CN118185915A - 一种新型酮糖3-差向异构酶及其在生产d-阿洛酮糖中的应用 - Google Patents
一种新型酮糖3-差向异构酶及其在生产d-阿洛酮糖中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新型酮糖3‑差向异构酶及其在生产D‑阿洛酮糖中的应用，属于基因工程和酶工程技术领域，该酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明经实验证实，MDAE酶催化D‑果糖转化为D‑阿洛酮糖的转化率为34.1％，是目前为止最高转化率的酶。该酶在pH 7.0‑8.6范围内显示出90％以上的相对活性，在75℃孵育4h后还能保留86％的活性。结果表明MDAE酶在中性、酸性、碱性条件下和较高温度下均有较高的酶活，该酶具有高转化率和良好的稳定性，适合应用于高产D‑阿洛酮糖，为D‑阿洛酮糖的工业化生产奠定重要基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，特别是涉及一种新型酮糖3-差向异构酶及其在生产D-阿洛酮糖中的应用。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种天然的稀少糖，在自然界中含量极少所以极难直接获取。D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70％，而热量仅为蔗糖的10％。D-阿洛酮糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、预防动脉粥样硬化、清除活性自由基等特殊功能，可用于制备特医食品、保健品以及合成药物。作为一种特性出众的功能糖，D-阿洛酮糖具有巨大的商业价值和广阔的市场前景。
目前，利用酮糖3-差向异构酶催化D-果糖异构化是工业生产D-阿洛酮糖的主流方法。酮糖3-差向异构酶催化D-果糖生成D-阿洛酮糖是一个可逆反应，生产过程比较温和、简单、易控，只需一种酶、一步反应便可从D-果糖转化获得D-阿洛酮糖。目前已被功能鉴定的酮糖3-差向异构酶仅有40多个，主要来源于微生物，如Pseudomonas sp.ST-24、Agrobacterium tumefaciens、Rhodobactersphaeroides、Clostridium cellulolyticum等。然而，这些酮糖3-差向异构酶普遍存在反应平衡转化率低(转化率最高仅为33％)、偏好碱性反应条件(引起糖的褐变、碱性异构化副反应)、热稳定性较差(易受热失活)等问题。更高转化率、中性偏酸性的，以及更好热稳定性的酮糖3-差向异构酶能够提升D-阿洛酮糖产量，提高原料利用率、减轻后处理产物分离负担和全面降低生产成本，是D-阿洛酮糖工业生产迫切需要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型酮糖3-差向异构酶及其在生产D-阿洛酮糖中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的MDAE酶具有高转化率、中性偏弱碱性的最适pH，以及良好的稳定性，适合应用于高产D-阿洛酮糖，为D-阿洛酮糖的工业化生产奠定重要基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种新型酮糖3-差向异构酶MDAE的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供一种新型酮糖3-差向异构酶MDAE，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种重组载体，包含上述基因。
本发明还提供一种重组菌，包含上述重组载体。
本发明还提供一种上述基因或上述新型酮糖3-差向异构酶MDAE或上述重组载体或上述重组菌在生产D-阿洛酮糖中的应用。
进一步地，将所述新型酮糖3-差向异构酶MDAE或所述重组菌与包含D-果糖的溶液混合反应，收获D-阿洛酮糖。
进一步地，所述混合反应的条件为40～95℃，pH 5.5～11。
进一步地，所述新型酮糖3-差向异构酶MDAE以纯化酶、粗酶、固定化酶或表达含MDAE酶的细胞、冻干细胞、固定化细胞的形式与包含D-果糖的溶液混合反应。
进一步地，所述重组菌选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和酿酒酵母中的至少一种。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一种新型高转化率的酮糖3-差向异构酶MDAE，其催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率为34.1％，是目前为止最高转化率的酶。并且经实验证实，该酶在pH7.0-8.6范围内显示出90％以上的相对活性，在75℃孵育4h后有86％的活性，在pH 11.0孵育12小时后仍然保留50％的活性。结果表明MDAE酶在中性、酸性、弱碱性条件下和较高温度下均有较高的酶活，该酶具有高转化率和良好稳定性，适合应用于高产D-阿洛酮糖，为D-阿洛酮糖的工业化生产奠定重要基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为MDAE的SDS-PAGE分析结果；M：marker；CK：诱导的E.coli T7/pET-28a；1：诱导的E.coli T7/pET-28a-MDAE；2：纯化的MDAE；
