CN110452974B - 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法 - Google Patents

一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110452974B
CN110452974B CN201910790501.7A CN201910790501A CN110452974B CN 110452974 B CN110452974 B CN 110452974B CN 201910790501 A CN201910790501 A CN 201910790501A CN 110452974 B CN110452974 B CN 110452974B
Authority
CN
China
Prior art keywords
library
sequencing
rdna
umi
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910790501.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110452974A (zh
Inventor
冯涛
马伟志
王震
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Qunfeng Nayuan Health Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Qunfeng Nayuan Health Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Qunfeng Nayuan Health Technology Co ltd filed Critical Beijing Qunfeng Nayuan Health Technology Co ltd
Priority to CN201910790501.7A priority Critical patent/CN110452974B/zh
Publication of CN110452974A publication Critical patent/CN110452974A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110452974B publication Critical patent/CN110452974B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法，通过在每个样品上加上分子标签UMI，分别扩增得到连接文库和拼接文库，对两个文库进行测序，通过识别UMI组合的方式提取数据，并组装出16S rDNA全长序列，进而比对数据库确定菌种种类。本发明的建库方法适合所有类型样本的菌群结构检测，能够将传统的菌群结构鉴定从“属”级别提升到“种”级别，与属水平相比较，种水平的优势，可以更准确的确定环境微生物的生态结构，便于深入研究，由此可对样本进行特定细菌菌种的检测。

Description

一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法
技术领域
本发明属于细菌分子生物学技术领域，具体涉及一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法。
背景技术
16S rRNA基因是原核生物所特有的基因，并且在原核生物中具有极高的拷贝数。全长1542nt的DNA序列包含9个间隔的高变区，兼具特异性和保守性的16S rRNA基因序列作为微生物标记被广泛应用于研究中。之前再对16S人DNA进行研究时，通常使用的是Sanger测序结合克隆的方法，或者芯片杂交方法，但是传统方法存在着通量低的缺陷。很多研究者已经用16S rDNA来对环境中的微生物，粪便微生物，皮肤中的微生物进行分类研究。目前，第二代测序技术已经成为微生物研究的主流手段，但是由于读长的限制，一般基于16SrDNA全长9个可变区中的一个或者几个(V6区、V3-V4区等)，而且只能分析到属级别，无法分析到菌种。例如公开号为CN108070643A的中国发明专利公开了一种微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法，包括采集样本，提取DNA；扩增；纯化；定量；测序，生物信息学分析。但是仍采用是16S rDNAV3-V4区测序方法。该类方法作为市场上最为成熟的细菌检测方法，仍存在某些缺陷。例如不能够完全对细菌的菌种级别进行检测，不能够准确的确定环境微生物的生态结构，以及在用于样本特定细菌菌种的检测，比如：病原菌，益生菌的检测。对于深入研究领域而言是远远不够的。
因此需要开发一种建库方法，能够检测样本中细菌的16S全长序列，以便分析样本中的菌种组成，确定样本菌群生态结构。
发明内容
针对以上存在的技术问题，本发明提供一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法，能够分析样本中的菌种组成，确定样本菌群生态结构。
本发明的技术方案为：一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法，包括以下步骤：
(1)定量提取样本中菌群的总DNA，标记为样本A；
(2)以步骤(1)样本A的DNA为模板，通过两端带有特异分子标签UMI的引物组PCR扩增16S rDNA全长，并为每一个原始扩增的16S rDNA全长加上特异的分子标签UMI，得到扩增产物；
(3)将步骤(2)所得扩增产物用Tn5酶片段化并构建测序用拼接文库，并标记为A-P；
(4)将步骤(2)所得扩增产物的环化连接并构建测序用连接文库，并标记为A-L；
(5)将所述拼接文库A-P和连接文库A-L使用illumina测序仪测序，得到拼接文库A-P和连接文库A-L的测序结果；
(6)将步骤(5)的测序结果进行生物信息技术处理分析，通过识别UMI组合的方式，在拼接文库A-P和连接文库A-L中提取数据，并组装出16S rDNA全长序列，进而比对数据库确定菌种种类。
