CN118185875A - 具有多种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及含有多种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途。本发明中自然杀伤细胞即NK细胞通过碱基编辑***安全高效地敲除NK细胞的TIGIT基因、TGFBR2基因、NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因。本发明中碱基编辑的NK细胞具有高效的杀伤肿瘤细胞的作用，可望开发成为一种安全而有效的抗癌药物，具有广阔的临床应用前景和开发价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及具有多种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤属于全身性疾病,人体细胞免疫功能的破坏是肿瘤复发、扩散和转移的重要原因，可以说只要能够阻止肿瘤的转移和复发，就解决了癌症的根本问题。
一些癌症的发生与功能失调的NK细胞有关。因此，修复这种NK细胞可能是抗肿瘤免疫治疗的一个潜在选择。这种修复的一种方法是抑制免疫检查点(如CD96、NKG2A等)，即癌细胞通过控制免疫细胞表面的抑制受体进行免疫逃逸；减少肿瘤TME对NK细胞的免疫抑制，从而增强NK细胞的肿瘤杀伤力和持久性，增强肿瘤的免疫应答，减少肿瘤的侵袭和迁移，具有良好的临床应用前景。
NK细胞又称自然杀伤细胞(Natural Killer Cell)，是机体的一类固有免疫细胞，作为人体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线，具有对肿瘤的直接溶解活性，可非特异性直接杀伤肿瘤细胞，这种天然杀伤活性既不需要抗原致敏，也不需要抗体参与，但目前NK细胞的杀伤效果还有待进一步的提高，需要研发杀伤效果更优异、安全性更高、副作用更小的NK细胞。
NK细胞的抗肿瘤效应取决于激活和抑制受体信号之间的平衡。激活受体识别在转化或感染细胞上选择性表达的各种配体，并且这些信号通过多种不同的细胞内信号通路传递。抑制受体包括识别MHC I类(主要是HLA-C/B)多形区域的抑制性杀伤免疫球蛋白样受体(iKIRs)和识别非经典HLA-E/G的NKG2A。抑制性配体的下调或缺失(“自我缺失”)促进NK细胞活化。NK细胞受体的表达可以随着激活而改变或受肿瘤微环境的影响，从而诱导NK细胞表达抑制性检查点分子。
同种异体NK细胞疗法与CAR-T细胞疗法相比具有多种优势：(1)异体NK细胞不会引起移植物抗宿主病(GVHD)，CRS反应和NT等不良事件发生率也比较低；(2)除了靶向识别之外，可以直接启动ADCC和细胞毒效应，多种方式识别肿瘤从而减少抗原逃逸；(3)NK细胞的来源更为广泛，也容易通过CRISPR/Cas9等基因编辑的手段提高NK细胞的反应持久性并降低免疫原性。
尽管经典的CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了对NK细胞的高效遗传操作，但经典的CRISPR/Cas9基因编辑技术以DNA双链断裂为基础的遗传操作可能导致百万碱基级别的染色体缺失，影响人类细胞基因组的完整性和稳定性。另外，双链断裂可引起p53诱导的细胞凋亡，阳性编辑的细胞更倾向于富集p53突变的细胞，这种编辑的细胞注射到体内无疑增加了癌变风险。因此，利用更安全的基因编辑工具应用于构建安全风险更小的基因编辑NK细胞是当下亟需解决的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种遗传修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途，用于解决现有技术中经以DNA双链断裂遗传操作的NK细胞可能导致百万碱基级别的染色体缺失以及癌变风险增加的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞的基因经过碱基编辑以在不引入DNA双链断裂的情况下进行基因编辑，所述基因选自TIGIT基因、TGFBR2基因、NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因中的任一个或多个。
本发明第二方面提供一种碱基编辑***，所述碱基编辑***包括：I)融合蛋白或编码融合蛋白的核苷酸；II)引导RNA或编码引导RNA的核苷酸，用于上述第一方面的自然杀伤细胞的碱基编辑。
本发明第三方面提供上述的第一方面的自然杀伤细胞的制备方法，所述制备方法为将上述第二方面的碱基编辑***导入自然杀伤细胞进行编辑，获得所述自然杀伤细胞。
本发明第四方面提供一种产品，所述产品包含上述第一方面的自然杀伤细胞、或上述第二方面的碱基编辑***。
本发明第五方面提供上述第一方面的自然杀伤细胞、上述第二方面的碱基编辑***、上述第三方面的制备方法、上述第四方面的产品的用途，所述用途选自以下任一项或多项：
1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
2)制备用于预防和/或***的药物；
3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
如上所述，本发明的一种自然杀伤细胞、及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
本发明的研究结果显示：利用修饰的sgRNA和碱基编辑融合蛋白，以电穿孔转染的方式将sgRNA/BE蛋白复合物(RNP)导入经体外扩增的原代NK细胞，可以高效敲除NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因，从而在不引入DNA双链断裂的情况下进行基因编辑，避免现有技术中经以DNA双链断裂遗传操作的NK细胞可能导致百万碱基级别的染色体缺失以及癌变风险增加的问题。利用本发明可解除NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2对NK细胞的免疫抑制作用。本发明的NK细胞相对于野生型NK细胞和现有的碱基编辑NK细胞在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，且具有更高的安全性，副作用更小。本发明的NK细胞可以作为药物及时有效地应用于临床免疫治疗，可以为建立碱基编辑技术联合过继免疫在肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS)的治疗提供新的选择，还可以为新的有效基因靶点的研究提供支持，同时为相关疾病治疗的研究奠定坚实的技术基础，因此具有明显的应用前景和临床应用价值。
附图说明
图1显示为本发明不同Donor来源的NK纯度检测。
图2显示为本发明第一周NK纯度检测。
图3显示为本发明不同靶点组合分组说明。
图4显示为本发明电转染后细胞密度统计。
图5显示为本发明第二周NK细胞增殖倍数统计
图6显示为本发明Group1编辑检测结果展示。
图7显示为本发明Group2编辑检测结果展示。
图8显示为本发明Group3编辑检测结果展示。
图9显示为本发明Group4编辑检测结果展示。
图10显示为本发明Group5编辑检测结果展示。
图11显示为本发明Group6编辑检测结果展示。
图12显示为本发明Group1-Group6中各个基因编辑效率结果展示。
图13显示为本发明三周NK总增殖情况统计表。
图14显示为本发明Group1在胃癌细胞中杀伤结果展示。
图15显示为本发明Group2和Group3在血液瘤细胞中杀伤结果展示。
图16显示为本发明Group2和Group3在脑胶质瘤细胞中杀伤结果展示。
图17显示为本发明Group4、Group5和Group6在肝癌细胞中杀伤结果展示。
图18显示为本发明Group1-Group6在胃癌、脑胶质瘤和肝癌中的抗肿瘤情况展示。
图19显示为本发明计算NK细胞体外杀伤能力计算公式。
图20显示为对比例1中Group1-Group6与Group8的杀伤效果对比。
图21显示为对比例2中Group1-Group6与Group8在胃癌、脑胶质瘤和肝癌中的抗肿瘤情况对比。
图22显示为对比例3中Group1-Group6与单基因编辑的Group9-Group11的杀伤效果对比。
具体实施方式
本发明第一方面提供一种自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞的基因经过碱基编辑以在不引入DNA双链断裂的情况下进行基因编辑，所述基因选自TIGIT基因、TGFBR2基因、NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因中的任一个或多个，例如可以为上述基因的随机组合。
本领域技术人员可知，所述自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。
进一步地，所述自然杀伤细胞的NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因中的3个同时经过碱基编辑。
在本申请中，碱基编辑是指一种新的基因组编辑技术，在靶基因内的靶位点引起点突变(诸如由于基因或基因水平的点突变而引起的单个氨基酸突变)的碱基突变，例如可以为碱基的置换、缺失或添加，在碱基编辑中突变碱基的数量较小。
在一些具体实施方式中，所述自然杀伤细胞包含如下特征中的一项或多项：
1)TIGIT、TGFBR2和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
2)TIGIT、TGFBR2和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
3)PVRIG、TGFBR2和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
4)TIGIT、CD96和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
5)TIGIT、PVRIG和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
6)TIGIT、CD96和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
