATTCAGATCTAGAAGAAAACTGCACAGTTGAATGCAGATTTTTATCCATAGATAACTGTAGTGTTTTGAAATGATAGGCCCTACCTTTGAAGTTTCTAAGACTTATTATGGGATGTAAATCTGTTTTTTAAAAACACTTTTTAGGGGCTTGAGAGCTGCCACCTGGCATTTAGTTTAGTGCGGCCAGTGACTGCTTCAAGAGACTTCTGACCTTGCTTCCCAACAGCTAAAGGGCTAACTGTCTTTATGGAAGGCACTTGTTACAGTATTTGCCCATTGTACAGAGCAATGCTACATTGTTGTAAAAAGAATTGCTATTGTAAAAAAGCACTGTGTGACTTTGTGAAGGACACTGCCTTGGAAATGTTGACTGACGTTTATGCCTGGTGATAGCATGTCCCGAGAAGCATGGACATGGAGTTTTGTTTTAATAAACCAGAAAAAAAAAACCCG
SEQ ID NO:8
>SEQ ID NO:7的反向互补序列
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CAAAACACTACAGTTATCTATGGATAAAAATCTGCATTCAACTGTGCAGTTTTCTTCTAGATCTGAATTAAAACCTT
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GGTAGATCCTTCATGAGGAAGGCACTGCAGCCAGCTTCCTGTGCTTGCTCTCTCCAGTGAGGAAAGATACCCGAGCA
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GTTTGGGAAATGCTACGTGCATCAGTCTGTGTACTATCAGATGCAGTCCTGTCCGCACCGCAGGGCACTGCAGGGCA
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GTCAGGAAGGCTAGAGTGTGTTCCTGGCTGAATGGACATAACACTTGTTTTGCCTTCATTTTTCCTTAGGATTTGGA
AAGCAAATGCCCCTCCCCCTCTGGCTTACTTGGCTTGGCCTCACTTAAAAGCAGAGTGCAGCTTCATATTGCTTAGT
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AGAGTAAACTGTAATAAATTATATACAAGCACCTAGTTTGTTTAATCGTTCGAGGAAGCCACCCACTGCTGGAAAAC
AAGGGGAATGTTTCTATTAGGGAACAGGGCTACCTGGAAGCCTTATTGTGATGCTTTTTGTCTTTCATAATGAGGCA
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TCCATAAGAAAGGTTTCAAAGCACCAGTTAATTATGAAAAGCGTGCGTGCCTATCCTCACAGTGAGTTAATTGTCAG
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ACAGATAAACCCAAGGGAGTACACCAGCCTCTCTGGGTGTCCCCCAAGTACAGCCAAGGGAAGTGCCAGCCTAGTTA
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GGAGGTGTGACATGCACAAGGCAAGGGCGGAGGTCACCACAGCACAGTATTATTGCTATGCGCTCCAGACCAGCCAC
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AAAAATTCATAATTCCGTAAAATCATATATATGGACAGTGAACAATTAGAGACTGCATTGTCACGTGATCTTGAAAT
CTGCCATAATCACCACAAATAACTAACAGTTATGCTCCCCGCTCATGAGAAAGGCACCTACCCACTACAACAGAGGT
GCTTTCACAATCACTCGCCTTTACATGGCAGGAAGTTTGGGTATGTGGCCCACATAAATGTCCTTGCCTCCAACCAC
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TGATCACTGCAGCCGAGCTCCTCAAAAGCAGCAGGTGTCAATCACTCAAAGGTATCAGCAACAGGGACTCTAAACAC
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TTCAGGCAGCTACTCAGATACATCTTGAGTGTGCCGGCGCAGGACAACATTGCTCCTTAGTAAAGCAGTTGAGAGGA
AAGGGCTCACATACAAACCATAACTTCTGTTGACAGCGATAATGGAGACAGAGAATGGATGGCCCAATTATTTTAAA
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CAGACTGGAGGCTGCAAGGGACTCATCAGCTCCTCGCTCGAGATAGGTGCTGAGAGATCGCTACAGCACCACAAAAC
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AGAAAGGTGATGAATTGCTGGTGCTCCTTGGACTGGCTCACCTTGAGATAGCAATCTCGCTGCTCCTCACCAAAGTC
ACTGTCTTCATCTTCCTCGTCACTTCTCCAGTTCAGTTCCGGAAGCTTCTTGTCCCACTGCTGTTCTGCAAGGCCAG
GACTGACATCTTCCTGGTCATCTTGCTCTGCCACTGTGAGAATGCCATACTGGATGAACTTGCCAACTGTCTCATGA
CAAACTTGGTAAAAAGTCTGGCAGGGCAGAGAAATGGTACCTTCGTTAGAGAGAAGGTAGCACAGGCTGGCGGCCTT
CCTCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTGCCGAGGCCTCCAGCGGACCCTCCAGAGCACCTCTTATTCAGGACTG
CATAGATGCTGCAAGCTATGATGGCTTCCATGATGAACACATGAAGTACGCCATTGCTGTAGAAGTTGAGTTCAAAG
ACTGACGGGACAGTTGTGCTGGGAGTAATAAAAAACTCATCTTTCCTGCTCGTGTGGGTGATTGTGACACAGTTCCC
CAGAAGCTGAATAGCATGCATGACGACATCTTCTGAATTCCCGGAGAAGCCTAGGTCGAAATCGCGAGCTAGGACTT
CCTCCTTCATCACAAAGAAGTCTTCCACAAGCGTGGAGAGATGGATTCCCTGCCTGTGTCTGTAGAGGAGCAGACAG
GCCACAATGTGGGTGGACATGATAGCGCAGGACTTGCTGGCGGTGAAGAGAATGTGCTCAGCCAGGTTTGCAATCAG
CCTTCGTCGGAAGGCTTCGTCTGCTGGGTTTCTGGACTCGTTACTGGATAGGTCTTGATGTTCATCAGCAACATCAT
TCGGTCTTGAAGGAAGGATCGCTGGTAACAGTGCTTGCTCCAGAGAAAGGGGGGCAGATACAGGTTTCTGACTCTGG
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GATAACGCCTCTCGCCACACTCCAGAGGCTCTCGTTCTTCTTGGGCTTTCCCAACTGTTCGCCATTGTAGTGACCTT
CGATTATGCGATCATACGAGATGCCCACGGGTATGACGAGGATGTCGGGGATGGTGTTGGACGACAGAGTATCCACT
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GAACTGCTGCTGTCGGAGGAGTTCAACTACATGCCCATGGAGCAACGCTCTGTACAGAATGTCTTTGCGTCCATCTG
GGGTTTCATCGAGCCTCCGTCTTATGAAAAAGCCCCCAAGCTTGTGAATCAAGGTACTGAAGACGGGGATGTTGAGA
TTATTGCCCGAGGCGATGTACGGCGCCTTGATGTTGTGGCAAAAGAGGATGAAGGTGAGCAACAGGTAGTCAATGTG
GGATCTGTGCACCGGCAGAAACAAGAGCGGCAGGTTCGTCTCAGTTGCAGCCTTGACCATCTCGAGTTGACCCTTGT
GAATCTGAATGTTCCAGAAGAAGCTGTTGAAGAGCTTTAGTAACACCCAGCCAGTCAGCCTGATCATCCCTGGGGAG
ACGGTGGCGACCATCTCCTGGAGGATCTTCCTGGCTTTCCTTTTCACCTTCTGGATGGCTTTGGACTGCTGCTGGGC
AGATCCATCTGGGTTCAACTCCGCAGCCACTTCAGCAATTGCCTCTTGGACTCTGCTGCTGCTCAGTACATTCTCAG
TAACACTGGTGGCAAACATGCCCTTATGGACGTCTCGCTCTTGAACAAAAAGGATGTAAGACAGCCGTCTCGCCAGC
CATCCTCTGTGCCTTGTGTGCGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAGAGATGGGATACTGGGGTTGAA
AAACCTTTCCCAGCTCTGTGGCGTGCAGGAATAGCAGCACCTTCCCACGAAGGGCCTCTTCCGGCTCATAAGGCTCT
CCTTCCATTTCAGTGTTGCAGATCTGAAGAAGGTAGGTTTGAACCCACAGTCAACCCAGTCCTCACTGGTGTGTTTA
CATCGGCCAAGGCTGTATTCCGATGAACTGGGCAGATAAGAAACGTCTATTGTGCCAACTGTCACTGAAGACTCCTC
CATGGCAGAACGTGCAAGTCCCAAACCATGTGTCAACTCCTGTTTAATAATTGTTCCCCAAAAGATTCAAATCGGCT
TCTAGCTCTTTGGCTTGTGGCTTCTAGGATTCCCCTAGTCTCTCTCCCTGAGAGAGCCGCTGCTTTAATATCTTTTC
TTTCCCTCTGATTTTGTTCAGGGTGATCTTTTGCCAGGCTCCTGATAAATAGCAGGTTCAGGAATGGAGCTGCAGGG
CTTTGCTTACTGGTCCTGTATCCTTGATGTGATATCTGGAGTTATTTTGAATCAGTTGACTAGCAAAGCTGTCCCAG
ACAGCTTCAGAAGAAGACAGCCCCAGGTGTGGGTGACTTAGAAGCTCCTCCAGAGGCCTATTTGTGTAGCTGGAAGC
TGGAGACCTTCGGGTACACAGCAGTAACCCCAGAGAAGCACCGCGGGCAGCAGCCAACAGTCCAGGATGGTTTTGCA
ACAGTGGAG
SEQ ID NO:9
>NM_017274.1大鼠线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),mRNA
CACGAATAAGCCTCTGGAGGAGCTGCTGAATCACCCCCGCCCCAGGCTGTCTTCTGAAGCTGTCTGGGGATAGCTTT
GCTAATCAACTGACTGGAAATAATTCCAGACACCACATCAAGGATACAGCTCATGTTTTGTTTGGGACTTCCACGTT
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GGCCGATGTAAACACACGAATGAGGACTGGGTTGACTGTGGCTTCAAACCTACCTTCTTCAGATCCGCAACGCTGAA
ATGGAAGGAGAGCCTCATGAGCCGGAAGAGGCCCTTCGTGGGAAGGTGTTGCTATTCATGCACGCCTCAGAGCTGGG
AAAGGTTTTTCAACCCCAGTATCCCATCTCTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAATGAAACTCACACAAGGCAC
CGAGGATGGCTGGCAAGACGGCTTTCTTACATCCTTTTTGTTCAAGAGCGCGATGTCCACAAGGGCATGTTTGCCAC
CAGTATCACTGACAATGTACTGAATAGCAGCAGAGTCCAAGAGGCAATTGCTGAAGTGGCTGCAGAATTGAACCCGG
ATGGATCTGCCCAGCAGCAGTCCAAAGCCATCCAGAAAGTGAAAAGGAAAGCCAGGAAGATCCTCCAGGAAATGGTT
GCTACAGTCTCCCCCGGGATGATCAGGCTGACTGGCTGGGTGTTACTAAAGCTCTTCAACAGCTTCTTCTGGAACAT
TCAGATTCACAAGGGTCAACTTGAGATGGTGAAAGCTGCAACTGAGACGAATCTGCCGCTCTTGTTTCTGCCGGTGC
ACAGATCCCACATCGACTACCTGCTGCTCACCTTCATCCTCTTCTGCCACAACATCAAAGCTCCATACATCGCCTCG
GGCAACAACCTCAACATCCCCATCTTCAGTACCTTGATTCACAAGCTTGGGGGCTTTTTCATAAGACGGAGGCTTGA
CGAAACTCCAGATGGACGCAAAGACATTCTGTACAGAGCGTTGCTCCATGGGCATATAGTTGAACTCCTCCGACAGC
AGCAGTTCCTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACCCGCTCCCGCAGTGGCAAGACCTCCTGTGCCCGGGCCGGGCTCCTG
TCAGTGGTAGTGGATACTCTGTCATCCAACACCATCCCTGACATCCTGGTCATCCCTGTGGGCATCTCGTATGATCG
GATAATCGAAGGTCACTACAATGGTGAACAGTTGGGCAAGCCCAAGAAGAATGAAAGTCTCTGGAGTGTGGCAAGAG
GCGTTATCAGAATGCTGCGGAAAAACTACGGCTATGTCCGAGTGGACTTTGCACAGCCATTTTCTTTGAAGGAATAT
TTAGAAGGCCAAAGTCAGAAACCTGTATCTGCTCCCCTCTCTTTGGAGCAAGCACTGTTACCAGCAATCCTTCCTTC
AAGACCTGATGCTGCTGCTGCCGAACATGAAGACATGTCCAGTAATGAGTCGAGAAACGCGGCAGACGAAGCCTTCC
GAAGGAGGCTGATCGCAAACCTGGCGGAGCACATTCTCTTCACCGCCAGCAAGTCCTGCGCTATCATGTCCACCCAC
ATTGTGGCCTGCCTGCTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATCCACCTCTCCACGCTGGTGGAAGACTTCTTTGTGAT
GAAGGAGGAAGTCCTAGCTCGGGATTTTGACCTGGGCTTCTCCGGGAATTCAGAAGATGTAGTCATGCATGCTATTC
AGCTTCTGGGGAACTGTGTCACAATCACCCACACTAGCAGGAAGGATGAATTCTTTATTACTCCCAGCACAACTGTC
CCGTCCGTCTTTGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAAGCCATCATAGCTTGCAG
CATTTATGCAGTCCAGAATAAGAGGGGTTCCGGAGGGTCTGCCGGAGGCCTTGGCAACCTGATCAGCCAGGAGCAGC
TGGTGCGGAAGGCCGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCTAATGAAGGTACCATTTCTCTGCCCTGCCAGACATTTTAC
CAGGTTTGTCAAGAGACAGTAGGAAAGTTCATCCAGTACGGAATTCTCACAGTGGCAGAGCAAGATGACCAGGAAGA
TGTCAGTCCTGGCCTTGCAGAGCAGCAGTGGAACAAGAAGCTTCCGGAGCCTCTGAACTGGAGAAGTGACGAAGAAG
ATGAGGACAGTGACTTTGGTGAGGAGCAGCGTGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAGGCCAAGGAGCACCAGCAATTC
ATCACCTTTCTGCAGAGGCTTCTGGGGCCCCTGCTAGAAGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTCCACACCTTCCG
CGGCCCAGTCCCGGAGTCTGAGTACCTGCAGAAGCTGCACAGGTACCTTCTCACCAGGACGGAGAGGAACGTCGCGG
TGTACGCTGAGAGTGCCACATACTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGACATCGGGGTTTTCAAAGAG
ACCAAGCAGAAGCGAGCGTCTGTCTTAGAACTGAGCACCACTTTCCTACCTCAGGGCAGCCGGCAGAAGCTCCTGGA
ATACATTCTGAGCTTCGTGGTGCTGTAG
SEQ ID NO:10
>SEQ ID NO:9的反向互补序列
CTACAGCACCACGAAGCTCAGAATGTATTCCAGGAGCTTCTGCCGGCTGCCCTGAGGTAGGAAAGTGGTGCTCAGTT
CTAAGACAGACGCTCGCTTCTGCTTGGTCTCTTTGAAAACCCCGATGTCCTTAAACATTTTCACAGCATTCTTCACA
AGACAGTATGTGGCACTCTCAGCGTACACCGCGACGTTCCTCTCCGTCCTGGTGAGAAGGTACCTGTGCAGCTTCTG
CAGGTACTCAGACTCCGGGACTGGGCCGCGGAAGGTGTGGACAAAGATGGCAGCAGAGCTGTAGGCTTCTAGCAGGG
GCCCCAGAAGCCTCTGCAGAAAGGTGATGAATTGCTGGTGCTCCTTGGCCTGGCTCACCTTCAGGTAGCAATCACGC
TGCTCCTCACCAAAGTCACTGTCCTCATCTTCTTCGTCACTTCTCCAGTTCAGAGGCTCCGGAAGCTTCTTGTTCCA
CTGCTGCTCTGCAAGGCCAGGACTGACATCTTCCTGGTCATCTTGCTCTGCCACTGTGAGAATTCCGTACTGGATGA
ACTTTCCTACTGTCTCTTGACAAACCTGGTAAAATGTCTGGCAGGGCAGAGAAATGGTACCTTCATTAGAGAGAAGG
TAGCACAGGCTGGCGGCCTTCCGCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTGCCAAGGCCTCCGGCAGACCCTCCGGA
ACCCCTCTTATTCTGGACTGCATAAATGCTGCAAGCTATGATGGCTTCCATGATAAAGACATGAAGTACCCCATTGC
TGTAGAAGTTGAGTTCAAAGACGGACGGGACAGTTGTGCTGGGAGTAATAAAGAATTCATCCTTCCTGCTAGTGTGG
GTGATTGTGACACAGTTCCCCAGAAGCTGAATAGCATGCATGACTACATCTTCTGAATTCCCGGAGAAGCCCAGGTC
AAAATCCCGAGCTAGGACTTCCTCCTTCATCACAAAGAAGTCTTCCACCAGCGTGGAGAGGTGGATTCCCTGCCTGT
GTCTGTAGAGGAGCAGGCAGGCCACAATGTGGGTGGACATGATAGCGCAGGACTTGCTGGCGGTGAAGAGAATGTGC
TCCGCCAGGTTTGCGATCAGCCTCCTTCGGAAGGCTTCGTCTGCCGCGTTTCTCGACTCATTACTGGACATGTCTTC
ATGTTCGGCAGCAGCAGCATCAGGTCTTGAAGGAAGGATTGCTGGTAACAGTGCTTGCTCCAAAGAGAGGGGAGCAG
ATACAGGTTTCTGACTTTGGCCTTCTAAATATTCCTTCAAAGAAAATGGCTGTGCAAAGTCCACTCGGACATAGCCG
TAGTTTTTCCGCAGCATTCTGATAACGCCTCTTGCCACACTCCAGAGACTTTCATTCTTCTTGGGCTTGCCCAACTG
TTCACCATTGTAGTGACCTTCGATTATCCGATCATACGAGATGCCCACAGGGATGACCAGGATGTCAGGGATGGTGT
TGGATGACAGAGTATCCACTACCACTGACAGGAGCCCGGCCCGGGCACAGGAGGTCTTGCCACTGCGGGAGCGGGTG
CCTTCCAGGAAGATCTCCAGGAACTGCTGCTGTCGGAGGAGTTCAACTATATGCCCATGGAGCAACGCTCTGTACAG
AATGTCTTTGCGTCCATCTGGAGTTTCGTCAAGCCTCCGTCTTATGAAAAAGCCCCCAAGCTTGTGAATCAAGGTAC
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AGCAGCAGGTAGTCGATGTGGGATCTGTGCACCGGCAGAAACAAGAGCGGCAGATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTCAC
CATCTCAAGTTGACCCTTGTGAATCTGAATGTTCCAGAAGAAGCTGTTGAAGAGCTTTAGTAACACCCAGCCAGTCA
GCCTGATCATCCCGGGGGAGACTGTAGCAACCATTTCCTGGAGGATCTTCCTGGCTTTCCTTTTCACTTTCTGGATG