进一步地，步骤(2)进一步包括：
(2.1)采用带有UMI标签的第一组引物序列对所述样本A的DNA进行第一轮PCR扩增，并进行第一次纯化步骤；
(2.2)采用第二组引物序列对第一次纯化产物进行第二轮PCR扩增，并进行第二次纯化步骤。
更进一步地，所述第一组引物序列如SED IQ NO：1-2所示。
更进一步地，所述第二组引物序列如SED IQ NO：3-4所示。
更进一步地，所述第二组引物序列的5‘端进行了磷酸化。
进一步地，步骤(3)进一步包括：
(3.1)将步骤(2)所得扩增产物用Tn5酶片段化；
(3.2)片段化后第一轮PCR扩增并纯化，扩增引物序列如SED IQ NO：5-7所示；
(3.3)对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增并纯化，拼接文库完成，标记为A-P，扩增引物序列如SED IQ NO：8-9所示。
进一步地，步骤(4)进一步包括：
(4.1)采用T4 DNA连接酶完成步骤(3)最终扩增产物的环化连接，得到连接产物；
(4.2)对所述连接产物进行第一轮PCR扩增并纯化，扩增引物如SED IQ NO：10-11所示；
(4.2)对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增，扩增引物如SED IQ NO：12-13所示。
进一步地，步骤(5)中使用illumina测序仪对所述A-P和A-L分别进行双端测序，测序长度为150bp。
进一步地，步骤(6)进一步包括：
(6.1)连接文库A-L分析：使用cutadaptor在连接文库测序结果中识别成对的UMI组合，用于在拼接文库A-L中提取数据；
(6.2)拼接文库A-P分析：根据步骤(6.1)得到的成对的UMI组合，在拼接文库中提取每对UMI组合所包含的reads；
(6.3)序列组装：对于每对UMI组合所包含的reads使用SPAdes组装，得到一条全长的16S rDNA序列；
(6.4)序列注释：使用bowtie2将步骤(6.3)得到的16s rDNA全长序列与Silva数据库进行比对，进而统计样本的菌种丰度信息。
本发明的有益效果为：
1)通用性：本发明的建库方法适合所有类型样本的菌群结构检测。
2)准确性：本发明将传统的菌群结构鉴定从“属”级别提升到“种”级别，与属水平相比较，种水平的优势，可以更准确的确定环境微生物的生态结构，便于深入研究，由此可对样本进行特定细菌菌种的检测。
3)高通量：基于高通量测序技术，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。
4)保真性：使用本发明检测的菌群丰度保真性好。
附图说明
图1是本发明的样本A基因组DNA的凝胶电泳图；
图2是本发明的样本A 16S全长扩增结果的凝胶电泳图；
图3是本发明样本A的拼接文库A-P的凝胶电泳图；
图4是本发明样本A的连接文库A-L的凝胶电泳图；
图5是本发明样本A的菌群丰度图；
图6是本发明实施例2中的模拟样本的菌群丰度检测结果图；
图7是本发明实施例3中排名前20的属两种方法丰度情况对比图。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的调剂操作。
实施例1
(一)样本DNA的提取
1.1本发明采用Qiagen的DNeasy PowerSoil Kit对一例粪便样本进行提取总DNA的操作，标记为样本A。
具体操作步骤：
a.震荡装有3ml保护剂粪便样本的收集管，平分到2个1.5ml离心管中，2500g10min去上清，用1ml广口枪头转移沉淀到Power Beads Tube中，轻轻涡旋混匀。
b.加入60μl C1，涡旋振荡10min。
c.10000g离心30s。
d.转移上清到2ml收集管中。
e.向收集管中加250μl C2，震荡5s，4℃孵育5min。
f.10000g离心1min。
g.转移600μl上清到2ml收集管中。
h.加200μl C3，振荡混匀，4℃孵育5min。
i.10000g离心1min。
j.转移750μl上清到新的2ml收集管中。
k.摇匀C4，加1200μl到上清中，震荡5s。
l.加675μl到MB Spin柱中，10000g离心1min,弃滤过液体。
m.重复步骤12两次，直到所有的液体都滤过。
n.加500μl C5.10000g离心30s。
o.弃滤过液，10000g离心1min
p.将MB spin柱转移到新的2ml收集管中。
q.在白色膜中央加100μl C6溶液或者无核酶的水。
r.室温孵育30s,10000g离心。
凝胶电泳结果见图1。从胶图1结果可知：提取DNA条带单一无降解，可用于后续实验。
(二)PCR扩增16S rDNA全长，并为每一个原始扩增的16S全长加上特异的分子标签UMI
2.1第一轮PCR
本实施例采用带有UMI标签的第一组引物序列对所述样本A的DNA进行第一轮PCR扩增，扩增试剂来自诺维赞公司。其中，第一组引物序列为：
16S-1-F:CTCCACCCAGACTCATCCATNNNNNNNNNNNNNNGCGATCTAAGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SED IQ NO：1)
16S-1-R:AGGGGGGCAAAGATGAAGATNNNNNNNNNNNNNNCGTACTAGTACGGYTACCTTGTTACGACTT(SED IQ NO：2)
第一轮PCR扩增的反应体系包括：2×Phanta Max Master Mix 25μl，DNA 10ng，16S-1-F 1μl，16S-1-R 1μl，H2O至50μl。
第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min，循环1次；95℃变性30sec，循环3次；58℃复性30sec，循环3次；72℃延伸30sec，循环3次；72℃后延伸5min，循环1次；4℃保持。
采用0.9倍诺维赞磁珠对第一轮PCR扩增的产物进行第一次纯化，包括以下步骤：
a.向PCR产物中加入45μl诺维赞磁珠，振荡混匀，室温放置5min.