本申请的具体实施例中，NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2都对NK细胞具有免疫抑制作用，同时编辑其中多个基因具有协同效应，提高了NK细胞的杀伤能力和抗肿瘤效果，且在本申请的某些实施例中，经过本申请的碱基编辑的NK细胞具有更高的安全性，肿瘤小鼠的存活时间更长。
所述自然杀伤细胞的来源种类丰富，在本申请中，通常情况下，所述自然杀伤的细胞可以为外周血细胞的NK细胞、源于脐带血的NK细胞、胚胎干细胞诱导的NK细胞或诱导多能干细胞(IPS)诱导的NK细胞中的一种或多种，或其它来源的自然杀伤细胞也可包含在本申请中。
进一步的，前述自然杀伤细胞中NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因的至少部分碱基C突变至T；所述碱基C突变至T生成提前终止密码子或使得起始密码子突变或使内含子剪接位点突变；所述碱基C突变至T发生CDS区中的CAA、CAG、CGA、TGG；具体的，前述自然杀伤细胞中提前终止密码子为TAA，TAG，TGA或者TGA；所述碱基C突变至T中发生起始密码子ATG突变为ATA；所述碱基C突变至T发生内含子剪接位点GT、AG突变为AT、AA。
在一些具体实施方式中，至少部分碱基C突变至T至少包含以下任一项或多项特征：
1)将TIGIT基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
2)将TGFBR2基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
3)将PVRIG基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
4)将NKG2A基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
5)将CD96基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
具体的，1)TIGIT基因上如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列；
2)TGFBR2基因上如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
3)PVRIG基因上如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
4)NKG2A基因上如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
5)CD96基因上如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列分别突变为如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
具体的，上述核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1AGGTTCCAGATTCCATTGCT
SEQ ID NO.2GAAGCCACAGGAAGTCTGTG
SEQ ID NO.3CTCCCAGGAGCCCTCAGGGA
SEQ ID NO.4AGGCAGCAACGAAAACCTAA
SEQ ID NO.5TGTTCCACACTTTATTTCCT
SEQ ID NO.6AGGTTCTAGATTCCATTGCT
SEQ ID NO.7GAAGCCATAGGAAGTCTGTG
SEQ ID NO.8CTCCCAGGAGCCCTCAGGGA
SEQ ID NO.9AGGTAGTAACGAAAACCTAA
SEQ ID NO.10TGTTTTACACTTTATTTCCT
本发明第二方面一种碱基编辑***，所述碱基编辑***包括：I)融合蛋白或编码融合蛋白的核苷酸；II)引导RNA或编码引导RNA的核苷酸，用于上述自然杀伤细胞的碱基编辑。
在一些具体实施方式中，所述碱基编辑***包括I)融合蛋白或其变体或编码融合蛋白或其变体的核苷酸；II)引导RNA或编码引导RNA的核苷酸。
在本发明的具体实施方式中，所述融合蛋白的结构可以包括：NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]-[核定位信号]-COOH或NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[核定位信号]-COOH。
具体的，前述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；编码前述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
在本申请的具体实施方式中，上述氨基酸和核苷酸序列如下所述：
SEQ ID NO.16：
MKRTADGSEFESPKKKRKVSSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKSGSETPGTSESATPESGSMEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIFDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSESGSGSETPGTSESATPESETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFEPKKKRKV
SEQ ID NO.17
ATGAAAAGGACAGCTGATGGATCAGAATTTGAGTCACCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCAGCAGCGACAAAAAGTACTCGATTGGCCTGGCGATTGGTACGAATTCTGTCGGTTGGGCGGTCATCACGGATGAGTACAAGGTCCCGAGCAAGAAATTCAAAGTGCTGGGTAATACAGATCGTCACAGCATCAAAAAAAACTTAATTGGTGCACTGCTGTTCGATAGCGGTGAAACCGCGGAAGCTACCCGCCTGAAGCGTACCGCGCGTCGTCGTTACACCCGTCGCAAGAACCGCATTTGTTATCTGCAAGAAATATTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTTGACGACAGCTTTTTTCATCGTCTGGAGGAGTCCTTCCTTGTGGAAGAGGACAAAAAGCACGAACGTCATCCGATCTTTGGTAACATTGTCGACGAAGTGGCATATCACGAAAAGTACCCGACCATCTATCATCTGAGAAAGAAGTTGGTTGACAGCACGGATAAGGCAGATCTGCGTCTGATTTACTTGGCTCTGGCGCACATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTCTGATCGAGGGTGATCTGAATCCGGATAACAGTGACGTTGACAAGCTTTTCATTCAGCTTGTGCAGACCTACAACCAGTTGTTCGAGGAAAACCCGATCAACGCCAGCGGGGTGGACGCGAAGGCGATTCTAAGCGCGCGTCTGTCCAAGAGCCGCCGTTTGGAGAACCTGATCGCTCAGTTGCCAGGTGAGAAGAAGAATGGCTTGTTCGGCAACCTCATCGCGCTGTCACTGGGTCTGACGCCGAATTTCAAATCAAACTTCGATTTAGCGGAGGATGCGAAACTGCAGCTGTCCAAAGATACCTATGATGATGACCTTGATAATCTCCTGGCCCAAATTGGCGACCAGTATGCAGATTTGTTCCTTGCCGCCAAGAACCTCTCTGACGCGATCCTGCTGTCTGATATCCTGCGCGTGAATACCGAAATAACCAAAGCCCCTCTCTCTGCGAGCATGATTAAACGTTACGACGAGCATCACCAAGATCTGACACTGCTCAAGGCCTTGGTGCGTCAGCAGCTACCGGAGAAGTATAAAGAGATCTTTTTCGACCAAAGCAAGAACGGCTACGCGGGTTATATCGATGGCGGCGCATCTCAAGAAGAGTTTTATAAGTTCATCAAGCCGATCCTCGAGAAAATGGACGGCACCGAGGAACTACTGGTCAAACTGAACCGAGAGGATTTATTACGTAAGCAACGTACCTTTGATAACGGCTCGATTCCGCATCAGATTCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATTTTGCGCCGTCAGGAGGATTTCTATCCGTTTCTTAAAGACAACCGTGAAAAAATCGAAAAAATCTTGACTTTTCGTATCCCTTATTACGTGGGTCCGCTGGCCCGTGGCAATAGCCGCTTCGCGTGGATGACCCGTAAATCCGAAGAAACCATCACCCCGTGGAACTTTGAAGAAGTGGTTGACAAAGGAGCGTCAGCGCAATCCTTTATCGAGCGTATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAATGAAAAGGTGCTCCCGAAGCACAGCTTATTGTACGAATACTTTACCGTTTATAATGAACTGACGAAAGTGAAATACGTTACCGAGGGTATGCGTAAGCCGGCTTTTTTATCCGGCGAGCAGAAGAAGGCGATTGTTGACTTGCTGTTTAAAACCAACCGTAAAGTGACCGTGAAACAATTAAAGGAGGACTATTTCAAAAAAATTGAGTGCTTTGACTCTGTTGAGATCTCCGGGGTGGAAGATCGCTTTAACGCGAGCCTTGGCACCTATCATGATCTGCTGAAAATCATCAAGGACAAAGATTTTTTGGATAACGAGGAGAATGAAGACATTCTGGAGGACATTGTACTGACCCTGACGCTGTTCGAAGATCGTGAAATGATAGAAGAGCGTCTCAAAACCTATGCACATCTGTTTGACGACAAGGTTATGAAACAGTTGAAGCGTCGGCGCTACACCGGCTGGGGTCGCCTGTCTCGTAAATTGATCAATGGCATTCGCGACAAGCAGAGCGGCAAGACGATCCTGGACTTCCTGAAATCCGACGGTTTCGCGAATCGTAATTTTATGCAGTTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAAGATATCCAAAAAGCTCAGGTTAGCGGCCAGGGTGACTCTCTTCACGAGCACATTGCAAATCTGGCCGGCAGCCCGGCAATTAAAAAAGGTATCTTGCAAACCGTTAAAGTGGTAGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGTAGGCACAAGCCGGAAAACATCGTGATCGAAATGGCTCGTGAAAATCAAACCACCCAGAAAGGCCAGAAGAACTCTCGTGAGCGCATGAAACGTATTGAAGAAGGTATCAAGGAGTTGGGCAGCCAAATTTTGAAGGAGCACCCGGTTGAAAACACCCAGCTGCAAAACGAGAAACTGTACTTGTACTATCTGCAAAACGGTAGAGATATGTATGTTGATCAAGAGCTCGACATCAACCGTTTGAGTGACTATGACGTTGACCACATCGTTCCGCAATCGTTCCTGAAAGACGACTCCATCGATAACAAAGTCTTAACCCGTAGCGATAAAAACCGCGGCAAGAGCGATAACGTGCCGTCCGAAGAAGTCGTCAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGTCAGCTGCTGAATGCGAAGCTGATAACCCAGCGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCGGAGCGTGGCGGCCTGTCGGAATTGGACAAAGCGGGCTTCATCAAACGCCAACTGGTCGAAACCCGTCAGATCACCAAACACGTTGCCCAGATCCTGGATTCCCGTATGAATACCAAGTACGATGAGAATGATAAGCTCATTCGTGAAGTTAAAGTGATTACGCTGAAATCTAAACTGGTGAGCGACTTCCGTAAGGATTTTCAGTTCTATAAAGTTCGCGAGATCAACAATTATCACCATGCCCACGATGCCTACTTGAACGCGGTGGTAGGTACGGCCCTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTTGAGTCGGAGTTCGTGTACGGCGATTACAAAGTTTATGACGTTCGCAAAATGATTGCTAAGAGCGAGCAAGAAATCGGCAAGGCGACCGCGAAGTATTTTTTCTACTCTAACATCATGAACTTTTTCAAGTCTGGCTCGGAAACTCCGGGTACCAGTGAGTCGGCGACTCCCGAATCGGGGTCTATGGAAGCAAGTCCGGCTTCAGGACCGCGTCACCTGATGGACCCGCATATCTTCACCTCTAACTTCAATAACGGTATCGGCCGTCACAAGACCTACCTGTGCTACGAGGTCGAACGTCTGGATAACGGAACCAGCGTAAAGATGGACCAGCACCGCGGCTTCCTGCATAATCAGGCGAAGAACCTGCTGTGTGGTTTCTACGGTCGTCACGCAGAATTGCGTTTTCTGGACCTTGTACCGAGCCTCCAATTGGACCCGGCGCAAATCTATCGTGTGACCTGGTTCATAAGCTGGAGCCCTTGTTTTAGCTGGGGCTGCGCAGGCGAAGTTCGCGCATTTCTGCAGGAGAACACGCATGTTCGTCTGAGAATCTTCGCCGCGCGTATCTTTGACTATGACCCGCTGTACAAAGAGGCTCTTCAGATGCTGCGTGATGCGGGCGCGCAAGTGAGCATCATGACATACGACGAATTCAAGCACTGCTGGGACACCTTCGTGGATCATCAAGGTTGCCCGTTTCAGCCGTGGGACGGTCTGGACGAACATAGCCAGGCGTTGAGCGGACGTCTCCGTGCTATTCTGCAAAACCAGGGTAATAGCGGCTCCGAATCGGGTAGCGGTAGTGAAACTCCGGGTACATCGGAGAGCGCAACCCCGGAATCTGAAACGAACGGTGAAACAGGTGAGATCGTTTGGGATAAGGGCAGAGATTTTGCTACCGTTCGTAAAGTCTTAAGCATGCCGCAGGTTAATATTGTGAAAAAAACCGAGGTGCAGACCGGCGGTTTTAGCAAAGAGAGCATTCTGCCAAAGCGTAATAGCGACAAACTGATTGCACGTAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAATACGGCGGTTTTGATTCACCAACCGTTGCGTACAGCGTATTGGTGGTTGCTAAAGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAATTGAAAAGCGTTAAAGAGCTGCTGGGCATCACGATTATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGACTTCCTGGAGGCCAAAGGTTATAAAGAGGTAAAAAAGGATTTGATCATTAAGTTGCCAAAATATTCTCTATTCGAATTGGAAAACGGTCGCAAACGCATGCTGGCGTCTGCGGGCGAACTGCAAAAAGGTAACGAGCTGGCGCTGCCAAGCAAGTACGTCAACTTTTTGTACTTGGCGAGTCATTATGAAAAGCTGAAAGGTAGCCCGGAGGACAACGAGCAAAAACAACTGTTCGTTGAACAGCATAAACACTATCTGGACGAAATCATTGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGCGCGTTATTCTCGCTGACGCGAATCTGGACAAGGTTCTATCAGCGTATAACAAACATCGTGATAAACCGATTCGTGAACAAGCAGAGAACATCATCCATTTGTTCACCCTAACGAACCTGGGTGCGCCGGCGGCATTTAAATACTTCGATACGACCATTGATCGGAAGCGTTACACTAGCACCAAGGAAGTTCTGGACGCTACCCTCATCCACCAGAGCATCACGGGCCTGTACGAGACGCGCATCGACCTCAGCCAGTTAGGTGGTGACAGCGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGCGGTAGCACCAATTTGAGCGATATTATCGAGAAGGAAACTGGCAAGCAATTAGTGATCCAGGAATCCATTCTGATGCTGCCGGAAGAAGTGGAAGAGGTTATTGGCAACAAGCCGGAAAGCGATATCCTGGTGCACACCGCTTACGACGAATCCACGGATGAGAACGTGATGCTGTTGACCAGCGACGCTCCGGAATATAAGCCGTGGGCACTGGTGATTCAGGATTCCAATGGCGAGAACAAGATTAAGATGCTGTCCGGTGGCTCCGGTGGCTCCGGCGGGTCGACGAACCTGTCCGACATTATCGAGAAAGAAACGGGTAAACAGTTAGTGATTCAAGAGTCCATTCTGATGCTCCCAGAGGAGGTTGAAGAGGTAATCGGTAACAAACCGGAAAGCGATATTCTAGTGCATACCGCTTACGACGAAAGCACCGATGAAAACGTTATGTTGCTGACTTCAGATGCGCCAGAATATAAGCCGTGGGCACTGGTTATTCAAGACAGTAACGGCGAAAATAAGATTAAGATGCTGTCTGGTGGTTCCAAAAGGACAGCCGATGGCTCCGAATTCGAACCAAAAAAAAAGAGAAAGGTT
在一些具体实施方式中，前述融合蛋白的变体为前述融合蛋白的片段、衍生物和类似物，其为一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基为遗传密码编码或非遗传密码编码的，或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。根据本发明的定义，前述片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在一些实施方式中，所述融合蛋白的变体是指与前述融合蛋白的氨基酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性，且具有前述融合蛋白相同或相似功能的蛋白。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性；具体地可为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。上述90％或90％以上同一性，可为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。所述相似功能是指保留原蛋白的75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高的功能。
所述编码融合蛋白及其变体的核苷酸为DNA或RNA形式中的一种或多种。DNA形式为cDNA、基因组DNA、人工合成的DNA，cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA中任意单链形式的一种或多种；RNA形式为编码链或非编码链中的一种或种。
在一些具体实施方式中，前述融合蛋白及其变体直接递送至自然杀伤细胞中以编辑核苷酸的碱基；或以前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸的RNA形式递送，其在递送进入宿主细胞之后被翻译成所述融合蛋白或其变体以编辑核苷酸的碱基；或以包含前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸的DNA形式的表达载体递送，所述表达载体包含编码一个或多个基因以表达融合蛋白及其变体的DNA形式的核苷酸序列，其在递送进入宿主细胞之后被转录、翻译成所述融合蛋白或其变体以编辑核苷酸的碱基。
在一些具体实施方式中，前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列为只编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列、编码融合蛋白及其变体和各种附加的核苷酸序列或编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列和非编码序列的核苷酸序列的一种或多种；前述引导RNA或编码引导RNA的核苷酸序列为只编码引导RNA或编码引导RNA核苷酸序列、编码引导RNA或编码引导RNA的核苷酸和各种附加的核苷酸序列、编码引导RNA或编码引导RNA的核苷酸和非编码序列的核苷酸序列的一种或多种。
在一些具体实施方式中，前述引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.5任一所示；前述引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.15任一所示。
具体的，SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.15的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.11
AGGTTCCAGATTCCATTGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
SEQ ID NO.12
GAAGCCACAGGAAGTCTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
SEQ ID NO.13
CTCCCAGGAGCCCTCAGGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
SEQ ID NO.14
AGGCAGCAACGAAAACCTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
SEQ ID NO.15
TGTTCCACACTTTATTTCCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
在一些具体实施方式中，针对TIGIT基因的引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；针对TIGIT基因的引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在一些具体实施方式中，针对TGFBR2基因的引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；针对TGFBR2基因的引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一些具体实施方式中，针对PVRIG基因的引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；针对PVRIG基因的引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在一些具体实施方式中，针对NKG2A基因的引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；针对NKG2A基因的引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在一些具体实施方式中，针对CD96基因的引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；针对CD96基因的引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
优选的，前述引导RNA的3'端和5'端的前2-4个核苷酸为硫代基和/或甲氧基修饰的核苷酸。
在本申请的优选实施例中，融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.16所示的融合蛋白时，所述引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5任一所示；所述引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.15任一所示。
在一些具体实施方式中，前述编辑***中引导RNA与融合蛋白或其变体的质量比为1:(2～20)；更具体的，所述质量比为1:(1～2)、1:(2～4)、1:(2～6)、1:(2～8)、1:(2～10)、1:(2～12)、1:(2～14)、1:(2～16)、1:(2～18)、1:(2～20)、1：(4～6)、1:(4～8)、1:(4～10)、1:(4～12)、1:(4～14)、1:(4～16)、1:(4～18)、1:(4～20)、1:(8～10)、1:(8～12)、1:(8～14)、1:(8～16)、1:(8～18)、1:(8～20)、1:(10～12)、1:(10～14)、1:(10～16)、1:(10～18)、1:(10～20)、1:(12～14)、1:(14～16)、1:(16～18)或1:(18～20)中任一的一组。优选的，所述质量比为为1:(2～8)。更优选的，所述质量比为1：(2～4)。
在一些具体实施方式中，前述碱基编辑***为表达载体。所述表达载体为一个或多个。前述表达载体包含第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件含有前述编码融合蛋白或其变体的核苷酸序列；所述第二调控元件含有前述编码引导RNA或编码引导RNA核苷酸序列。前述第一调控元件和第二调控元件位于相同或不同的表达载体上。表达载体中第一调控元件和第二调控元件为一个或多个。
前述第一调控元件调控前述编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列的转录。所述第一调控元件中编码融合蛋白及其变体的核苷酸序列为一个或多个。所述第二调控元件调控前述编码引导RNA或编码引导RNA核苷酸序列的转录。所述第二调控元件中编码引导RNA序列的核苷酸序列为一个或多个。
上述碱基编辑***在使用时，通过碱基编辑***使NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因上的碱基C突变至T，或将碱基A突变至G以编辑NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因。
在一些具体实施方式中，碱基C突变至T，或碱基A突变至G如下述的一种或多种：
1)将TIGIT基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
2)将TGFBR2基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
3)将PVRIG基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
4)将NKG2A基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
5)将CD96基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
更具体的，上述碱基C突变至T，或碱基A突变至G，具有以下一项或多项特征，
1)TIGIT基因上如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
2)TGFBR2基因上如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；；
3)PVRIG基因上如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
3)NKG2A基因上如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
3)CD96基因上如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
本发明第三方面提供所述自然杀伤细胞的制备方法，所述制备方法为将所述的碱基编辑***导入自然杀伤细胞进行编辑，以制备NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因经过碱基编辑的自然杀伤细胞，该自然杀伤细胞具有更好的杀伤效果和抗肿瘤效果，且具有更高的安全性。
在一些具体实施方式中，将所述的碱基编辑***导入自然杀伤细胞的方法选自电穿孔法、病毒转导、显微注射法、粒子轰击法或基因枪转化法中的一种或多种。更具体的，所述转入的方法为电穿孔法。
优选的，前述电穿孔法中使用的电转仪***选自LONZA***、Thermo的Neon转染***或CTS的Xenon电穿孔***中的一种或多种。
在本发明的具体实施例中，所述电穿孔法中使用的电转仪***为LONZA***、型号为4D-Nucleofector的电转仪时，电转程序选自CM137、CM158或CM189；
在本发明的另一具体实施例中，电穿孔法中使用的电转仪***为Thermo电转染***、型号为Neon电转染仪或CTS Xenon电转染仪时，电转程序选自以下任一程序：
1)电压1650-1750v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；
2)电压1750-1850v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；
3)电压2150-2250v，脉冲宽度2-4ms，脉冲次数3-5；
4)电压1550-1650v，脉冲宽度7-9ms，脉冲次数2-4。
此外，在本申请中的自然杀伤细胞中、或由上述碱基编辑***编辑的自然杀伤细胞、或由上述制备方法制备的自然杀伤细胞中，所述碱基C突变至T，或将碱基A突变至G发生在前述NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因的编码核苷酸序列中；所述C突变至T将导致NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因中的突变。
进一步的，NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因的突变为功能丧失突变或非编码突变。具体的，所述功能丧失突变为在NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2基因中引入提前终止密码子或使内含子的剪接位点突变，其导致截短或非功能性的NKG2A、CD96、PVRIG、TIGIT和TGFBR2蛋白产生。
进一步的，前述提前终止密码子为TAA，TAG，TGA或者TGA。例如，所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA转化生成；所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG转化生成；所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CGA至TGA转化生成；所述提前终止密码子经由互补链上的第三个C的脱氨基从TGG至TGA转化生成；所述起始密码子突变经由互补链上的第三个C的脱氨基从ATG至ATA转化生成；所述内含子剪接位点突变由互补链上的C的脱氨基从CA转变成TA或TC转变为TT。
本发明第四方面还提供一种产品，所述产品包含上述的自然杀伤细胞、或上述的碱基编辑***。
所述产品可以为多种形式，只需包含上述自然杀伤细胞或碱基编辑***作为其中的有效成分，例如形式可以为药物组合物、试剂盒等。当产品为药物组合物时，所述药物组合物的剂型例如可以为注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等。当产品为试剂盒时，还可以包括常规的试剂盒组分、试剂等
所述产品中可以以上述自然杀伤细胞或碱基编辑***为单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。所述其他活性组分可以是其他各种可以用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病的药物。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述碱基编辑***或NK细胞的施用量通常可以为1～1000mg/kg/day、20～200mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～150mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、或500～1000mg/kg/day。
产品中也可以包含其它辅助成分，例如药物学上可接受的辅料、添加剂、载体等，例如具体可以为无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween)、螯合剂(EDTA)、粘合剂等。而且，也可含有低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；多糖或单糖；甘露糖醇或山梨糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇)、多元醇(丙二醇，PEG)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)。
本发明还提供上述自然杀伤细胞、上述碱基编辑***、上述的制备方法、上述的产品的用途，所述用途选自以下一项或多项：
1)制备用于预防和/或治疗自身免疫疾病的药物；
2)制备用于预防和/或***的药物；
3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
其中，所述自身免疫性疾病选自***性红斑狼疮、类风湿关节炎、银屑病关节炎、狼疮性肾炎、视神经脊髓炎、***性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种；。
其中，所述肿瘤选自肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；优选的，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾***状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、***癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、肺癌、***癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种。优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
其中，所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、或埃可病毒中的一种或多种。
其中，所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或多种。
本发明第六方面还提供一种预防和/或治疗病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的前述碱基编辑***、前述自然杀伤细胞或前述产品；所述病症选自以下一项或多种：自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病。
本发明中，前述碱基编辑***、前述自然杀伤细胞或前述产品还可以与其他药物或其它治疗方法联用。在一些实施方式中，未编辑的自然杀伤细胞细胞来自于有需要的受试者。在一些实施方式中，所述方法进一步包括，向有需要的受试者施用一种或多种细胞因子，例如包括但不限于是IL-2和/或IL-15等。与天然自然杀伤细胞细胞相比，经碱基编辑的前述自然杀伤细胞对细胞因子刺激更加敏感并表现出改善的扩增、抗肿瘤功能和抗病毒功能等。
当本申请中的自然杀伤细胞、碱基编辑***或产品与其他治疗剂联用时，所述活性成分与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
本文所用“基因递送”、“基因转移”、“转导”、“转入”等，其指代将外源性多核苷酸导入宿主细胞，如载体介导的基因转移(通过，例如，病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)以及协助“裸”多核苷酸递送的技术(如电穿孔，“基因枪”递送以及用于导入多核苷酸的各种其他技术)。导入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常需要导入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者纳入到宿主细胞的复制子，诸如染色体外复制子(例如，质粒)或核或线粒体染色体。许多“载体”已知能够介导基因向哺乳动物细胞的转移，如本领域已知和本文所述。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
如本文所用，同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
如本文所用，“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
如本文所用，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
如本文所用，“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
如本文所用，进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。
如本文所用，术语“核酸”和“核酸组分”可互换使用，其指具有核碱基和酸性部分的化合物，例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。在一些实施方式中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方式中，“核酸”是指包含三个或更多个核苷酸残基的寡核苷酸链。本文中所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指核苷酸的聚合物(例如，一串至少三个核苷酸)。在一些实施方式中，“核酸”包括RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然产生的或是非天然产生的分子。
如本文所用，术语“表达”指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品内mRNA或蛋白质的量予以确定。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面中，亚基可以通过其他键连接，例如，酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。已知蛋白质和肽具有C-末端和N-末端，所述C-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合羧基的末端，所述N-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合氨基的末端。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及D和L光学异构体，氨基酸类似物和肽模拟物。术语“融合”在蛋白质或多肽上下文中是指两个或更多个蛋白质或多肽(或其结构域)末端之间形成融合蛋白的连接。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1：第一周NK细胞的制备
1.1.准备工作
1)生物安全柜开启紫外灯，照射30min后，打开玻璃挡风至刻度线位置。用酒精棉擦拭操作台面。打开风机等待5分钟，气流稳定再行操作。以下细胞操作除流式细胞仪检测步骤均在生物安全柜内完成。
2)以下离心操作中，离心机温度设置均为24℃，转速1000rpm，离心时长5min，加速与刹车设置为2档，严格按照“中心对称”法则配平。需等待离心机到达最大转速方可离开，如出现异常声响或震动需立即点击“STOP”并检查原因。
3)检查水浴锅水位应位于加热管上方，设置温度为56℃或37℃。
4)准备培养基：每48mL NK无血清培养基中加入1.5mL EPA(3％)及0.5mL P/S(1％)配制为完全培养基，轻轻摇晃10次混匀后，置于37℃水浴锅预热。
5)准备IL-2：取注射用重组人白介素-2(20万IU)加入1mL NK无血清完全培养基轻轻吹打10遍后放置4℃冰箱20min以充分溶解，即200U/uL浓度。按每管100uL体积分装至1.5mL离心管，-20℃保存。按实际需求于4℃冰箱解冻后取用，避免反复冻融。
1.2细胞培养
1)取液氮冻存PBMC，于37℃预热水浴中快速解冻后转移至15mL离心管中，并加入无血清培养基使最终的体积变为10mL，1000rpm，离心5min，弃上清；培养密度：1E6，计数后取1E7个细胞添加20mLOptiVitroRNK细胞无血清培养基后转至T75培养瓶，轻轻晃匀10次培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱竖放培养；
2)与此同时，从液氮中取出EK562细胞，在37℃预热水浴中快速解冻后转移至15mL离心管中，并加入RPMI-1640培养基使最终的体积变为10mL，1000rpm，离心5min。弃上清后，补充加入2.0mLOptiVitroRNK细胞无血清培养基，计数后转移至PBMC中。十字交叉摇匀10遍后，放置于37℃，5％CO2细胞培养箱竖放培养。
3)第二天培养瓶变为平放培养，并每天补充IL-2(100U/mL IL-2)。
4)第七天统计细胞增殖倍数和检测细胞纯度，如图1所示，使用三个不同来源的Donor进行NK扩增尝试，结果表明3组Donor的平均增殖倍数都在150-200左右(图1A)，且NK纯度(图1B)可达到95％及以上，并以此作为后续NK可进行电转染标准。
实施例2：NK细胞的电转染
2.1.sgRNA的制备
经过前期筛选，本发明选取了可能突变成终止密码子或突变起始密码子或突变内含子剪接位点的靶序列(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5)。相应的sgRNA可以通过第三方公司合成方式获得。对合成的sgRNA末端进行修饰，有助于提高编辑效率，编码核苷酸序列如SEQID NO.11-SEQ ID NO.15所示，其中，每条序列在3'端和5'端各含有3个硫代基和3个甲氧基修饰。
2.2.碱基编辑融合蛋白(CBE蛋白)的制备和纯化
1)密码子优化：将所使用的胞嘧啶碱基编辑融合蛋白进行大肠杆菌密码子优化，由金斯瑞公司合成序列，并构建入pET28a表达质粒骨架中。
2)质粒转化：将质粒分别转化BL21感受态，涂板，挑单克隆进行摇菌表达，准备2L培基在37℃，220rpm的摇床摇菌，待菌液OD值在0.6-0.8之间加IPTG 2mL(2M浓度)，诱导培养24小时后收菌。
3)收菌：将菌液高速离心：4000rpm 30min，弃上清。
4)破菌：用Buffer A将离心后的菌体吹散后，加入蛋白酶抑制剂，用高压破碎机将大肠杆菌破碎。高速离心后取上清。Buffer A配方：25mM Tris pH＝8.0，500mM NaCl，10％(v/v)Glycerol，0.22μM滤器过滤。
5)过柱：将破碎后的上清用0.45μM滤膜过滤，然后加入Buffer A润洗后的钴离子亲和层析柱(Clontech，635504)对带His标签的Cas9蛋白吸附。
6)去杂质。用40ml添加有5mM咪唑的Buffer A过柱子，以去除亲和力较低的杂质。
7)洗脱。用30ml添加有500mM咪唑的BufferA过柱子，置换出目的蛋白。
8)浓缩。Western blot鉴定后将洗脱下来的目的蛋白加入到蛋白浓缩柱中，3900rpm，20min。浓缩后的蛋白进行离子交换层析(Ion exchange chromatography(IEC))，以除去与蛋白结合的核酸。然后再次浓缩，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的胞嘧啶碱基编辑蛋白(CBE蛋白)，测定浓度，分装，冻存备用。
2.3.NK细胞电转染
根据实施例1对电转程序及sgRNA优化的结果，选定Lonza电转仪CM137程序为优选电转程序，所用的高效sgRNA为实施例2中编号为Group 11(用于敲除NKG2A、CD96和PVRIG)。在此基础上进一步对sgRNA与碱基编辑融合蛋白的比例进行优化，以进一步提高碱基编辑效率。
1)收集实施例1经体外扩增的原代NK细胞，利用流式细胞鼠检测NK细胞纯度，如图2所示，当纯度达到95％及以上时，可进行后续电转染过程；。
2)设计六个实验组和一个对照组进行电转，如图3所示，分别命名为Group1-Group7，取3.5E7个细胞，室温250×g离心5min，弃上清，采用1×PBS缓冲液重悬细胞，室温250×g离心5min。
3)弃上清，采用电转仪配套电转缓冲液重悬NK细胞。
4)RNP混合，根据比例将sgRNA和CBE蛋白以1:3的摩尔质量比混匀，此方案中选用Lonza-100uL体系进行。
5)将RNP混合液加入准备好的NK细胞悬液中。
6)采用Lonza电转仪4D-Nucleofector进行电穿孔转染，电转程序设置为CM189。
7)电转后对细胞活率和密度进行检测，如图4所示，电转后七组细胞的整体活率维持在90％以上，且细胞数量基本保持在4.5E6(初始细胞量为5E6)，细胞损失小于10％，且碱基编辑组和对照组无明显差异，符合预期，可进行第二周培养。
一个可选实施方案是，采用Thermo电转仪进行电穿孔转染，用电转液将细胞和RNP重悬混匀后，加入电转杯中，从候选的4个电转程序中选择合适的电转程序进行电转。电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，培养7天后进行流式检测或者测序分析，从而获得编辑效率相关的数据。
实施例3：第二周及第三周NK细胞的制备
1)电转后细胞按照NK:EK562＝1:1的比例进行培养；
2)每天按照计数并补充相应数量的IL-2(100U/mL IL-2)。
3)细胞培养密度维持在1E6/mL-2E6/mL；
4)第十四天统计细胞增殖倍数，如图5所示，第二周细胞呈指数型增长，其中对照组Group7的增殖略优于实验组Group1-6，且Group1-6组间明显差异(图5A)，最终七组细胞的增殖倍数维持在100-150倍左右(图5B)。
5)按照上述相同的培养方式及条件进行第三周NK的制备；
6)第二十一天统计细胞增殖倍数，如图13所示，第三周细胞对照组Group7的增殖优于实验组Group1-6，且Group1-6组间无明显差异，最终七组细胞的增殖倍数维持在1000-3000倍左右，总细胞两可达到1E10左右。
7)综上结果表明电转染可能会造成一定程度的NK细胞损伤，但总体并不影响NK的扩增。
实施例4：碱基编辑效率的检测
1)取1×106NK细胞于离心管中。
2)将离心管放入离心机中，1000rpm，24℃离心5min，弃上清。
3)加入1mL含1％FBS的PBS重悬后转移至1.5mL离心管中，1000rpm，24℃
离心5min，弃上清。
4)以100uL体积含1％FBS的PBS重悬，每个反应体系中避光加入1μL BV421
anti-human CD56抗体，1μL PE anti-human TIGIT抗体，1μL Alexa488anti-humanNKG2A抗体，1μL APC anti-human TGFBR2抗体，1μL PE anti-human PVRIG抗体，1μL APC anti-human CD96抗体，震荡混匀后4℃避光孵育15min。
5)期间调整离心机温度为4℃，点击“FAST TEMP”快速降温。
6)向上述离心管中加入400uL PBS重悬，1000rpm，4℃离心5min，弃上清。
7)向上述离心管中加入500uL含1％FBS的PBS重悬。
8)流式细胞仪检测NK细胞中TIGIT、NKG2A、TGFBR2、CD96和PVRIG等蛋白的表达情况。
9)如图6-12所示，结果表明Group1-6组分别和Group7组相比，基因的编辑效率基本维持在75％及以上(图6-11)，且每个基因的编辑效率在不同组合之间具有较高的一致性(图12)，表明转染方案的可靠性。
实施例5：碱基编辑NK细胞体外杀伤研究
1)收集肿瘤细胞和NK细胞进行计数，向96孔板中加入肿瘤细胞，10000个/孔，终体积50μL。
2)按照靶点特性进行不同的杀伤组合，如下所示：
a.收集野生型NK细胞(Group7)、CBE碱基编辑的NK细胞(Group1)计数后分别按NK细胞：肿瘤细胞(如HGC27胃癌细胞)＝1:1的个数比例，向96孔板中加入50μL NK细胞，同时分为TGFβ1处理组(标记为+TGFβ1)和TGFβ1未处理组(标记为-TGFβ1)。
b.收集野生型NK细胞(Group7)、CBE碱基编辑的NK细胞(Group2和Group3)计数后分别按NK细胞：肿瘤细胞(如KG-1A血液瘤细胞)＝1:1的个数比例，向96孔板中加入50μL NK细胞，同时分为TGFβ1处理组(标记为+TGFβ1)和TGFβ1未处理组(标记为-TGFβ1)。
c.收集野生型NK细胞(Group7)、CBE碱基编辑的NK细胞(Group2和Group3)计数后分别按NK细胞：肿瘤细胞(如U251-MG脑胶质瘤细胞)＝1:1的个数比例，向96孔板中加入50μL NK细胞，同时分为TGFβ1处理组(标记为+TGFβ1)和TGFβ1未处理组(标记为-TGFβ1)。
d.收集野生型NK细胞(Group7)、CBE碱基编辑的NK细胞(Group4、Group5和Group6)计数后分别按NK细胞：肿瘤细胞(如PLC/PRE/5肝癌细胞)＝1:1的个数比例，向96孔板中加入50μL NK细胞。
e.收集野生型NK细胞(Group7)、CBE碱基编辑的NK细胞(Group4、Group5和Group6)计数后分别按NK细胞：肿瘤细胞(如Huh7肝癌细胞)＝1:1的个数比例，向96孔板中加入50μLNK细胞。
3)每组做3个重复孔，另设立3个肿瘤细胞单独培养对照孔。
4)将细胞板放在实时动态检测仪(IncuCyte S3，Sartorius)上进行拍照48小时。
5)48小时后，实时动态检测仪检测得出细胞的荧光强度。
6)按图19的公式计算NK细胞杀伤活力：
其中，NKNK+Tumor：NK细胞与肿瘤细胞共培养组的平均发光强度；
NKTumor：肿瘤细胞单独培养组的平均发光强度。
7)结果如图14-17所示：
和Group7相比，Group1在胃癌细胞中表现出明显的杀伤效果(图14)；
和Group7相比，Group2和Group3在血液瘤细胞中表现出明显的杀伤效果(图15)；
和Group7相比，Group2和Group3在脑胶质瘤细胞中表现出明显的杀伤效果(图16)；
和Group7相比，Group4、Group5和Group6在肝癌细胞中表现出明显的杀伤效果(图17)；
实施例6：碱基编辑NK细胞体内药效学评价
6.1HGC27胃癌模型
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集HGC27胃癌细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。
3)将HGC27细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为3组，每组4只，分别接种收集Group7野生型NK细胞和Group1碱基编辑NK细胞进行过继免疫治疗，空白对照组(Control)仅注射RPMI-1640培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射3×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第3天开始第一次NK细胞注射治疗。从接种肿瘤细胞后的第3天开始测量小鼠瘤块大小，每2天测量一次；
7)结果表明，和Group7相比，Group1在胃癌模型中表现出明显的抗肿瘤效果(图18A)，同时从体重分布上看，Group1未体现出与碱基编辑相关的毒性作用，具有安全性。
6.2U251-MG脑胶质瘤模型
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集U251-MG脑胶质瘤细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。
3)将U251-MG脑胶质瘤细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为3组，每组4只，分别接种收集Group7野生型NK细胞和Group2和Group3碱基编辑NK细胞进行过继免疫治疗，空白对照组(Control)仅注射RPMI-1640培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射1×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第3天开始第一次NK细胞注射治疗。从接种肿瘤细胞后的第3天开始测量小鼠瘤块大小，每2天测量一次；
7)结果表明，和Group7相比，Group2和Group3在脑胶质瘤模型中表现出明显的抗肿瘤效果(图18B)，同时从体重分布上看，Group2和Group3未体现出与碱基相关的毒性作用，具有安全性。
6.2PLC/PRE/5肝癌模型
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集PLC/PRE/5肝癌细胞，使用无血清DMEM培养液重悬细胞。
3)将PLC/PRE/5肝癌细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液200μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为3组，每组4只，分别接种收集Group7野生型NK细胞和Group4、Group5、Group6碱基编辑NK细胞进行过继免疫治疗，空白对照组(Control)仅注射DMEM培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射3×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第3天开始第一次NK细胞注射治疗。从接种肿瘤细胞后的第3天开始测量小鼠瘤块大小，每2天测量一次；
7)结果表明，和Group7相比，Group4、Group5、Group6在肝癌模型中表现出明显的抗肿瘤效果(图18C)，同时从体重分布上看，Group4、Group5、Group6未体现出与碱基编辑相关的毒性作用，具有安全性。
对比例1现有的碱基编辑的NK细胞的体外杀伤研究
参照实施例5的实验方法，本对比例对比了本申请中不同靶点组合与现有的其他基因组合的NK细胞的体外杀伤能力。将对比组合命名为Group8，基因包括，PVRIG，NKG2A以及CD96(对应sgRNA序列编号为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5)。不同靶点组合细胞以效靶比(effecter:target,E:T)比1：1上述癌细胞共同培养，以实时动态杀伤法检测NK细胞对上述肿瘤细胞的杀伤活性。
结果如图20所示：
和Group8相比，Group1在肺癌细胞H460-Ms Green中表现出明显的杀伤效果(图20A)；
和Group8相比，Group2和Group3在脑胶质瘤细胞U251-MG中表现出明显的杀伤效果(图20B)；
和Group8相比，Group4、Group5和Group6在肝癌细胞Huh7中表现出明显的杀伤效果(图20C)。
对比例2现有的碱基编辑的NK细胞的体内药效学评价
参照实施例6的实验方法，本对比例对比了本申请中不同靶点组合与其他基因组合的NK细胞的体内抗肿瘤能力。将对比组合命名为Group8，基因包括，PVRIG，NKG2A以及CD96(对应sgRNA序列编号为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5)。
2.1H460-Ms Green肺癌模型
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集H460-Ms Green肺癌细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。
3)将H460-Ms Green细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为3组，每组5只，分别接种收集Group8对照组NK细胞和Group1碱基编辑NK细胞进行过继免疫治疗，空白对照组(Control)仅注射RPMI-1640培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射3×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第7天开始第一次NK细胞注射治疗。接种肿瘤细胞后的第30天测量小鼠瘤块大小；
7)结果表明，和Group8相比，Group1在肺癌模型中表现出明显的抗肿瘤效果(图21A)，同时从体重分布上看，Group1的体重分布比Group8更好，具有更高的安全性，未体现出与碱基编辑相关的毒性作用。
2.2U251-MG脑胶质瘤模型
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集U251-MG脑胶质瘤细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。
3)将U251-MG脑胶质瘤细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为4组，每组5只，分别接种收集Group8对照组NK细胞和Group2和Group3碱基编辑NK细胞进行过继免疫治疗，空白对照组(Control)仅注射RPMI-1640培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射3×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第7天开始第一次NK细胞注射治疗。接种肿瘤细胞后的第30天测量小鼠瘤块大小；
7)结果表明，和Group8相比，Group2和Group3在脑胶质瘤模型中表现出明显的抗肿瘤效果(图21B)，同时从体重分布上看，Group2、Group3的体重分布比Group8更好，具有更高的安全性，未体现出与碱基编辑相关的毒性作用。
2.3Huh7肝癌模型
1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞。
2)消化并收集Huh7肝癌细胞，使用无血清DMEM培养液重悬细胞。
3)将Huh7肝癌细胞悬液浓度调整至3×107个/mL。
4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，置于呼吸麻醉机进行异氟烷麻醉。
5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液200μL。
6)接种3天后，小鼠按体重随机分为5组，每组5只，分别接种收集Group8对照组NK细胞和Group4、Group5、Group6碱基编辑NK细胞进行过继免疫治疗，空白对照组(Control)仅注射DMEM培养液。NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射3×107个NK细胞，每周注射1次，共治疗3次，从接种肿瘤细胞后的第3天开始第一次NK细胞注射治疗。接种肿瘤细胞后的第30天测量小鼠瘤块大小；
7)结果表明，和Group8相比，Group4、Group5、Group6在肝癌模型中表现出明显的抗肿瘤效果(图21C)，同时从体重分布上看，Group4、Group5、Group6的体重分布比Group8更好，具有更高的安全性，未体现出与碱基编辑相关的毒性作用。
综上所述可见：本发明所述的碱基编辑NK细胞在体内、体外相比现有的其他基因组合进行碱基编辑的NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性，同时从体重分布上看，本申请的碱基编辑NK细胞治疗的小鼠的体重分布更好，安全性更高，无碱基编辑相关的毒性作用。
对比例3单基因碱基编辑NK体外杀伤研究
参照实施例5的实验方法，本实施例对比了本申请中不同靶点组合与单基因靶点组合的NK细胞的体外杀伤能力。将对比组合命名为Group9-11，单碱基编辑基因分别为PVRIG，NKG2A以及CD96(对应sgRNA序列编号为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5)。不同靶点组合细胞以效靶比(effecter:target,E:T)比1：1上述癌细胞共同培养，以实时动态杀伤法检测NK细胞对上述肿瘤细胞的杀伤活性。
结果如图22所示：
和Group9相比，Group1在卵巢癌细胞SKOV3中表现出明显的杀伤效果(图22A)；
和Group10相比，Group2和Group3在血液瘤细胞H929中表现出明显的杀伤效果(图22B)；
和Group11相比，Group4、Group5和Group6在肝癌细胞PLC/PRE/5中表现出明显的杀伤效果(图22C)；
综上所述可见：本发明所述的碱基编辑NK细胞在体内、体外相比其他基因组合进行碱基编辑的NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性。
综上所述可见：本发明所述的碱基编辑NK细胞在体内、体外相比普通NK细胞、其它碱基编辑的NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性和更高的安全性，且不同组合碱基编辑的NK细胞对不同的瘤种有不同的抗肿瘤效果，因此本发明所述的碱基编辑NK细胞有望开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (13)
1.一种自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞的基因经过碱基编辑以在不引入DNA双链断裂的情况下进行基因编辑，所述基因选自TIGIT基因、TGFBR2基因、NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因中的多个。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞，其特征在于，所述基因至少包括3个。
3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞，其特征在于，至少包括以下任一项或多项特征：
所述自然杀伤细胞的TIGIT、TGFBR2和PVRIG基因同时经过碱基编辑；
所述自然杀伤细胞的TIGIT、TGFBR2和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
所述自然杀伤细胞的PVRIG、TGFBR2和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
所述自然杀伤细胞的TIGIT、CD96和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
所述自然杀伤细胞的TIGIT、PVRIG和NKG2A基因同时经过碱基编辑；
所述自然杀伤细胞的TIGIT、CD96和PVRIG基因同时经过碱基编辑。
4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞，其特征在于，所述碱基编辑将自然杀伤细胞中TIGIT基因、TGFBR2基因、NKG2A基因、CD96基因或PVRIG基因上的至少部分碱基C突变至T；
所述至少部分碱基C突变至T至少包含以下任一项或多项特征：
1)将TIGIT基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
2)将TGFBR2基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
3)将PVRIG基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
4)将NKG2A基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T；
5)将CD96基因中核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示靶点所对应碱基编辑窗口的至少部分碱基C突变至T。
5.根据权利要求4所述的自然杀伤细胞，其特征在于，所述自然杀伤细胞还包括以下任一项或多项特征：
1)TIGIT基因上如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
2)TGFBR2基因上如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
3)PVRIG基因上如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
4)NKG2A基因上如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
5)CD96基因上如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列突变为如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
和/或，所述自然杀伤细胞为源于外周血细胞的NK细胞、源于脐带血的NK细胞、胚胎干细胞诱导的NK细胞或诱导多能干细胞诱导的NK细胞中的一种或多种。
6.一种碱基编辑***，所述碱基编辑***包括：I)编辑核苷酸的碱基的融合蛋白或编码融合蛋白的核苷酸；II)引导RNA或编码引导RNA的核苷酸，用于权利要求1-5任一项所述的自然杀伤细胞的碱基编辑。
7.根据权利要求6所述的碱基编辑***，其特征在于，所述融合蛋白的结构包括：NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[胞嘧啶脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[UGI肽段]-[UGI肽段]-[核定位信号]-COOH或NH2-[核定位信号]-[第一nCas9片段]-[连接肽A]-[腺嘌呤脱氨酶片段]-[连接肽A]-[第二nCas9片段]-[GS肽段]-[核定位信号]-COOH。
8.根据权利要求6所述的碱基编辑***，其特征在于，所述碱基编辑***还包括以下任一项或多项特征：
a)碱基编辑***中引导RNA或编码引导RNA的核苷酸与融合蛋白的质量比为1：1-1：20；
b)所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16任一所示；和/或，编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；
c)所述引导RNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11-15任一所示；和/或，所述引导RNA的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5任一所示；
d)所述引导RNA或编码引导RNA的核苷酸的3'端和5'端的前2-4个核苷酸为硫代基和/或甲氧基修饰的核苷酸。
9.一种权利要求1-5任一项所述的自然杀伤细胞的制备方法，所述制备方法为将权利要求6-8任一项所述的碱基编辑***导入自然杀伤细胞进行编辑，获得所述自然杀伤细胞。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述将碱基编辑***通过电穿孔法、病毒转导、显微注射法、粒子轰击法或基因枪转化法中的一种或多种导入自然杀伤细胞进行编辑；优选的，将碱基编辑***通过电穿孔法导入自然杀伤细胞进行编辑；更优选的，所述电穿孔法中使用的电转仪***选自LONZA***、Thermo的Neon转染***或Gibco CTSXenon电转染***中的一种或多种；更优选的，所述电穿孔法中使用的电转仪***为LONZA***、型号为4D-Nucleofector的电转仪时，电转程序选自CM137、CM158或CM189；或电穿孔法中使用的电转仪***为Thermo电转染***、型号为Neon电转染仪或CTS Xenon电转染仪时，电转程序选自以下任一程序：
1)电压1650-1750v，脉冲宽度9-11ms，脉冲次数1-3；
2)电压2150-2250v，脉冲宽度2-4ms，脉冲次数3-5；
3)电压1550-1650v，脉冲宽度7-9ms，脉冲次数2-4。
11.一种产品，所述产品包含权利要求1-5任一项所述的自然杀伤细胞、或权利要求6-8任一项所述的碱基编辑***。
12.权利要求1-5任一所述的自然杀伤细胞、权利要求6-8任一项所述的碱基编辑***、权利要求9-10任一项所述的制备方法、权利要求11所述的产品的用途，所述用途选自以下任一项或多项：
1)制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物；
2)制备用于预防和/或***的药物；
3)制备用于预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；
4)制备用于预防和/或治疗细菌感染性疾病的药物。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病选自***性红斑狼疮、类风湿关节炎、银屑病关节炎、狼疮性肾炎、视神经脊髓炎、***性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种；
和/或，所述肿瘤选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾***状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、***癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、肺癌、***癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种；
和/或，所述病毒选自流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒或埃可病毒中的一种或多种；
和/或，所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或多种。
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