GCTTTGGACTGCTGCTGGGCAGATCCATCCGGGTTCAATTCTGCAGCCACTTCAGCAATTGCCTCTTGGACTCTGCT
GCTATTCAGTACATTGTCAGTGATACTGGTGGCAAACATGCCCTTGTGGACATCGCGCTCTTGAACAAAAAGGATGT
AAGAAAGCCGTCTTGCCAGCCATCCTCGGTGCCTTGTGTGAGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAGA
GATGGGATACTGGGGTTGAAAAACCTTTCCCAGCTCTGAGGCGTGCATGAATAGCAACACCTTCCCACGAAGGGCCT
CTTCCGGCTCATGAGGCTCTCCTTCCATTTCAGCGTTGCGGATCTGAAGAAGGTAGGTTTGAAGCCACAGTCAACCC
AGTCCTCATTCGTGTGTTTACATCGGCCAAGGCTGTATTCTGATGAATTGGGCAGATAAGAAACGTCTATTGTGCCA
ATTGTCACTGAAGACTCCTCCATGACTCAACGTGGAAGTCCCAAACAAAACATGAGCTGTATCCTTGATGTGGTGTC
TGGAATTATTTCCAGTCAGTTGATTAGCAAAGCTATCCCCAGACAGCTTCAGAAGACAGCCTGGGGCGGGGGTGATT
CAGCAGCTCCTCCAGAGGCTTATTCGTG
SEQ ID NO:11
>NM_001266771.1猕猴线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),mRNA
CTGTTGTATGGACATTCTGCACCCGAAACTGATAGCTGAGTCCTGAAGTTTTATGTTATGAAACAGAAGAACTTTCA
TCCCAGCACATGATTTGGGAATTACACTTTGTGACATGGATGAATCTGCACTGACCCTTGGTACAATAGATGTTTCT
TATCTGCCGAATTCATCAGAATACAGTGTTGGTCGATGTAAGCACACAAGTGAGGAATGGGGTGAGTGTGGTTTTAG
ACCTACTGTCTTCAGATCTGCAACTTTAAAATGGAAAGAAAGCCTAATGAGTCGGAAAAGGCCATTTGTTGGAAGAT
GTTGTTACTCCTGCACTCCCCAGAGCTGGGACAGATTTTTCAACCCCAGTATCCCGTCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
ATTTATATCAATGAAACTCACACAAGACACCGGGGATGGCTTGCAAGACGCCTTTCTTATGTTCTTTTTATTCAAGA
GCGAGATGTGCATAAGGGCATGTTTGCCACCAATGTGACTGAAAATGTGCTGAACAGCAGTAGAGTACAAGAGGCAA
TTGCAGAAGTGGCTGCTGAATTAAACCCTGATGGTTCTGCCCAGCAGCAATCAAAAGCCGTTAACAAAGTGAAAAAG
AAAGCTAAAAGGATTCTTCAAGAAATGGTTGCCACTGTCTCACCGGCAATGATCAGACTGACTGGGTGGGTGCTGCT
AAAACTGTTCAACAGCTTCTTTTGGAACATTCAAATTCACAAAGGTCAACTTGAGATGGTTAAAGCTGCAACTGAGA
CGAATTTGCCGCTTCTGTTTCTACCAGTTCATAGATCCCATATTGACTATCTGCTGCTCACTTTCATTCTCTTCTGC
CATAACATCAAAGCACCATACATTGCTTCAGGCAATAATCTCCATATCCCAATCTTCAGTACTTTGATCCATAAGCT
TGGGGGCTTCTTCATACGACGAAGGCTCGATGAAACACCAGATGGACGGAAAGATGTTCTCTACAGAGCTTTGCTCC
ATGGGCATATAGTTGAATTACTTCGACAGCAGCAATTCTTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACACGTTCTAGGAGTGGA
AAAACCTCCTGTGCTCGGGCGGGACTTTTGTCAGTTGTGGTAGATACTCTATCTACCAATGTCATCCCAGACATCTT
GATAATACCTGTTGGAATCTCCTATGATCGTATTATCGAAGGTCACTACAATGGCGAACAACTGGGCAAGCCAAAGA
AGAATGAGAGCCTGTGGAGTATAGCAAGAGGTGTTATTAGAATGTTACGAAAAAACTATGGTTGTGTCCGAGTGGAT
TTTGCACAGCCGTTTTCCTTAAAGGAATATTTAGAAAGCCAAAGTCAGAAACCGGTGTCTGCTCCACTTTCTCTGGA
GCAAGCGTTGTTACCAGCTATACTTCCTTCAAGACCCAATGATGCTGCTGATGAAGGTAGAGACACATCCATTAATG
AGTCCAGAAATGCAACAGATGAATTCCTACGAAGGAGGTTGATTGCAAATCTGGCTGAGCATATTCTATTCACTGCT
AGCAAGTCCTGTGCCATTATGTCCACACACATTGTGGCTTGCCTACTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATTGATCT
CTCCACATTGGTGGAAGACTTCTTTGTGATGAAAGAGGAAGTCCTGGCTCGTGATTTTGACCTGGGGTTCTCAGGAA
ATTCAGAAGATGTAGTAATGCATGCCATACAGCTGCTGGGAAATTGCGTCACAATCACTCACACTAGCAGGAACGATGAGTTTTTTATCACCCCCAGCACAACTGTCCCAGCAGTCTTCGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAGGCCATCATAGCTTGCAGCCTTTATGCAGTTCTGAACAAGAGGGGATTAGGGGGGCCCACTGGCACCCCACCTAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGCGGAAGGCGGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCCAATGAGGGCACCATCTCACTGCCTTGCCAGACATTTTACCAAGTGTGCCATGAAACAGTAGGAAAGTTTATCCAGTATGGCATTCTTACAGTGGCAGAGCACGATGACCAGGAAGATATCAGTCCTAGTCTTGCTGAGCAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCTGAACCTTTGTCTTGGAGAAGTGATGAAGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGGGAGGAACAGCGAGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAATCCAAGGAGCACCAGCAGTTTATCACCTTCTTACAGAGACTCCTTGGGCCTTTGCTGGAGGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTTCACAACTTTAGCGGCCCTGTTCCAGAACCTGAATATCTGCAAAAGTTGCACAAATACCTAGTAACCAGAACAGAAAGAAATGTTGCAGTATATGCTGAGAGTGCCACATACTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGATATTGGGGTTTTCAAGGAGACCAAACAAAAGAGAGTGTCTGTTTTAGAACTGAGCAGCACTTTTCTACCTCAATGCAACCGGCAAAAACTTCTAGAATATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGGTAACGTGTGGCACCGCTGGCAAATGAAGGTCATGAGATGAGTCCCTTGTAGGTACCAGCTTCTGGCTCGAGAGTTGAAGGTGCCGTCGCAAGGTCACGCCTGCCCTGTCCCGCAGTGATCTCCTGGAAGACAAGTGCCTTCTCCCTCCATGGATCTGTGATCTTCCCAGCTCTGCATCCACACAGCAGCCTGCAGATAACACTTGGGGGGACCTCAGCCTCTATTCGCAACTCACAATCCGTAGACTACAAGATGAAATCTCAATACATTATTTTGGAGTTTATTAAAGATTGACATTTTAAGTACAACTTTTAAGGACTAATTACTGTGATGGACACAGAAATGTAGCTGTGTTCTAGAACTGAATCTTATATGGTATACTTAGTGCTATTGGGTAATTTGTTGGTATATTATCTGGTTAATGGTTAATGCTTCCTTTAAAAATAATTGAGTCATCCATTCACTCTTTTTCAGTTTTATCTTTGTCAATAGTAGCTACATTTTTAATGGGAGTACCTTTTATCCCAAGTGCTTTATAAATGAATGGACTGATATATATCACACCCAGGTATCACTGTGCTGTCCTTTGCAGTCAGATATAGAAAATGTTTTTAAGAGGTATGTGAAAACAGACAGTATTAGTTTAGGTCGGGAACTGAGATATTGTAATCAAATAGTTAACATCAGGAAGTTAATTTGGCTGGCAAAATTCTAGGGAAACTTGGCCAGAAAACTGGTGTTGAAGGCTTTTGCTCATATAAAAAAGTGCCATTGAGTTTTAAATGACCAGCAAATATTTAGAACCCTTCCTGTTTTATGTCTGTACCCCGTCTACCCCTCAGGTAATACCTGCTTCTCACGGGTACAGCTGTTTCTTGGAAATCCTCCAACCAAATAGCAACTTTCCTAACTTGATTAGCTTGAGCTGACAGACTCTGTTAGAATACAGTGCTCTGGCCACAACTGATGAGGGCTTTCTGTACTGCACACAGATTGTGTACTGCACCCCAGTCCAGGTGACTGGTGCCCACTTGAGTTGTGCCGTGCACAACCTGTCCAGTATATGCATGTGGTGGCCCTACTGACTGGTAATGGTTAGAGGCATTTGTGAATTTTTAGCTTTGAGGAAAAACCATGACTTTTAACAAATTTTTATGGGTTATATGCCTAAACCATTATGCCACATAGTGGTAAATAATTATGAAAAATGGTCTGTTCATAATTGGTAGGTGCCTTTTGTGAACAGGGAGCATAATTATTAGTTTATTATGGTAATTATGGTGATTTCTTAAATATCATGTAATGTTAAAACATTTTCTAACAGTTTACTGTTGCTTATCTCTAAGATATTATGGAATTAAGAATTTTTCCAGATGAGTGTTACATAGTTTCTTTGAATTTAGTATAAAAATACTGAGAATTAAGTTTGTACTTCTATAAGCTTGGGTTTTAAACACTAATAGTGTCTCATGAGTAACGTGTGTTTTGGGAGAGGGAGGGATGCTGATTGATATTTCACATTGTATGAAGTATCACGTTTGAAACTGGTAGCAATAATGCTATGCTGTTGTGATCCCTCTCAAGTTCTGCATTTAAAAGATATTTTTTCTTGATAGGAATTGAGGTACTGTTAAGTCATTGTCAGTTGTAGTAGCTCTGATGTTAATGAGATAATCACGTTTTAGCATTCCATTTTACTGACTAGGGTGGAAGAACACTTTTCTCGGCTACATTTGGAGGATACCCAGGGAGTCTTGGGTGTTCCTTATGTGGGGAATCAAGCATTTCACTAGTCTCTTTTTTTCATCCTTTAAATTGTAGATTAAGGATTACTCAAGCTCACCATTATTCAAGGTTGGGACTCACTTCCCAGTGGATACTCTGCCCTGCCTGTCACTGCTGCAAAGAGCTGCTGCTTCGCCAGCCTAAGCAGAGAAAATATGGCTTCTCTTGCATTATTTTCCCTTTTGGTTGGTTTGTTTTCGAGAAGTTTGATCAGATGCTTTGAGGAATGCAATGTATGATTTGCTAGCTCTCTTACCACTTAAGTCACTGTGAGGATAAATATGCATGCATTTTGTAATTAACTGGTGCTTTGAAAATCTTTTTTAAGGGAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCATCCAGACAAGCTGACCTTTGAGTTAATTTCAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATGACCGAAAAACAAAAAGCAAAAAAGAAAGCATCTTCACAATAAAGCTTCCAGATAGCACCATTTTGCTAAAAGATACGTTCTCATTGTTTTCCAACAGCGATGGCTTCCATGTAAGGTTAAACAAACTAGGTGCTTGTAAATAATTTTATTACAGTTTACTCTATTGCATTTCTATAACATGAAATGCATGCCCTTCAGGGGAAGACTGTGAGTCAAGTTAAAAAAAAATATTAAGCAATATGCAACTGCTCTCTGTTTTTAAAAATGAGAATGTCCTAAGTGATTCAGAAGAGAGGAAGGAATTTATGTACTCTTAAAATTGCATGAAAAACAAGGCAAAAACTAGTGTGAAATGTGTAGAACTGTTAACTGAGACGGCATTGAGTCTTCCTTCTGAAATCTGTTAAATCTCACAAAGTCATGAGGGTATATGGAGAAAATATTTCTGGGATTACAATGAATGTAATCCCAGATTGTGGAATTTCCAGTAACCTGGACCGGGAAAAGCATTTCCCATAGTACTCCATGTAATATGAGTGCTCTGTGAGATGTTCATCAGTGTTTTATAGAAATGGTGTTGCTGGGAACTAAGTTTGCACATGGAGACTTACAATGCACTTTAGCGCAGTAAGGGCTTGGCATCTGGCAGTGAAAAACTGTTCAACCCAGCATTGCCCAAACTATTTTGACATCAGGACCTTTTTCTCCTTTGGGATACCTGTGAACCTCTCACTACTGTCCTGTGGAGAACATTTTGGGAAACGCTGTTAGATAGTTCTTTAAGGAGACAAAACGGTAATGAACACATGGCACTGGGGCAGAATTCACATGCATTTTGTAACATCCAGTGTGGCATGGAATAGATGTGTATTTCCTCCCCTAAAGAAAATAAGCACAGAAAATTATATTGTAGGTGATCGGAGCTCTTTCCTTTGATAGAAAGAACAGCCCCAATGATCCTGGCTTTTTCACTGAACATATCAGAATACATGGATGAGTTGGGGTTAATAAGGTTTTCATTCAGATGTAGAAGAAAGTATTGTACAATTGAATGCAGATTTTTATCCACAGACAGTTGTAGTGTTTAGACGTGACAGGACCTATTGTTGAGGTTTATAAGACTTACTATGGGCTGTAAACCTATTTTTTAAAACTCTTTTTAGAAACCTGAGACTTGTCATCTGGCATTTTAGTTTAATACAAACTAATGATTGCATTTGAAAGAGATTCTTGACCTTATTTCTGAACATCTAAAGCTCTGAAATGTCTTGATGGAAGGTATTAAACTATTTGCCTGTTGTATAAAGAAATGTTAAGACTGTTGTGAAAAGAATTACTGTAAGGTACTGTGAAATGACTGTGATTTTTGTGAGCGAAACATACTTGGAAATACTGAATTGATTTTTATGCTTGTTAATGTATTGCAAGAAACACAGAAAATGTAGTTTTGTTTTAATAAAC
SEQ ID NO:12
>SEQ ID NO:11的反向互补序列
GTTTATTAAAACAAAACTACATTTTCTGTGTTTCTTGCAATACATTAACAAGCATAAAAATCAATTCAGTATTTCCA
AGTATGTTTCGCTCACAAAAATCACAGTCATTTCACAGTACCTTACAGTAATTCTTTTCACAACAGTCTTAACATTT
CTTTATACAACAGGCAAATAGTTTAATACCTTCCATCAAGACATTTCAGAGCTTTAGATGTTCAGAAATAAGGTCAA
GAATCTCTTTCAAATGCAATCATTAGTTTGTATTAAACTAAAATGCCAGATGACAAGTCTCAGGTTTCTAAAAAGAG
TTTTAAAAAATAGGTTTACAGCCCATAGTAAGTCTTATAAACCTCAACAATAGGTCCTGTCACGTCTAAACACTACA
ACTGTCTGTGGATAAAAATCTGCATTCAATTGTACAATACTTTCTTCTACATCTGAATGAAAACCTTATTAACCCCA
ACTCATCCATGTATTCTGATATGTTCAGTGAAAAAGCCAGGATCATTGGGGCTGTTCTTTCTATCAAAGGAAAGAGC
TCCGATCACCTACAATATAATTTTCTGTGCTTATTTTCTTTAGGGGAGGAAATACACATCTATTCCATGCCACACTG
GATGTTACAAAATGCATGTGAATTCTGCCCCAGTGCCATGTGTTCATTACCGTTTTGTCTCCTTAAAGAACTATCTA
ACAGCGTTTCCCAAAATGTTCTCCACAGGACAGTAGTGAGAGGTTCACAGGTATCCCAAAGGAGAAAAAGGTCCTGA
TGTCAAAATAGTTTGGGCAATGCTGGGTTGAACAGTTTTTCACTGCCAGATGCCAAGCCCTTACTGCGCTAAAGTGC
ATTGTAAGTCTCCATGTGCAAACTTAGTTCCCAGCAACACCATTTCTATAAAACACTGATGAACATCTCACAGAGCA
CTCATATTACATGGAGTACTATGGGAAATGCTTTTCCCGGTCCAGGTTACTGGAAATTCCACAATCTGGGATTACAT
TCATTGTAATCCCAGAAATATTTTCTCCATATACCCTCATGACTTTGTGAGATTTAACAGATTTCAGAAGGAAGACT
CAATGCCGTCTCAGTTAACAGTTCTACACATTTCACACTAGTTTTTGCCTTGTTTTTCATGCAATTTTAAGAGTACA
TAAATTCCTTCCTCTCTTCTGAATCACTTAGGACATTCTCATTTTTAAAAACAGAGAGCAGTTGCATATTGCTTAAT
ATTTTTTTTTAACTTGACTCACAGTCTTCCCCTGAAGGGCATGCATTTCATGTTATAGAAATGCAATAGAGTAAACT
GTAATAAAATTATTTACAAGCACCTAGTTTGTTTAACCTTACATGGAAGCCATCGCTGTTGGAAAACAATGAGAACG
TATCTTTTAGCAAAATGGTGCTATCTGGAAGCTTTATTGTGAAGATGCTTTCTTTTTTGCTTTTTGTTTTTCGGTCA
TGAGGCACTGAAGAATGAGTTGTGCTGAAATTAACTCAAAGGTCAGCTTGTCTGGATGAGCATAACTTTGGTTGAGA
TTTTTCTCCCTTAAAAAAGATTTTCAAAGCACCAGTTAATTACAAAATGCATGCATATTTATCCTCACAGTGACTTA
AGTGGTAAGAGAGCTAGCAAATCATACATTGCATTCCTCAAAGCATCTGATCAAACTTCTCGAAAACAAACCAACCA
AAAGGGAAAATAATGCAAGAGAAGCCATATTTTCTCTGCTTAGGCTGGCGAAGCAGCAGCTCTTTGCAGCAGTGACA
GGCAGGGCAGAGTATCCACTGGGAAGTGAGTCCCAACCTTGAATAATGGTGAGCTTGAGTAATCCTTAATCTACAAT
TTAAAGGATGAAAAAAAGAGACTAGTGAAATGCTTGATTCCCCACATAAGGAACACCCAAGACTCCCTGGGTATCCT
CCAAATGTAGCCGAGAAAAGTGTTCTTCCACCCTAGTCAGTAAAATGGAATGCTAAAACGTGATTATCTCATTAACA
TCAGAGCTACTACAACTGACAATGACTTAACAGTACCTCAATTCCTATCAAGAAAAAATATCTTTTAAATGCAGAAC
TTGAGAGGGATCACAACAGCATAGCATTATTGCTACCAGTTTCAAACGTGATACTTCATACAATGTGAAATATCAAT
CAGCATCCCTCCCTCTCCCAAAACACACGTTACTCATGAGACACTATTAGTGTTTAAAACCCAAGCTTATAGAAGTA
CAAACTTAATTCTCAGTATTTTTATACTAAATTCAAAGAAACTATGTAACACTCATCTGGAAAAATTCTTAATTCCA
TAATATCTTAGAGATAAGCAACAGTAAACTGTTAGAAAATGTTTTAACATTACATGATATTTAAGAAATCACCATAA
TTACCATAATAAACTAATAATTATGCTCCCTGTTCACAAAAGGCACCTACCAATTATGAACAGACCATTTTTCATAA
TTATTTACCACTATGTGGCATAATGGTTTAGGCATATAACCCATAAAAATTTGTTAAAAGTCATGGTTTTTCCTCAA
AGCTAAAAATTCACAAATGCCTCTAACCATTACCAGTCAGTAGGGCCACCACATGCATATACTGGACAGGTTGTGCA