b.将PCR管短暂离心并至于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min),小心移除上清。
c.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
d.重复步骤c，总计漂洗两次。
e.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10min至无乙醇残留。
f.将PCR管从磁力架中取出，加入21μl TE，涡旋振荡，于室温放置2min,将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后，小心移取20μl上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。
2.2第二轮PCR
采用第二组引物序列对第一次纯化产物进行第二轮PCR扩增，其中，第二组引物序列为：
16S-2-F:CTCCACCCAGACTCATCCAT(SED IQ NO：3)
16S-2-R:AGGGGGGCAAAGATGAAGAT(SED IQ NO：4)
引物的5‘端进行了磷酸化，为后续连接实验做准备。
第二轮PCR扩增的反应体系包括：2×Phanta Max Master Mix 25μl，DNA 1μl，16S-2-F 1μl，16S-2-R 1μl，H2O至22μl。
第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min，循环1次；95℃变性30sec，循环25次；58℃复性30sec，循环25次；72℃延伸30sec，循环25次；72℃后延伸5min，循环1次；4℃保持。
第二次扩增产物用0.9倍磁珠进行纯化，20μl TE溶液溶解。文库跑胶结果见图2，由胶图2结果可知:16S全长产物条带在1600bp左右，条带大小正确且条带单一。
(三)扩增产物用Tn5酶片段化
3.1配制Tn5酶片段化体系，包括DNA 10μl，TAGMENT DNA buffer 5μl，TAGMENTDNA enzyme 0.5μL，H2O 4.5μL。试剂来自illumina
Figure BDA0002179399490000071
DNA Library Prep试剂盒。将体系振荡离心，置于PCR仪上，反应程序为：55℃反应5min，循环数为1次；4℃保持。
3.2采用第三组引物序列对片段化后产物进行第一轮PCR扩增，其中，扩增试剂来自诺维赞公司。其中，第三组引物序列为：
16S-3-F1:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCCACCCAGACTCATCCAT(SEDIQ NO：5)
16S-3-F2:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGGGGCAAAGATGAAGAT(SEDIQ NO：6)
16S-3-R：TCGTCGGCAGCGTCAG(SED IQ NO：7)
第一轮PCR扩增反应体系包括：2×Phanta Max Master Mix 25μl，DNA 10μl，16S-3-R 1μl，16S-3-F 1μl，16S-3-F 2μl，H2O至12μl。
第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，循环1次；95℃变性30sec，循环8次；58℃复性30sec，循环8次；72℃延伸1min，循环8次；72℃后延伸5min，循环1次；4℃保持。
第一轮扩增的产物采用0.9倍诺维赞磁珠进行纯化，20ul TE溶解。
3.3采用第四组引物序列对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增，其中，第四组引物序列为：
16S-P7-01:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCAGGAAGTGACTGGAGTTCAGACGTG(SED IQNO：8)
16S-I5-01:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAGCTGAATCGTCGGCAGCGTCAGAT(SEDIQ NO：9)
其中，上述引物序列中的下划线为index，不同的样本可以采用不同的index进行区分。
第二轮PCR扩增反应体系包括：2×Phanta Max Master Mix 25μl，DNA 2μl，16S-P7-01μl，16S-I5-01μl，1H2O至21μl。
第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，循环1次；95℃变性30sec，循环8次；58℃复性30sec，循环8次；72℃延伸1min，循环8次；72℃后延伸5min，循环1次；4℃保持。
第二轮PCR扩增产物用0.9倍诺维赞磁珠纯化，20ul TE溶液溶解。拼接文库完成。标记为A-P，文库跑胶结果见图3。由胶图3结果可知，拼接文库在100-1500左右呈弥散状态，说明片段化比较均匀，符合预期。
(四)将步骤2.2中的最后扩增产物环化并构建连接文库(Link-tag library)
4.1采用T4 DNA连接酶(Thermo)完成步骤2.2中的最后扩增产物的环化连接。具体体系包括：T4 DNA连接酶1μl，T4 DNA连接酶buffer 2μl，DNA 2μl，H2O 15μL。将上述反应体系至于PCR仪上，16℃孵育1h，得到连接产物。
4.2采用第五组引物序列对上述连接产物进行第一轮PCR扩增，其中，第五组引物序列为：
16S-4-F:TCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGAGCCAKGATCAAACTCTTAGATCGC(SED IQ NO：10)
16S-4-R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGTCGTAACAAGGTARCCGTACTAGTACG(SED IQ NO：11)
第一轮PCR扩增反应体系包括：2×Phanta Max Master Mix 25μl，连接产物10μl，16S-4-R 1μl，16S-4-F 1μl，H2O至13μl。
第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min，循环1次；95℃变性30sec，循环8次；58℃复性30sec，循环8次；72℃延伸1min，循环8次；72℃后延伸3min，循环1次；4℃保持。
第一轮扩增的产物采用0.9倍诺维赞磁珠进行纯化，20ul TE溶解。
4.3采用第六组引物序列对上步的第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增，其中，第六组引物序列为：