图2为金属离子对MDAE酶活性的影响；
图3为反应温度对MDAE酶活性的影响；
图4为反应pH值对MDAE酶活性的影响；
图5为MDAE酶的热稳定性；
图6为MDAE酶的pH稳定性；
图7为MDAE酶催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的HPLC分析结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
下述实施例所用所有试剂无特殊声明则均为常规试剂，用去离子水配置，用到的仪器均为实验室常规仪器。下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
目前已报道的酮糖3-差向异构酶的转化率普遍不高、偏好碱性作用条件、热稳定性也较差，本发明为了解决上述问题，从GenBank数据库中获得了一个全新的酮糖3-差向异构酶(MDAE)，该新型酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
ATGAATTTACCCGCTAAAAAGATGGTACTAGGCGTGCACACCTTCGCCGTGGCTCCATTTTGGGATCTGGAGGTTATGCGTCATGAGGCAAGACGTCTGAAATCTCACGGCGTGGGTCTGCTGGAGATCCCGCTGCTGCGTCCGGAAGAGATCAACATTAAAGCGACCCGTGCGTTCGCCCGCGAATTTGGCTTCGAACTGGTTACCAGCCTGGGTCTGCCGAGCAATATCGACGCCGTGGAGGACCCACAAAGCGCGTTGGCCTTCCTCGAACCGGCTTTCAAAGTGGCTGCCGAGATTGGTAGCAACATGCTGTCCGGTGTGACCTACGCACCTATTGGTAAAATCAGCGGTCAGCCGGTTACCCAGCGCGAAAAAGATGGTATCTGCCGTTTTCTGCAACAAGCAGCAGCTTTGGCCGCTAATCATGGCTTGAAGCTGGGCGTAGAACCGTGTAATCGCTACGAGACGCATCTGATGAACACCGCGGCGCAGGCAGTCGAGTATGTGGAGGCAGTCGCGGCGGAAAACCTGTTTATCCACCTGGATACTTACCACATGAATATTGAAGAAGAGTCTTTTGCCGCTGGTTTCGCGAAGGCGGCTCCGTATCTGGGTTACGTTCACTTAAGCGAATCGAACCGCGGTGTTCCGGGTCGTGCTATGATTAACTGGGACGCAGTCATGGGTGCGTTGGCGGACATCGGCTATCACGGCGCGTTGACTCTGGAGTCCATGAACTACGTTGACCCGGACATCGCCACCGCACTAGCGGTGTGGCGTCCGGTTGCGAAGAACCCGGATGATGTTATTGACTTCGGGTTGGCGTTCTTGCTTAAGGCGGCGGCGGATGCGGGCCTCACGTTTGGCTAA(SEQ ID NO.1)；
MNLPAKKMVLGVHTFAVAPFWDLEVMRHEARRLKSHGVGLLEIPLLRPEEINIKATRAFAREFGFELVTSLGLPSNIDAVEDPQSALAFLEPAFKVAAEIGSNMLSGVTYAPIGKISGQPVTQREKDGICRFLQQAAALAANHGLKLGVEPCNRYETHLMNTAAQAVEYVEAVAAENLFIHLDTYHMNIEEESFAAGFAKAAPYLGYVHLSESNRGVPGRAMINWDAVMGALADIGYHGALTLESMNYVDPDIATALAVWRPVAKNPDDVIDFGLAFLLKAAADAGLTFG(SEQ IDNO.2)。
本发明将该新型酮糖3-差向异构酶基因克隆到质粒pET-28a，然后将重组质粒转化到大肠杆菌T7 Express中，实现酮糖3-差向异构酶的异源表达。之后将酮糖3-差向异构酶纯化，再以D-果糖为底物，将其转化为D-阿洛酮糖。结果证实该新型酮糖3-差向异构酶具有高转化率和良好稳定性，在中性、酸性条件下、较高温度下有较高的酶活。具体研究如下：
实施例1：大肠杆菌重组表达菌株的构建