CGGCACAACTCAAGTGGGCACCAGTCACCTGGACTGGGGTGCAGTACACAATCTGTGTGCAGTACAGAAAGCCCTCA
TCAGTTGTGGCCAGAGCACTGTATTCTAACAGAGTCTGTCAGCTCAAGCTAATCAAGTTAGGAAAGTTGCTATTTGG
TTGGAGGATTTCCAAGAAACAGCTGTACCCGTGAGAAGCAGGTATTACCTGAGGGGTAGACGGGGTACAGACATAAA
ACAGGAAGGGTTCTAAATATTTGCTGGTCATTTAAAACTCAATGGCACTTTTTTATATGAGCAAAAGCCTTCAACAC
CAGTTTTCTGGCCAAGTTTCCCTAGAATTTTGCCAGCCAAATTAACTTCCTGATGTTAACTATTTGATTACAATATC
TCAGTTCCCGACCTAAACTAATACTGTCTGTTTTCACATACCTCTTAAAAACATTTTCTATATCTGACTGCAAAGGA
CAGCACAGTGATACCTGGGTGTGATATATATCAGTCCATTCATTTATAAAGCACTTGGGATAAAAGGTACTCCCATT
AAAAATGTAGCTACTATTGACAAAGATAAAACTGAAAAAGAGTGAATGGATGACTCAATTATTTTTAAAGGAAGCAT
TAACCATTAACCAGATAATATACCAACAAATTACCCAATAGCACTAAGTATACCATATAAGATTCAGTTCTAGAACA
CAGCTACATTTCTGTGTCCATCACAGTAATTAGTCCTTAAAAGTTGTACTTAAAATGTCAATCTTTAATAAACTCCA
AAATAATGTATTGAGATTTCATCTTGTAGTCTACGGATTGTGAGTTGCGAATAGAGGCTGAGGTCCCCCCAAGTGTT
ATCTGCAGGCTGCTGTGTGGATGCAGAGCTGGGAAGATCACAGATCCATGGAGGGAGAAGGCACTTGTCTTCCAGGA
GATCACTGCGGGACAGGGCAGGCGTGACCTTGCGACGGCACCTTCAACTCTCGAGCCAGAAGCTGGTACCTACAAGG
GACTCATCTCATGACCTTCATTTGCCAGCGGTGCCACACGTTACCTACAGCACCACAAAACTCAGAATATATTCTAG
AAGTTTTTGCCGGTTGCATTGAGGTAGAAAAGTGCTGCTCAGTTCTAAAACAGACACTCTCTTTTGTTTGGTCTCCT
TGAAAACCCCAATATCCTTAAACATTTTCACAGCATTCTTCACAAGACAGTATGTGGCACTCTCAGCATATACTGCA
ACATTTCTTTCTGTTCTGGTTACTAGGTATTTGTGCAACTTTTGCAGATATTCAGGTTCTGGAACAGGGCCGCTAAA
GTTGTGAACAAAGATGGCAGCAGAGCTGTAGGCCTCCAGCAAAGGCCCAAGGAGTCTCTGTAAGAAGGTGATAAACT
GCTGGTGCTCCTTGGATTGGCTCACCTTCAGGTAGCAATCTCGCTGTTCCTCCCCAAAGTCACTGTCTTCATCTTCT
TCATCACTTCTCCAAGACAAAGGTTCAGGAAGCTTCTTGTCCCACTGCTGCTCAGCAAGACTAGGACTGATATCTTC
CTGGTCATCGTGCTCTGCCACTGTAAGAATGCCATACTGGATAAACTTTCCTACTGTTTCATGGCACACTTGGTAAA
ATGTCTGGCAAGGCAGTGAGATGGTGCCCTCATTGGAGAGAAGGTAGCACAGGCTGGCCGCCTTCCGCACCAGCTGC
TCCTGGCTGATCAGGTTAGGTGGGGTGCCAGTGGGCCCCCCTAATCCCCTCTTGTTCAGAACTGCATAAAGGCTGCA
AGCTATGATGGCCTCCATGATAAAGACATGAAGTACCCCATTGCTGTAGAAGTTGAGTTCGAAGACTGCTGGGACAG
TTGTGCTGGGGGTGATAAAAAACTCATCGTTCCTGCTAGTGTGAGTGATTGTGACGCAATTTCCCAGCAGCTGTATG
GCATGCATTACTACATCTTCTGAATTTCCTGAGAACCCCAGGTCAAAATCACGAGCCAGGACTTCCTCTTTCATCAC
AAAGAAGTCTTCCACCAATGTGGAGAGATCAATTCCCTGCCTGTGTCTGTAGAGGAGTAGGCAAGCCACAATGTGTG
TGGACATAATGGCACAGGACTTGCTAGCAGTGAATAGAATATGCTCAGCCAGATTTGCAATCAACCTCCTTCGTAGG
AATTCATCTGTTGCATTTCTGGACTCATTAATGGATGTGTCTCTACCTTCATCAGCAGCATCATTGGGTCTTGAAGG
AAGTATAGCTGGTAACAACGCTTGCTCCAGAGAAAGTGGAGCAGACACCGGTTTCTGACTTTGGCTTTCTAAATATT
CCTTTAAGGAAAACGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACACAACCATAGTTTTTTCGTAACATTCTAATAACACCTCTT
GCTATACTCCACAGGCTCTCATTCTTCTTTGGCTTGCCCAGTTGTTCGCCATTGTAGTGACCTTCGATAATACGATC
ATAGGAGATTCCAACAGGTATTATCAAGATGTCTGGGATGACATTGGTAGATAGAGTATCTACCACAACTGACAAAA
GTCCCGCCCGAGCACAGGAGGTTTTTCCACTCCTAGAACGTGTGCCTTCCAGGAAGATCTCCAAGAATTGCTGCTGT
CGAAGTAATTCAACTATATGCCCATGGAGCAAAGCTCTGTAGAGAACATCTTTCCGTCCATCTGGTGTTTCATCGAG
CCTTCGTCGTATGAAGAAGCCCCCAAGCTTATGGATCAAAGTACTGAAGATTGGGATATGGAGATTATTGCCTGAAG
CAATGTATGGTGCTTTGATGTTATGGCAGAAGAGAATGAAAGTGAGCAGCAGATAGTCAATATGGGATCTATGAACT
GGTAGAAACAGAAGCGGCAAATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTAACCATCTCAAGTTGACCTTTGTGAATTTGAATGTT
CCAAAAGAAGCTGTTGAACAGTTTTAGCAGCACCCACCCAGTCAGTCTGATCATTGCCGGTGAGACAGTGGCAACCA
TTTCTTGAAGAATCCTTTTAGCTTTCTTTTTCACTTTGTTAACGGCTTTTGATTGCTGCTGGGCAGAACCATCAGGG
TTTAATTCAGCAGCCACTTCTGCAATTGCCTCTTGTACTCTACTGCTGTTCAGCACATTTTCAGTCACATTGGTGGC
AAACATGCCCTTATGCACATCTCGCTCTTGAATAAAAAGAACATAAGAAAGGCGTCTTGCAAGCCATCCCCGGTGTC
TTGTGTGAGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAAAGACGGGATACTGGGGTTGAAAAATCTGTCCCAG
CTCTGGGGAGTGCAGGAGTAACAACATCTTCCAACAAATGGCCTTTTCCGACTCATTAGGCTTTCTTTCCATTTTAA
AGTTGCAGATCTGAAGACAGTAGGTCTAAAACCACACTCACCCCATTCCTCACTTGTGTGCTTACATCGACCAACAC
TGTATTCTGATGAATTCGGCAGATAAGAAACATCTATTGTACCAAGGGTCAGTGCAGATTCATCCATGTCACAAAGT
GTAATTCCCAAATCATGTGCTGGGATGAAAGTTCTTCTGTTTCATAACATAAAACTTCAGGACTCAGCTATCAGTTT
CGGGTGCAGAATGTCCATACAACAG
SEQ ID NO:13
>XM_005566424.2预测的:食蟹猴线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),转录物变体X1,mRNA TGTGGTGTTTCAAAACTGCTCTGGGAGAATTTGCTGTTGCGGGGGGGACTCTTTCTGAGGTTACTGTGGAGCACCCAAAGTCCGTCAGCCTCTGGCCGTGCAGAGGGGCACCCAGAGGAAGTAGACCTTGCTTCTTATTCACCCACAGCCTGGGACTGTCTTCTCCAGAGTCTCCATCACCTTTGCTAATCGACTGATTGGAAATAATTCCTCAAACACCACCAAGTCAAGGATACAGGCAGCAGCGGCTCCCCTGTTGTATGGACATTCTGCACCCGAAACTGATAGCTGAGTCCTGAAGTTTTATGTTATGAAACAGAAGAACTTTCATCCCAGCACATGATTTGGGAATTACACTTTGTGACATGGATGAATCTGCACTGACCCTTGGTACAATAGATGTTTCTTATCTGCCGAATTCATCAGAATACAGTGTTGGTCGATGTAAGCACACAAGTGAGGAATGGGGTGAGTGTGGTTTTAGACCTACTGTCTTCAGATCTGCAACTTTAAAATGGAAAGAAAGCCTAATGAGTCGGAAAAGGCCATTTGTTGGAAGATGTTGTTACTCCTGCACTCCCCAGAGCTGGGACAGATTTTTCAACCCCAGTATCCCATCTTTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAATGAAACTCACACAAGACACCGGGGATGGCTTGCAAGACGCCTTTCTTATGTTCTTTTTATTCAAGAGCGAGATGTGCATAAGGGCATGTTTGCCACCAATGTGACTGAAAATGTGCTGAACAGCAGTAGAGTACAAGAGGCAATTGCAGAAGTGGCTGCTGAATTAAACCCTGATGGTTCTGCCCAGCAGCAATCAAAAGCCGTTAACAAAGTGAAAAAGAAAGCTAAAAGGATTCTTCAAGAAATGGTTGCCACTGTCTCACCGGCAATGATCAGACTGACTGGGTGGGTGCTGCTAAAACTGTTCAACAGCTTCTTTTGGAACATTCAAATTCACAAAGGTCAACTTGAGATGGTTAAAGCTGCAACTGAGACGAATTTGCCGCTTCTGTTTCTACCAGTTCATAGATCCCATATTGACTATCTGCTGCTCACTTTCATTCTCTTCTGCCATAACATCAAAGCACCATACATTGCTTCAGGCAATAATCTCCATATCCCAATCTTCAGTACTTTGATCCATAAGCTTGGGGGCTTCTTCATACGACGAAGGCTCGATGAAACACCAGATGGACGGAAAGATGTTCTCTACAGAGCTTTGCTCCATGGGCATATAGTTGAATTACTTCGACAGCAGCAATTCTTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACACGTTCTAGGAGTGGAAAAACCTCCTGTGCTCGGGCGGGACTTTTGTCAGTTGTGGTAGATACTCTATCTACCAATGTCATCCCAGACATCTTGATAATACCTGTTGGAATCTCCTATGATCGTATTATCGAAGGTCACTACAATGGCGAACAACTGGGCAAGCCAAAGAAGAATGAGAGCCTGTGGAGTATAGCAAGAGGTGTTATTAGAATGTTACGAAAAAACTATGGTTGTGTCCGAGTGGATTTTGCACAGCCGTTTTCCTTAAAGGAATATTTAGAAAGCCAAAGTCAGAAACCGGTGTCTGCTCCACTTTCTCTGGAGCAAGCGTTGTTACCAGCTATACTTCCTTCAAGACCCAATGATGCTGCTGATGAAGGTAGAGACACATCCATTAATGAGTCCAGAAATGCAACAGATGAATTCCTACGAAGGAGGTTGATTGCAAATCTGGCTGAGCATATTCTATTCACTGCTAGCAAGTCCTGTGCCATTATGTCCACACACATTGTGGCTTGCCTACTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATTGATCTCTCCACATTGGTGGAAGACTTCTTTGTGATGAAAGAGGAAGTCCTGGCTCGTGATTTTGACCTGGGGTTCTCAGGAAATTCAGAAGATGTAGTAATGCATGCCATACAGCTGCTGGGAAATTGCGTCACAATCACTCACACTAGCAGGAACGATGAGTTTTTTATCACCCCCAGCACAACTGTCCCAGCAGTCTTCGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAGGCCATCATAGCTTGCAGCCTTTATGCAGTTCTGAACAAGAGGGGATTAGGGGGGCCCACTGGCACCCCACCTAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGCGGAAGGCGGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCCAATGAGGGCACCATCTCACTGCCTTGCCAGACATTTTACCAAGTGTGCCATGAAACAGTAGGAAAGTTTATCCAGTATGGCATTCTTACAGTGGCAGAGCACGATGACCAGGAAGATATCAGTCCTAGTCTTGCTGAGCAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCTGAACCTTTGTCTTGGAGAAGTGATGAAGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGGGAGGAACAGCGAGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAATCCAAGGAGCACCAGCAGTTTATCACCTTCTTACAGAGACTCCTTGGGCCTTTGCTGGAGGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTTCACAACTTTAGCGGCCCTGTTCCAGAACCTGAATATCTGCAAAAGTTGCACAAATACCTAGTAACCAGAACAGAAAGAAATGTTGCAGTATATGCTGAGAGTGCCACATACTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGATATTGGGGTTTTCAAGGAGACCAAACAAAAGAGAGTGTCTGTTTTAGAACTGAGCAGCACTTTTCTACCTCAATGCAACCGGCAAAAACTTCTAGAATATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTG TAGGTAACGTGTGGCACCGCTGGCAAATGAAGGTCATGAGATGAGTCCCTTGTAGGTACCAGCTTCTGGCTCGAGAGTTGAAGGTGCCGTCGCAAGGTCACGCCTGCCCTGTCCCGCAGTGATCTCCTGGAAGACAAGTGCCTTCTCCCTCCATGGATCTGTGATCTTCCCAGCTCTGCATCCACACAGCAGCCTGCAGATAACACTTGGGGGGACCTCAGCCTCTATTCGCAACTCACAATCCGTAGACTACAAGATGAAATCTCAATACATTATTTTGGAGTTTATTAAAGATTGACATTTTAAGTACAACTTTTAAGGACTAATTACTGTGATGGACACAGAAATGTAGCTGTGTTCTAGAACTGAATCTTATATGGTATACTTAGTGCTATTGGGTAATTTGTTGGTATATTATCTGGTTAATGGTTAATGCTTCCTTTAAAAATAATTGAGTCATCCATTCACTCTTTTTCAGTTTTATCTTTGTCAATAGTAGCTACATTTTTAATGGGAGTACCTTTTATCCCAAGTGCTTTATAAATGAATGGACTGATATATATCACACCCAGGTATCACTGTGCTGTCCTTTGCAGTCAGATATAGAAAATGTTTTTAAGAGGTATGTGAAAACAGACAGTATTAGTTTAGGTCGGGAACTGAGATATTGTAATCAAATAGTTAACATCAGGAAGTTAATTTGGCTGGCAAAATTCTAGGGAAACTTGGCCAGAAAACTGGTGTTGAAGGCTTTTGCTCATATAAAAAAGTGCCATTGAGTTTTAAATGACCAGCAAATATTTAGAACCCTTCCTGTTTTATGTCTGTACCCCGTCTACCCCTCAGGTAATACCTGCTTCTCACGGGTACAGCTGTTTCTTGGAAATCCTCCAACCAAATAGCAACTTTCCTAACTTGATTAGCTTGAGCTGACAGACTCTGTTAGAATACAGTGCTCTGGCCACAACTGATGAGGGCTTTCTGTACTGCACACAGATTGTGTACTGCACCCCAGTCCAGGTGACTGGTGCCCACTTGAGTTGTGCCGTGCACAACCTGTCCAGTATATGCATGTGGTGGCCCTACTGACTGGTAATGGTTAGAGGCATTTGTGAATTTTTAGCTTTGAGGAAAAACCATGACTTTTAACAAATTTTTATGGGTTATATGCCTAAACCATTATGCCACGTAGTGGTAAATAATTATGAAAAATGGTCTGTTCATAATTGGTAGGTGCCTTTTGTGAACAGGGAGCATAATTATTAGTTTATTATGGTAATTATGGTGATTTCTTGAATATCATGTAATGTTAAAACATTTTCTAACAGTTTACTGTTGCTTATCTCTAAGATATTATGGAATTAAGAATTTTTCCAGATGAGTGTTACATAGTTTCTTTGAATTTAGTATAAAAATACTGAGAATTAAGTTTGTACTTCTATAAGCTTGGGTTTTAAACACTAATAGTGTCTCATGAGTAACGTGTGTTTTGGGAGAGGGAGGGATGCTGATTGATATTTCACATTGTATGAAGTATCACGTTTGAAACTGGTAGCAATAATGCTATGCTGTTGTGATCCCTCTCAAGTTCTGCATTTAAAAGATATTTTTTCTTGATAGGAATTGAGGTACTGTTAAGTCATTGTCAGTTGTAGTAGCTCTGATGTTAATGAGATAATCACGTTTTAGCATTCCATTTTACTGACTAGGGTGGAAGAACACTTTTCTCGGCTACATTTGGAGGATACCCAGGGAGTCTTGGGTGTTCCTTATGTGGGGAATCAAACATTTCACTAGTCTCTTTTTTTCATCCTTTAAATTGTAGATTAAGGATTACTCAAGCTCACCATTATTCAAGGTTGGGACTCACTTCCCAGTGGATACTCTGCCCTGCCTGTCACTGCTGCAAAGAGCTGCTGCTTCGCCAGCCTAAGCAGAGAAAATATGGCTTCTCTTGCATTATTTTCCCTTTTGGTTGGTTTGTTTTCTAGAAGTTTGATCAGATGCTTTGAGGAATGCAATGTATGATTTGCTAGCTCTCTTACCACTTAAGTCACTGTGAGGATAAATATGCATGCATTTTGTAATTAACTGGTGCTTTGAAAATCTTTTTTAAGGGAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCATCCAGACAAGCTGACCTTTGAGTTAATTTCAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATGACCGAAAAACAAAAAACAAAAAAGAAAGCATCTTCACAATAAAGCTTCCAGATAGCACCGTTTTGCTAAAAGATACGTTCTCATTGTTTTCCAACAGTGATGGCTTCCATGTAAGGTTAAACAAACTAGGTGCTTGTAAATAATTTTATTACAGTTTACTCTATTGCATTTCTATAACATGAAATGCATGCCCTTCAGGGGAAGACTGTGAGTCAAGTTAAAAAAAAATATTAAGCAATATGCAACTGCTCTCTGTTTTTAAAAATGAGAATGTCCTAAGTGATTCAGAAGAGAGGAAGGAATTTATGTACTCTTAAAATTGCATGAAAAACAAGGCAAAAACTAGTGTGAAATGTGTAGAACTGTTAACTGAGATGGCATTGAGTCTTCCTTCTGAAATCTGTTAAATCTCACAAAGTCATGAGGGTATATGGAGAAAATATTTCTGGGATTACAATGAATGTAATCCCAGATTGTGGAATTTCCAGTAACCTGGACCGGGAAAAGCATTTCCCATAGTACTCCATGTAATATGAGTGCTCTGTGAGATGTTCATCAGTGTTTTATAGAAATGGTGTTGCTGGGAACTAAGTTTGCACATGGAGACTTACAATGCACTTTAGCGCAGTAAGGGCTTGGCATCTGGCAGTGAAAAACTGTTCAACCCAGCATTGCCCAAACTATTTTGACATCAGGACCTTTTTCTCCTTTGGGATACCTGTGAACCTCTCACTACTGTCCTGTGGAGAACATTTTGGGAAACACTGTTAGATAGTTCTTTAAGGAGACAAAACGGTAATGAACACATGGCACTGGGGCAGAATTCACATGCATTTTGTAACATCCAGTGTGGCATGGAATAGATGTGTATTTCCTCCCCTAAAGAAAATAAGCACAGAAAATTATATTGTAGGTGATCGGAGCTCTTTCCTTTGATAGAAAGAACAGCCCCAATGATCCTGGCTTTTTCACTGAACATATCAGAATACATGGATGAGTTGGGGTTAATAAGGTTTTCATTCAGATGTAGAAGAAAGTATTGTACAATTGAATGCAGATTTTTATCCACAGACAGTTGTAGTGTTTAGACGTGACAGGACCTATCGTTGAGGTTTATAAGACTTACTATGGGCTGTAAACCTATTTTTTAAAACTCTTTTTAGAAACCTGAGACTTGTCATCTGGCATTTTAGTTTAATACAAACTAATGATTGCATTTGAAAGAGATTCTTGACCTTATTTCTGAACATCTAAAGCTCTGAAATGTCTTGATGGAAGGTATTAAACTATTTGCCTGTTGTATAAAGAAATGTTAAGACTGTTGTGAAAAGAATTACTGTAAGGTACTGTGAAATGACTGTGATTTTTGTGAGCGAAACATACTTGGAAATACTGAATTGATTTTTATGCTTGTTAATGTATTGCAAGAAACACAGAAAATGTAATTTTGTTTTAATAAACCAAAAAATGAACATA