16S-P7-01:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCAGGAAGTGACTGGAGTTCAGACGTG(SED IQNO：12)
16S-P5-01:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAACATCGACACTCTTTCCCTACACGAC(SED IQ NO：13)
下划线为index，不同的样本可以采用不同的index进行区分。
第二轮PCR扩增反应体系包括：2×Phanta Max Master Mix 25μl，DNA 1μl，16S-P7-01μl，16S-P5-01μl，1H2O至22μl。
第二轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，循环1次；95℃变性30sec，循环8次；58℃复性30sec，循环8次；72℃延伸1min，循环8次；72℃后延伸5min，循环1次；4℃保持。
第二轮PCR扩增产物用0.9倍诺维赞磁珠纯化，20ul TE溶液溶解。连接文库完成，标记为A-L，文库跑胶结果见图4。由胶图4结果可知，连接文库在260bp左右且条带单一，符合预期。
(五)使用illumina测序仪测序
5.1采用illumina测序仪对连接文库A-L和拼接文库A-P进行双端测序，测序长度150bp，得到连接文库A-L和拼接文库A-P测序结果。
(六)测序结果生物信息技术处理分析
6.1连接文库A-L分析：使用cutadaptor在连接文库测序结果中识别成对的UMI组合，用于在拼接文库A-L中提取数据；
6.2拼接文库A-P分析：根据步骤6.1得到的成对的UMI组合，在拼接文库中提取每对UMI组合所包含的reads；
6.3序列组装：对于每对UMI组合所包含的reads使用SPAdes组装，得到一条全长的16S rDNA序列；
6.4序列注释：使用bowtie2将步骤(6.3)得到的16s rDNA全长序列与Silva数据库进行比对，进而统计样本的菌种丰度信息，结果见表1和图5。
表1样本A确定的细菌种类
Figure BDA0002179399490000111
Figure BDA0002179399490000121
实施例2
将四种已知菌种(Streptococcus_pneumoniae，Enterococcus_faecalis，Streptococcus_pyogenes，Streptococcus_agalactiae)的DNA样本按照1：1：1：1的菌群丰度混合，组成模拟样本(mock community)，用本发明的16S-FAST技术检测样本菌群丰度保真性情况。结果如图6所示，从图6中结果可知：本发明的技术确定的菌群丰度的保真性很好，基本接近真实的比例。
实施例3
采用本发明的方法对样本的16S全长检测作为实验组，采用现有技术中V3V4区段测序检测方法作为对照组，比对二者的检测结果，如表2所示：
表2排名前20的属两种方法丰度情况
属名 A-V3V4 A-16S
Prevotella 60.87 60.56
Megamonas 19.61 21.54
Bacteroides 5.85 5.81
Roseburia 3.87 2.72
Faecalibacterium 1.50 1.89
Enterobacter 1.36 0
Sutterella 1.17 2.07
Ruminococcus 1.13 0.68
Clostridium 0.86 0.01
Dorea 0.72 1.08
Parabacteroides 0.69 0.77
Blautia 0.60 0.37
Coprococcus 0.58 0.02
Eubacterium 0.31 1.43
Gemmiger 0.15 0
Bifidobacterium 0.08 0
Klebsiella 0.08 0.32
Butyricicoccus 0.07 0.03
Leuconostoc 0.07 0
others 0.42 0.7
从表2和图7可知：两种方法确定的属的丰度相关性系数R2为：0.998，说明两种方法确定的属类别基本一致。但是16S-FAST全长技术能够将准确度从属提高到种，所以该方法优于传统的区段测序。
序列表
Figure BDA0002179399490000141
Figure BDA0002179399490000151
Figure BDA0002179399490000161
Figure BDA0002179399490000171
Figure BDA0002179399490000181
Figure BDA0002179399490000191
Figure BDA0002179399490000201
序列表
<110> 北京群峰纳源健康科技有限公司
<120> 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法
<130> 无
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(62)
<221> misc_feature
<222> (21)..(34)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-1-F
<400> 1
ctccacccag actcatccat nnnnnnnnnn nnnngcgatc taagagtttg atcmtggctc 60
ag 62
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(64)
<221> misc_feature
<222> (21)..(34)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-1-R
<400> 2
aggggggcaa agatgaagat nnnnnnnnnn nnnncgtact agtacggyta ccttgttacg 60
actt 64
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-2-F
<400> 3
ctccacccag actcatccat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-2-R
<400> 4
aggggggcaa agatgaagat 20
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(54)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-3-F1
<400> 5
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctccac ccagactcat ccat 54
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(54)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-3-F2