MDAE基因由金斯瑞生物科技股份有限公司合成(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。以合成的DNA为模板，使用引物F：5’-tataccatgggcaatttacccgctaaaaagatggta-3’和R：5’-gtgctcgaggccaaacgtgaggcccgcatccgc-3’扩增MDAE片段。使用限制性内切酶NcoI和XhoI分别酶切MDAE片段及pET-28a质粒(Novagen公司)，回收酶切产物并用T4 DNA连接酶(宝生物工程(大连)有限公司)进行连接。将连接产物转化E.coli T7 Express感受态细胞(New England Biolabs公司)，涂布含有50μg/mL卡纳霉素的LB琼脂平板(酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH 7.0)，置于37℃培养箱倒置培养12h。挑取单菌落进行液体培养，通过DNA测序，确认重组质粒pET28-MDAE构建成功。
实施例2：菌株培养及MDAE的表达、纯化
将重组菌接种至含有50μg/mL卡纳霉素的5mLTB培养基中(蛋白胨20g/L，酵母提取物24g/L，K2HPO40.072 mol/L，KH2PO40.017 mol/L，甘油4mL/L)，置于37℃，220rpm摇床中培养10h。按1％比例转接到100mL的TB培养基中，于37℃培养至菌液OD600nm为0.4-0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG，并置入20℃、180rpm摇床中诱导20h后，6000rpm离心收集菌体。加入裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，300mM NaCl，10mM咪唑)重悬细胞，加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶，充分混匀置于冰上静置15min。使用超声破胞仪破碎细胞，12000rpm离心30min。取出上清，与Ni-NTA填料充分混合，于冰上孵育1h，使目标蛋白质和Ni-NTA填料结合。将填料转移至层析柱中，使用含20mM咪唑的缓冲液洗去杂蛋白，再用含300mM咪唑的缓冲液洗脱MDAE。将洗脱所得酶液加入到透析袋中，在含有10mM EDTA的50mM Tris缓冲液中透析12h，然后再置于50mM Tris缓冲液中透析12h。即可获得不含金属离子的MDAE酶。通过SDS-PAGE分析纯化到的MDAE，结果如图1所示：纯化后获得了纯度较高的MDAE酶。
实施例3：MDAE酶学性质测定
酶活单位定义：在标准反应条件下，每分钟催化D-果糖生产1μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。
使用HPLC测定D-阿洛酮糖和D-果糖的含量，色谱条件如下：色谱柱：糖分析柱MARSMPb(10μm，300×7.8mm)；流动相：超纯水；柱温：75℃；流速：0.6mL/min。图7为MDAE酶与D-果糖反应的HPLC分析结果，表明MDAE酶能够催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。
MDAE最适金属离子的测定：将不含金属离子的MDAE与终浓度为1mM的金属离子(BaCl2，CaCl2，CoCl2，CuCl2，FeCl2，MgCl2，MnCl2，NiCl2，ZnCl2，FeCl3)，或EDTA在4℃孵育1h。取酶液在50mM Tris缓冲液(pH8.0)中加入1mM的对应的金属离子或EDTA，以50g/L的D-果糖为底物，于85℃反应10分钟后煮沸终止反应。HPLC检测反应液中的糖浓度，计算酶活力。以最高活力为100％，计算各条件下的相对活性。测试结果如图2所示，MDAE的最适金属离子为Co2+。
MDAE最适温度的测定：取酶液在含有1mM CoCl2的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中，以50g/L的D-果糖为底物测定40℃～95℃的温度对酶活性的影响。反应10分钟后煮沸终止反应。HPLC检测反应液中的糖浓度，计算酶活力。以最高活力为100％，计算各条件下的相对活性。发现MDAE的最适温度为85℃，在80℃-90℃范围内表现出90％以上相对活性(图3)。
MDAE最适pH的测定：取酶液分别在含有1mM CoCl2的50mM MES缓冲液(pH5.5-6.5)、MOPS缓冲液(pH6.5-7.5)、Tris缓冲液(pH7.5-8.5)、CHES缓冲液(pH8.6-10.0)、CAPS缓冲液(pH10.0-11.0)中，以50g/L的D-果糖为底物测定pH对酶活性的影响。于85℃反应10分钟后煮沸终止反应。HPLC检测反应液中的糖浓度，计算酶活力。以最高活力为100％，计算各条件下的相对活性。发现MDAE的最适pH为8.0，在pH 6.5-9.5的范围内具有60％以上的相对酶活(图4)。
MDAE热稳定性的测定：将MDAE置于75℃，80℃，85℃，90℃水浴中孵育特定时间，测定处理后的酶液所剩余的酶活力。取酶液在含有1mM CoCl2的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中，以50g/L的D-果糖为底物，于85℃反应10分钟后煮沸终止反应。HPLC检测反应液中的糖浓度，计算酶活力。以未经过热孵育处理的酶的活性为100％，计算各条件下的相对活性。结果如图5所示，MDAE在75℃的环境中孵育4h后，仍然能保留86％的残余活力。计算结果表明，MDAE在75℃下的半衰期为1155分钟。
MDAE的pH稳定性的测定：将MDAE在pH为5.5～11.0的环境中孵育12h后，测定处理后的酶液所剩余的酶活力。取酶液在含有1mM CoCl2的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中，以50g/L的D-果糖为底物，于85℃反应10分钟后煮沸终止反应。HPLC检测反应液中的糖浓度，计算酶活力。以最高活力为100％，计算各条件下的相对活性。可以发现MDAE具有优秀的pH稳定性，在pH 6.5～9.5的环境中孵育12h，残余酶活保持在90％以上，在pH11.0孵育12小时后仍然保留50％的活性(图6)。
上述结果证实，本研究提供的MDAE酶能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖，且该酶具有优异的耐高温和耐酸碱度性能，稳定性好。
实施例4：使用纯化的MDAE制备D-阿洛酮糖
分别在含有1mM CoCl2的50mM的Tris缓冲液(pH7.5或8.0)，MOPS缓冲液(pH7.0或7.5)中，以500g/L果糖为底物，加入终浓度为10μM MDAE酶，在75、80或85℃条件下反应12h。煮沸终止反应后，使用HPLC检测反应液。检测结果如表1所示，MDAE在测试的条件下均能将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，其中最高转化率为34.1％。
表1MDAE的转化率
实施例5：使用含有MDAE的粗酶液制备D-阿洛酮糖
按照实施例2所描述的方法，在大肠杆菌中诱导表达MDAE并使用超声破胞仪破碎细胞，12000rpm离心30min后获得上清液。该上清即为含有MDAE的粗酶液。在含有1mM CoCl2的50mM的Tris缓冲液(pH8.0)中，以500g/L果糖为底物，加入终浓度为0.65mg/mL的MDAE粗酶液，在85℃下反应6h。煮沸终止反应后，使用HPLC检测反应液。结果显示MDAE粗酶液能够将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，转化率为34.1％。
实施例6：使用表达MDAE的大肠杆菌细胞制备D-阿洛酮糖
按照实施例2所描述的方法，在大肠杆菌中诱导表达MDAE并离心收集菌体。以新鲜的菌体或者经冷冻干燥后的菌体为全细胞催化剂制备D-阿洛酮糖。在含有1mM CoCl2的50mM的Tris缓冲液(pH8.0)中，以500g/L果糖为底物，加入终浓度为12.5、25、50或100OD600nm的细胞，在85℃下反应6h。煮沸终止反应后，使用HPLC检测反应液。结果显示无论是新鲜的菌体或者经冷冻干燥后的菌体均能够将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，转化率均在34.0-34.1％。
表2全细胞反应的转化率
实施例7：枯草芽孢杆菌重组表达菌株的构建
以pET28-MDAE为模板，使用引物pHT-F：5’-gaaggatccatgaatttacccgctaaaaagatggtac-3’和pHT-R：5’-gactctagattagtgatggtgatggtgatggccaaacgtgaggcccgcatccgc-3’扩增MDAE片段。使用限制性内切酶BamHI和XbaI分别酶切MDAE片段及pHT254质粒(MoBiTecMolecular Biotechnology公司)，回收酶切产物并用T4 DNA连接酶(宝生物工程(大连)有限公司)进行连接。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞(New England Biolabs公司)，涂布含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板(酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH 7.0)，置于37℃培养箱倒置培养16h。挑取单菌落进行液体培养，通过DNA测序，确认重组质粒pHT-MDAE构建成功。通过电转将重组质粒pHT-MDAE转化进枯草芽孢杆菌WB800N中，涂布含有5μg/mL氯霉素的LB琼脂平板，置于37℃培养箱倒置培养16h。
实施例8：重组枯草芽孢杆菌培养及全细胞转化制备D-阿洛酮糖
将重组枯草芽孢杆菌接种至含有5μg/mL氯霉素的5mL LB培养基中，置于37℃，220rpm摇床中培养12h。按1％比例转接到含有5μg/mL氯霉素的100mL的LB培养基中，于37℃培养至菌液OD600nm为0.6时加入终浓度为1mM的IPTG，并置入30℃、220rpm摇床中诱导16h后，6000rpm离心收集菌体。在含有1mM CoCl2的50mM的Tris缓冲液(pH8.0)中，以500g/L果糖为底物，加入终浓度为100OD600nm的细胞，在60-90℃下反应6h。煮沸终止反应后，使用HPLC检测反应液。结果显示使用重组枯草芽孢杆菌全细胞能够将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，转化率在27.3-32.0％范围内。
表3全细胞反应的转化率
实施例9：酿酒酵母重组表达菌株的构建
以pHT-MDAE为模板，使用引物pcev-F：5’-gcatagcaatctaatctaagaaaaaaatgaatttacccgctaaaaagatg-3’和pcev-R：5’-ccttttcggttagagcggatttagtgatggtgatggtgatggccaaacgtgaggcccgc-3’扩增MDAE片段。以pCEV-G4-km(Addgene)为模板，使用引物pcev-CYC-F：5’-atccgctctaaccgaaaaggaagg-3’和pcev-TEF-R：5’-cttagattagattgctatgctttctttc-3’扩增载体片段。使用In-fusion HD cloning kit将MDAE片段和载体片段连接(宝生物工程(大连)有限公司)。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞(New England Biolabs公司)，涂布含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板(酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH 7.0)，置于37℃培养箱倒置培养16h。挑取单菌落进行液体培养，通过DNA测序，确认重组质粒pCEV-MDAE构建成功。通过电转将重组质粒pCEV-MDAE转化进酿酒酵母MYA-1166中，涂布含有200μg/mL的G418的YPD(酵母粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂15.0g/L)琼脂平板，置于37℃培养箱倒置培养3天。
实施例10：重组酿酒酵母菌培养及全细胞转化制备D-阿洛酮糖
将重组酿酒酵母菌接种至含有200μg/mLG418的5mLYPD培养基中(酵母粉10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L)，置于30℃，200rpm摇床中培养24h。按2％比例转接到含有200μg/mLG418的100mL的YPD培养基中，置于30℃、200rpm摇床中培养36后，6000rpm离心收集菌体。在含有1mM CoCl2的50mM的Tris缓冲液(pH8.0)中，以500g/L果糖为底物，加入终浓度为100OD600nm的细胞，分别在80，85和90℃下反应6h。煮沸终止反应后，使用HPLC检测反应液。结果显示使用重组酿酒酵母菌全细胞能够将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，转化率在3.5-5.0％范围内。
表4全细胞反应的转化率
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种新型酮糖3-差向异构酶MDAE的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种新型酮糖3-差向异构酶MDAE，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述基因。
4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述重组载体。
5.一种如权利要求1所述基因或权利要求2所述新型酮糖3-差向异构酶MDAE或权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组菌在生产D-阿洛酮糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述新型酮糖3-差向异构酶MDAE或所述重组菌与包含D-果糖的溶液混合反应，收获D-阿洛酮糖。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述混合反应的条件为40～95℃，pH5.5～11。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述新型酮糖3-差向异构酶MDAE以纯化酶、粗酶、固定化酶或表达含MDAE酶的细胞、冻干细胞、固定化细胞的形式与包含D-果糖的溶液混合反应。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组菌选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母中的至少一种。
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