SEQ ID NO:14
>SEQ ID NO:13的反向互补序列
TATGTTCATTTTTTGGTTTATTAAAACAAAATTACATTTTCTGTGTTTCTTGCAATACATTAACAAGCATAAAAATC
AATTCAGTATTTCCAAGTATGTTTCGCTCACAAAAATCACAGTCATTTCACAGTACCTTACAGTAATTCTTTTCACA
ACAGTCTTAACATTTCTTTATACAACAGGCAAATAGTTTAATACCTTCCATCAAGACATTTCAGAGCTTTAGATGTT
CAGAAATAAGGTCAAGAATCTCTTTCAAATGCAATCATTAGTTTGTATTAAACTAAAATGCCAGATGACAAGTCTCA
GGTTTCTAAAAAGAGTTTTAAAAAATAGGTTTACAGCCCATAGTAAGTCTTATAAACCTCAACGATAGGTCCTGTCA
CGTCTAAACACTACAACTGTCTGTGGATAAAAATCTGCATTCAATTGTACAATACTTTCTTCTACATCTGAATGAAA
ACCTTATTAACCCCAACTCATCCATGTATTCTGATATGTTCAGTGAAAAAGCCAGGATCATTGGGGCTGTTCTTTCT
ATCAAAGGAAAGAGCTCCGATCACCTACAATATAATTTTCTGTGCTTATTTTCTTTAGGGGAGGAAATACACATCTA
TTCCATGCCACACTGGATGTTACAAAATGCATGTGAATTCTGCCCCAGTGCCATGTGTTCATTACCGTTTTGTCTCC
TTAAAGAACTATCTAACAGTGTTTCCCAAAATGTTCTCCACAGGACAGTAGTGAGAGGTTCACAGGTATCCCAAAGG
AGAAAAAGGTCCTGATGTCAAAATAGTTTGGGCAATGCTGGGTTGAACAGTTTTTCACTGCCAGATGCCAAGCCCTT
ACTGCGCTAAAGTGCATTGTAAGTCTCCATGTGCAAACTTAGTTCCCAGCAACACCATTTCTATAAAACACTGATGA
ACATCTCACAGAGCACTCATATTACATGGAGTACTATGGGAAATGCTTTTCCCGGTCCAGGTTACTGGAAATTCCAC
AATCTGGGATTACATTCATTGTAATCCCAGAAATATTTTCTCCATATACCCTCATGACTTTGTGAGATTTAACAGAT
TTCAGAAGGAAGACTCAATGCCATCTCAGTTAACAGTTCTACACATTTCACACTAGTTTTTGCCTTGTTTTTCATGC
AATTTTAAGAGTACATAAATTCCTTCCTCTCTTCTGAATCACTTAGGACATTCTCATTTTTAAAAACAGAGAGCAGT
TGCATATTGCTTAATATTTTTTTTTAACTTGACTCACAGTCTTCCCCTGAAGGGCATGCATTTCATGTTATAGAAAT
GCAATAGAGTAAACTGTAATAAAATTATTTACAAGCACCTAGTTTGTTTAACCTTACATGGAAGCCATCACTGTTGG
AAAACAATGAGAACGTATCTTTTAGCAAAACGGTGCTATCTGGAAGCTTTATTGTGAAGATGCTTTCTTTTTTGTTT
TTTGTTTTTCGGTCATGAGGCACTGAAGAATGAGTTGTGCTGAAATTAACTCAAAGGTCAGCTTGTCTGGATGAGCA
TAACTTTGGTTGAGATTTTTCTCCCTTAAAAAAGATTTTCAAAGCACCAGTTAATTACAAAATGCATGCATATTTAT
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AAAACAAACCAACCAAAAGGGAAAATAATGCAAGAGAAGCCATATTTTCTCTGCTTAGGCTGGCGAAGCAGCAGCTC
TTTGCAGCAGTGACAGGCAGGGCAGAGTATCCACTGGGAAGTGAGTCCCAACCTTGAATAATGGTGAGCTTGAGTAA
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ATTATCTCATTAACATCAGAGCTACTACAACTGACAATGACTTAACAGTACCTCAATTCCTATCAAGAAAAAATATC
TTTTAAATGCAGAACTTGAGAGGGATCACAACAGCATAGCATTATTGCTACCAGTTTCAAACGTGATACTTCATACA
ATGTGAAATATCAATCAGCATCCCTCCCTCTCCCAAAACACACGTTACTCATGAGACACTATTAGTGTTTAAAACCC
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AAATTCTTAATTCCATAATATCTTAGAGATAAGCAACAGTAAACTGTTAGAAAATGTTTTAACATTACATGATATTC
AAGAAATCACCATAATTACCATAATAAACTAATAATTATGCTCCCTGTTCACAAAAGGCACCTACCAATTATGAACA
GACCATTTTTCATAATTATTTACCACTACGTGGCATAATGGTTTAGGCATATAACCCATAAAAATTTGTTAAAAGTC
ATGGTTTTTCCTCAAAGCTAAAAATTCACAAATGCCTCTAACCATTACCAGTCAGTAGGGCCACCACATGCATATAC
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AAAGTTGCTATTTGGTTGGAGGATTTCCAAGAAACAGCTGTACCCGTGAGAAGCAGGTATTACCTGAGGGGTAGACG
GGGTACAGACATAAAACAGGAAGGGTTCTAAATATTTGCTGGTCATTTAAAACTCAATGGCACTTTTTTATATGAGC
AAAAGCCTTCAACACCAGTTTTCTGGCCAAGTTTCCCTAGAATTTTGCCAGCCAAATTAACTTCCTGATGTTAACTA
TTTGATTACAATATCTCAGTTCCCGACCTAAACTAATACTGTCTGTTTTCACATACCTCTTAAAAACATTTTCTATA
TCTGACTGCAAAGGACAGCACAGTGATACCTGGGTGTGATATATATCAGTCCATTCATTTATAAAGCACTTGGGATA
AAAGGTACTCCCATTAAAAATGTAGCTACTATTGACAAAGATAAAACTGAAAAAGAGTGAATGGATGACTCAATTAT
TTTTAAAGGAAGCATTAACCATTAACCAGATAATATACCAACAAATTACCCAATAGCACTAAGTATACCATATAAGA
TTCAGTTCTAGAACACAGCTACATTTCTGTGTCCATCACAGTAATTAGTCCTTAAAAGTTGTACTTAAAATGTCAAT
CTTTAATAAACTCCAAAATAATGTATTGAGATTTCATCTTGTAGTCTACGGATTGTGAGTTGCGAATAGAGGCTGAG
GTCCCCCCAAGTGTTATCTGCAGGCTGCTGTGTGGATGCAGAGCTGGGAAGATCACAGATCCATGGAGGGAGAAGGC
ACTTGTCTTCCAGGAGATCACTGCGGGACAGGGCAGGCGTGACCTTGCGACGGCACCTTCAACTCTCGAGCCAGAAG
CTGGTACCTACAAGGGACTCATCTCATGACCTTCATTTGCCAGCGGTGCCACACGTTACCTACAGCACCACAAAACT
CAGAATATATTCTAGAAGTTTTTGCCGGTTGCATTGAGGTAGAAAAGTGCTGCTCAGTTCTAAAACAGACACTCTCT
TTTGTTTGGTCTCCTTGAAAACCCCAATATCCTTAAACATTTTCACAGCATTCTTCACAAGACAGTATGTGGCACTC
TCAGCATATACTGCAACATTTCTTTCTGTTCTGGTTACTAGGTATTTGTGCAACTTTTGCAGATATTCAGGTTCTGG
AACAGGGCCGCTAAAGTTGTGAACAAAGATGGCAGCAGAGCTGTAGGCCTCCAGCAAAGGCCCAAGGAGTCTCTGTA
AGAAGGTGATAAACTGCTGGTGCTCCTTGGATTGGCTCACCTTCAGGTAGCAATCTCGCTGTTCCTCCCCAAAGTCA
CTGTCTTCATCTTCTTCATCACTTCTCCAAGACAAAGGTTCAGGAAGCTTCTTGTCCCACTGCTGCTCAGCAAGACT
AGGACTGATATCTTCCTGGTCATCGTGCTCTGCCACTGTAAGAATGCCATACTGGATAAACTTTCCTACTGTTTCAT
GGCACACTTGGTAAAATGTCTGGCAAGGCAGTGAGATGGTGCCCTCATTGGAGAGAAGGTAGCACAGGCTGGCCGCC
TTCCGCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTAGGTGGGGTGCCAGTGGGCCCCCCTAATCCCCTCTTGTTCAGAAC
TGCATAAAGGCTGCAAGCTATGATGGCCTCCATGATAAAGACATGAAGTACCCCATTGCTGTAGAAGTTGAGTTCGA
AGACTGCTGGGACAGTTGTGCTGGGGGTGATAAAAAACTCATCGTTCCTGCTAGTGTGAGTGATTGTGACGCAATTT
CCCAGCAGCTGTATGGCATGCATTACTACATCTTCTGAATTTCCTGAGAACCCCAGGTCAAAATCACGAGCCAGGAC
TTCCTCTTTCATCACAAAGAAGTCTTCCACCAATGTGGAGAGATCAATTCCCTGCCTGTGTCTGTAGAGGAGTAGGC
AAGCCACAATGTGTGTGGACATAATGGCACAGGACTTGCTAGCAGTGAATAGAATATGCTCAGCCAGATTTGCAATC
AACCTCCTTCGTAGGAATTCATCTGTTGCATTTCTGGACTCATTAATGGATGTGTCTCTACCTTCATCAGCAGCATC
ATTGGGTCTTGAAGGAAGTATAGCTGGTAACAACGCTTGCTCCAGAGAAAGTGGAGCAGACACCGGTTTCTGACTTT
GGCTTTCTAAATATTCCTTTAAGGAAAACGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACACAACCATAGTTTTTTCGTAACATT
CTAATAACACCTCTTGCTATACTCCACAGGCTCTCATTCTTCTTTGGCTTGCCCAGTTGTTCGCCATTGTAGTGACC
TTCGATAATACGATCATAGGAGATTCCAACAGGTATTATCAAGATGTCTGGGATGACATTGGTAGATAGAGTATCTA
CCACAACTGACAAAAGTCCCGCCCGAGCACAGGAGGTTTTTCCACTCCTAGAACGTGTGCCTTCCAGGAAGATCTCC
AAGAATTGCTGCTGTCGAAGTAATTCAACTATATGCCCATGGAGCAAAGCTCTGTAGAGAACATCTTTCCGTCCATC
TGGTGTTTCATCGAGCCTTCGTCGTATGAAGAAGCCCCCAAGCTTATGGATCAAAGTACTGAAGATTGGGATATGGA
GATTATTGCCTGAAGCAATGTATGGTGCTTTGATGTTATGGCAGAAGAGAATGAAAGTGAGCAGCAGATAGTCAATA
TGGGATCTATGAACTGGTAGAAACAGAAGCGGCAAATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTAACCATCTCAAGTTGACCTTT
GTGAATTTGAATGTTCCAAAAGAAGCTGTTGAACAGTTTTAGCAGCACCCACCCAGTCAGTCTGATCATTGCCGGTG
AGACAGTGGCAACCATTTCTTGAAGAATCCTTTTAGCTTTCTTTTTCACTTTGTTAACGGCTTTTGATTGCTGCTGG
GCAGAACCATCAGGGTTTAATTCAGCAGCCACTTCTGCAATTGCCTCTTGTACTCTACTGCTGTTCAGCACATTTTC
AGTCACATTGGTGGCAAACATGCCCTTATGCACATCTCGCTCTTGAATAAAAAGAACATAAGAAAGGCGTCTTGCAA
GCCATCCCCGGTGTCTTGTGTGAGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAAAGATGGGATACTGGGGTTG
AAAAATCTGTCCCAGCTCTGGGGAGTGCAGGAGTAACAACATCTTCCAACAAATGGCCTTTTCCGACTCATTAGGCT
TTCTTTCCATTTTAAAGTTGCAGATCTGAAGACAGTAGGTCTAAAACCACACTCACCCCATTCCTCACTTGTGTGCT
TACATCGACCAACACTGTATTCTGATGAATTCGGCAGATAAGAAACATCTATTGTACCAAGGGTCAGTGCAGATTCA
TCCATGTCACAAAGTGTAATTCCCAAATCATGTGCTGGGATGAAAGTTCTTCTGTTTCATAACATAAAACTTCAGGA
CTCAGCTATCAGTTTCGGGTGCAGAATGTCCATACAACAGGGGAGCCGCTGCTGCCTGTATCCTTGACTTGGTGGTG
TTTGAGGAATTATTTCCAATCAGTCGATTAGCAAAGGTGATGGAGACTCTGGAGAAGACAGTCCCAGGCTGTGGGTG
AATAAGAAGCAAGGTCTACTTCCTCTGGGTGCCCCTCTGCACGGCCAGAGGCTGACGGACTTTGGGTGCTCCACAGT
AACCTCAGAAAGAGTCCCCCCCGCAACAGCAAATTCTCCCAGAGCAGTTTTGAAACACCACA
SEQ ID NO:15
>XM_005566426.2预测的:食蟹猴线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),转录物变体X2,mRNA GCATTGGCCGGGACTTGAAGTGCGGGGTGCTGCAGCAGCCGAAGCCGGAGCTGCTAGGGTGCGAACTGCGAGAGCAGGTGTGGGCTGCGAGAGGCTGCTCTGGCCGGGAGCGCCGGGACAAGCAGCAGCGGCTCCCCTGTTGTATGGACATTCTGCACCCGAAACTGATAGCTGAGTCCTGAAGTTTTATGTTATGAAACAGAAGAACTTTCATCCCAGCACATGATTTGGGAATTACACTTTGTGACATGGATGAATCTGCACTGACCCTTGGTACAATAGATGTTTCTTATCTGCCGAATTCATCAGAATACAGTGTTGGTCGATGTAAGCACACAAGTGAGGAATGGGGTGAGTGTGGTTTTAGACCTACTGTCTTCAGATCTGCAACTTTAAAATGGAAAGAAAGCCTAATGAGTCGGAAAAGGCCATTTGTTGGAAGATGTTGTTACTCCTGCACTCCCCAGAGCTGGGACAGATTTTTCAACCCCAGTATCCCATCTTTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAATGAAACTCACACAAGACACCGGGGATGGCTTGCAAGACGCCTTTCTTATGTTCTTTTTATTCAAGAGCGAGATGTGCATAAGGGCATGTTTGCCACCAATGTGACTGAAAATGTGCTGAACAGCAGTAGAGTACAAGAGGCAATTGCAGAAGTGGCTGCTGAATTAAACCCTGATGGTTCTGCCCAGCAGCAATCAAAAGCCGTTAACAAAGTGAAAAAGAAAGCTAAAAGGATTCTTCAAGAAATGGTTGCCACTGTCTCACCGGCAATGATCAGACTGACTGGGTGGGTGCTGCTAAAACTGTTCAACAGCTTCTTTTGGAACATTCAAATTCACAAAGGTCAACTTGAGATGGTTAAAGCTGCAACTGAGACGAATTTGCCGCTTCTGTTTCTACCAGTTCATAGATCCCATATTGACTATCTGCTGCTCACTTTCATTCTCTTCTGCCATAACATCAAAGCACCATACATTGCTTCAGGCAATAATCTCCATATCCCAATCTTCAGTACTTTGATCCATAAGCTTGGGGGCTTCTTCATACGACGAAGGCTCGATGAAACACCAGATGGACGGAAAGATGTTCTCTACAGAGCTTTGCTCCATGGGCATATAGTTGAATTACTTCGACAGCAGCAATTCTTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACACGTTCTAGGAGTGGAAAAACCTCCTGTGCTCGGGCGGGACTTTTGTCAGTTGTGGTAGATACTCTATCTACCAATGTCATCCCAGACATCTTGATAATACCTGTTGGAATCTCCTATGATCGTATTATCGAAGGTCACTACAATGGCGAACAACTGGGCAAGCCAAAGAAGAATGAGAGCCTGTGGAGTATAGCAAGAGGTGTTATTAGAATGTTACGAAAAAACTATGGTTGTGTCCGAGTGGATTTTGCACAGCCGTTTTCCTTAAAGGAATATTTAGAAAGCCAAAGTCAGAAACCGGTGTCTGCTCCACTTTCTCTGGAGCAAGCGTTGTTACCAGCTATACTTCCTTCAAGACCCAATGATGCTGCTGATGAAGGTAGAGACACATCCATTAATGAGTCCAGAAATGCAACAGATGAATTCCTACGAAGGAGGTTGATTGCAAATCTGGCTGAGCATATTCTATTCACTGCTAGCAAGTCCTGTGCCATTATGTCCACACACATTGTGGCTTGCCTACTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATTGATCTCTCCACATTGGTGGAAGACTTCTTTGTGATGAAAGAGGAAGTCCTGGCTCGTGATTTTGACCTGGGGTTCTCAGGAAATTCAGAAGATGTAGTAATGCATGCCATACAGCTGCTGGGAAATTGCGTCACAATCACTCACACTAGCAGGAACGATGAGTTTTTTATCACCCCCAGCACAACTGTCCCAGCAGTCTTCGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAGGCCATCATAGCTTGCAGCCTTTATGCAGTTCTGAACAAGAGGGGATTAGGGGGGCCCACTGGCACCCCACCTAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGCGGAAGGCGGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCCAATGAGGGCACCATCTCACTGCCTTGCCAGACATTTTACCAAGTGTGCCATGAAACAGTAGGAAAGTTTATCCAGTATGGCATTCTTACAGTGGCAGAGCACGATGACCAGGAAGATATCAGTCCTAGTCTTGCTGAGCAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCTGAACCTTTGTCTTGGAGAAGTGATGAAGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGGGAGGAACAGCGAGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAATCCAAGGAGCACCAGCAGTTTATCACCTTCTTACAGAGACTCCTTGGGCCTTTGCTGGAGGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTTCACAACTTTAGCGGCCCTGTTCCAGAACCTGAATATCTGCAAAAGTTGCACAAATACCTAGTAACCAGAACAGAAAGAAATGTTGCAGTATATGCTGAGAGTGCCACATACTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGATATTGGGGTTTTCAAGGAGACCAAACAAAAGAGAGTGTCTGTTTTAGAACTGAGCAGCACTTTTCTACCTCAATGCAACCGGCAAAAACTTCTAGAATATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGGTAACGTGTGGCACCGCTGGCAAATGAAGGTCATGAGATGAGTCCCTTGTAGGTACCAGCTTCTGGCTCGAGAGTTGAAGGTGCCGTCGCAAGGTCACGCCTGCCCTGTCCCGCAGTGATCTCCTGGAAGACAAGTGCCTTCTCCCTCCATGGATCTGTGATCTTCCCAGCTCTGCATCCACACAGCAGCCTGCAGATAACACTTGGGGGGACCTCAGCCTCTATTCGCAACTCACAATCCGTAGACTACAAGATGAAATCTCAATACATTATTTTGGAGTTTATTAAAGATTGACATTTTAAGTACAACTTTTAAGGACTAATTACTGTGATGGACACAGAAATGTAGCTGTGTTCTAGAACTGAATCTTATATGGTATACTTAGTGCTATTGGGTAATTTGTTGGTATATTATCTGGTTAATGGTTAATGCTTCCTTTAAAAATAATTGAGTCATCCATTCACTCTTTTTCAGTTTTATCTTTGTCAATAGTAGCTACATTTTTAATGGGAGTACCTTTTATCCCAAGTGCTTTATAAATGAATGGACTGATATATATCACACCCAGGTATCACTGTGCTGTCCTTTGCAGTCAGATATAGAAAATGTTTTTAAGAGGTATGTGAAAACAGACAGTATTAGTTTAGGTCGGGAACTGAGATATTGTAATCAAATAGTTAACATCAGGAAGTTAATTTGGCTGGCAAAATTCTAGGGAAACTTGGCCAG AAAACTGGTGTTGAAGGCTTTTGCTCATATAAAAAAGTGCCATTGAGTTTTAAATGACCAGCAAATATTTAGAACCCTTCCTGTTTTATGTCTGTACCCCGTCTACCCCTCAGGTAATACCTGCTTCTCACGGGTACAGCTGTTTCTTGGAAATCCTCCAACCAAATAGCAACTTTCCTAACTTGATTAGCTTGAGCTGACAGACTCTGTTAGAATACAGTGCTCTGGCCACAACTGATGAGGGCTTTCTGTACTGCACACAGATTGTGTACTGCACCCCAGTCCAGGTGACTGGTGCCCACTTGAGTTGTGCCGTGCACAACCTGTCCAGTATATGCATGTGGTGGCCCTACTGACTGGTAATGGTTAGAGGCATTTGTGAATTTTTAGCTTTGAGGAAAAACCATGACTTTTAACAAATTTTTATGGGTTATATGCCTAAACCATTATGCCACGTAGTGGTAAATAATTATGAAAAATGGTCTGTTCATAATTGGTAGGTGCCTTTTGTGAACAGGGAGCATAATTATTAGTTTATTATGGTAATTATGGTGATTTCTTGAATATCATGTAATGTTAAAACATTTTCTAACAGTTTACTGTTGCTTATCTCTAAGATATTATGGAATTAAGAATTTTTCCAGATGAGTGTTACATAGTTTCTTTGAATTTAGTATAAAAATACTGAGAATTAAGTTTGTACTTCTATAAGCTTGGGTTTTAAACACTAATAGTGTCTCATGAGTAACGTGTGTTTTGGGAGAGGGAGGGATGCTGATTGATATTTCACATTGTATGAAGTATCACGTTTGAAACTGGTAGCAATAATGCTATGCTGTTGTGATCCCTCTCAAGTTCTGCATTTAAAAGATATTTTTTCTTGATAGGAATTGAGGTACTGTTAAGTCATTGTCAGTTGTAGTAGCTCTGATGTTAATGAGATAATCACGTTTTAGCATTCCATTTTACTGACTAGGGTGGAAGAACACTTTTCTCGGCTACATTTGGAGGATACCCAGGGAGTCTTGGGTGTTCCTTATGTGGGGAATCAAACATTTCACTAGTCTCTTTTTTTCATCCTTTAAATTGTAGATTAAGGATTACTCAAGCTCACCATTATTCAAGGTTGGGACTCACTTCCCAGTGGATACTCTGCCCTGCCTGTCACTGCTGCAAAGAGCTGCTGCTTCGCCAGCCTAAGCAGAGAAAATATGGCTTCTCTTGCATTATTTTCCCTTTTGGTTGGTTTGTTTTCTAGAAGTTTGATCAGATGCTTTGAGGAATGCAATGTATGATTTGCTAGCTCTCTTACCACTTAAGTCACTGTGAGGATAAATATGCATGCATTTTGTAATTAACTGGTGCTTTGAAAATCTTTTTTAAGGGAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCATCCAGACAAGCTGACCTTTGAGTTAATTTCAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATGACCGAAAAACAAAAAACAAAAAAGAAAGCATCTTCACAATAAAGCTTCCAGATAGCACCGTTTTGCTAAAAGATACGTTCTCATTGTTTTCCAACAGTGATGGCTTCCATGTAAGGTTAAACAAACTAGGTGCTTGTAAATAATTTTATTACAGTTTACTCTATTGCATTTCTATAACATGAAATGCATGCCCTTCAGGGGAAGACTGTGAGTCAAGTTAAAAAAAAATATTAAGCAATATGCAACTGCTCTCTGTTTTTAAAAATGAGAATGTCCTAAGTGATTCAGAAGAGAGGAAGGAATTTATGTACTCTTAAAATTGCATGAAAAACAAGGCAAAAACTAGTGTGAAATGTGTAGAACTGTTAACTGAGATGGCATTGAGTCTTCCTTCTGAAATCTGTTAAATCTCACAAAGTCATGAGGGTATATGGAGAAAATATTTCTGGGATTACAATGAATGTAATCCCAGATTGTGGAATTTCCAGTAACCTGGACCGGGAAAAGCATTTCCCATAGTACTCCATGTAATATGAGTGCTCTGTGAGATGTTCATCAGTGTTTTATAGAAATGGTGTTGCTGGGAACTAAGTTTGCACATGGAGACTTACAATGCACTTTAGCGCAGTAAGGGCTTGGCATCTGGCAGTGAAAAACTGTTCAACCCAGCATTGCCCAAACTATTTTGACATCAGGACCTTTTTCTCCTTTGGGATACCTGTGAACCTCTCACTACTGTCCTGTGGAGAACATTTTGGGAAACACTGTTAGATAGTTCTTTAAGGAGACAAAACGGTAATGAACACATGGCACTGGGGCAGAATTCACATGCATTTTGTAACATCCAGTGTGGCATGGAATAGATGTGTATTTCCTCCCCTAAAGAAAATAAGCACAGAAAATTATATTGTAGGTGATCGGAGCTCTTTCCTTTGATAGAAAGAACAGCCCCAATGATCCTGGCTTTTTCACTGAACATATCAGAATACATGGATGAGTTGGGGTTAATAAGGTTTTCATTCAGATGTAGAAGAAAGTATTGTACAATTGAATGCAGATTTTTATCCACAGACAGTTGTAGTGTTTAGACGTGACAGGACCTATCGTTGAGGTTTATAAGACTTACTATGGGCTGTAAACCTATTTTTTAAAACTCTTTTTAGAAACCTGAGACTTGTCATCTGGCATTTTAGTTTAATACAAACTAATGATTGCATTTGAAAGAGATTCTTGACCTTATTTCTGAACATCTAAAGCTCTGAAATGTCTTGATGGAAGGTATTAAACTATTTGCCTGTTGTATAAAGAAATGTTAAGACTGTTGTGAAAAGAATTACTGTAAGGTACTGTGAAATGACTGTGATTTTTGTGAGCGAAACATACTTGGAAATACTGAATTGATTTTTATGCTTGTTAATGTATTGCAAGAAACACAGAAAATGTAATTTTGTTTTAATAAACCAAAAAATGAACATA
SEQ ID NO:16
>SEQ ID NO:15的反向互补序列
TATGTTCATTTTTTGGTTTATTAAAACAAAATTACATTTTCTGTGTTTCTTGCAATACATTAACAAGCATAAAAATC
AATTCAGTATTTCCAAGTATGTTTCGCTCACAAAAATCACAGTCATTTCACAGTACCTTACAGTAATTCTTTTCACA
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TGGACAGGTTGTGCACGGCACAACTCAAGTGGGCACCAGTCACCTGGACTGGGGTGCAGTACACAATCTGTGTGCAG
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GGGTACAGACATAAAACAGGAAGGGTTCTAAATATTTGCTGGTCATTTAAAACTCAATGGCACTTTTTTATATGAGC
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TTTGATTACAATATCTCAGTTCCCGACCTAAACTAATACTGTCTGTTTTCACATACCTCTTAAAAACATTTTCTATA
TCTGACTGCAAAGGACAGCACAGTGATACCTGGGTGTGATATATATCAGTCCATTCATTTATAAAGCACTTGGGATA
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TTTTAAAGGAAGCATTAACCATTAACCAGATAATATACCAACAAATTACCCAATAGCACTAAGTATACCATATAAGA
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CTTTAATAAACTCCAAAATAATGTATTGAGATTTCATCTTGTAGTCTACGGATTGTGAGTTGCGAATAGAGGCTGAG
GTCCCCCCAAGTGTTATCTGCAGGCTGCTGTGTGGATGCAGAGCTGGGAAGATCACAGATCCATGGAGGGAGAAGGC
ACTTGTCTTCCAGGAGATCACTGCGGGACAGGGCAGGCGTGACCTTGCGACGGCACCTTCAACTCTCGAGCCAGAAG
CTGGTACCTACAAGGGACTCATCTCATGACCTTCATTTGCCAGCGGTGCCACACGTTACCTACAGCACCACAAAACT
CAGAATATATTCTAGAAGTTTTTGCCGGTTGCATTGAGGTAGAAAAGTGCTGCTCAGTTCTAAAACAGACACTCTCT
TTTGTTTGGTCTCCTTGAAAACCCCAATATCCTTAAACATTTTCACAGCATTCTTCACAAGACAGTATGTGGCACTC
TCAGCATATACTGCAACATTTCTTTCTGTTCTGGTTACTAGGTATTTGTGCAACTTTTGCAGATATTCAGGTTCTGG
AACAGGGCCGCTAAAGTTGTGAACAAAGATGGCAGCAGAGCTGTAGGCCTCCAGCAAAGGCCCAAGGAGTCTCTGTA
AGAAGGTGATAAACTGCTGGTGCTCCTTGGATTGGCTCACCTTCAGGTAGCAATCTCGCTGTTCCTCCCCAAAGTCA
CTGTCTTCATCTTCTTCATCACTTCTCCAAGACAAAGGTTCAGGAAGCTTCTTGTCCCACTGCTGCTCAGCAAGACT
AGGACTGATATCTTCCTGGTCATCGTGCTCTGCCACTGTAAGAATGCCATACTGGATAAACTTTCCTACTGTTTCAT
GGCACACTTGGTAAAATGTCTGGCAAGGCAGTGAGATGGTGCCCTCATTGGAGAGAAGGTAGCACAGGCTGGCCGCC
TTCCGCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTAGGTGGGGTGCCAGTGGGCCCCCCTAATCCCCTCTTGTTCAGAAC
TGCATAAAGGCTGCAAGCTATGATGGCCTCCATGATAAAGACATGAAGTACCCCATTGCTGTAGAAGTTGAGTTCGA
AGACTGCTGGGACAGTTGTGCTGGGGGTGATAAAAAACTCATCGTTCCTGCTAGTGTGAGTGATTGTGACGCAATTT
CCCAGCAGCTGTATGGCATGCATTACTACATCTTCTGAATTTCCTGAGAACCCCAGGTCAAAATCACGAGCCAGGAC
TTCCTCTTTCATCACAAAGAAGTCTTCCACCAATGTGGAGAGATCAATTCCCTGCCTGTGTCTGTAGAGGAGTAGGC
AAGCCACAATGTGTGTGGACATAATGGCACAGGACTTGCTAGCAGTGAATAGAATATGCTCAGCCAGATTTGCAATC
AACCTCCTTCGTAGGAATTCATCTGTTGCATTTCTGGACTCATTAATGGATGTGTCTCTACCTTCATCAGCAGCATC
ATTGGGTCTTGAAGGAAGTATAGCTGGTAACAACGCTTGCTCCAGAGAAAGTGGAGCAGACACCGGTTTCTGACTTT
GGCTTTCTAAATATTCCTTTAAGGAAAACGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACACAACCATAGTTTTTTCGTAACATT
CTAATAACACCTCTTGCTATACTCCACAGGCTCTCATTCTTCTTTGGCTTGCCCAGTTGTTCGCCATTGTAGTGACC
TTCGATAATACGATCATAGGAGATTCCAACAGGTATTATCAAGATGTCTGGGATGACATTGGTAGATAGAGTATCTA
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AAGAATTGCTGCTGTCGAAGTAATTCAACTATATGCCCATGGAGCAAAGCTCTGTAGAGAACATCTTTCCGTCCATC
TGGTGTTTCATCGAGCCTTCGTCGTATGAAGAAGCCCCCAAGCTTATGGATCAAAGTACTGAAGATTGGGATATGGA
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TGGGATCTATGAACTGGTAGAAACAGAAGCGGCAAATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTAACCATCTCAAGTTGACCTTT
GTGAATTTGAATGTTCCAAAAGAAGCTGTTGAACAGTTTTAGCAGCACCCACCCAGTCAGTCTGATCATTGCCGGTG
AGACAGTGGCAACCATTTCTTGAAGAATCCTTTTAGCTTTCTTTTTCACTTTGTTAACGGCTTTTGATTGCTGCTGG
GCAGAACCATCAGGGTTTAATTCAGCAGCCACTTCTGCAATTGCCTCTTGTACTCTACTGCTGTTCAGCACATTTTC
AGTCACATTGGTGGCAAACATGCCCTTATGCACATCTCGCTCTTGAATAAAAAGAACATAAGAAAGGCGTCTTGCAA
GCCATCCCCGGTGTCTTGTGTGAGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAAAGATGGGATACTGGGGTTG
AAAAATCTGTCCCAGCTCTGGGGAGTGCAGGAGTAACAACATCTTCCAACAAATGGCCTTTTCCGACTCATTAGGCT
TTCTTTCCATTTTAAAGTTGCAGATCTGAAGACAGTAGGTCTAAAACCACACTCACCCCATTCCTCACTTGTGTGCT
TACATCGACCAACACTGTATTCTGATGAATTCGGCAGATAAGAAACATCTATTGTACCAAGGGTCAGTGCAGATTCA
TCCATGTCACAAAGTGTAATTCCCAAATCATGTGCTGGGATGAAAGTTCTTCTGTTTCATAACATAAAACTTCAGGACTCAGCTATCAGTTTCGGGTGCAGAATGTCCATACAACAGGGGAGCCGCTGCTGCTTGTCCCGGCGCTCCCGGCCAGAGCAGCCTCTCGCAGCCCACACCTGCTCTCGCAGTTCGCACCCTAGCAGCTCCGGCTTCGGCTGCTGCAGCACCCCGCACTTCAAGTCCCGGCCAATGC
SEQ ID NO:17
>XM_005566425.2预测的:食蟹猴线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),转录物变体X3,mRNA
TCCACGCGCCGGTTGCGTCATCATGGTGCGCCATTGCAGCAGGCATTGGCCGGGACTTGAAGTGCGGGGTGCTGCAGCAGCCGAAGCCGGAGCTGCTAGGGTGCGAACTGCGAGAGCAGGCAGCAGCGGCTCCCCTGTTGTATGGACATTCTGCACCCGAAACTGATAGCTGAGTCCTGAAGTTTTATGTTATGAAACAGAAGAACTTTCATCCCAGCACATGATTTGGGAATTACACTTTGTGACATGGATGAATCTGCACTGACCCTTGGTACAATAGATGTTTCTTATCTGCCGAATTCATCAGAATACAGTGTTGGTCGATGTAAGCACACAAGTGAGGAATGGGGTGAGTGTGGTTTTAGACCTACTGTCTTCAGATCTGCAACTTTAAAATGGAAAGAAAGCCTAATGAGTCGGAAAAGGCCATTTGTTGGAAGATGTTGTTACTCCTGCACTCCCCAGAGCTGGGACAGATTTTTCAACCCCAGTATCCCATCTTTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAATGAAACTCACACAAGACACCGGGGATGGCTTGCAAGACGCCTTTCTTATGTTCTTTTTATTCAAGAGCGAGATGTGCATAAGGGCATGTTTGCCACCAATGTGACTGAAAATGTGCTGAACAGCAGTAGAGTACAAGAGGCAATTGCAGAAGTGGCTGCTGAATTAAACCCTGATGGTTCTGCCCAGCAGCAATCAAAAGCCGTTAACAAAGTGAAAAAGAAAGCTAAAAGGATTCTTCAAGAAATGGTTGCCACTGTCTCACCGGCAATGATCAGACTGACTGGGTGGGTGCTGCTAAAACTGTTCAACAGCTTCTTTTGGAACATTCAAATTCACAAAGGTCAACTTGAGATGGTTAAAGCTGCAACTGAGACGAATTTGCCGCTTCTGTTTCTACCAGTTCATAGATCCCATATTGACTATCTGCTGCTCACTTTCATTCTCTTCTGCCATAACATCAAAGCACCATACATTGCTTCAGGCAATAATCTCCATATCCCAATCTTCAGTACTTTGATCCATAAGCTTGGGGGCTTCTTCATACGACGAAGGCTCGATGAAACACCAGATGGACGGAAAGATGTTCTCTACAGAGCTTTGCTCCATGGGCATATAGTTGAATTACTTCGACAGCAGCAATTCTTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACACGTTCTAGGAGTGGAAAAACCTCCTGTGCTCGGGCGGGACTTTTGTCAGTTGTGGTAGATACTCTATCTACCAATGTCATCCCAGACATCTTGATAATACCTGTTGGAATCTCCTATGATCGTATTATCGAAGGTCACTACAATGGCGAACAACTGGGCAAGCCAAAGAAGAATGAGAGCCTGTGGAGTATAGCAAGAGGTGTTATTAGAATGTTACGAAAAAACTATGGTTGTGTCCGAGTGGATTTTGCACAGCCGTTTTCCTTAAAGGAATATTTAGAAAGCCAAAGTCAGAAACCGGTGTCTGCTCCACTTTCTCTGGAGCAAGCGTTGTTACCAGCTATACTTCCTTCAAGACCCAATGATGCTGCTGATGAAGGTAGAGACACATCCATTAATGAGTCCAGAAATGCAACAGATGAATTCCTACGAAGGAGGTTGATTGCAAATCTGGCTGAGCATATTCTATTCACTGCTAGCAAGTCCTGTGCCATTATGTCCACACACATTGTGGCTTGCCTACTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATTGATCTCTCCACATTGGTGGAAGACTTCTTTGTGATGAAAGAGGAAGTCCTGGCTCGTGATTTTGACCTGGGGTTCTCAGGAAATTCAGAAGATGTAGTAATGCATGCCATACAGCTGCTGGGAAATTGCGTCACAATCACTCACACTAGCAGGAACGATGAGTTTTTTATCACCCCCAGCACAACTGTCCCAGCAGTCTTCGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAGGCCATCATAGCTTGCAGCCTTTATGCAGTTCTGAACAAGAGGGGATTAGGGGGGCCCACTGGCACCCCACCTAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTGCGGAAGGCGGCCAGCCTGTGCTACCTTCTCTCCAATGAGGGCACCATCTCACTGCCTTGCCAGACATTTTACCAAGTGTGCCATGAAACAGTAGGAAAGTTTATCCAGTATGGCATTCTTACAGTGGCAGAGCACGATGACCAGGAAGATATCAGTCCTAGTCTTGCTGAGCAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCTGAACCTTTGTCTTGGAGAAGTGATGAAGAAGATGAAGACAGTGACTTTGGGGAGGAACAGCGAGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAATCCAAGGAGCACCAGCAGTTTATCACCTTCTTACAGAGACTCCTTGGGCCTTTGCTGGAGGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTTCACAACTTTAGCGGCCCTGTTCCAGAACCTGAATATCTGCAAAAGTTGCACAAATACCTAGTAACCAGAACAGAAAGAAATGTTGCAGTATATGCTGAGAGTGCCACATACTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGATATTGGGGTTTTCAAGGAGACCAAACAAAAGAGAGTGTCTGTTTTAGAACTGAGCAGCACTTTTCTACCTCAATGCAACCGGCAAAAACTTCTAGAATATATTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGGTAACGTGTGGCACCGCTGGCAAATGAAGGTCATGAGATGAGTCCCTTGTAGGTACCAGCTTCTGGCTCGAGAGTTGAAGGTGCCGTCGCAAGGTCACGCCTGCCCTGTCCCGCAGTGATCTCCTGGAAGACAAGTGCCTTCTCCCTCCATGGATCTGTGATCTTCCCAGCTCTGCATCCACACAGCAGCCTGCAGATAACACTTGGGGGGACCTCAGCCTCTATTCGCAACTCACAATCCGTAGACTACAAGATGAAATCTCAATACATTATTTTGGAGTTTATTAAAGATTGACATTTTAAGTACAACTTTTAAGGACTAATTACTGTGATGGACACAGAAATGTAGCTGTGTTCTAGAACTGAATCTTATATGGTATACTTAGTGCTATTGGGTAATTTGTTGGTATATTATCTGGTTAATGGTTAATGCTTCCTTTAAAAATAATTGAGTCATCCATTCACTCTTTTTCAGTTTTATCTTTGTCAATAGTAGCTACATTTTTAATGGGAGTACCTTTTATCCCAAGTGCTTTATAAATGAATGGACTGATATATATCACACCCAGGTATCACTGTGCTGTCCTTTGCAGTCAGATATAGAAAATGTTTTTAAGAGGTATGTGAAAACAGACAGTATTAGTTTAGGTCGGGAACTGAGATATTGTAATCAAATAGTTAACATCAGGAAGTTAATTTGGCTGGCAAAATTCTAGGGAAACTTGGCCAGAAAACTGGTGTTGAAGGCTTTTGCTCATATAAAAAAGTGCCATTGAGTTTTAAATGACCAGCAAATATTTAGAACCCTTCCTGTTTTATGTCTGTACCCCGTCTACCCCTCAGGTAATACCTGCTTCTCACGGGTACAGCTGTTTCTTGGAAATCCTCCAACCAAATAGCAACTTTCCTAACTTGATTAGCTTGAGCTGACAGACTCTGTTAGAATACAGTGCTCTGGCCACAACTGATGAGGGCTTTCTGTACTGCACACAGATTGTGTACTGCACCCCAGTCCAGGTGACTGGTGCCCACTTGAGTTGTGCCGTGCACAACCTGTCCAGTATATGCATGTGGTGGCCCTACTGACTGGTAATGGTTAGAGGCATTTGTGAATTTTTAGCTTTGAGGAAAAACCATGACTTTTAACAAATTTTTATGGGTTATATGCCTAAACCATTATGCCACGTAGTGGTAAATAATTATGAAAAATGGTCTGTTCATAATTGGTAGGTGCCTTTTGTGAACAGGGAGCATAATTATTAGTTTATTATGGTAATTATGGTGATTTCTTGAATATCATGTAATGTTAAAACATTTTCTAACAGTTTACTGTTGCTTATCTCTAAGATATTATGGAATTAAGAATTTTTCCAGATGAGTGTTACATAGTTTCTTTGAATTTAGTATAAAAATACTGAGAATTAAGTTTGTACTTCTATAAGCTTGGGTTTTAAACACTAATAGTGTCTCATGAGTAACGTGTGTTTTGGGAGAGGGAGGGATGCTGATTGATATTTCACATTGTATGAAGTATCACGTTTGAAACTGGTAGCAATAATGCTATGCTGTTGTGATCCCTCTCAAGTTCTGCATTTAAAAGATATTTTTTCTTGATAGGAATTGAGGTACTGTTAAGTCATTGTCAGTTGTAGTAGCTCTGATGTTAATGAGATAATCACGTTTTAGCATTCCATTTTACTGACTAGGGTGGAAGAACACTTTTCTCGGCTACATTTGGAGGATACCCAGGGAGTCTTGGGTGTTCCTTATGTGGGGAATCAAACATTTCACTAGTCTCTTTTTTTCATCCTTTAAATTGTAGATTAAGGATTACTCAAGCTCACCATTATTCAAGGTTGGGACTCACTTCCCAGTGGATACTCTGCCCTGCCTGTCACTGCTGCAAAGAGCTGCTGCTTCGCCAGCCTAAGCAGAGAAAATATGGCTTCTCTTGCATTATTTTCCCTTTTGGTTGGTTTGTTTTCTAGAAGTTTGATCAGATGCTTTGAGGAATGCAATGTATGATTTGCTAGCTCTCTTACCACTTAAGTCACTGTGAGGATAAATATGCATGCATTTTGTAATTAACTGGTGCTTTGAAAATCTTTTTTAAGGGAGAAAAATCTCAACCAAAGTTATGCTCATCCAGACAAGCTGACCTTTGAGTTAATTTCAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATGACCGAAAAACAAAAAACAAAAAAGAAAGCATCTTCACAATAAAGCTTCCAGATAGCACCGTTTTGCTAAAAGATACGTTCTCATTGTTTTCCAACAGTGATGGCTTCCATGTAAGGTTAAACAAACTAGGTGCTTGTAAATAATTTTATTACAGTTTACTCTATTGCATTTCTATAACATGAAATGCATGCCCTTCAGGGGAAGACTGTGAGTCAAGTTAAAAAAAAATATTAAGCAATATGCAACTGCTCTCTGTTTTTAAAAATGAGAATGTCCTAAGTGATTCAGAAGAGAGGAAGGAATTTATGTACTCTTAAAATTGCATGAAAAACAAGGCAAAAACTAGTGTGAAATGTGTAGAACTGTTAACTGAGATGGCATTGAGTCTTCCTTCTGAAATCTGTTAAATCTCACAAAGTCATGAGGGTATATGGAGAAAATATTTCTGGGATTACAATGAATGTAATCCCAGATTGTGGAATTTCCAGTAACCTGGACCGGGAAAAGCATTTCCCATAGTACTCCATGTAATATGAGTGCTCTGTGAGATGTTCATCAGTGTTTTATAGAAATGGTGTTGCTGGGAACTAAGTTTGCACATGGAGACTTACAATGCACTTTAGCGCAGTAAGGGCTTGGCATCTGGCAGTGAAAAACTGTTCAACCCAGCATTGCCCAAACTATTTTGACATCAGGACCTTTTTCTCCTTTGGGATACCTGTGAACCTCTCACTACTGTCCTGTGGAGAACATTTTGGGAAACACTGTTAGATAGTTCTTTAAGGAGACAAAACGGTAATGAACACATGGCACTGGGGCAGAATTCACATGCATTTTGTAACATCCAGTGTGGCATGGAATAGATGTGTATTTCCTCCCCTAAAGAAAATAAGCACAGAAAATTATATTGTAGGTGATCGGAGCTCTTTCCTTTGATAGAAAGAACAGCCCCAATGATCCTGGCTTTTTCACTGAACATATCAGAATACATGGATGAGTTGGGGTTAATAAGGTTTTCATTCAGATGTAGAAGAAAGTATTGTACAATTGAATGCAGATTTTTATCCACAGACAGTTGTAGTGTTTAGACGTGACAGGACCTATCGTTGAGGTTTATAAGACTTACTATGGGCTGTAAACCTATTTTTTAAAACTCTTTTTAGAAACCTGAGACTTGTCATCTGGCATTTTAGTTTAATACAAACTAATGATTGCATTTGAAAGAGATTCTTGACCTTATTTCTGAACATCTAAAGCTCTGAAATGTCTTGATGGAAGGTATTAAACTATTTGCCTGTTGTATAAAGAAATGTTAAGACTGTTGTGAAAAGAATTACTGTAAGGTACTGTGAAATGACTGTGATTTTTGTGAGCGAAACATACTTGGAAATACTGAATTGATTTTTATGCTTGTTAATGTATTGCAAGAAACACAGAAAATGTAATTTTGTTTTAATAAACCAAAAAATGAACATA
SEQ ID NO:18
>SEQ ID NO:17的反向互补序列
TATGTTCATTTTTTGGTTTATTAAAACAAAATTACATTTTCTGTGTTTCTTGCAATACATTAACAAGCATAAAAATC
AATTCAGTATTTCCAAGTATGTTTCGCTCACAAAAATCACAGTCATTTCACAGTACCTTACAGTAATTCTTTTCACA
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GGTTTCTAAAAAGAGTTTTAAAAAATAGGTTTACAGCCCATAGTAAGTCTTATAAACCTCAACGATAGGTCCTGTCA
CGTCTAAACACTACAACTGTCTGTGGATAAAAATCTGCATTCAATTGTACAATACTTTCTTCTACATCTGAATGAAA
ACCTTATTAACCCCAACTCATCCATGTATTCTGATATGTTCAGTGAAAAAGCCAGGATCATTGGGGCTGTTCTTTCT
ATCAAAGGAAAGAGCTCCGATCACCTACAATATAATTTTCTGTGCTTATTTTCTTTAGGGGAGGAAATACACATCTA
TTCCATGCCACACTGGATGTTACAAAATGCATGTGAATTCTGCCCCAGTGCCATGTGTTCATTACCGTTTTGTCTCC
TTAAAGAACTATCTAACAGTGTTTCCCAAAATGTTCTCCACAGGACAGTAGTGAGAGGTTCACAGGTATCCCAAAGG
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AATCTGGGATTACATTCATTGTAATCCCAGAAATATTTTCTCCATATACCCTCATGACTTTGTGAGATTTAACAGAT
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AATTTTAAGAGTACATAAATTCCTTCCTCTCTTCTGAATCACTTAGGACATTCTCATTTTTAAAAACAGAGAGCAGT
TGCATATTGCTTAATATTTTTTTTTAACTTGACTCACAGTCTTCCCCTGAAGGGCATGCATTTCATGTTATAGAAAT
GCAATAGAGTAAACTGTAATAAAATTATTTACAAGCACCTAGTTTGTTTAACCTTACATGGAAGCCATCACTGTTGG
AAAACAATGAGAACGTATCTTTTAGCAAAACGGTGCTATCTGGAAGCTTTATTGTGAAGATGCTTTCTTTTTTGTTT
TTTGTTTTTCGGTCATGAGGCACTGAAGAATGAGTTGTGCTGAAATTAACTCAAAGGTCAGCTTGTCTGGATGAGCA
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CCTCACAGTGACTTAAGTGGTAAGAGAGCTAGCAAATCATACATTGCATTCCTCAAAGCATCTGATCAAACTTCTAG
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TTTGCAGCAGTGACAGGCAGGGCAGAGTATCCACTGGGAAGTGAGTCCCAACCTTGAATAATGGTGAGCTTGAGTAA
TCCTTAATCTACAATTTAAAGGATGAAAAAAAGAGACTAGTGAAATGTTTGATTCCCCACATAAGGAACACCCAAGA
CTCCCTGGGTATCCTCCAAATGTAGCCGAGAAAAGTGTTCTTCCACCCTAGTCAGTAAAATGGAATGCTAAAACGTG
ATTATCTCATTAACATCAGAGCTACTACAACTGACAATGACTTAACAGTACCTCAATTCCTATCAAGAAAAAATATC
TTTTAAATGCAGAACTTGAGAGGGATCACAACAGCATAGCATTATTGCTACCAGTTTCAAACGTGATACTTCATACA
ATGTGAAATATCAATCAGCATCCCTCCCTCTCCCAAAACACACGTTACTCATGAGACACTATTAGTGTTTAAAACCCAAGCTTATAGAAGTACAAACTTAATTCTCAGTATTTTTATACTAAATTCAAAGAAACTATGTAACACTCATCTGGAAAAATTCTTAATTCCATAATATCTTAGAGATAAGCAACAGTAAACTGTTAGAAAATGTTTTAACATTACATGATATTCAAGAAATCACCATAATTACCATAATAAACTAATAATTATGCTCCCTGTTCACAAAAGGCACCTACCAATTATGAACAGACCATTTTTCATAATTATTTACCACTACGTGGCATAATGGTTTAGGCATATAACCCATAAAAATTTGTTAAAAGTCATGGTTTTTCCTCAAAGCTAAAAATTCACAAATGCCTCTAACCATTACCAGTCAGTAGGGCCACCACATGCATATACTGGACAGGTTGTGCACGGCACAACTCAAGTGGGCACCAGTCACCTGGACTGGGGTGCAGTACACAATCTGTGTGCAGTACAGAAAGCCCTCATCAGTTGTGGCCAGAGCACTGTATTCTAACAGAGTCTGTCAGCTCAAGCTAATCAAGTTAGGAAAGTTGCTATTTGGTTGGAGGATTTCCAAGAAACAGCTGTACCCGTGAGAAGCAGGTATTACCTGAGGGGTAGACGGGGTACAGACATAAAACAGGAAGGGTTCTAAATATTTGCTGGTCATTTAAAACTCAATGGCACTTTTTTATATGAGCAAAAGCCTTCAACACCAGTTTTCTGGCCAAGTTTCCCTAGAATTTTGCCAGCCAAATTAACTTCCTGATGTTAACTATTTGATTACAATATCTCAGTTCCCGACCTAAACTAATACTGTCTGTTTTCACATACCTCTTAAAAACATTTTCTATATCTGACTGCAAAGGACAGCACAGTGATACCTGGGTGTGATATATATCAGTCCATTCATTTATAAAGCACTTGGGATAAAAGGTACTCCCATTAAAAATGTAGCTACTATTGACAAAGATAAAACTGAAAAAGAGTGAATGGATGACTCAATTATTTTTAAAGGAAGCATTAACCATTAACCAGATAATATACCAACAAATTACCCAATAGCACTAAGTATACCATATAAGATTCAGTTCTAGAACACAGCTACATTTCTGTGTCCATCACAGTAATTAGTCCTTAAAAGTTGTACTTAAAATGTCAATCTTTAATAAACTCCAAAATAATGTATTGAGATTTCATCTTGTAGTCTACGGATTGTGAGTTGCGAATAGAGGCTGAGGTCCCCCCAAGTGTTATCTGCAGGCTGCTGTGTGGATGCAGAGCTGGGAAGATCACAGATCCATGGAGGGAGAAGGCACTTGTCTTCCAGGAGATCACTGCGGGACAGGGCAGGCGTGACCTTGCGACGGCACCTTCAACTCTCGAGCCAGAAGCTGGTACCTACAAGGGACTCATCTCATGACCTTCATTTGCCAGCGGTGCCACACGTTACCTACAGCACCACAAAACTCAGAATATATTCTAGAAGTTTTTGCCGGTTGCATTGAGGTAGAAAAGTGCTGCTCAGTTCTAAAACAGACACTCTCTTTTGTTTGGTCTCCTTGAAAACCCCAATATCCTTAAACATTTTCACAGCATTCTTCACAAGACAGTATGTGGCACTCTCAGCATATACTGCAACATTTCTTTCTGTTCTGGTTACTAGGTATTTGTGCAACTTTTGCAGATATTCAGGTTCTGGAACAGGGCCGCTAAAGTTGTGAACAAAGATGGCAGCAGAGCTGTAGGCCTCCAGCAAAGGCCCAAGGAGTCTCTGTAAGAAGGTGATAAACTGCTGGTGCTCCTTGGATTGGCTCACCTTCAGGTAGCAATCTCGCTGTTCCTCCCCAAAGTCACTGTCTTCATCTTCTTCATCACTTCTCCAAGACAAAGGTTCAGGAAGCTTCTTGTCCCACTGCTGCTCAGCAAGACTAGGACTGATATCTTCCTGGTCATCGTGCTCTGCCACTGTAAGAATGCCATACTGGATAAACTTTCCTACTGTTTCATGGCACACTTGGTAAAATGTCTGGCAAGGCAGTGAGATGGTGCCCTCATTGGAGAGAAGGTAGCACAGGCTGGCCGCCTTCCGCACCAGCTGCTCCTGGCTGATCAGGTTAGGTGGGGTGCCAGTGGGCCCCCCTAATCCCCTCTTGTTCAGAACTGCATAAAGGCTGCAAGCTATGATGGCCTCCATGATAAAGACATGAAGTACCCCATTGCTGTAGAAGTTGAGTTCGAAGACTGCTGGGACAGTTGTGCTGGGGGTGATAAAAAACTCATCGTTCCTGCTAGTGTGAGTGATTGTGACGCAATTTCCCAGCAGCTGTATGGCATGCATTACTACATCTTCTGAATTTCCTGAGAACCCCAGGTCAAAATCACGAGCCAGGACTTCCTCTTTCATCACAAAGAAGTCTTCCACCAATGTGGAGAGATCAATTCCCTGCCTGTGTCTGTAGAGGAGTAGGCAAGCCACAATGTGTGTGGACATAATGGCACAGGACTTGCTAGCAGTGAATAGAATATGCTCAGCCAGATTTGCAATCAACCTCCTTCGTAGGAATTCATCTGTTGCATTTCTGGACTCATTAATGGATGTGTCTCTACCTTCATCAGCAGCATCATTGGGTCTTGAAGGAAGTATAGCTGGTAACAACGCTTGCTCCAGAGAAAGTGGAGCAGACACCGGTTTCTGACTTTGGCTTTCTAAATATTCCTTTAAGGAAAACGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACACAACCATAGTTTTTTCGTAACATTCTAATAACACCTCTTGCTATACTCCACAGGCTCTCATTCTTCTTTGGCTTGCCCAGTTGTTCGCCATTGTAGTGACCTTCGATAATACGATCATAGGAGATTCCAACAGGTATTATCAAGATGTCTGGGATGACATTGGTAGATAGAGTATCTACCACAACTGACAAAAGTCCCGCCCGAGCACAGGAGGTTTTTCCACTCCTAGAACGTGTGCCTTCCAGGAAGATCTCCAAGAATTGCTGCTGTCGAAGTAATTCAACTATATGCCCATGGAGCAAAGCTCTGTAGAGAACATCTTTCCGTCCATCTGGTGTTTCATCGAGCCTTCGTCGTATGAAGAAGCCCCCAAGCTTATGGATCAAAGTACTGAAGATTGGGATATGGAGATTATTGCCTGAAGCAATGTATGGTGCTTTGATGTTATGGCAGAAGAGAATGAAAGTGAGCAGCAGATAGTCAATATGGGATCTATGAACTGGTAGAAACAGAAGCGGCAAATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTAACCATCTCAAGTTGACCTTTGTGAATTTGAATGTTCCAAAAGAAGCTGTTGAACAGTTTTAGCAGCACCCACCCAGTCAGTCTGATCATTGCCGGTGAGACAGTGGCAACCATTTCTTGAAGAATCCTTTTAGCTTTCTTTTTCACTTTGTTAACGGCTTTTGATTGCTGCTGGGCAGAACCATCAGGGTTTAATTCAGCAGCCACTTCTGCAATTGCCTCTTGTACTCTACTGCTGTTCAGCACATTTTCAGTCACATTGGTGGCAAACATGCCCTTATGCACATCTCGCTCTTGAATAAAAAGAACATAAGAAAGGCGTCTTGCAAGCCATCCCCGGTGTCTTGTGTGAGTTTCATTGATATAAATAACATTCCGCAAACCCAAAGATGGGATACTGGGGTTGAAAAATCTGTCCCAGCTCTGGGGAGTGCAGGAGTAACAACATCTTCCAACAAATGGCCTTTTCCGACTCATTAGGCTTTCTTTCCATTTTAAAGTTGCAGATCTGAAGACAGTAGGTCTAAAACCACACTCACCCCATTCCTCACTTGTGTGCTTACATCGACCAACACTGTATTCTGATGAATTCGGCAGATAAGAAACATCTATTGTACCAAGGGTCAGTGCAGATTCATCCATGTCACAAAGTGTAATTCCCAAATCATGTGCTGGGATGAAAGTTCTTCTGTTTCATAACATAAAACTTCAGGACTCAGCTATCAGTTTCGGGTGCAGAATGTCCATACAACAGGGGAGCCGCTGCTGCCTGCTCTCGCAGTTCGCACCCTAGCAGCTCCGGCTTCGGCTGCTGCAGCACCCCGCACTTCAAGTCCCGGCCAATGCCTGCTGCAATGGCGCACCATGATGACGCAACCGGCGCGTGGA
SEQ ID NO:19
>XM_015456672.1预测的:食蟹猴线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),转录物变体X4,mRNA
TGCAGCAGCCGAAGCCGGAGCTGCTAGGGTGCGAACTGCGAGAGCAGGTGTGGGCTGCGAGAGGCTGCTCTGGCCGGGAGCGCCGGGACAAGTGCGTGGAGCTGGCAGCAGCGGCTCCCCTGTTGTATGGACATTCTGCACCCGAAACTGATAGCTGAGTCCTGAAGTTTTATGTTATGAAACAGAAGAACTTTCATCCCAGCACATGATTTGGGAATTACACTTTGTGAC
ATGGATGAATCTGCACTGACCCTTGGTACAATAGATGTTTCTTATCTGCCGAATTCATCAGAATACAGTGTTGGTCG
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TTTTTCAACCCCAGTATCCCATCTTTGGGTTTGCGGAATGTTATTTATATCAATGAAACTCACACAAGACACCGGGG
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TCTGCCCAGCAGCAATCAAAAGCCGTTAACAAAGTGAAAAAGAAAGCTAAAAGGATTCTTCAAGAAATGGTTGCCAC
TGTCTCACCGGCAATGATCAGACTGACTGGGTGGGTGCTGCTAAAACTGTTCAACAGCTTCTTTTGGAACATTCAAA
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TCCCATATTGACTATCTGCTGCTCACTTTCATTCTCTTCTGCCATAACATCAAAGCACCATACATTGCTTCAGGCAA
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TTCTTGGAGATCTTCCTGGAAGGCACACGTTCTAGGAGTGGAAAAACCTCCTGTGCTCGGGCGGGACTTTTGTCAGT
TGTGGTAGATACTCTATCTACCAATGTCATCCCAGACATCTTGATAATACCTGTTGGAATCTCCTATGATCGTATTA
TCGAAGGTCACTACAATGGCGAACAACTGGGCAAGCCAAAGAAGAATGAGAGCCTGTGGAGTATAGCAAGAGGTGTT
ATTAGAATGTTACGAAAAAACTATGGTTGTGTCCGAGTGGATTTTGCACAGCCGTTTTCCTTAAAGGAATATTTAGA
AAGCCAAAGTCAGAAACCGGTGTCTGCTCCACTTTCTCTGGAGCAAGCGTTGTTACCAGCTATACTTCCTTCAAGAC
CCAATGATGCTGCTGATGAAGGTAGAGACACATCCATTAATGAGTCCAGAAATGCAACAGATGAATTCCTACGAAGG
AGGTTGATTGCAAATCTGGCTGAGCATATTCTATTCACTGCTAGCAAGTCCTGTGCCATTATGTCCACACACATTGT
GGCTTGCCTACTCCTCTACAGACACAGGCAGGGAATTGATCTCTCCACATTGGTGGAAGACTTCTTTGTGATGAAAG
AGGAAGTCCTGGCTCGTGATTTTGACCTGGGGTTCTCAGGAAATTCAGAAGATGTAGTAATGCATGCCATACAGCTG
CTGGGAAATTGCGTCACAATCACTCACACTAGCAGGAACGATGAGTTTTTTATCACCCCCAGCACAACTGTCCCAGC
AGTCTTCGAACTCAACTTCTACAGCAATGGGGTACTTCATGTCTTTATCATGGAGGCCATCATAGCTTGCAGCCTTT
ATGCAGTTCTGAACAAGAGGGGATTAGGGGGGCCCACTGGCACCCCACCTAACCTGATCAGCCAGGAGCAGCTGGTG
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GTGCCATGAAACAGTAGGAAAGTTTATCCAGTATGGCATTCTTACAGTGGCAGAGCACGATGACCAGGAAGATATCA
GTCCTAGTCTTGCTGAGCAGCAGTGGGACAAGAAGCTTCCTGAACCTTTGTCTTGGAGAAGTGATGAAGAAGATGAA
GACAGTGACTTTGGGGAGGAACAGCGAGATTGCTACCTGAAGGTGAGCCAATCCAAGGAGCACCAGCAGTTTATCAC
CTTCTTACAGAGACTCCTTGGGCCTTTGCTGGAGGCCTACAGCTCTGCTGCCATCTTTGTTCACAACTTTAGCGGCC
CTGTTCCAGAACCTGAATATCTGCAAAAGTTGCACAAATACCTAGTAACCAGAACAGAAAGAAATGTTGCAGTATAT
GCTGAGAGTGCCACATACTGTCTTGTGAAGAATGCTGTGAAAATGTTTAAGGATATTGGGGTTTTCAAGGAGACCAA
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TTCTGAGTTTTGTGGTGCTGTAGGTAACGTGTGGCACCGCTGGCAAATGAAGGTCATGAGATGAGTCCCTTGTAGGT
ACCAGCTTCTGGCTCGAGAGTTGAAGGTGCCGTCGCAAGGTCACGCCTGCCCTGTCCCGCAGTGATCTCCTGGAAGA
CAAGTGCCTTCTCCCTCCATGGATCTGTGATCTTCCCAGCTCTGCATCCACACAGCAGCCTGCAGATAACACTTGGG
GGGACCTCAGCCTCTATTCGCAACTCACAATCCGTAGACTACAAGATGAAATCTCAATACATTATTTTGGAGTTTAT
TAAAGATTGACATTTTAAGTACAACTTTTAAGGACTAATTACTGTGATGGACACAGAAATGTAGCTGTGTTCTAGAA
CTGAATCTTATATGGTATACTTAGTGCTATTGGGTAATTTGTTGGTATATTATCTGGTTAATGGTTAATGCTTCCTT
TAAAAATAATTGAGTCATCCATTCACTCTTTTTCAGTTTTATCTTTGTCAATAGTAGCTACATTTTTAATGGGAGTA
CCTTTTATCCCAAGTGCTTTATAAATGAATGGACTGATATATATCACACCCAGGTATCACTGTGCTGTCCTTTGCAG
TCAGATATAGAAAATGTTTTTAAGAGGTATGTGAAAACAGACAGTATTAGTTTAGGTCGGGAACTGAGATATTGTAA
TCAAATAGTTAACATCAGGAAGTTAATTTGGCTGGCAAAATTCTAGGGAAACTTGGCCAGAAAACTGGTGTTGAAGG
CTTTTGCTCATATAAAAAAGTGCCATTGAGTTTTAAATGACCAGCAAATATTTAGAACCCTTCCTGTTTTATGTCTG
TACCCCGTCTACCCCTCAGGTAATACCTGCTTCTCACGGGTACAGCTGTTTCTTGGAAATCCTCCAACCAAATAGCA
ACTTTCCTAACTTGATTAGCTTGAGCTGACAGACTCTGTTAGAATACAGTGCTCTGGCCACAACTGATGAGGGCTTT
CTGTACTGCACACAGATTGTGTACTGCACCCCAGTCCAGGTGACTGGTGCCCACTTGAGTTGTGCCGTGCACAACCT
GTCCAGTATATGCATGTGGTGGCCCTACTGACTGGTAATGGTTAGAGGCATTTGTGAATTTTTAGCTTTGAGGAAAA
ACCATGACTTTTAACAAATTTTTATGGGTTATATGCCTAAACCATTATGCCACGTAGTGGTAAATAATTATGAAAAA
TGGTCTGTTCATAATTGGTAGGTGCCTTTTGTGAACAGGGAGCATAATTATTAGTTTATTATGGTAATTATGGTGAT
TTCTTGAATATCATGTAATGTTAAAACATTTTCTAACAGTTTACTGTTGCTTATCTCTAAGATATTATGGAATTAAG
AATTTTTCCAGATGAGTGTTACATAGTTTCTTTGAATTTAGTATAAAAATACTGAGAATTAAGTTTGTACTTCTATA
AGCTTGGGTTTTAAACACTAATAGTGTCTCATGAGTAACGTGTGTTTTGGGAGAGGGAGGGATGCTGATTGATATTT
CACATTGTATGAAGTATCACGTTTGAAACTGGTAGCAATAATGCTATGCTGTTGTGATCCCTCTCAAGTTCTGCATT
TAAAAGATATTTTTTCTTGATAGGAATTGAGGTACTGTTAAGTCATTGTCAGTTGTAGTAGCTCTGATGTTAATGAG
ATAATCACGTTTTAGCATTCCATTTTACTGACTAGGGTGGAAGAACACTTTTCTCGGCTACATTTGGAGGATACCCA
GGGAGTCTTGGGTGTTCCTTATGTGGGGAATCAAACATTTCACTAGTCTCTTTTTTTCATCCTTTAAATTGTAGATT
AAGGATTACTCAAGCTCACCATTATTCAAGGTTGGGACTCACTTCCCAGTGGATACTCTGCCCTGCCTGTCACTGCT
GCAAAGAGCTGCTGCTTCGCCAGCCTAAGCAGAGAAAATATGGCTTCTCTTGCATTATTTTCCCTTTTGGTTGGTTT
GTTTTCTAGAAGTTTGATCAGATGCTTTGAGGAATGCAATGTATGATTTGCTAGCTCTCTTACCACTTAAGTCACTG
TGAGGATAAATATGCATGCATTTTGTAATTAACTGGTGCTTTGAAAATCTTTTTTAAGGGAGAAAAATCTCAACCAA
AGTTATGCTCATCCAGACAAGCTGACCTTTGAGTTAATTTCAGCACAACTCATTCTTCAGTGCCTCATGACCGAAAA
ACAAAAAACAAAAAAGAAAGCATCTTCACAATAAAGCTTCCAGATAGCACCGTTTTGCTAAAAGATACGTTCTCATT
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ATTGCATTTCTATAACATGAAATGCATGCCCTTCAGGGGAAGACTGTGAGTCAAGTTAAAAAAAAATATTAAGCAAT
ATGCAACTGCTCTCTGTTTTTAAAAATGAGAATGTCCTAAGTGATTCAGAAGAGAGGAAGGAATTTATGTACTCTTA
AAATTGCATGAAAAACAAGGCAAAAACTAGTGTGAAATGTGTAGAACTGTTAACTGAGATGGCATTGAGTCTTCCTT
CTGAAATCTGTTAAATCTCACAAAGTCATGAGGGTATATGGAGAAAATATTTCTGGGATTACAATGAATGTAATCCC
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TTTCTCCTTTGGGATACCTGTGAACCTCTCACTACTGTCCTGTGGAGAACATTTTGGGAAACACTGTTAGATAGTTC
TTTAAGGAGACAAAACGGTAATGAACACATGGCACTGGGGCAGAATTCACATGCATTTTGTAACATCCAGTGTGGCA
TGGAATAGATGTGTATTTCCTCCCCTAAAGAAAATAAGCACAGAAAATTATATTGTAGGTGATCGGAGCTCTTTCCT
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GAATTGATTTTTATGCTTGTTAATGTATTGCAAGAAACACAGAAAATGTAATTTTGTTTTAATAAACCAAAAAATGA
ACATA
SEQ ID NO:20
>SEQ ID NO;19的反向互补序列
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AGACTGCTGGGACAGTTGTGCTGGGGGTGATAAAAAACTCATCGTTCCTGCTAGTGTGAGTGATTGTGACGCAATTT
CCCAGCAGCTGTATGGCATGCATTACTACATCTTCTGAATTTCCTGAGAACCCCAGGTCAAAATCACGAGCCAGGAC
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AAGCCACAATGTGTGTGGACATAATGGCACAGGACTTGCTAGCAGTGAATAGAATATGCTCAGCCAGATTTGCAATC
AACCTCCTTCGTAGGAATTCATCTGTTGCATTTCTGGACTCATTAATGGATGTGTCTCTACCTTCATCAGCAGCATC
ATTGGGTCTTGAAGGAAGTATAGCTGGTAACAACGCTTGCTCCAGAGAAAGTGGAGCAGACACCGGTTTCTGACTTT
GGCTTTCTAAATATTCCTTTAAGGAAAACGGCTGTGCAAAATCCACTCGGACACAACCATAGTTTTTTCGTAACATT
CTAATAACACCTCTTGCTATACTCCACAGGCTCTCATTCTTCTTTGGCTTGCCCAGTTGTTCGCCATTGTAGTGACC
TTCGATAATACGATCATAGGAGATTCCAACAGGTATTATCAAGATGTCTGGGATGACATTGGTAGATAGAGTATCTA
CCACAACTGACAAAAGTCCCGCCCGAGCACAGGAGGTTTTTCCACTCCTAGAACGTGTGCCTTCCAGGAAGATCTCC
AAGAATTGCTGCTGTCGAAGTAATTCAACTATATGCCCATGGAGCAAAGCTCTGTAGAGAACATCTTTCCGTCCATC
TGGTGTTTCATCGAGCCTTCGTCGTATGAAGAAGCCCCCAAGCTTATGGATCAAAGTACTGAAGATTGGGATATGGA
GATTATTGCCTGAAGCAATGTATGGTGCTTTGATGTTATGGCAGAAGAGAATGAAAGTGAGCAGCAGATAGTCAATA
TGGGATCTATGAACTGGTAGAAACAGAAGCGGCAAATTCGTCTCAGTTGCAGCTTTAACCATCTCAAGTTGACCTTT
GTGAATTTGAATGTTCCAAAAGAAGCTGTTGAACAGTTTTAGCAGCACCCACCCAGTCAGTCTGATCATTGCCGGTG
AGACAGTGGCAACCATTTCTTGAAGAATCCTTTTAGCTTTCTTTTTCACTTTGTTAACGGCTTTTGATTGCTGCTGG
GCAGAACCATCAGGGTTTAATTCAGCAGCCACTTCTGCAATTGCCTCTTGTACTCTACTGCTGTTCAGCACATTTTC
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CTCAGCTATCAGTTTCGGGTGCAGAATGTCCATACAACAGGGGAGCCGCTGCTGCCAGCTCCACGCACTTGTCCCGG
CGCTCCCGGCCAGAGCAGCCTCTCGCAGCCCACACCTGCTCTCGCAGTTCGCACCCTAGCAGCTCCGGCTTCGGCTG
CTGCA
Claims (125)
1.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链,其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,和所述反义链包含与SEQID NO:2或4的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
2.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的互补区,该互补区包含与表3-6中任一个所列的任何一个反义序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂,其中所述dsRNA剂包含至少一个修饰的核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链的基本上所有核苷酸包含修饰。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的dsRNA剂,其中所述反义链的基本上所有核苷酸包含修饰。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸包含修饰。
7.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链RNA(dsRNA)剂,其中所述双链RNA剂包含形成双链区的有义链和反义链,
其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,和所述反义链包含与SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,
其中所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸为修饰的核苷酸,并且
其中所述有义链与在3’末端连接的配体缀合。
8.根据权利要求7所述的dsRNA剂,其中所述有义链的所有核苷酸包含修饰。
9.根据权利要求7所述的dsRNA剂,其中所述反义链的所有核苷酸包含修饰。
10.根据权利要求7所述的dsRNA剂,其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸包含修饰。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的dsRNA剂,其中至少一个所述修饰的核苷酸选自脱氧核苷酸、3'-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构象受限的核苷酸、约束的乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-失水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸、包含5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸;及其组合。
12.根据权利要求11所述的dsRNA剂,其中所述核苷酸修饰为2’-O-甲基和/或2’-氟修饰。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为至少17个核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为19-30个核苷酸。
15.根据权利要求14所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为19-25个核苷酸。
16.根据权利要求15所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为21-23个核苷酸。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链的长度不超过30个核苷酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链的长度独立地为19-30个核苷酸。
19.根据权利要求18所述的dsRNA剂,其中每条链的长度独立地为19-25个核苷酸。
20.根据权利要求18所述的dsRNA剂,其中每条链的长度独立地为21-23个核苷酸。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的dsRNA剂,其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。
22.根据权利要求21所述的dsRNA剂,其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。
23.根据权利要求1-6和11-22中任一项所述的dsRNA剂,进一步包含配体。
24.根据权利要求23所述的dsRNA剂,其中所述配体与所述dsRNA剂的有义链的3’端缀合。
25.根据权利要求7或24所述的dsRNA剂,其中所述配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
28.根据权利要求27所述的dsRNA剂,其中X为O。
29.根据权利要求2所述的dsRNA剂,其中所述互补区包含表3-6任一个中的任何一个反义序列。
30.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p’、q和q’各自独立地为0-6;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
np、np’、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中所述有义链与至少一个配体缀合。
31.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中i为0;j为0;i为1;j为1;i和j均为0;或者i和j均为1。
32.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中k为0;l为0;k为1;l为1;k和l均为0;或者k和l均为1。
33.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中XXX与X’X’X’互补,YYY与Y’Y’Y’互补,且ZZZ与Z’Z’Z’互补。
34.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述YYY基序出现在所述有义链的切割位点处或其附近。
35.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述Y’Y’Y’基序出现在所述反义链从所述5’端起的11、12和13位处。
36.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中式(III)由式(IIIa)表示:
有义:5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'(IIIa)。
37.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中式(III)由式(IIIb)表示:
有义:5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'(IIIb)
其中Nb和Nb’各自独立地代表包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
38.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中式(III)由式(IIIc)表示:
有义:5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'(IIIc)
其中Nb和Nb’各自独立地代表包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
39.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中式(III)由式(IIId)表示:
有义:5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3’
反义:3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'(IIId)
其中Nb和Nb’各自独立地代表包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,并且Na和Na’各自独立地代表包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
40.根据权利要求30-39中任一项所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为至少17个核苷酸。
41.根据权利要求30-39中任一项所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为19-30个核苷酸。
42.根据权利要求41所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为19-25个核苷酸。
43.根据权利要求42所述的dsRNA剂,其中所述互补区的长度为21-23个核苷酸。
44.根据权利要求30-43中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链的长度不超过30个核苷酸。
45.根据权利要求30-43中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链的长度独立地为19-30个核苷酸。
46.根据权利要求30-45中任一项所述的dsRNA剂,其中所述核苷酸上的修饰选自LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2’-O-甲基、2′-脱氧、2’-羟基及其组合。
47.根据权利要求46所述的dsRNA剂,其中所述核苷酸上的修饰为2′-O-甲基和/或2′-氟修饰。
48.根据权利要求30-46中任一项所述的dsRNA剂,其中Y’是2’-O-甲基或2’-氟修饰的核苷酸。
49.根据权利要求30-48中任一项所述的dsRNA剂,其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。
50.根据权利要求30-49中任一项所述的dsRNA剂,其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。
51.根据权利要求30-50中任一项所述的dsRNA剂,其中所述dsRNA剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
52.根据权利要求51所述的dsRNA剂,其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的3’-末端。
53.根据权利要求52所述的dsRNA剂,其中所述链是反义链。
54.根据权利要求52所述的dsRNA剂,其中所述链是有义链。
55.根据权利要求51所述的dsRNA剂,其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的5’-末端。
56.根据权利要求55所述的dsRNA剂,其中所述链是反义链。
57.根据权利要求55所述的dsRNA剂,其中所述链是有义链。
58.根据权利要求51所述的dsRNA剂,其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的5’-末端和3’-末端。
59.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述双链体的反义链5′-端的1位的碱基对是AU碱基对。
60.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中p’>0。
61.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中p’=2。
62.根据权利要求61所述的dsRNA剂,其中q’=0,p=0,q=0,和p’突出端核苷酸与靶mRNA互补。
63.根据权利要求61所述的dsRNA剂,其中q’=0,p=0,q=0,和p’突出端核苷酸与靶mRNA不互补。
64.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述有义链具有总共21个核苷酸,和所述反义链具有总共23个核苷酸。
65.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。
66.根据权利要求65所述的dsRNA剂,其中所有np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。
67.根据权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸包含修饰。
68.根据权利要求30-67中任一项所述的dsRNA剂,其中所述配体与所述dsRNA剂的有义链的3’端缀合。
69.根据权利要求68所述的dsRNA剂,其中所述配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
72.根据权利要求71所述的dsRNA剂,其中X为O。
73.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p’、q和q’各自独立地为0-6;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
np、np′、nq和nq′,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中所述有义链与至少一个配体缀合。
74.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中所述有义链与至少一个配体缀合。
75.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;和
其中所述有义链与至少一个配体缀合,其中所述配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
76.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
Nb和Nb’各自独立地代表包含0-10个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地代表三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,和Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰;
其中所述有义链包含至少一个硫代磷酸酯键;和
其中所述有义链与至少一个配体缀合,其中所述配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
77.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码GPAM的mRNA的部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述dsRNA剂由式(III)表示:
有义:5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反义:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'(IIIa)
其中:
np、nq和nq’,其每一个可以存在或不存在,各自独立地代表突出端核苷酸;
p、q和q’各自独立地为0-6;
np′>0且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
Na和Na’各自独立地代表包含0-25个修饰或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸;
YYY和Y′Y′Y′各自独立地代表在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰;
其中所述有义链包含至少一个硫代磷酸酯键;和
其中所述有义链与至少一个配体缀合,其中所述配体是通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物。
78.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链,
其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,且所述反义链包含与SEQ ID NO:2或4的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,
其中所述有义链的基本上所有核苷酸均包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰,
其中所述有义链在5’末端包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键,
其中所述反义链的基本上所有核苷酸包含选自2’-O-甲基修饰和2’-氟修饰的修饰,
其中所述反义链包含在5’末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键和在3’末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键,并且
其中所述有义链与在3’末端通过单价、二价或三价分支接头连接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
79.根据权利要求78所述的dsRNA剂,其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸为修饰的核苷酸。
80.根据权利要求2、30和73-79中任一项所述的dsRNA剂,其中所述互补区包含表3-6中任一个所列的任何一个反义序列。
81.根据权利要求1-80中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链和所述反义链包含选自表3-6中任一个所列的任一试剂的核苷酸序列的核苷酸序列。
82.一种细胞,其含有权利要求1-81中任一项所述dsRNA剂。
83.一种载体,其编码权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂的至少一条链。
84.一种用于抑制线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)基因表达的药物组合物,其包含权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂。
85.根据权利要求84所述的药物组合物,其中所述dsRNA剂在未缓冲溶液中配制。
86.根据权利要求85所述的药物组合物,其中所述未缓冲溶液是盐水或水。
87.根据权利要求84所述的药物组合物,其中所述dsRNA剂用缓冲溶液配制。
88.根据权利要求87所述的药物组合物,其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐,或其任何组合。
89.根据权利要求87所述的药物组合物,其中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
90.一种抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的方法,该方法包括使所述细胞与权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物接触,从而抑制所述细胞中的GPAM表达。
91.根据权利要求90所述的方法,其中所述细胞在受试者体内。
92.根据权利要求91所述的方法,其中所述受试者是人。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的方法,其中所述GPAM表达被抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%,或至低于GPAM表达的检测水平。
94.根据权利要求93所述的方法,其中所述人类受试者患有GPAM相关疾病、障碍或病症。
95.根据权利要求94所述的方法,其中所述GPAM相关疾病、障碍或病症为慢性纤维炎性肝病。
96.根据权利要求95所述的方法,其中所述慢性纤维炎性肝病与肝脏中脂滴的积累和/或扩张相关。
97.根据权利要求95所述的方法,其中所述慢性纤维炎性肝病选自肝脏的炎症、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、HCV相关的肝硬化、药物诱导的肝损伤和肝细胞坏死。
98.一种抑制受试者中GPAM表达的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,从而抑制所述受试者中的GPAM表达。
99.一种抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的肝脏中脂滴积累的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的所述受试者的肝脏中脂肪的积累。
100.一种治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的方法,包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,从而治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的所述受试者。
101.一种预防患有将受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者中的至少一种症状的方法,包括向所述受试者施用预防有效量的权利要求1-31中任一项所述的dsRNA剂或权利要求34-39中任一项所述的药物组合物,从而预防患有将受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者中的至少一种症状。
102.一种降低受试者中发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,从而降低所述受试者中发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险。
103.一种增加受试者的肝胰岛素敏感性的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,从而增加所述受试者的肝胰岛素敏感性。
104.一种增加受试者中游离脂肪酸的β氧化的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,从而增加所述受试者中游离脂肪酸的β氧化。
105.一种降低患有脂肪变性的受试者中发生慢性肝病的风险的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,从而降低患有脂肪变性的所述受试者中发生慢性肝病的风险。
106.一种在患有脂肪变性的受试者中抑制脂肪变性进展为脂肪性肝炎的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,从而抑制所述受试者中脂肪变性进展为脂肪性肝炎。
107.一种抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的肝脏中的脂滴积累的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而抑制患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的肝脏中脂肪的积累。
108.一种治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的受试者的方法,包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而治疗患有GPAM相关疾病、障碍或病症的所述受试者。
109.一种预防患有受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者中的至少一种症状的方法,包括向所述受试者施用预防有效量的权利要求1-81中任一项所述的试剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而预防患有受益于GPAM基因表达减少的疾病、障碍或病症的受试者的至少一种症状。
110.一种降低受试者中发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而降低所述受试者发生肝脂肪变性或肝脂肪变性恶化的风险。
111.一种增加受试者中肝胰岛素敏感性的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而增加所述受试者中的肝胰岛素敏感性。
112.一种增加受试者中游离脂肪酸的β氧化的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而增加所述受试者中游离脂肪酸的β氧化。
113.一种降低患有脂肪变性的受试者中发生慢性肝病的风险的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而降低患有脂肪变性的所述受试者中发生慢性肝病的风险。
114.一种在患有脂肪变性的受试者中抑制脂肪变性进展为脂肪性肝炎的方法,该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-81中任一项所述的dsRNA剂或权利要求84-89中任一项所述的药物组合物,以及靶向HSD17B13基因的dsRNA剂或包含靶向HSD17B13基因的dsRNA剂的药物组合物,从而抑制所述受试者中脂肪变性进展为脂肪性肝炎。
115.根据权利要求91-114中任一项所述的方法,其中向所述受试者施用所述dsRNA剂或所述药物组合物导致所述受试者的肝脏中GPAM酶活性降低、GPAM蛋白积累减少、HSD17B13酶活性降低、HSD17B13蛋白积累减少和/或脂肪积累减少和/或脂滴扩张。
116.根据权利要求99-115中任一项所述的方法,其中所述GPAM相关疾病、障碍或病症为慢性纤维炎性肝病。
117.根据权利要求116所述的方法,其中所述慢性纤维炎性肝病与肝脏中脂滴的积累和/或扩张相关。
118.根据权利要求117所述的方法,其中所述慢性纤维炎性肝病选自肝脏中的脂肪积累、肝脏炎症、肝纤维化、脂肪性肝病(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝病(ALD)、HCV相关的肝硬化、药物诱导的肝损伤和肝细胞坏死。
119.根据权利要求118所述的方法,其中所述慢性纤维炎性肝病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
120.根据权利要求91-119中任一项所述的方法,其中所述受试者是肥胖的。
121.根据权利要求91-120中任一项所述的方法,进一步包括向所述受试者施用另外的治疗剂。
122.根据权利要求91-121中任一项所述的方法,其中所述dsRNA剂以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于所述受试者。
123.根据权利要求91-122中任一项所述的方法,其中所述dsRNA剂静脉内、肌内或皮下施用于所述受试者。
124.根据权利要求91-123中任一项所述的方法,进一步包括确定所述受试者中的GPAM水平。
125.一种用于抑制细胞中的线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAM)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂,其中所述dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链,其中所述有义链包含表3-6任一个中的任一试剂的核苷酸序列,并且所述反义链包含表3-6任一个中的任一试剂的核苷酸序列,
其中所述有义链的基本上所有的核苷酸和所述反义链的基本上所有的核苷酸为修饰的核苷酸,并且
其中所述dsRNA剂与配体缀合。
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