<400> 6
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggggg gcaaagatga agat 54
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-3-R
<400> 7
tcgtcggcag cgtcag 16
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(52)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-P7-01
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agatagcagg aagtgactgg agttcagacg tg 52
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(55)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-I5-01
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg agctgaatcg tcggcagcgt cagat 55
<210> 10
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(64)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-4-F
<400> 10
tctacactct ttccctacac gacgctcttc cgatctctga gccakgatca aactcttaga 60
tcgc 64
<210> 11
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(64)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-4-R
<400> 11
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagtcg taacaaggta rccgtactag 60
tacg 64
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(52)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-P7-01
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agatagcagg aagtgactgg agttcagacg tg 52
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 根据实验要求而设计，作为扩增引物16S-P5-01
<400> 13
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca aacatcgaca ctctttccct acacgac 57

Claims (4)

1.一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）定量提取样本中菌群的总DNA；
（2）以步骤（1）样本的DNA为模板，通过两端带有特异分子标签UMI的引物组PCR扩增16SrDNA全长，并为每一个原始扩增的16S rDNA全长加上特异的分子标签UMI，得到扩增产物：
（2.1）采用带有UMI标签的第一组引物序列对所述样本的DNA进行第一轮PCR扩增，并进行第一次纯化，所述第一组引物序列如SED IQ NO：1-2所示；
（2.2）采用第二组引物序列对第一次纯化产物进行第二轮PCR扩增，并进行第二次纯化，所述第二组引物序列如SED IQ NO：3-4所示；
（3）将步骤（2.2）所得扩增产物用Tn5酶片段化，对片段化产物进行第一轮PCR扩增并纯化，扩增引物序列如SED IQ NO：5-7所示，对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增并纯化，扩增引物序列如SED IQ NO：8-9所示，由此构建拼接文库并标记为A-P；
（4）将步骤（2.2）所得扩增产物环化连接，对连接产物进行第一轮PCR扩增，扩增引物如SED IQ NO：10-11所示，对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增并纯化，扩增引物如SEDIQ NO：12-13所示，由此构建连接文库并标记为A-L；
（5）将所述拼接文库A-P和所述连接文库A-L测序，得到拼接文库A-P和连接文库A-L的测序结果；
（6）将步骤（5）的测序结果进行生物信息技术处理分析，通过识别UMI组合的方式，在拼接文库A-P和连接文库A-L中提取数据，并组装出16S rDNA全长序列，进而比对数据库确定菌种种类。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2.2）中所述第二组引物序列的5‘端进行了磷酸化。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中所述测序为对拼接文库A-P和连接文库A-L分别进行双端测序，测序长度为150 bp。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）进一步包括：
（6.1）连接文库A-L分析：识别连接文库测序结果中成对的UMI组合，用于在拼接文库A-L中提取数据；
（6.2）拼接文库A-P分析：根据步骤（6.1）得到的成对的UMI组合，在拼接文库中提取每对UMI组合所包含的reads；
（6.3）序列组装：对于每对UMI组合所包含的reads进行组装，得到全长的16S rDNA序列；
（6.4）序列注释：将步骤（6.3）得到的16s rDNA序列与微生物数据库进行比对，进而统计样本的菌种丰度信息。
CN201910790501.7A 2019-08-26 2019-08-26 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法 Active CN110452974B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910790501.7A CN110452974B (zh) 2019-08-26 2019-08-26 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910790501.7A CN110452974B (zh) 2019-08-26 2019-08-26 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110452974A CN110452974A (zh) 2019-11-15
