CN118186118A - 一种实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒及快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒及快速检测方法，属于实验动物检测领域，包括：针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为SEQ ID NO15：及SEQ ID NO：16；针对沙门氏菌的引物对，序列为SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44；针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56；针对绿脓杆菌的引物对，序列为SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：84。本发明可以同时检测4种病原菌的的多重PCR方法，检测效率高、耗时短、特异性好，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及实验动物检测，本发明特别涉及一种实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒及快速检测方法。
背景技术
实验动物是生命科学、医学等众多领域研究的基础条件，其关系到相关研究的准确性、可靠性，同时也涉及到实验操作人员的安全。因此实验动物质量控制至关重要，其中尤为关键的就是实验动物病原微生物的检测。
现行的实验动物微生物质量检测方法GB/T14926-2001中针对细菌的检测方法其推荐的是分离培养、生化检测。但是这些方法存在需要进一步改善的空间：耗时长，效率低，操作繁琐，需要有经验的实验操作人员，结检测果易受主观判断影响，可能产生检测批间差。
随着实验动物需求量的日益增加，相关机构的生产养殖规模也逐渐扩大，这就更加需要进一步改善。
因此为适应实验动物产业的发展，开发一种准确，高效，适合大规模检测的方法是十分必要的。
多重PCR是一种理性的方法，其可以在一个体系中对多种病原微生物进行检测，具有高效、快速、简便的优点，近些年有不少关于多重PCR研究及相关应用的文献及专利报道，如CN111518931A公开了一种牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒》，实现了同时检测牛奶种的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌；ZA202108519B公开了一种用于检测不同念珠菌类型的引物探针组合、试剂盒、检测方法和应用，可同时检测出念珠球菌的不同类型，《兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重 PCR 检测方法的建立》（《实验动物科学》，2023年第4期，10-16页，张贺等）报道了一种同时检测三种病菌的多重PCR方法。
上述现有技术检测的细菌种类相对较少，且没有专门针对实验动物检测的研究。
上述背景技术是为了便于理解本发明，并非是申请本发明之前已向普通公众公开的公知技术。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供一种实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，可以同时检测4种病原菌的的多重PCR方法，检测效率高、耗时短、特异性好，成本低。
针对实验动物国家标准要求的微生物检测项目，本发明开发了一种可同时检测四种病原菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌）的多重PCR方法，检测项目多、针对性强、耗时短且成本低，是一种有效的实验动物病原菌检测方法。
技术方案是：一种实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，用于并行检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌，该实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒包括：
针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为SEQ ID NO15：及SEQ ID NO：16；
针对沙门氏菌的引物对，序列为SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44；
针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56；
针对绿脓杆菌的引物对，序列为SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：84。
进一步地，所述实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒还包括多重PCR酶Mix和H2O。
进一步地，所述SEQ ID NO：15与SEQ ID NO：16各自均为0.5-1μL，SEQ ID NO：43与SEQ ID NO：44各自均为0.1-0.6μL，SEQ ID NO：55与SEQ ID NO：56各自均为0.1-0.6μL，SEQID NO：83与SEQ ID NO：84各自均为0 .1-0.5μL，多重PCR酶Mix为12.5μL。
进一步地，所述实验动物为啮齿动物。
进一步地，所述啮齿动物为实验小鼠。
本发明还提供一种实验动物微生物多重PCR快速检测方法。
技术方案是：一种实验动物微生物多重PCR快速检测方法，并行检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集并培养处理样本；
（2）提取DNA；
（3）扩增，加入（2）提取的DNA液，针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为SEQ IDNO：15及SEQID NO：16；针对沙门氏菌的引物对，序列为SEQ ID NO：43及SEQID NO：44；针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为SEQ ID NO：55及SEQID NO：56；针对绿脓杆菌的引物对，序列为SEQ ID NO：83及SEQID NO：84；
（4）电泳；
（5）得电泳图。
进一步地，所述扩增的条件为：
多重PCR酶Mix及H2O；
反应程序为：
a.预变性：94-98℃，3-5min；
b.循环延伸：94-98℃，30-45s
c.退火温度：55-60℃，30-45s
d.循环延伸：70-75℃，30-60s
e.循环30-35次
f.循环外延伸：70-75℃，5-10min。
进一步地，所述电泳的条件为：
a.配制凝胶，加热融化后加入溴化乙锭；
b.待凝胶凝固后，放入电泳槽中，在加样孔中扩增产物，并在最后一加样孔中加Marker；
c.电泳仪电泳；
d.电泳结束后使用紫外成像仪拍摄凝胶图像。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明可以同时检测4种病原菌的的多重PCR方法，其同时检测4种病原菌提高了检测效率同时降低了成本，检测时间较短共2小时，且通过干扰实验证明其检测特异性较好，具有较高的应用价值。
附图说明
图1是本发明金黄色葡萄球菌各引物筛选PCR电泳结果图；
图2是本发明沙门氏菌各引物筛选PCR电泳结果图；
图3是本发明肺炎克雷伯菌各引物筛选PCR电泳结果图；
图4是本发明绿脓杆菌各引物筛选PCR电泳结果图；
图5是本发明实施例6的PCR条带图；
图6是本发明实施例7的PCR条带图；
图7是本发明实施例8的PCR条带图；
图8是本发明实施例9的4种目标菌多重PCR条带图；
图9是本发明实施例10的4种目标菌多重PCR条带图；
图10是本发明实施例11的4种目标菌多重PCR条带图；
图11是本发明实施例12的四种目标菌+四种干扰菌多重PCR条带图；
图12是本发明实施例14的多重PCR条带图一；
图13是本发明实施例14的多重PCR条带图二；
图14是本发明实施例14的多重PCR条带图三。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
下面以具体地实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下面这几个具体的实施例可以相互结合，对于相同或相似的概念或过程可能在某些实施例不再赘述。
本发明中，主要试剂来源如下：
细菌基因组DNA提取试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；
D2000DNA Marker 购自康润生物；
胰酪大豆胨液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司
多重PCR酶可采购天根生化科技有限公司、南京诺唯赞生物科技股份有限公司、宝日医生物技术（北京）有限公司等厂家产品，本发明中，多重PCR酶采购自天根生化科技有限公司。
实施例1 细菌DNA提取
将-80℃保存的菌株分别接种于相应的胰酪大豆胨液体培养基复苏，划线于相应的血平皿上，36±1℃培养24h，挑取单菌落溶于灭菌ddH2O。参照细菌基因组提取试剂盒说明书进行提取细菌DNA，将提取的DNA模板于－20℃保存，待后续实验使用。
下述实施例2-实施例5中，参考GenBank中的金黄色葡萄球菌nuc基因序列、大肠杆菌phoE基因序列、沙门氏菌invA基因序列和绿脓杆菌LasI基因序列。经对比分析，使用NCBI引物设计功能分别设计各基因的引物，并通过PCR验证引物的特异性与扩增效率，引物筛选中的引物如下表1-表4。
表1金黄色葡萄球菌引物序列表 （目的基因nuc）
表2沙门氏菌引物序列表（目的基因invA）
表3肺炎克雷伯菌引物序列表（目的基因phoE）
表4绿脓杆菌引物序列表（目的基因LasI）
。
实施例2 金黄色葡萄球菌引物筛选
金黄色葡萄球菌引物筛选根据以下步骤进行：
（1）扩增
多重PCR酶Mix12 .5μL，实施例1的模板DNA 1μL，上、下游引物各0 .5μL（上、下游引物来自表1），ddH2O加至25μL。
反应程序如下：
a.预变性：95℃，5min；
b.循环延伸：95℃，30s
c.退火温度：55℃，30s
d.循环延伸：72℃，30s
e.循环35次
f.循环外延伸：72℃，5min。
得扩增产物；
（2）电泳
电泳程序如下：
a.配制4%的琼脂糖凝胶，加热融化后加入溴化乙锭，摇匀，倒入插好样品梳的胶盘。
b.待凝胶凝固后，放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中，在加样孔中加入（1）的扩增产物（一个加样孔加入一个扩增产物，一个扩增产物加入量为5μL），并在最后一加样孔中加入5μL Marker。
c.加样完毕后，调整电泳仪参数，电压为120V，电泳时间35min。
d.电泳结束后使用紫外成像仪拍摄凝胶图像，得电泳图1。
图1中的泳道与引物的对应关系如下表5。
表5
实施例3 沙门氏菌引物筛选
本实施例与实施例2相比，除了模板DNA（来自实施例1）与上、下游引物（来自表1）不同外，其余与实施例2均相同。
实施例3得电泳图2。
图2中的泳道与引物的对应关系如下表6。
表6
。
实施例4肺炎克雷伯菌引物筛选
本实施例与实施例2相比，除了模板DNA（来自实施例1）与上、下游引物（来自表1）不同外，其余与实施例2均相同。
实施例4得电泳图3。
图3中的泳道与引物的对应关系如下表7。
表7
。
实施例5绿脓杆菌引物筛选
本实施例与实施例2相比，除了模板DNA（来自实施例1）与上、下游引物（来自表1）不同外，其余与实施例2均相同。
实施例5得电泳图4。
图4中的泳道与引物的对应关系如下表8。
表8
实施例2-实施例5选取特异性好、扩增效率相近的引物三对，如下表9。
表9
实施例6
（1）单一细菌各自扩增
多重PCR酶Mix12 .5μL，模板DNA 1μL（来自实施例1），上、下游引物各0 .5μL（来自表10），ddH2O加至25μL。
反应程序如下：
a.预变性：95℃，5min；
b.循环延伸：95℃，30s
c.退火温度：55℃，30s
d.循环延伸：72℃，30s
e.循环35次
f.循环外延伸：72℃，5min。
得扩增产物。
（2）电泳
程序如下：
a.配制4%的琼脂糖凝胶，加热融化后加入溴化乙锭，摇匀，倒入插好样品梳的胶盘。
b.待凝胶凝固后，放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中。在加样孔中加入（1）的扩增产物（一个加样孔加入一个扩增产物，一个扩增产物加入量为5μL），并在最后一加样孔中加入5μL Marker（分子标记）。
c.加样完毕后，调整电泳仪参数，电压为120V，电泳时间35min。
d.电泳结束后使用紫外成像仪拍摄凝胶图像，得电泳图5。
图5中，病原菌、引物与泳道的对应关系如下表10。
表10
。
实施例7
除上、下游引物与实施例6不同外，其余与实施例6相同，得电泳图6。
本实施例中，上、下游引物来自表11。
图6中，病原菌、引物与泳道的对应关系如下表11。
表11
。
实施例8
除上、下游引物与实施例6不同外，其余与实施例6相同，得电泳图7。
本实施例中，上、下游引物来自表12。
图7中，病原菌、引物与泳道的对应关系如下表12。
表12
从图7可以看出，金黄色葡萄球菌与肺炎克雷伯菌产物片段大小过于接近，无法在多重PCR时被有效分离。
实施例9
（1）扩增
多重PCR酶Mix12 .5μL，实施例1的四种模板DNA 各1μL，四队上、下游引物各0 .5μL，ddH2O加至25μL。
反应程序如下：
a.预变性：95℃，5min；
b.循环延伸：95℃，30s
c.退火温度：55℃，30s
d.循环延伸：72℃，30s
e.循环35次
f.循环外延伸：72℃，5min。
得扩增产物。
（2）电泳
程序如下：
a.配制4%的琼脂糖凝胶，加热融化后加入溴化乙锭，摇匀，倒入插好样品梳的胶盘。
b.待凝胶凝固后，放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中。在加样孔中加入（1）的扩增产物5μL，并在最后一加样孔中加；入5μL Marker。
c.加样完毕后，调整电泳仪参数，电压为120V，电泳时间35min。
d.电泳结束后使用紫外成像仪拍摄凝胶图像，得电泳图8。
图8中，泳道1从下至上为：肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。
本实施例中，上、下游引物如下表13。
表13
。
实施例10
除上、下游引物与实施例9不同外，其余与实施例9相同，得电泳图9。
本实施例中，上、下游引物如下表14。
表14
图9中，泳道1从下至上为：肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、沙门氏菌。
图9中，所用金黄色葡萄球菌引物在多重PCR反应时为劣势反应受其他3种菌抑制较明显，导致无法正常产生扩增产物。
实施例11
实施例9虽然可以在同一泳道中四种菌从上到下一一排列，但是，仍有进一步改善的空间。
从电泳图8中可看出各种菌扩增效率差异较大，如沙门氏菌PCR产物量较大，而金黄色葡萄球菌PCR产物很少，反应效率不一致会影响多重PCR检测的准确性。
与实施例9相比，除以下不同外，其余与实施例9相同：
本实施例中，以ddH2O作为空白对照。
本实施例中，多重PCR酶Mix12.5μL，金黄色葡萄球菌引物最适量为0.9μL、肺炎克雷伯菌引物最适量在0.2μL、绿脓杆菌引物最适量在0.3μL、沙门氏菌引物最适量在0.25μL，最适退火温度为55℃。
反应程序：
a.预变性：95℃，5min；
b.循环延伸：95℃，30s
c.退火温度：55℃，30s
d.循环延伸：72℃，30s
e.循环35次
f.循环外延伸：72℃，5min。
电泳检测得图10，其中，泳道1从下至上为：肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。
实施例12 特异性验证
以检测目标菌和干扰菌的混合核酸(金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、鼠棒状杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌）为模板进行多重PCR反应（引物同实施例11），验证该方法的特异性，得图11，图11中，泳道1为阴性对照 ，泳道2为四种目标菌（从下至上为：肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌）+四种干扰菌（鼠棒状杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌）。从图11中可知，以混合菌DNA模板进行多重PCR反应产物均为检测目标菌的条带，说明该多重PCR特异性良好。
实施例13 重复性验证
以实施例11条件建立的多重PCR，重复检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌和绿脓杆菌4种菌的混合DNA样本，验证多重PCR的稳定性。结果表明均能稳定扩增出相应的目的条带。
实施例14临床样本检测结果
将临床采集的小鼠粪便样本，经液体培养基摇床培养过夜后，取部分上清培养液用于细菌平板培养，再取部分上清培养液提取DNA用于多重PCR检测（细菌基因组DNA提取试剂盒购自生工生物工程股份有限公司，操作流程按说明书进行），引物采用实施例11的引物，验证多重PCR方法与国标推荐的细菌培养法的符合率，得图12-图14。共检测金黄色葡萄球菌阳性样本10例、阴性样本26例均符合细菌培养的结果，样本阴阳性见表15。
表15
。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，用于并行检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌，其特征在于，该实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒包括：
针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为SEQ ID NO15：及SEQ ID NO：16；
针对沙门氏菌的引物对，序列为SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44；
针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56；
针对绿脓杆菌的引物对，序列为SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：84。
2.根据权利要求1所述的实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒还包括多重PCR酶Mix和H2O。
3.根据权利要求2所述的实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO：15与SEQ ID NO：16各自均为0.5-1μL，SEQ ID NO：43与SEQ ID NO：44各自均为0.1-0.6μL，SEQ ID NO：55与SEQ ID NO：56各自均为0.1-0.6μL，SEQ ID NO：83与SEQ IDNO：84各自均为0 .1-0.5μL，多重PCR酶Mix为12.5μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述实验动物为啮齿动物。
5.根据权利要求4所述的实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述啮齿动物为实验小鼠。
6.一种实验动物微生物多重PCR快速检测方法，采用权利要求1-5任一项所述的实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集并培养处理样本；
（2）提取DNA；
（3）扩增，加入（2）提取的DNA液，针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16；针对沙门氏菌的引物对，序列为SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44；针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56；针对绿脓杆菌的引物对，序列为SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：84；
（4）电泳；
（5）得电泳图。
7.根据权利要求6所述的实验动物微生物多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：
a.预变性：94-98℃，3-5min；
b.循环延伸：94-98℃，30-45s
c.退火温度：55-60℃，30-45s
d.循环延伸：70-75℃，30-60s
e.循环30-35次
f.循环外延伸：70-75℃，5-10min。
8.根据权利要求6所述的实验动物微生物多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述电泳的条件为：
a.配制凝胶，加热融化后加入溴化乙锭；
b.待凝胶凝固后，放入电泳槽中，在加样孔中扩增产物，并在最后一加样孔中加Marker；
c.电泳仪电泳；
d.电泳结束后使用紫外成像仪拍摄凝胶图像。
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