CN110452974B true CN110452974B (zh) 2022-09-16

Family

ID=68489102

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910790501.7A Active CN110452974B (zh) 2019-08-26 2019-08-26 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110452974B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111816258B (zh) * 2020-07-20 2023-10-31 杭州谷禾信息技术有限公司 人体菌群16S rDNA高通量测序物种精确鉴定的优化方法
CN112735527B (zh) * 2021-01-06 2022-09-13 武汉华大基因技术服务有限公司 一种串联序列解析方法、装置和存储介质
CN114373508B (zh) * 2022-01-24 2024-02-02 浙江天科高新技术发展有限公司 一种基于16S rDNA序列的菌种鉴定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105937053A (zh) * 2015-12-02 2016-09-14 广州赛哲生物科技股份有限公司 一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法
CN110004210A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 杭州进一生物科技有限公司 一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105937053A (zh) * 2015-12-02 2016-09-14 广州赛哲生物科技股份有限公司 一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法
CN110004210A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 杭州进一生物科技有限公司 一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study;WILLIAM G. WEISBURG等;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;19911231;第173卷(第2期);第697-703页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110452974A (zh) 2019-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110452974B (zh) 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法
EP4198142A1 (en) Kit and method for detecting nucleic acid and uses thereof
CN107868837B (zh) 一种用于分析肠道微生物的引物组合物及其应用
CN110484655B (zh) 副流感病毒全基因组二代测序的检测方法
CN113249499B (zh) 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN113025734A (zh) 鉴别布鲁氏菌疫苗株a19与野毒株的引物、探针及应用
CN112029881B (zh) 用于检测副干酪乳杆菌n1115的引物对及应用
CN113667729A (zh) 一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法
WO2016119448A2 (zh) 不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子
Johnson et al. Characterization of Brachyspira communities from clinical cases of swine mucohaemorrhagic diarrhea through deep sequencing of the NADH oxidase (nox) gene
CN115747361A (zh) 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法
CN103874766B (zh) 分子检测测定
CN113684316A (zh) 基于数字pcr的新型冠状病毒检测试剂盒及应用
CN108642190B (zh) 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN112522792A (zh) 一种rna测序文库的构建方法
CN112899385A (zh) 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用
CN111424102B (zh) 一种化妆品特定菌多重pcr快速检测试剂盒及其检测方法
CN114836581B (zh) 用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合
CN110501414B (zh) 一种vim型和spm型金属酶铜绿假单胞菌的识别模型、构建方法及应用
KR102612101B1 (ko) 로도코쿠스 파시언스 검출용 프라이머 세트
CN117867180B (zh) 用于检测呼吸道病原体的引物组合、试剂盒及应用
CN111197094B (zh) 用于副溶血弧菌基因分型的组合物、试剂盒和方法
CN116042868A (zh) 用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物及其应用
Munkhtogtokh et al. Combination of upstream primer-multuplex PCR (UP-mpcr) and capillary electrophoresis for equine genetic analysis
Wei et al. CRISPR/Cas13a-based single-nucleotide polymorphism detection for reliable determination of ABO blood group genotypes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant