CN116917470A - PAN-RAS mRNA癌症疫苗 - Google Patents

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大卫·布朗
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Abstract

本发明提供了用于治疗具有ras基因家族突变的癌症的有效mRNA疫苗的组合物和方法。这些组合物包括药物组合物和药学上可接受的载体，该药物组合物包含编码一组体细胞突变体的多种肽中的至少一种肽的mRNA分子，或基本上由其组成，或还进一步包含其。本发明提供了刺激***免疫应答和进行治疗的方法，包括瘤内注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和皮下注射本文所公开的组合物。

Description

PAN-RAS mRNA癌症疫苗
相关申请的交叉引用
根据《美国法典》第35章第119条(e)款，本申请要求2020年10月14日提交的第63/091,711号美国临时申请的优先权，该临时申请的内容全文以引用方式并入本申请中。
技术领域
本公开涉及用于治疗具有肿瘤抑制基因(诸如Pan-RAS基因家族)突变的癌症患者的治疗性疫苗。
背景技术
癌症属于遗传疾病家族，其中遗传物质的变化驱使正常细胞进入失调状态，表现为肿瘤组织的恶性生长。随着社会的老龄化，癌症在死亡率和医疗保健成本方面造成了日益加重的负担。根据来自国家癌症研究所(NCI)的数据，在2020年，美国大约180万人将被诊断为患有癌症，并且预计606,520人将死于癌症。在所有不同类型的癌症中，肺癌是导致最多死亡人数的原因，预计有135,720人死于该疾病。这几乎是由于结肠直肠癌导致的53,200死亡人数的三倍，结肠直肠癌是癌症死亡的第二大常见原因。胰腺癌位列最致命癌症第三位，导致47,050人死亡。
因此，存在有效治疗癌症的需要。本公开满足了这种需求，并且还提供了相关的优点。
发明内容
在一方面，本文提供了组合物或疫苗，该组合物或疫苗包含信使核糖核酸(mRNA)分子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，该信使核糖核酸(mRNA)分子表达源自突变的人ras基因的癌症新抗原。在另一方面，它们与载体一起配制，例如，它们与药学上可接受的载体一起配制。合适的载体包括但不限于组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)、4-(二甲基氨基)-丁酸、(10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-10,13-十九碳二烯-1-基酯(DLIN-MC3-DMA或MC3)、1,2-二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)或它们的任何组合，它们在一些方面可用作佐剂以增强针对携带ras突变的癌细胞的免疫应答。还提供了使用这些药物组合物的方法，包括治疗方法、过程开发和特定递送途径。
在一方面，提供了核糖核酸(RNA)，该RNA包含编码一种或多种ras衍生肽的开放阅读框(ORF)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该一种或多种ras衍生肽中的每一种由23至29个氨基酸残基组成，例如由25个氨基酸残基组成。另外地或另选地，所编码的肽选自SEQ ID NO:1至69所示的组或它们中每一者的等效物。在一些实施方案中，该一种或多种ras衍生肽不包含SEQ ID NO:1-18、32-49或53-68中的任一者或多者，或另选地基本上由其组成，或另选地由其组成。
在另一方面，提供了分离的核糖核酸(RNA)，该RNA包含编码ras衍生肽的开放阅读框(ORF)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，所编码的ras衍生肽包含以下突变中的一个或多个(例如，任何一个、或任何两个、或任何三个、或任何四个、或所有五个)突变：与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的苯丙氨酸(F)(本文称为L19F)；与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的苏氨酸(T)(本文称为A59T)；与SEQ IDNO:70的第60位氨基酸残基对齐的天冬氨酸(D)(本文称为G60D)；与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的天冬酰胺(N)(本文称为K117N)；或与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T(本文称为A146T)。在一些实施方案中，所编码的ras衍生肽还包含以下突变中的任何一个或多个(例如，任何一个、或任何两个、或任何三个)突变：与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D(本文称为G12D)；与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D(本文称为G13D)；或与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的组氨酸(H)(本文称为Q61H)。在一些实施方案中，所编码的ras衍生肽包含以下突变：G12D、G13D、L19F、A59T、G60D、Q61H、K117N和A146T。在一些实施方案中，所编码的ras衍生肽包含SEQ ID NO:70所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，条件是该等效物保留G12D、G13D、L19F、A59T、G60D、Q61H、K117N和A146T的八个突变。在一些实施方案中，RNA包含SEQID NO:88所示的多核苷酸或SEQ ID NO:88的核苷酸(nt)1至nt 612，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，RNA被配制在药学上可接受的载体中，诸如包封在纳米颗粒中。
在进一步的方面，提供了编码本文所公开的RNA的多核苷酸(诸如DNA)，或与该多核苷酸互补的多核苷酸，或两者。在又一方面，提供了包含本文所公开的多核苷酸、或基本上由其组成，或还进一步由其组成的载体。在一些实施方案中，该载体还包含与多核苷酸可操作地连接以指导其复制或转录的调控序列，诸如启动子。在一些实施方案中，该载体是非病毒载体，诸如质粒、脂质体或胶束。在进一步的实施方案中，该载体是pUC57、或pSFV1、或pcDNA3、或pTK126。在再进一步的实施方案中，该载体包含SEQ ID NO:91所示的多核苷酸或其转录成相同RNA的等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该载体是病毒载体，诸如腺病毒载体、或腺相关病毒载体、或逆转录病毒载体、或慢病毒载体、或植物病毒载体。
在一方面，提供了包含以下项中的一者或多者的细胞：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸或本文所公开的载体。在一方面，该细胞是原核细胞。在另一方面，该细胞是真核细胞。
在进一步的方面，提供了包含载体(例如，药学上可接受的载体)和以下项中的一者或多者的组合物：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体或本文所公开的细胞，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在又一方面，提供了产生本公开的RNA的方法。在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达RNA(诸如将DNA转录成RNA)的条件下培养本文所公开的细胞，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一方面，该细胞包含编码本公开的RNA的DNA。在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达RNA(诸如将DNA转录成RNA)的条件下，使本文所公开的多核苷酸或本文所公开的载体与RNA聚合酶、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、鸟苷-5'-三磷酸(GTP)和三磷酸尿苷(UTP)或经化学修饰的UTP接触，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，该方法还包括分离RNA。另外地，提供了通过本文所公开的方法产生的RNA。
另外地，提供了组合物(诸如免疫原性组合物)，该组合物包含配制在载体(例如，药学上可接受的载体，诸如纳米颗粒)中的有效量的本文所公开的RNA，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，纳米颗粒是聚合物纳米颗粒载体，例如包含组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)(诸如H3K(+H)4b或H3k(+H)4b或两者)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成的那些聚合物纳米颗粒载体。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒，例如，8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物。
在一方面，提供了产生本文所公开的组合物(诸如免疫原性组合物)的方法。该方法包括使本文所公开的RNA与HKP或脂质或两者接触，从而使RNA和HKP或脂质或HKP和脂质两者自组装成纳米颗粒，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在另一方面，提供了治疗患有癌症或疑似患有癌症、或处于癌症风险或另选地具有癌症高风险的受试者的方法。该方法包括向受试者施用例如药学上有效量的以下项中的任一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞或本文所公开的组合物(诸如免疫原性组合物)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，癌症包含(诸如表达)由本文所公开的RNA表达的一个或多个突变(本文也称为新抗原)，诸如ras突变。在一些实施方案中，癌症包含编码本文所公开的新抗原的突变的ras基因。在进一步的实施方案中，该方法还包括向受试者施用另外的抗癌疗法，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在又一方面，提供了用于本文所公开的方法的试剂盒。该试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞、本文所公开的组合物、本文所公开的药学上可接受的载体、或抗癌疗法，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
附图说明
图1示出了ras的主要蛋白质结构域。
图2列出了病毒载体疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗的优点和缺点。
图3示出了通过计算机预测和体外测定筛选新抗原。
图4示出了mRNA疫苗的小基因结构。本文提供了由小基因QNAADSYSWVPEQAESRAMENQYSP编码的示例性氨基酸序列，如SEQ ID NO:71。
图5提供了优化的mRNA疫苗表达结构的示意图。这种结构可包含在和/或转录在线性体外转录(IVT)表达***或质粒DNA递送载体中。
图6示出了可用于mRNA生产的质粒载体。常用的质粒是pSFV1、pcDNA3和pTK126。
图7示出了多脂质纳米颗粒(PLNP)和脂质纳米颗粒(LNP)结构。
图8显示在mRNA递送中，H3K(+H)4b是比H3K4b明显更好的载体。为了形成多聚复合物，将mRNA(1g)与3种不同比例的HK(4g，8g，12g)聚合物混合30分钟。然后在测量荧光素酶活性之前，将mRNA加入细胞中保持24小时。H3K(+H)4b对比H3K4b，分别是P<0.0001和P<0.001。
图9显示H3K(+H)4b比H3K4b更紧密地结合到mRNA。1％琼脂糖凝胶中H3K(+H)4b和H3K4b在mRNA和多肽的不同比例(wt:wt；肽:mRNA)下的延迟电泳测定。泳道1和泳道7：单独mRNA(1μg)。其他泳道：各重量比的mRNA和多肽。
图10显示，与用于mRNA转染的具有其他4支链HK肽的H3K(+H)4b相比，在第二基序中具有额外组氨酸的HK载体在mRNA转染中具有改善的性能。还将H3K(+H)4b与第二基序中没有额外组氨酸的HK肽比较。H3k(+H)4b是mRNA的最有效的肽载体(H3k(+H)4b相对于H3K(+4b)；*，P＜0.05)。
图11显示，用DOTAP和HK肽的组合对MDA-MB-231细胞的转染。DOTAP和HK肽的组合显著增加了细胞中mRNA的表达率。
图12提供了用DOTAP和几种HK肽转染mRNA的比较。DOTAP组合H3k(+H)4b在mRNA转染中最有效。
图13提供了精胺-脂质缀合物(SLiC)种类的示例性结构。
图14提供了使用在www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/可访问的ClustalOmega进行的SEQ ID NO:70、101、103和104所示的序列之间的比对。
图15显示RAS的体外表达。ELISA用于检测免疫小鼠中产生的Ras抗体(Ab)。带His标签的Ras蛋白用作ELISA抗原。使用RAS癌症疫苗候选物的各种mRNA制剂来免疫小鼠。
图16示出了RAS中的8个突变热点。
图17提供了使用蛋白质印迹证实的RAS表达。测量β-肌动蛋白的表达并用作上样对照。
图18显示用HKP(H)配制的纳米颗粒转染的细胞中的体外RAS表达。测量β-肌动蛋白的表达并用作上样对照。
图19显示用LNP配制的纳米颗粒转染的细胞中的体外RAS表达。测量β-肌动蛋白的表达并用作上样对照。
图20示出了评价本文所公开的组合物的体内动物模型。简言之，小鼠在第0天进行免疫，并且在第28天给予加强免疫。在第28天和第42天收集血清。然后评估血清中的抗RAS抗体。处死小鼠后，取出脾脏并用qRT-PCR评价。
图21绘制了检测血清中的抗RAS抗体的ELISA数据。
图22A至图22D显示了评价用Ras疫苗免疫的小鼠中IgG同种型(图22A，IgG2a；图22B，IgG2b；图22C，IgG1；和图22D，IgG3)的结果。用Ras疫苗免疫的小鼠中主要IgG同种型是IgG2b。
图23A至图23B提供了使用qRT-PCR评估的Th1(图23A)和Th2(图23B)相关基因的表达结果。
图24A至图24C提供了用RAS疫苗免疫的小鼠的NGS结果。从6只小鼠的脾脏分离出RNA，并送去进行NGS分析。使用来自小鼠#1、#2、#3和#5的RNA进行NGS。这种小鼠编号与图21至图23中的编号相关联。基于ELISA结果，#5小鼠用作相对阴性对照。因此，图24A显示了与小鼠#5的NGS结果相比，小鼠#1的NGS结果；图24B显示了与小鼠#5的NGS结果相比，小鼠#2的NGS结果；并且图24C显示了与小鼠#5的NGS结果相比，小鼠#3的NGS结果。
图25A至图25C提供了用RAS疫苗免疫的小鼠的NGS显示的前20个KEGG途径。在图标题中，图21至图23所鉴定的小鼠#1记为“LNP-1”，图21至图23所鉴定的小鼠#2记为“LNP_2”，图21至图23所鉴定的小鼠#3记为“HKPH”，图21至图23所鉴定的小鼠#5记为“HKP”。因此，图25A列出了使用来自小鼠#1的样品鉴定的前20个KEGG途径；图25B列出了使用来自小鼠#2的样品鉴定的前20个KEGG途径；并且图25C列出了使用来自小鼠#3的样品鉴定的前20个KEGG途径。
图26A至图26B提供了在用RAS疫苗免疫的小鼠中NGS所揭示的上调基因。在图例中，图21至图23所鉴定的小鼠#1记为“LNP-1”，图21至图23所鉴定的小鼠#2记为“LNP_2”，图21至图23所鉴定的小鼠#3记为“HKPH”，图21至图23所鉴定的小鼠#5记为“HKP”。图26A显示Th1和Th2分化的途径。在图26A中六个基因用方框标记，并且使用FKPM计数将它们的表达水平进一步绘制在图26B中。FPKM(每百万个测序的碱基对中每千碱基转录物序列的预计片段数目的缩写)是最常见的估计基因表达水平的方法。
图27A至图27B提供了在用RAS疫苗免疫的小鼠中NGS所揭示的途径分析。在图例中，图21至图23所鉴定的小鼠#1记为“LNP-1”，图21至图23所鉴定的小鼠#2记为“LNP_2”，图21至图23所鉴定的小鼠#3记为“HKPH”，图21至图23所鉴定的小鼠#5记为“HKP”。图27A显示了参与图27B所示的抗原加工和呈递途径的基因的FKPM计数。
图28绘制了使用NGS评估的Th1和Th2相关基因的FKPM计数所示的基因表达水平。在图例中，图21至图23所鉴定的小鼠#1记为“LNP-1”，图21至图23所鉴定的小鼠#2记为“LNP_2”，图21至图23所鉴定的小鼠#3记为“HKPH”，图21至图23所鉴定的小鼠#5记为“HKP”。
图29绘制了使用NGS评估的CTLA-4和LFA-1的FKPM计数所示的基因表达水平。CTLA-4和LFA-1是活化的CD8+细胞的表型标记。在图例中，图21至图23所鉴定的小鼠#1记为“LNP-1”，图21至图23所鉴定的小鼠#2记为“LNP_2”，图21至图23所鉴定的小鼠#3记为“HKPH”，图21至图23所鉴定的小鼠#5记为“HKP”。
图30A至图30B显示用LNP-RAS疫苗免疫减少了体内肿瘤生长。图30A绘制了以mm3为单位的肿瘤大小，而图30B绘制了以g为单位的肿瘤重量。
图31示出了评价本文所公开的组合物的另一个体内动物模型。简言之，小鼠在第0天进行免疫，并且在第14天给予加强免疫。在第21天收集血液。并在第28天接种肿瘤细胞。
图32显示了检测小鼠血清中的抗RAS抗体的ELISA结果。
具体实施方式
定义
如将理解的，本文所用的章节或子章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制和/或分离所描述的主题。
应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以有所不同。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制，原因是本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但优选的方法、设备和材料是目前描述的。本文引用的所有技术和专利出版物均以引用方式全文并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本公开无权因在先公开而早于此类公开物。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook和Russell编著(2001年)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第3版；Ausubel等人编著(2007年)“Current Protocols in Molecular Biology”系列；“Methodsin Enzymology”系列，(Academic Press,Inc.，纽约)；MacPherson等人(1991年)“PCR 1：APractical Approach”(Oxford University Press的IRL Press)；MacPherson等人(1995年)“PCR 2:A Practical Approach”；Harlow和Lane编著(1999年)“Antibodies,ALaboratory Manual”；Freshney(2005年)“Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechique”，第5版；Gait编著(1984年)“Oligonucleotide Synthesis”；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编著(1984年)“Nucleic Acid Hybridization”；Anderson(1999年)“Nucleic Acid Hybridization”；Hames和Higgins编著(1984年)“Transcription andTranslation”；“Immobilized Cells and Enzymes”(IRL Press(1986年))；Perbal(1984年)“A Practical Guide to Molecular Cloning”；Miller和Calos编著(1987年)“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides编著(2003年)“Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells”；Mayer和Walker编著(1987年)“Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology”(AcademicPress，伦敦)；Herzenberg等人编著(1996年)“Weir's Handbook of ExperimentalImmunology”；“Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual”，第3版(ColdSpring Harbor Laboratory Press(2002))；Sohail编著(2004年)“Gene Silencing byRNA Interference:Technology and Application”(CRC Press)；和Plotkin等人，Plotkin；“Human Vaccines”，第7版(Elsevier)。
如本说明书和权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括多个细胞，该多个细胞包括它们的混合物。
如本文所用，术语“包含”意在指化合物、组合物和方法包括列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义化合物、组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对组合具有任何基本意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除例如来自分离和纯化方法的痕量污染物以及药学上可接受的载体、防腐剂等。“由……组成”应意指排除超过痕量要素的其他成分。由这些过渡术语中的每一者定义的实施方案都在本技术的范围内。
所有的数字符号(例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围)都是近似值，以1％、5％或10％的增量正向(+)或负向(-)变化。应当理解，尽管不总是明确地陈述，但所有数字符号前面均有术语“约”。还应理解，尽管不总是明确地陈述，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物是本领域已知的。
本文所用的术语“约”在涉及可测量值诸如量或浓度等时，意指涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
如本文所用，本文所用的比较性术语，诸如高、低、增加、减少、降低或其任何语法上的变化，可指相对于参考物的某些变化。在一些实施方案中，这种变化可指比参考物高约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约1倍、或约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约6倍、或约7倍、或约8倍、或约9倍、或约10倍、或约20倍、或约30倍、或约40倍、或约50倍、或约60倍、或约70倍、或约80倍、或约90倍、或约100倍或更多倍。在一些实施方案中，这样的变化可指参考物的约1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约0％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及它们的子范围的组合。此外，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的情况可能发生或可能不发生，因此该描述包括该情况发生的情形和该情况不发生的情形。
如本文所用，“和/或”是指并涵盖相关的所列项目中一个或多个项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代形式(“或”)理解时缺少组合。
“大体上”或“基本上”意指几乎全部或完全，例如某一给定量的95％或更大。在一些实施方案中，“大体上”或“基本上”意指95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。
当用于描述对本文所公开的任何组分、范围、剂型等的选择时，这些术语或“可接受的”、“有效的”或“足够的”意指所述组分、范围、剂型等适用于所公开的目的。
在一些实施方案中，组件名称中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”或类似术语用于区分和识别在名称上有一定一致性的多于一个组件。例如，“第一RNA”和“第二RNA”用于区分两种RNA。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基(也被称为残基)可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可以通过其他键例如酯键、醚键等连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸(包括甘氨酸，D和L光学异构体)、氨基酸类似物和肽模拟物。
在一些实施方案中，蛋白质的片段可以是免疫原性片段。如本文所用，术语“免疫原性片段”指这样的多肽片段，其至少部分地保留了其所来源的蛋白质的免疫原性。在一些实施方案中，免疫原性片段为至少约3个氨基酸(aa)长，或至少约4个aa长，或至少约5个aa长，或至少约6个aa长，或至少约7个aa长，或至少约8个aa长，或至少约9个aa长，或至少约10个aa长，或至少约15个aa长，或至少约20个aa长，或至少约25个aa长，或至少约30个aa长，或至少约35个aa长，或至少约40个aa长，或至少约50个aa长，或至少约60个aa长，或至少约70个aa长，或至少约80个aa长，或至少约90个aa长，或至少约100个aa长，或至少约120个aa长，或至少约150个aa长，或至少约200个aa长，或更长。
如本文所用，目的序列中“对应于”或“对齐”参考序列中的鉴定位置的氨基酸(aa)或核苷酸(nt)残基位置是指在目的序列与参考序列之间的序列比对中，残基位置与鉴定位置对齐。各种程序可用于执行此类序列比对，诸如Clustal Omega和BLAST。在一方面，等效多核苷酸、蛋白质和相应序列可使用BLAST(可访问blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，最后一次访问日期为2021年8月1日)来确定。
如本文所用，氨基酸突变在本文中是指被整数分隔的两个字母，诸如L19F。第一个字母提供了待突变的原始氨基酸残基的单字母代码；而最后一个字母提供突变，诸如指示缺失的Δ，或突变后的氨基酸残基的单字母代码。在一些实施方案中，整数是未发生突变的氨基酸序列中待突变氨基酸残基的编号，任选地从N末端到C末端计数。在一些实施方案中，整数是突变后的氨基酸序列中突变氨基酸残基的编号，任选地从N末端到C末端计数。
除非另有说明，否则无需明确叙述即可推断，当本公开涉及多肽、蛋白质、多核苷酸时，其等效物或生物学等效物也在本公开的范围内。如本文所用，术语“其生物学等效物”在提及参考蛋白质、多肽或核酸时，意在与“其等效物”同义，指具有最小同源性同时仍保持所需结构或功能的蛋白质、多肽或核酸。除非本文特别列举，否则预期本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效物。例如，等效物与参考蛋白、多肽或核酸具有至少约70％的同源性或同一性、或至少80％的同源性或同一性、或至少约85％的同源性或同一性、或另选地至少约90％的同源性或同一性、或另选地至少约95％的同源性或同一性、或另选地至少约96％的同源性或同一性、或另选地至少约97％的同源性或同一性、或另选地至少约98％的同源性或同一性、或另选地至少约99％的同源性或同一性(在一方面，如使用Clustal Omega比对程序所测定的)，并且表现出与参考蛋白、多肽或核酸基本上等效的生物活性。另选地，当提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。
参考多肽的等效物包含与参考多肽具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少约96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％的氨基酸同一性的多肽(在一方面，如使用Clustal Omega比对程序所测定的)，或由在高严格度条件下与编码参考多肽的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，基本上由其组成，或另选地由其组成，任选地其中高严格度条件包括：约55℃至约68℃的温育温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。
在一些实施方案中，将第一序列(核酸序列或氨基酸)与第二序列进行比较，并且可以计算两条序列之间的同一性百分比。在进一步的实施方案中，第一序列在本文中可以被称为等效物，并且第二序列在本文中可以被称为参考序列。在再进一步的实施方案中，基于第一序列的全长序列计算同一性百分比。在其他实施方案中，基于第二序列的全长序列计算同一性百分比。
在一些实施方案中，参考多肽的等效物包含一个或多个氨基酸残基被保守取代置换的参考多肽，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。取代可以是“保守的”，即在同一氨基酸家族内的取代。天然存在的氨基酸可以分成以下四个家族，并且保守取代将在这些家族内进行。
(1)具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
(2)具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；
(3)具有不带电荷的极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；
(4)具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的任何长度的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并可执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在多核苷酸组装之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另外指明或要求，否则本公开的任何实施方案，即多核苷酸，涵盖双链形式以及已知或预测构成该双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多核苷酸为RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。这种字母表示可以输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，诸如功能基因组学和同源性搜索。
本文所用的术语“RNA”是指其在本领域普遍接受的含义。通常，术语“RNA”是指包含至少一个呋喃核糖核苷部分的多核苷酸。该术语可包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(诸如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括(例如在RNA的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸物质。核酸分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸(诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸)或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。在一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)。
“信使RNA”(mRNA)是指编码(至少一种)多肽(天然存在的、非天然存在的或经修饰的氨基酸聚合物)并且可以被翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码的多肽的任何多核苷酸。在一些实施方案中，本文所公开的mRNA包含至少一个编码区、5'非翻译区(UTR)、3'UTR、5'帽子和poly-A尾，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
疫苗接种是预防和控制疾病的最成功的医学方法。疫苗的成功开发和使用已经挽救了数千人的生命并节省了大量的资金。RNA疫苗的关键优势是可在实验室中使用容易获得的材料从DNA模板产生RNA，比可能需要使用鸡蛋或其他哺乳动物细胞的常规疫苗生产更便宜且更快。此外，mRNA疫苗具有简化疫苗发现和开发的潜力，并促进对出现的感染性疾病的快速应答(参见例如，Maruggi等人，Mol Ther.，2019年，第27卷第4期：第757-772页)。
临床前和临床试验已表明mRNA疫苗在动物模型和人中提供安全且持久的免疫应答。针对感染性疾病的mRNA疫苗可以开发为预防性或治疗性治疗。表达感染性病原体的抗原的mRNA疫苗已被证明诱导强效的T细胞和体液免疫应答。参见例如，Pardi等人，Nat RevDrug Discov.，2018年，第17卷：第261-279页。与全微生物、减毒活疫苗和亚单位疫苗的生产相比，生成mRNA疫苗的生产方法是无细胞的、简单且快速的。这种快速且简单的生产方法使得mRNA成为有前景的生物产物，其有可能填补新出现的感染性疾病和对有效疫苗的迫切需求之间的空白。
本文所用的关于核酸诸如DNA或RNA的术语“分离的”是指分别从大分子天然来源中存在的其他DNA或RNA分离的分子。术语“分离的核酸”意指包括不是作为片段天然存在的并且在天然状态下不存在的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白质分离的多肽、蛋白质和/或宿主细胞，并且意在包括纯化的和重组的多肽。在其他实施方案中，术语“分离的”意指从与细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽或蛋白质通常天然地关联的成分、细胞和其他物质分离。例如，分离的细胞是从具有不相似表型或基因型的组织或细胞分离的细胞。如本领域技术人员所显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽或蛋白质不需要“分离”以将其与其天然存在的对应物区分。
在一些实施方案中，术语“工程化的”或“重组的”是指具有通常不存在于天然存在的蛋白质、多肽、多核苷酸、菌株、野生型菌株或所提及物种的亲本宿主菌株中的至少一种修饰。在一些实施方案中，术语“工程化的”或“重组的”是指通过人类干预合成的。如本文所用，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码多肽的DNA***到合适的表达载体中，该表达载体进而用于转化宿主细胞以产生异源蛋白。
如本文所用，“互补”序列是指这样的两条核苷酸序列，它们在彼此反向平行比对时含有多个相互配对的单独核苷酸碱基。核苷酸碱基的配对形成氢键，从而稳定由互补序列形成的双链结构。两条序列中的每一个核苷酸碱基都必须相互配对，才能被认为是“互补”的序列。例如，如果两条序列中至少30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的核苷酸碱基相互配对，则序列可被认为是互补的。在一些实施方案中，术语互补是指两条序列中100％的核苷酸碱基相互配对。此外，当两条序列的总长度彼此显著不同时，序列仍可被认为是“互补的”。例如，当15个核苷酸的引物与含有数百个核苷酸的较长多核苷酸的特定区域反向平行比对时，如果该引物的多个单独核苷酸碱基与该较长多核苷酸中的核苷酸碱基配对，则该引物可被认为与该较长多核苷酸“互补”。配对的核苷酸碱基是本领域已知的，诸如在DNA中，嘌呤腺嘌呤(A)与嘧啶胸腺嘧啶(T)配对，嘧啶胞嘧啶(C)总是与嘌呤鸟嘌呤(G)配对；而在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。此外，在两个互补序列中彼此反向平行比对但并非为一对的核苷酸碱基在本文中被称为错配。
“基因”是指含有至少一个开放阅读框(ORF)的多核苷酸，该多核苷酸能够在被转录和翻译后编码特定的多肽或蛋白质。
术语“表达”是指产生基因产物，诸如mRNA、肽、多肽或蛋白质。如本文所用，“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程或所转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。
“基因产物”，或另选地，“基因表达产物”是指当基因被转录和翻译时产生的氨基酸(例如肽或多肽)。在一些实施方案中，基因产物可以指当基因被转录时产生的mRNA或其他RNA，诸如干扰RNA。
当应用于多核苷酸时，术语“编码”是指，如果多核苷酸在其天然状态下或在通过本领域技术人员熟知的方法操作时可被转录以产生多肽或其片段的mRNA，并且任选地被翻译以产生多肽或其片段，则称该多核苷酸“编码”多肽。反义链是这种核酸的互补链，并且可由其推导编码序列。此外，如本文所用，氨基酸序列编码序列是指编码该氨基酸序列的核苷酸序列。
术语“化学修饰”和“经化学修饰的”是指针对腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷在其位置、模式、百分比或群体中的至少一个方面进行修饰。在一些实施方案中，该术语是指在天然存在的5'-末端mRNA帽子部分中的核糖核苷酸修饰。在进一步的实施方案中，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，经化学修饰的核苷酸的掺入程度已被优化，以改善对疫苗制剂的免疫应答。在其他实施方案中，该术语不包括在天然存在的5'-末端mRNA帽子部分中的核糖核苷酸修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括在多核苷酸合成期间或合成后引入以实现所需功能或性质的非天然修饰核苷酸。修饰可存在于核苷酸间键、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可用化学合成或用聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入。多核苷酸的区域中的任一区域可被化学修饰。
在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的残基被本文所公开的一种或多种修饰化学修饰。在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的尿苷残基被本文所公开的一种或多种修饰化学修饰。
在一些实施方案中，本文所公开的RNA是“优化的”。在一些实施方案中，优化可用于使目标和宿主生物体中的密码子频率匹配以确保正确的折叠；偏重GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base run)最小化；自定义转录和翻译控制区；***或去除蛋白质运输序列(trafficking sequence)；在编码的蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白结构域；***或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以使蛋白质的各个结构域正确折叠；或减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。
“3'非翻译区”(3'UTR)是指mRNA的位于终止密码子(即，mRNA转录物中发出翻译终止信号的密码子)的正下游(即，3')的不编码多肽的区域。在一些实施方案中，本文所用的3’UTR包含以下项中的一种或多种，或基本上由其组成，或还进一步由其组成：
GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGC(SEQ ID NO:92)；
GGCGCUCGAGCAGGUUCAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAACGCCACC(SEQ ID NO:93)；或
GGGCGCUCGAGCAGGUUCAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAAC(SEQ ID NO:94)。
“5'非翻译区”(5'UTR)是指RNA的位于起始密码子(即，mRNA转录物中由核糖体翻译的第一密码子)的正上游(即，5')的不编码多肽的区域。在一些实施方案中，本文所用的5’UTR包含以下项中的一种或两种，或基本上由其组成，或还进一步由其组成：
ACAUUUGCUUCUGACACAACUGUGUUCACUAGCAACCUCAAACAGACACC(SEQ ID NO:95)；或
GGCGCACGAGCAGGGAGAGAAGGAGAUCAAAAACCCCCAAGGAUCAAACGCCACC(SEQ ID NO:96)。
在一些实施方案中，RNA还包含polyA尾。“polyA尾”是mRNA的位于3'UTR的下游，例如正下游(即3')，含有多个连续的单磷酸腺苷的区域。polyA尾可含有10个至300个单磷酸腺苷。另外地或另选地，在相关生物环境中(例如，在细胞中，在体内)，polyA尾具有保护mRNA免于酶促降解(例如在细胞质内)的功能，并协助转录终止、mRNA从细胞核运出和翻译。在一些实施方案中，本文所用的polyA尾包含以下项中的一种或多种，或基本上由其组成，或还进一步由其组成：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:97)；或
CGGCAAUAAAAAGACAGAAUAAAACGCACGGUGUUGGGUCGUUUGUUC(SEQ ID NO:98)。
体外转录(IVT)方法涉及几乎任何序列的RNA分子的模板导向合成。可以使用IVT方法合成的RNA分子的大小从短寡核苷酸到几千个碱基的长核酸聚合物不等。IVT方法允许合成大量的RNA转录物(例如，从微克到毫克量)(Beckert等人，Methods Mol Biol.，第703卷：第29-41页(2011年)；Rio等人，“RNA:ALaboratory Manual.”，Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2011年，第205-220页；和Cooper,Geoffery M.，“The Cell:A Molecular Approach.”，第4版，Washington D.C.:ASM Press，2007年，第262-299页)。通常，IVT利用具有目的序列上游的启动子序列的DNA模板。启动子序列最常见的是噬菌体来源(例如T7、T3或SP6启动子序列)，但也可以接受许多其他启动子序列，包括从头设计的启动子序列。DNA模板的转录通常最好通过使用对应于特异性噬菌体启动子序列的RNA聚合酶来实现。示例性RNA聚合酶包括但不限于T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶等。IVT通常起始于dsDNA，但可以在单链上进行。
应当理解，本文所公开的RNA可使用任何合适的合成方法制备。例如，在一些实施方案中，使用IVT从作为模板的单底链DNA和作为启动子的互补寡核苷酸来制备RNA。单底链DNA可作为RNA体外转录的DNA模板，并且可从例如质粒、PCR产物或化学合成获得。在一些实施方案中，从环形模板线性化单底链DNA。单底链DNA模板通常包括启动子序列，例如噬菌体启动子序列，以促进IVT。使用单底链DNA和顶链启动子互补寡核苷酸制备RNA的方法是本领域已知的。示例性方法包括但不限于，使DNA底链模板与顶链启动子互补寡核苷酸(例如，T7启动子互补寡核苷酸、T3启动子互补寡核苷酸或SP6启动子互补寡核苷酸)退火，然后使用对应于启动子序列的RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)进行IVT。
IVT方法也可使用双链DNA模板进行。例如，在一些实施方案中，通过使用本领域可用的链延伸技术延伸互补寡核苷酸以产生互补DNA链，来制备双链DNA模板。在一些实施方案中，使含有启动子序列和编码一个或多个目的表位的序列的单底链DNA模板与顶链启动子互补寡核苷酸退火，并进行类似PCR的过程以延伸顶链，从而产生双链DNA模板。另选地或另外地，使含有与底链启动子序列互补且与编码一个或多个目的表位的序列互补的序列的顶链DNA与底链启动子寡核苷酸退火，并进行类似PCR的过程以延伸底链，从而产生双链DNA模板。在一些实施方案中，类似PCR的循环的数目为1至20个循环，例如3至10个循环。在一些实施方案中，双链DNA模板完全或部分通过化学合成方法来合成。双链DNA模板可如本文所述进行体外转录。
“在转录控制下”(在本文中也用作“指导……的表达”)或其任何语法变体是本领域熟知的术语，并且表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录和任选的翻译取决于其与有助于转录起始或促进转录的元件的可操作性的连接。
“可操作地连接”是指多核苷酸以允许它们在细胞中起作用的方式排列。
本文所用的术语“调控序列”、“表达控制元件”或“启动子”意指可操作地连接到待转录或复制的靶多核苷酸并促进该靶多核苷酸的表达或复制的多核苷酸。
启动子是表达控制元件或调控序列的示例。启动子可以位于基因或其他多核苷酸的5'或上游，其提供调控基因转录的控制点。在一些实施方案中，本文所用的启动子对应于RNA聚合酶。在进一步的实施方案中，本文使用的启动子包含T7启动子、或SP6启动子或T3启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。WO2001009377A1中提供了合适的启动子的非限制性示例。
“RNA聚合酶”是指产生多核糖核苷酸序列的酶，其与预先存在的模板多核苷酸(DNA或RNA)互补。在一些实施方案中，RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶，任选地是T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。合适的聚合酶的非限制性示例在US10526629B2中进一步详述。
在一些实施方案中，术语“载体”意指保留感染和转导非***细胞和/或缓慢***细胞并任选地整合到靶细胞的基因组中的能力的重组载体。载体的非限制性示例包括质粒、纳米颗粒、脂质体、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方案中，质粒载体可由可商购获得的载体制备。在其他实施方案中，病毒载体可根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等产生。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是质粒。在一个实施方案中，载体是纳米颗粒，任选地是聚合物纳米颗粒或脂质纳米颗粒。
既含有启动子又含有多核苷酸可以可操作地连接到其中的克隆位点的载体是本领域熟知的。此类载体能够在体外或体内转录RNA，并且可以从诸如Stratagene(美国加利福尼亚州拉荷亚)和Promega Biotech(威斯康星州麦迪逊)的来源商购获得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要去除、添加或改变克隆的5'和/或3'非翻译部分，以消除额外的、潜在的不适当的翻译起始密码子或可能在转录或翻译水平干扰或降低表达的其他序列。另选地，可将共有核糖体结合位点直接***起始密码子的5'以增强表达。
“质粒”是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在许多情况下，它是环状的和双链的。质粒提供了在微生物群体内水平基因转移的机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择性优势。质粒可以运载在竞争性环境生态位中提供对天然存在的抗生素的抗性的基因，或另选地，产生的蛋白质可以在类似的环境下作为毒素发挥作用。许多质粒可商购获得用于此类用途。将待复制的基因***到质粒的拷贝中，该质粒含有使细胞对特定抗生素具有抗性的基因和多克隆位点(MCS或多接头)，该多克隆位点是含有若干个常用限制性位点的短区域，使得DNA片段便于在该位置***。质粒的另一个主要用途是制备大量的蛋白质。在这种情况下，研究人员培养含有运载目的基因的质粒的细菌。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素抗性一样，它也可以被诱导以从***的基因产生大量蛋白质。这是一种廉价且简单的大规模生产基因或其编码的蛋白质的方法。
如本文所用，术语“胶束”是指由亲水性外壳(或冠)和疏水性和/或离子性内部组成的聚合物组装体。此外，术语“胶束”可以指由具有净正电荷的多嵌段共聚物和合适的带负电荷的多核苷酸组成的任何聚离子复合物组装体。
“病毒载体”定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含将在体内、离体或体外递送至宿主细胞中的多核苷酸。如本领域技术人员所知，存在6类病毒。DNA病毒构成I类和II类。RNA病毒和逆转录病毒构成其余的类别。III类病毒具有双链RNA基因组。IV类病毒具有正单链RNA基因组，基因组本身用作mRNA。V类病毒具有用作mRNA合成的模板的负单链RNA基因组。VI类病毒具有正单链RNA基因组，但不仅在复制中而且在mRNA合成中都具有DNA中间体。逆转录病毒以RNA的形式运载其遗传信息；然而，一旦病毒感染细胞，RNA就被逆转录成DNA形式，该DNA形式被整合到感染细胞的基因组DNA中。所整合的DNA形式被称为原病毒。病毒载体的示例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等。甲病毒载体，诸如基于塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)的载体和基于辛德毕斯(Sindbis virus)病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见Schlesinger和Dubensky(1999年)Curr.Opin.Biotechnol.，第5卷：第434-439页和Ying等人(1999年)Nat.Med.，第5卷(第7期)：第823-827页。如本文所用，感染复数(MOI)是指在感染期间每个细胞添加的病毒颗粒的数量。
术语“腺病毒”与术语“腺病毒载体”同义，并且是指腺病毒属的病毒。术语“腺病毒属”总体上是指哺乳动物腺病毒属的动物腺病毒，该哺乳动物腺病毒属包括但不限于人、牛、羊、马、犬、猪、鼠和猿腺病毒亚属。特别地，人腺病毒包括A-F亚属及其各血清型，并且A-F亚属包括但不限于人腺病毒1型、2型、3型、4型、4a型、5型、6型、7型、8型、9型、10型、11型(Ad11A和Ad11P)、12型、13型、14型、15型、16型、17型、18型、19型、19a型、20型、21型、22型、23型、24型、25型、26型、27型、28型、29型、30型、31型、32型、33型、34型、34a型、35型、35p型、36型、37型、38型、39型、40型、41型、42型、43型、44型、45型、46型、47型、48型和91型。术语“牛腺病毒”包括但不限于牛腺病毒1型、2型、3型、4型、7型和10型。术语“犬腺病毒”包括但不限于犬1型(毒株CLL、Glaxo、R1261、Utrect、Toronto 26-61)和2型。术语“马腺病毒”包括但不限于马1型和2型。术语“猪腺病毒”包括但不限于猪3型和4型。在本发明的一个实施方案中，腺病毒来源于人腺病毒血清型2或5。就本发明的目的而言，腺病毒载体可在靶细胞中具有复制能力或复制缺陷。在一些实施方案中，腺病毒载体是条件性或选择性复制腺病毒，其中病毒复制所需的基因与细胞和/或环境特异性启动子可操作地连接。选择性复制或条件性复制病毒载体的示例是本领域已知的(参见例如，美国专利号7,691,370)。
逆转录病毒诸如γ逆转录病毒和/或慢病毒包含(a)含有脂质和糖蛋白的包膜，(b)载体基因组，其为递送至靶细胞的RNA(通常为在5'末端包含帽子并且在3'末端包含两侧为LTR的polyA尾的二聚体RNA)，(c)衣壳，和(d)蛋白质，诸如蛋白酶。美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列有助于整合到靶细胞基因组中。该专利教导了每个逆转录病毒基因组包含被称为gag、pol和env的基因，这些基因编码毒粒蛋白和酶。这些基因的两端是被称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过位于病毒基因组5'末端的psi序列发生的。LTR本身是相同的序列，可以分为三个元件，这三个元件被称为U3、R和U5。U3来源于RNA的3'末端独有的序列。R来源于RNA两端重复的序列，并且U5来源于RNA的5'末端独有的序列。这三个元件的大小可在不同的逆转录病毒中有很大的差异。对于病毒基因组，poly(A)添加(终止)的位点在右侧LTR中的R和U5之间的边界。U3含有前病毒的大部分转录控制元件，包括对细胞，并且在一些情况下对病毒转录激活蛋白有响应的启动子和多条增强子序列。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，该RT含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关RNase H和整合酶(IN)。
为了产生病毒载体颗粒，载体RNA基因组由编码其的DNA构建体在宿主细胞中表达。未被载体基因组编码的颗粒的组件由在宿主细胞中表达的另外的核酸序列(“包装***”，其通常包括gag/pol和env基因中的一者或两者)以反式(trans)方式提供。产生病毒载体颗粒所需的一组序列可通过瞬时转染引入宿主细胞，或者它们可整合到宿主细胞基因组中，或者它们可以混合方式提供。所涉及的技术是本领域技术人员已知的。
本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指与该名称相关并且属于细小病毒科(Parvoviridae)依赖性细小病毒属(dependoparvovirus)的病毒类别的成员。已知该病毒的多种血清型适用于基因递送；所有已知的血清型可以感染来自各种组织类型的细胞。至少11种按顺序编号的AAV血清型是本领域已知的。用于本文公开方法的非限制性示例性血清型包括11种血清型中的任一种，例如AAV2、AAV8、AAV9或变体或合成血清型，例如AAV-DJ和AAV PHP.B。AAV颗粒包含三种主要病毒蛋白：VP1、VP2和VP3，另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一个实施方案中，AAV是指血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV PHP.B或AAV rh74。这些载体是可商购获得的，或者已经在专利或技术文献中描述过。
本文所用的“植物病毒”是指已经被鉴定为对植物具有致病性的一组病毒。这些病毒依赖于植物宿主进行复制，因为它们缺乏在不具有植物宿主的情况下进行复制的分子机制。因此，植物病毒可用作将目的基因安全地递送至非植物动物受试者的载体。植物病毒包括但不限于烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize chloroticmottle virus)、玉米雷亚多菲诺病毒(Maize rayado fino virus)、燕麦褪绿矮化病毒(Oat chlorotic stunt virus)、佛手瓜花叶芜菁黄花叶病毒(Chayote mosaictymovirus)、葡萄星状花叶伴随病毒(Grapevine asteroid mosaic-associated virus)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus)、葡萄红球病毒(Grapevine Red Globe virus)、沙地葡萄叶脉羽化病毒(Grapevine rupestris vein feathering virus)、甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus)、酸浆斑点芜菁黄花叶病毒(Physalis mottletymovirus)、李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot)、尼日利亚烟草潜隐病毒(Nigerian tobacco latent virus)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaicvirus)、烟草坏死病毒(Tobacco necrosis virus)、茄花叶病毒(Eggplant mosaicvirus)、肯尼迪亚黄色花叶病毒(Kennedya yellow mosaic virus)、番茄TVM类病毒(Lycopersicon esculentum TVM viroid)、燕麦蓝矮病毒(Oat blue dwarf virus)、老布达辣椒病毒(Obuda pepper virus)、橄榄潜隐病毒1型(Olive latent virus 1)、红辣椒轻型斑驳病毒(Paprika mild mottle virus)、PMMV、番茄花叶病毒、芜菁脉明病毒(Turnipvein-clearing virus)、香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus)、鸭茅斑驳病毒(Cocksfoot mottle virus)、牛膝菊属花叶病毒(Galinsoga mosaic virus)、高粱褪绿条纹花叶病毒(Johnsongrass chlorotic stripe mosaic virus)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus)、芒柄花黄花叶病毒(Ononis yellow mosaic virus)、黍花叶病毒(Panicum mosaic virus)、一品红花叶病毒(Poinsettia mosaic virus)、绿萝潜隐病毒(Pothos latent virus)或长叶车前花叶病毒(Ribgrass mosaic virus)。
基因递送载体还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本文所公开的方法中。除了将多核苷酸递送至细胞或细胞群之外，可以通过非限制性蛋白转染技术将本文所述的蛋白直接引入该细胞或细胞群，另选地，可以增强本文所公开的蛋白的表达和/或促进其活性的培养条件是其他非限制性技术。
本文所用的术语“调控序列”、“表达控制元件”或“启动子”意指可操作地连接到待转录和/或复制的靶多核苷酸并促进该靶多核苷酸的表达和/或复制的多核苷酸。启动子是表达控制元件或调控序列的示例。启动子可以位于基因或其他多核苷酸的5'或上游，其提供调控基因转录的控制点。聚合酶II和III是启动子的示例。
聚合酶II或“pol II”启动子催化DNA的转录，以合成mRNA以及大多数shRNA和微RNA的前体。pol II启动子的示例是本领域已知的，并且包括但不限于磷酸甘油酸激酶(“PGK”)启动子；EF1-α；CMV(最小巨细胞病毒启动子)；以及来自逆转录病毒载体和慢病毒载体的LTR。
增强子是增加靶序列表达的调控元件。“启动子/增强子”是含有能够提供启动子和增强子两种功能的序列的多核苷酸。例如，逆转录病毒的长末端重复序列含有启动子和增强子两种功能。增强子/启动子可以是“内源”或“外源”或“异源”的。“内源”增强子/启动子是与基因组中的给定基因天然连接的增强子/启动子。“外源”或“异源”增强子/启动子是通过遗传操作(即，分子生物学技术)与基因并置的增强子/启动子，使得该基因的转录由连接的增强子/启动子指导。
“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键稳定的复合物的反应。氢键可通过沃森-克里克碱基配对、霍格斯坦结合(Hoogsteinbinding)或任何其他序列特异性方式出现。复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单条自杂交链或这些物质的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，诸如PCR反应的启动或核酶对多核苷酸的酶切。
杂交反应可在不同“严格度”的条件下进行。通常，低严格度杂交反应在约40℃下在10×SSC或相等离子强度/温度的溶液中进行。中等严格度杂交通常在约50℃下在6×SSC中进行，并且高严格度杂交反应通常在约60℃下在1×SSC中进行。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的非限制性示例为通常在细胞中存在的温度、离子强度、pH和Mg2+浓度。
严格杂交条件的示例包括：约25℃至约37℃的温育温度；约6×SSC至约10×SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及约4×SSC至约8×SSC的洗涤溶液。中等杂交条件的示例包括：约40℃至约50℃的温育温度；约9×SSC至约2×SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5×SSC至约2×SSC的洗涤溶液。高严格条件的示例包括：约55℃至约68℃的温育温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。通常，杂交温育时间为5分钟至24小时，具有1个、2个或更多个洗涤步骤，并且洗涤温育时间为约1分钟、2分钟或15分钟。SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。应当理解，可以采用使用其他缓冲***的SSC的等效物。
当杂交以反向平行构型在两个单链多核苷酸之间发生时，反应被称为“退火”，并且这些多核苷酸被描述为“互补的”。如果杂交可以在第一多核苷酸的一条链和第二多核苷酸的一条链之间发生，则双链多核苷酸可以与另一多核苷酸“互补”或“同源”。“互补性”或“同源性”(一个多核苷酸与另一个多核苷酸互补的程度)可根据普遍接受的碱基配对规则就预期彼此形成氢键的相反链中的碱基比例定量。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较可出于比较的目的而被比对的每条序列中的位置来确定。当所比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列具有的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源”序列与本公开的序列中的一条序列具有小于40％的同一性，或另选地小于25％的同一性。在一些实施方案中，两个多肽或多核苷酸之间的同一性是根据它们的全长，或根据两者的较短序列，或根据两者的较长序列计算的。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一条序列具有一定百分比(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指当比对时，在比较两条序列时，碱基(或氨基酸)的百分比相同。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域已知的软件程序来确定，例如Ausubel等人编著(2007年)“Current Protocols inMolecular Biology.”中所述的软件程序。优选地，使用默认参数进行比对。一种比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，程序为BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可参见以下互联网地址：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，最后一次访问日期为2021年8月1日。
在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸是RNA或其类似物。在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸是DNA或其类似物。在一些实施方案中，本文所公开的多核苷酸是DNA和RNA的杂交体或其类似物。
在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物编码由参考物编码的相同序列。在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物任选地在高严格度条件下与参考物、互补参考物、反向参考物或反向互补参考物杂交。
另外地或另选地，等效核酸、多核苷酸或寡核苷酸是与参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有至少70％序列同一性、或至少75％序列同一性、或至少80％序列同一性、或另选地至少85％序列同一性、或另选地至少90％序列同一性、或另选地至少92％序列同一性、或另选地至少95％序列同一性、或另选地至少97％序列同一性、或另选地至少98％序列、或另选地至少99％序列同一性的核酸，或者另选地，等效核酸在高严格度条件下与参考多核苷酸或其互补物杂交。在一方面，等效物必须编码相同的蛋白质或蛋白质的功能等效物，其任选地可以通过本文所述的一种或多种测定来鉴定。另外地或另选地，多核苷酸的等效物将编码与参考或亲代多核苷酸具有相同或相似功能的蛋白质或多肽。
术语“转导”是指将外源核苷酸序列导入细胞的过程。在一些实施方案中，这种转导通过病毒载体或非病毒载体进行。
“可检测标记”、“标记”、“可检测标志物”或“标志物”可互换使用，包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质(包括酶)。可检测标记也可连接到本文所述的多核苷酸、多肽、蛋白质或组合物。
如本文所用，术语“标记”或可检测标记意指可直接或间接检测的化合物或组合物，例如N末端组氨酸标签(N-His)、磁活性同位素(例如115Sn、117Sn和119Sn)、非放射性同位素(诸如13C和15N)、多核苷酸或蛋白质(诸如抗体)，其直接或间接地缀合至待检测的组合物以生成“标记的”组合物。该术语还包括与多核苷酸缀合的序列，其会在***序列表达时提供信号，诸如绿色荧光蛋白(GFP)等。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。标记可适用于小规模检测或更适用于高通量筛选。因此，合适的标记包括但不限于磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质(包括酶)。标记可以简单地检测，或者其可以被定量。简单检测的应答通常包括其存在仅被确认的应答，而定量的应答通常包括具有可定量的(例如，可以数值报告的)值(诸如强度、极化或其他性质)的应答。在发光或荧光测定中，可以使用与实际参与结合的检测组分结合的发光团或荧光团直接生成可检测的响应，或者使用与另一(例如，报告物或指示物)组分结合的发光团或荧光团间接生成可检测的响应。产生信号的发光标记的示例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光响应通常包括发光信号的变化或出现。用于发光标记测定组分的合适方法和发光团是本领域已知的，并且例如描述于Haugland,Richard P.(1996年)“Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals”(第6版)。发光探针的示例包括但不限于水母发光蛋白和荧光素酶。
如本文所用，术语“免疫缀合物”包含与第二药剂缔合或连接的抗体或抗体衍生物，该第二药剂诸如细胞毒性剂、可检测药剂、放射性药剂、靶向性药剂、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、半合成抗体或多特异性抗体。
合适的荧光标记的示例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、茋、荧光黄、Cascade BlueTM和德州红。其他合适的光学染料描述于Haugland,Richard P.(1996年)“Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals”(第6版)。
在一些实施方案中，荧光标记被官能化以促进共价连接到存在于细胞或组织的表面之中或之上的细胞组分，诸如细胞表面标志物。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤，所有这些都可用于将荧光标记连接到第二分子上。荧光标记的官能团的选择将取决于与接头、药剂、标志物或第二标记剂的连接位点。
如本文所用，纯化标记或标志物是指可用于纯化标记所缀合的分子或组分的标记，诸如表位标签(包括但不限于Myc标签、人流感血凝素(HA)标签、FLAG标签)、亲和标签(包括但不限于谷胱甘肽-S转移酶(GST)、多组氨酸(His)标签、钙调蛋白结合蛋白(CBP)或麦芽糖结合蛋白(MBP))或荧光标签。
“选择标志物”是指在选择性培养方案中生长的细胞的存活或生长所必需的蛋白质或编码该蛋白质的基因。典型的选择标志物包括编码赋予对选择性药剂(诸如抗生素、除草剂或其他毒素)的抗性的蛋白质的序列。选择标志物的示例包括赋予对抗生素(诸如壮观霉素、链霉素、四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、G 418、新霉素、博来霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、麦草畏、草铵膦或草甘膦)的抗性的基因。
术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或各种培养基中进行的体外或离体繁殖。应当理解，在培养物中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同(即，在形态学、遗传学或表型上)。
在一些实施方案中，本文所公开的细胞是真核细胞或原核细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是细胞系，诸如人胚肾293细胞(HEK 293细胞或293细胞)、293T细胞或a549细胞。在一些实施方案中，细胞是宿主细胞。
“宿主细胞”不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境的影响在后代中发生，所以这种后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语的范围内。宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细胞系，诸如人胚肾293细胞(HEK 293细胞或293细胞)、293T细胞或a549细胞。培养的细胞系可从例如美国典型培养物保藏中心商购获得。
如本文所用，“免疫细胞”包括例如可来源于骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞，诸如粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞和淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和NKT细胞))、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和NKT细胞)和骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞来源于以下项中的一种或多种：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞来源的细胞、胚胎生殖干细胞、胚胎生殖干细胞来源的细胞、干细胞、干细胞来源的细胞、多能干细胞、诱导的多能干细胞(iPSc)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。在一些实施方案中，HSC来源于受试者的脐带血、受试者的外周血或受试者的骨髓。在一些实施方案中，直接或间接从其获得免疫细胞的受试者是待治疗的同一受试者。在一些实施方案中，直接或间接从其获得免疫细胞的受试者不同于待治疗的受试者。在进一步的实施方案中，直接或间接从其获得免疫细胞的受试者不同于待治疗的受试者，并且这些受试者来自同一物种，诸如人。
“真核细胞”包括除原核生物界之外的所有生命界。它们可以通过膜结合细胞核容易地区分。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或生物体，其细胞通过内膜和细胞骨架组织成复杂结构。最具特征性的膜结合结构是细胞核。除非特别列举，否则术语“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性示例包括猿、犬、牛、猪、鼠、大鼠、禽、爬行类动物和人。
“原核细胞”通常缺乏细胞核或任何其他膜结合细胞器，并且被分成细菌和古细菌两个领域。另外，这些细胞没有染色体DNA，其遗传信息是在一个被称为质粒的环状环中。细菌细胞非常小，大约为动物线粒体的大小(直径约1-2μm，长10μm)。原核细胞有三种主要形状：杆状、球形和螺旋形。不同于真核生物那样经过复杂的复制过程，细菌细胞通过二***进行***。示例包括但不限于芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌细菌和沙门氏菌属细菌。培养的细胞系可从例如美国典型培养物保藏中心商购获得。
“组合物”意在指活性剂与另一种惰性(例如可检测药剂或标记)或活性化合物或组合物(诸如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等)的组合，并且包括载体，诸如药学上可接受的载体。在一些实施方案中，载体(诸如药学上可接受的载体)包括纳米颗粒(诸如聚合物纳米颗粒载体(例如HKP纳米颗粒)或脂质纳米颗粒(LNP))，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和其他寡糖；衍生糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，它们可以单独或组合存在，单独或组合的含量以重量或体积计为1％-99.99％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。代表性氨基酸组分(其也可以起缓冲作用)包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也在本技术的范围内，其示例包括但不限于单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。
本文所公开的组合物可以是药物组合物。“药物组合物”意在包括活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物适用于体外、体内或离体诊断或治疗用途。
“药学上可接受的载体”是指可用于本文所公开的组合物中的任何稀释剂、赋形剂或载体。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括纳米颗粒(诸如聚合物纳米颗粒载体(例如HKP纳米颗粒)或脂质纳米颗粒(LNP))，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。另外地或另选地，药学上可接受的载体包括离子交换剂；氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，诸如人血清白蛋白；缓冲物质，诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水、盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐；胶态二氧化硅；三硅酸镁；聚乙烯吡咯烷酮；基于纤维素的物质；聚乙二醇；羧甲基纤维素钠；聚丙烯酸酯；蜡；聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物；聚乙二醇；和羊毛脂。合适的药物载体描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Company，该领域的标准参考文献中。它们可以根据预期的施用形式(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等)，并依照常规的药物实践进行选择。
如本文所用，术语“赋形剂”是指与药物活性成分一起配制，为长期稳定、增加固体制剂体积的目的或为了使最终剂型中的活性成分具有治疗性增强(诸如促进药物吸收、降低粘度或增强溶解度)而加入的天然或合成物质。
根据本公开使用的组合物可以剂量单位形式包装，以便于施用和剂量均匀。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理学上分离的单位，每个单位含有经计算产生与其施用(即，适当的途径和方案)相关的期望响应的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量，施用量取决于所需的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于从业人员的判断，并且对于每个个体是独特的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(症状缓解与治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制后，溶液以与剂量制剂相容的方式并以治疗或预防有效的量施用。制剂易于以各种剂型施用，诸如本文所述的可注射溶液的类型。
本文所用的组合意指组合物的各活性成分单独配制以组合使用，并且可以特定剂量或不以特定剂量单独包装。组合的活性成分可以同时或依次施用。
四支链组氨酸-赖氨酸(HK)肽聚合物H2K4b已被证明是大分子量DNA质粒的良好载体(Leng等人，Nucleic Acids Res，2005年；第33卷：第e40页)，但是是相对低分子量的siRNA的不良载体(Leng等人，J Gene Med，2005年；第7卷：第977-986页)。H2K4b的两种富含组氨酸的肽类似物，即H3K4b和H3K(+H)4b，被证明是siRNA的有效载体(Leng等人，J GeneMed，2005年；第7卷：第977-986页；Chou等人，Biomaterials，2014年；第35卷：第846-855页)，而H3K(+H)4b的有效性似乎略高(Leng等人，Mol Ther，2012年；第20卷：第2282-2290页)。此外，siRNA的H3K4b载体在体外和体内诱导细胞因子的程度显著高于H3K(+H)4bsiRNA多聚复合物(polyplex)(Leng等人，Mol Ther，2012年；第20卷：第2282-2290页)。合适的HK多肽描述于WO/2001/047496、WO/2003/090719和WO/2006/060182中，这些专利中的每一篇的内容整体并入本文。这些多肽具有赖氨酸主链(三个赖氨酸残基)，其中赖氨酸侧链ε-氨基基团和N-末端与各种HK序列偶联。HK多肽载体可通过本领域熟知的方法合成，包括例如固相合成。
发现这种组氨酸-赖氨酸肽聚合物(“HK聚合物”或“HKP”)作为mRNA载体出人意料地有效，并且它们可以单独或与脂质体组合使用以提供mRNA进入靶细胞的有效递送。与PEI和其他载体类似，最初的结果表明HK聚合物运载和释放核酸的能力不同。然而，因为HK聚合物可在肽合成仪上可再现地制备，所以它们的氨基酸序列可容易地改变，从而实现RNA结合和释放的精细控制，以及含有HK聚合物与RNA的多聚复合物的稳定性(Chou等人，Biomaterials，2014年；第35卷：第846-855页；Midoux等人，Bioconjug Chem，1999年；第10卷：第406-411页；Henig等人，Journal of American Chemical Society，1999年；第121卷：第5123-5126页)。当mRNA分子与一种或多种HKP载体混合时，组分自组装成纳米颗粒。
如本文所述，有利地，HK聚合物包含与三赖氨酸氨基酸核心连接的四条短肽支链。肽支链由组氨酸和赖氨酸氨基酸组成，呈不同的构型。这些组氨酸-赖氨酸肽聚合物(HK聚合物)的一般结构如式I所示，其中R表示肽支链，并且K为氨基酸L-赖氨酸。
在式I中，其中K为L-赖氨酸，并且R1、R2、R3和R4中的每一者独立地为组氨酸-赖氨酸肽。在本发明的HK聚合物中，R1-4支链可以相同或不同。当R支链“不同”时，该支链的氨基酸序列不同于聚合物中其他R支链中的每一条R支链。用于式I所示的本发明的HK聚合物中的合适的R支链包括但不限于以下R支链RA-RJ：
RA＝KHKHHKHHKHHKHHKHHKHK-(SEQ ID NO:72)
RB＝KHHHKHHHKHHHKHHHK-(SEQ ID NO:73)
RC＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK-(SEQ ID NO:74)
RD＝kHHHkHHHkHHHHkHHHk-(SEQ ID NO:75)
RE＝HKHHHKHHHKHHHHKHHHK-(SEQ ID NO:76)
RF＝HHKHHHKHHHKHHHHKHHHK-(SEQ ID NO:77)
RG＝KHHHHKHHHHKHHHHKHHHHK-(SEQ ID NO:78)
RH＝KHHHKHHHKHHHKHHHHK-(SEQ ID NO:79)
RI＝KHHHKHHHHKHHHKHHHK-(SEQ ID NO:80)
RJ＝KHHHKHHHHKHHHKHHHHK-(SEQ ID NO:81)
可用于mRNA组合物的特定HK聚合物包括但不限于其中R1、R2、R3和R4中的每一者相同并选自RA-RJ的HK聚合物(表1)。这些HK聚合物分别称为H2K4b、H3K4b、H3K(+H)4b、H3k(+H)4b、H-H3K(+H)4b、HH-H3K(+H)4b、H4K4b、H3K(1+H)4b、H3K(3+H)4b和H3K(1,3+H)4b。在这10个示例中的每一者中，大写字母“K”表示L-赖氨酸，并且小写字母“K”表示D-赖氨酸。与H3K4b相比，额外的组氨酸残基在支链序列中加下划线。HK聚合物的命名如下：
1)对于H3K4b，支链中的主要重复序列是-HHHK-(SEQ ID NO:82)，因此“H3K”是该名称的一部分；“4b”是指支链的数量；
2)在H3K4b及其类似物的每条支链中有四个-HHHK-(SEQ ID NO:82)基序；第一HHHK基序(SEQ ID NO:82)(“1”)最接近赖氨酸核心；
3)H3K(+H)4b是H3K4b的类似物，其中在H3K4b的第二HHHK基序(SEQ ID NO:82)(基序2)中***一个额外的组氨酸；
4)对于H3K(1+H)4b和H3K(3+H)4b肽，在第一(基序1)和第三(基序3)基序中分别存在额外的组氨酸；
5)对于H3K(1,3+H)4b，在支链的第一和第三基序中都存在两个额外的组氨酸。
表1
可以进行本领域熟知的方法，包括凝胶阻滞测定、肝素置换测定和流式细胞术，以评估含有HK聚合物加脂质体的不同制剂在成功递送mRNA方面的性能。合适的方法描述于例如Gujrati等人，Mol.Pharmaceutics，第11卷：第2734-2744页(2014年)和等人，MolTher Nucleic Acids.，第7卷：第1-10页(2017年)。/>
也可以使用技术(Millipore Sigma)来检测细胞对mRNA的摄取。这些灵光(smart flare)是具有附着序列的珠子，当识别细胞中的RNA序列时，这些珠子产生可用荧光显微镜分析的荧光增加。
其他方法包括测量mRNA的蛋白质表达，例如，编码荧光素酶的mRNA可用于测量转染效率。参见例如，He等人(J Gene Med.，2021年2月；第23卷(第2期)：第e3295页)，其证明了使用HKP和脂质体制剂递送mRNA的有效性。
H3K(+H)4b和DOTAP(阳离子脂质)的组合在运载mRNA进入MDA-MB-231细胞的能力方面出人意料地具有协同作用(H3K(+H)4b/脂质体相对于脂质体，P＜0.0001)。该组合作为mRNA载体的有效性是单独的聚合物和阳离子脂质载体的约3倍和8倍。并非所有HK肽都表现出与DOTAP脂质的协同活性。例如，H3K4b和DOTAP的组合作为荧光素酶mRNA的载体的有效性比DOTAP脂质体低。除了DOTAP，可以与HK肽一起使用的其他阳离子脂质包括Lipofectin(ThermoFisher)、Lipofectamine(ThermoFisher)和DOSPER。
H3k(+H)4b的D-异构体(其中支链中的L-赖氨酸被D-赖氨酸取代)是最有效的聚合物载体(H3k(+H)4b相对于H3K(+H)4b，P＜0.05)。mRNA的D-异构体/脂质体载体的有效性分别是单独的H3k(+H)4b和脂质体载体的近4倍和10倍。尽管D-H3k(+H)4b/脂质组合比L-H3K(+H)4b/脂质组合的有效性略高，该比较在统计学上并无差异。
H3K4b和H3K(+H)4b都可用作体外核酸的载体，参见例如Leng等人，JGene Med，2005年；第7卷：第977-986页；和Chou等人，Cancer Gene Ther，2011年；第18卷：第707-716页。尽管有这些先前的发现，H3K(+H)4b作为mRNA载体明显优于其他类似物(表2)。
表2
尤其在不同重量比(HK:mRNA)条件下，其mRNA转染效率均高于H3K4b。在4:1的比例下，MDA-MB-231细胞中H3K(+H)4b的荧光素酶表达是H3K4b的10倍高，无明显的细胞毒性。此外，由于H3K4b和H3K(+H)4b中组氨酸的百分比(按重量计)分别为68.9％和70.6％，缓冲能力似乎不是它们转染差异的重要因素。
凝胶阻滞测定显示HK聚合物延迟了mRNA的电泳迁移率。肽与mRNA重量比越高，阻滞效应越强。然而，在2:1的比例下，H3K(+H)4b完全阻滞mRNA，而H3K4b未完全阻滞mRNA。这表明H3K(+H)4b可形成更稳定的多聚复合物，这有利于其成为mRNA递送的合适载体的能力。
用肝素置换测定进一步证实H3K(+H)4b肽更紧密地结合mRNA。将各种浓度的肝素加入到由mRNA和HK形成的多聚复合物中，并观察到，特别是在较低肝素浓度下，H3K4b聚合物比H3K(+H)4b聚合物更容易释放mRNA。这些数据表明H3K(+H)4b能结合mRNA并比H3K4b形成更稳定的多聚复合物。
利用青色素-5标记的mRNA，使用流式细胞术比较MDA-MB-231细胞对H3K4b和H3K(+H)4b多聚复合物的摄取。在不同的时间点(1小时、2小时和4小时)，H3K(+H)4b多聚复合物比H3K4b多聚复合物更有效地被导入细胞。与这些结果相似，荧光显微镜显示，位于酸性内体小泡中的H3K(+H)4b多聚复合物明显多于H3K4b多聚复合物(H3K4b相对于H3K(+H)4b，P＜0.001)。有趣的是，不与细胞内小泡重叠的不规则形状的H3K4b多聚复合物可能是胞外的，并且未观察到H3K(+H)4b多聚复合物。
已知HK聚合物和阳离子脂质(即DOTAP)均显著且独立地增加质粒转染。参见例如，Chen等人，Gene Ther，2000年；第7卷：第1698-1705页。因此，研究了这些脂质与HK聚合物一起是否增强了mRNA转染。值得注意的是，H3K(+H)4b和H3k(+H)4b载体是比DOTAP脂质体显著更好的mRNA载体。H3K(+H)4b和DOTAP脂质的组合在运载mRNA进入MDA-MB-231细胞的能力方面具有协同作用。该组合作为mRNA载体的有效性分别是单独的聚合物和脂质体载体的约3倍和8倍(H3K(+H)4b/脂质相对于脂质体或H3K(+H)4b)。值得注意的是，并非所有HK肽都表现出与DOTAP脂质的活性提高。H3K4b和DOTAP载体的组合作为荧光素酶mRNA的载体的有效性比DOTAP脂质体低。发现DOTAP和H3K(+H)4b载体的组合在它们运载mRNA进入细胞的能力方面是协同的。参见例如，He等人，J Gene Med.，2020年11月10日：e3295。
在一些实施方案中，载体，诸如HKP纳米颗粒，还包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离的阳离子脂质，并且非阳离子脂质是中性脂质，并且固醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
在一些实施方案中，载体是纳米颗粒。如本文所用，术语“纳米颗粒”是指具有小于1000纳米(nm)的直径的任何颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒具有足够小的尺寸以允许它们被真核细胞摄取。通常，纳米颗粒具有200nm或更小的最长直线尺寸(例如，直径)。在一些实施方案中，纳米颗粒具有100nm或更小的直径。在一些实施方案中，使用例如具有50nm或更小的直径，例如5nm-30nm的直径的较小的纳米颗粒。
在一些实施方案中，载体是聚合物纳米颗粒。术语“聚合物纳米颗粒”是指由聚合物化合物(例如，由重复连接的单元或单体构成的化合物)构成的纳米颗粒，该聚合物化合物包括任何有机聚合物，诸如组氨酸-赖氨酸(HK)多肽(HKP)。
如本文所用，“脂质体”是指形成复合物的一种或多种脂质，其通常被水溶液包围。脂质体通常是包含脂质脂肪酸的球形结构、脂质双层型结构、单层囊泡和无定形脂质囊泡。通常，脂质体是含有截留的水体积的完全封闭的脂质双层膜。脂质体可以是单层囊泡(具有单个双层膜)、寡层或多层(以多个膜双层为特征的洋葱状结构，每个膜双层通过水层与下一个膜双层分开)。
在一些实施方案中，载体是脂质纳米颗粒(LNP，在本文中也被称为脂质体纳米颗粒)。在一些实施方案中，LNP具有约50nm至约200nm的平均直径。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒载体/制剂通常包含脂质，特别是可电离的阳离子脂质，例如本文所公开的SM-102、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)或二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，LNP载体/制剂还包含中性脂质、固醇(诸如胆固醇)和能够降低颗粒聚集的分子，例如PEG或PEG修饰的脂质(在本文中也称为聚乙二醇化脂质(PEGylated lipid))。另外的示例性脂质纳米颗粒组合物和其制备方法描述于例如Semple等人(2010年)Nat.Biotechnol.，第28卷：第172-176页；Jayarama等人(2012年)Angew.Chem.Int.Ed.，第51卷：第8529-8533页；和Maier等人(2013年)Molecular Therapy，第21卷：第1570-1578页，这些文献中的每一篇的内容通过引用方式全文并入本文。
在一个实施方案中，本文所用的术语“疾病”或“病症”是指癌症、诊断患有癌症的状态、疑似患有癌症的状态或处于患有癌症的风险中的状态。
如本文所用，“癌症”是特征为在受试者中存在表现出异常的不受控制的复制的细胞的疾病状态，并且在一些方面，该术语可与术语“肿瘤”互换使用。术语“癌症或肿瘤抗原”或“新抗原”是指已知与癌细胞或肿瘤细胞或组织有关并在癌细胞或肿瘤细胞(诸如在细胞表面上)或组织中表达的抗原，并且术语“癌症或肿瘤靶向抗体”是指靶向这种抗原的抗体。在一些实施方案中，新抗原不在非癌细胞或组织中表达。在一些实施方案中，新抗原在非癌细胞或组织中以与癌细胞或组织相比显著更低的水平表达。
在一些实施方案中，癌症选自：循环***，例如心脏(肉瘤[血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤]、黏液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤和脂肪瘤)、纵隔和胸膜以及其他胸内器官、血管性肿瘤和肿瘤相关血管组织；呼吸道，例如鼻腔和中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺，诸如小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、支气管癌(鳞状细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；胃肠***，例如食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃部、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤(Karposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；在任何部位出现的胃肠道间质瘤和神经内分泌瘤；泌尿生殖道，例如肾(腺癌、维尔姆斯氏瘤(Wilm'stumor)[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和/或尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、***(腺癌、肉瘤)、睾丸(***瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、***癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)；肝脏，例如肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤、胰腺内分泌肿瘤(诸如嗜铬细胞瘤、胰岛素瘤、血管活性肠肽瘤、胰岛细胞瘤和胰高血糖素瘤)；骨，例如骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨黏液性纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经***，例如中枢神经***(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑癌(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、胚组织瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；生殖***，例如妇科、子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(***、肿瘤前宫颈发育不良)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、未分类癌]、粒层-泡膜细胞瘤、支持***瘤(Sertoli-Leydig cell tumors)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、胎盘、***(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)以及与女性生殖器相关的其他部位；***、***、睾丸以及与***相关的其他部位；血液***，例如血液((骨髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴球性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)[恶性淋巴瘤]；口腔，例如唇、舌、牙龈、口底以及口的其他部分、腮腺以及唾液腺的其他部分、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状窝、下咽部以及唇、口腔和咽中的其他部位；皮肤，例如恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、发育异常痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤和瘢痕瘤；肾上腺：成神经细胞瘤；以及其他组织，这些组织包括***和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼、眼内黑色素瘤和附件、***、头或颈、***区、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺以及其他内分泌腺和相关结构、***的继发性和未指明的恶性赘生物、呼吸和消化***的继发性恶性赘生物以及其他部位的继发性恶性赘生物。在一些实施方案中，癌症是结肠癌、结肠直肠癌或直肠癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是腺癌、腺癌、腺瘤、白血病、淋巴瘤、癌、黑色素瘤、血管肉瘤或***瘤。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在其他实施方案中，癌症不是实体瘤。在进一步的实施方案中，癌症是白血病癌症。在一些实施方案中，癌症来自癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是结肠癌、结肠直肠癌或直肠癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。
在一些实施方案中，癌症是原发性癌症或转移性癌症。在一些实施方案中，癌症是复发性癌症。在一些实施方案中，癌症达到缓解，但可复发。在一些实施方案中，癌症是不可切除的。
在一些实施方案中，癌症表达本文所公开的ras突变，诸如肺腺癌、黏液性腺瘤、胰腺导管癌、结肠直肠癌、直肠癌、滤泡性甲状腺癌、自身免疫淋巴组织增生综合征、努南综合征(Noonan syndrome)、幼年骨髓单核细胞白血病、膀胱癌、滤泡性甲状腺癌和口腔鳞状细胞癌。可通过对癌症的活检组织进行测序、DNA印迹法、RNA印迹法或通过与特异性结合该突变的抗体接触来检测突变，该抗体诸如购自ThermoFisher的Ras(G12D突变体)单克隆抗体(HL10)或购自abcam的抗Ras(突变的G12D)抗体(ab221163)。
如本文所用，术语“动物”是指活的多细胞脊椎动物生物体，即包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、猕猴等)、家养动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、蝙蝠、大鼠、兔、豚鼠)。
术语“受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指动物，通常指哺乳动物。任何合适的哺乳动物都可通过本文所述的方法进行治疗。哺乳动物的非限制性示例包括人、非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、猕猴等)、家养动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、蝙蝠、兔、豚鼠)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者患有疾病或诊断为患有疾病。在一些实施方案中，受试者疑似患有疾病。在一些实施方案中，受试者处于患有疾病的风险中。在一些实施方案中，受试者处于完全(诸如无癌症)癌症缓解。在进一步的实施方案中，受试者处于癌症再发或复发的风险中。在一些实施方案中，受试者处于部分癌症缓解。在一些实施方案中，受试者处于癌症转移的风险中。
如本文所用，受试者的疾病的“治疗”是指(1)防止症状或疾病发生于易患或尚未表现出疾病症状的受试者；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)改善或引起疾病或疾病症状的消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益或期望的结果可包括一种或多种，但不限于，一种或多种症状的缓解或改善、病症(包括疾病)程度的减轻、病症(包括疾病)状态的稳定(即，不恶化)、病症(包括疾病)的延迟或减缓、进展、病症(包括疾病)的改善或缓和、状态和缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。当疾病是癌症时，以下临床终点是治疗的非限制性示例：肿瘤负荷的降低、肿瘤生长的减缓、较长的总生存期、较长的肿瘤进展时间、转移的抑制或肿瘤转移的减少。在一方面，治疗不包括预防。
在一些实施方案中，如本文所用，术语“治疗”意指改善疾病，以便减轻、改善或消除其病因、其进展、其严重性或其症状中的一种或多种症状，或以其他方式有益地改变受试者的疾病。提及患者的“治疗”意在包括预防。治疗本质上也可以是先占的，即，治疗可包括预防暴露于疾病或处于疾病风险中的受试者的疾病。疾病的预防可涉及完全防止疾病，例如在预防病原体感染的情况下，或者可涉及预防疾病进展。例如，疾病的预防可能并不意味着在任何水平上完全排除与疾病相关的任何影响，而是可能意味着预防疾病的症状到临床显著的水平或可检测的水平。疾病的预防还可指预防疾病进展到疾病的晚期阶段。
当疾病是癌症时，以下临床终点是治疗的非限制性示例：(1)受试者中或受试者的组织/器官中或癌症位点中的癌症的消除；(2)肿瘤负荷(诸如癌细胞的数量、癌症病灶的数量、病灶中癌细胞的数量、实体癌的大小、体液中液体癌的浓度和/或体内癌症的量)的降低；(3)癌症生长和/或发展的稳定或延迟或减缓或抑制，包括但不限于癌细胞生长和/或***、实体瘤或癌症位点的大小生长、癌症进展和/或转移(诸如形成新转移的时间、总转移数量、转移大小以及容纳转移细胞的各种组织/器官)；(4)具有癌症生长和/或发展的风险较小；(5)诱导患者对癌症的免疫应答，诸如较高数量的肿瘤浸润性免疫细胞、较高数量的活化免疫细胞或较高数量的表达免疫治疗靶点的癌细胞，或癌细胞中较高水平的免疫治疗靶点表达；(6)较高的生存概率和/或增加的生存持续时间，诸如增加的总生存期(OS，其可显示为1年、2年、5年、10年或20年生存率)、增加的无进展生存期(PFS)、增加的无疾病生存期(DFS)、增加的肿瘤复发时间(TTR)和增加的肿瘤进展时间(TTP)。在一些实施方案中，治疗后的受试者经历一个或多个终点，这些终点选自肿瘤缓解、肿瘤大小的减小、肿瘤负荷的减小、总生存期的增加、无进展生存期的增加、抑制转移、生活质量的改善、药物相关毒性的最小化和副作用的避免(例如，治疗突发不良事件减少)。在一些实施方案中，生活质量的改善包括癌症特异性症状的消退或改善，这些癌症特异性症状诸如但不限于疲劳、疼痛、恶心/呕吐、缺乏食欲以及便秘；心理健康(例如，易怒、抑郁、健忘、紧张和焦虑的程度)的改善或维持；社会健康(例如，减少对进食、穿衣或使用洗手间的帮助的需求；进行正常休闲活动、爱好或社交活动的能力的改善或维持；与家人的关系的改善和维持)的改善或维持。在一些实施方案中，改善的患者生活质量通过患者叙述定性地测量，或者使用本领域技术人员已知的验证生活质量工具定量地测量，或者通过它们的组合测量。终点的其他非限制性示例包括入院减少、治疗副作用的药物使用减少、较长的停止治疗时期以及较早地返回工作或护理责任。在一方面，预防(prevention或prophylaxis)被排除在治疗之外。
“免疫应答”广义上是指淋巴细胞对外来物质的抗原特异性应答。术语“免疫原”和“免疫原性的”是指具有引发免疫应答能力的分子。所有免疫原都是抗原，但不是所有抗原都是免疫原性的。本文所公开的免疫应答可以是体液(通过抗体活性)或细胞介导的(通过T细胞活化)。该应答可以在体内或体外发生。本领域技术人员将理解，多种大分子(包括蛋白质、核酸、脂肪酸、脂质、脂多糖和多糖)具有免疫原性的潜力。技术人员还将理解，编码能够引发免疫应答的分子的核酸必然编码免疫原。技术人员还将理解，免疫原不限于全长分子，还可包括部分分子。
如本文所用，生物样品或样品从受试者获得。示例性样品包括但不限于细胞样品、组织样品、活检组织、液体样品诸如血液和生物来源的其他液体样品，包括但不限于前鼻拭子、眼部液体(房水和玻璃体液)、外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、***、***液、考珀液(cowper'sfluid)或预***液、女性潮射液、汗液、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、腹水、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕液、***分泌物/冲洗液、滑液、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液或脐带血。在一些实施方案中，生物样品是肿瘤活检组织。
在一些实施方案中，样品包括来自受试者的流体，包括但不限于血液或血液制品(例如，血清、血浆等)、脐带血、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、女性生殖道的洗液、尿液、粪便、痰液、唾液、鼻粘液、***液、灌洗液、***、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、母乳、乳腺液等或它们的组合。在一些实施方案中，液体生物样品是血浆或血清样品。本文所用的术语“血液”是指来自受试者的血液样品或制剂。该术语涵盖全血、血液制品或血液的任何级分，诸如常规定义的血清、血浆、血沉棕黄层等。在一些实施方案中，术语“血液”是指外周血。血浆是指用抗凝剂处理的血液离心所得的全血级分。血清是指在血液样品凝固之后剩余的流体的水样部分。流体样品通常根据医院或诊所通常遵循的标准方案来收集。对于血液，通常收集适量的外周血(例如，3毫升至40毫升)，并且可在制备之前或之后根据标准方法储存。
术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的物质或混合物。作为非限制性示例，佐剂可包括双十八烷基二甲基溴化铵、双十八烷基二甲基氯化铵、双十八烷基二甲基磷酸铵或双十八烷基二甲基乙酸铵(DDA)和分枝杆菌的总脂质提取物的非极性级分或所述非极性级分的一部分(参见例如，US 8,241,610)。在另一个实施方案中，合成的纳米载体可包含至少一种多核苷酸和佐剂。作为非限制性示例，包含多核苷酸和佐剂的合成性纳米载体可通过WO2011150240和US20110293700中描述的方法配制，这些专利中的每一篇通过引用方式整体并入本文。
术语“接触”意指两者或更多者之间的直接或间接结合或相互作用。直接相互作用的具体示例是结合。间接相互作用的具体示例是一个实体作用于中间分子，该中间分子进而作用于第二个提及的实体。本文所用的接触包括溶液中、固相中、体外、离体、细胞中和体内。体内接触可称为施用。
细胞或载体或其他药剂和含有它们的组合物的“施用”或“递送”可在整个治疗过程中以一个剂量连续地或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而变化。可进行单次或多次施用，其中剂量水平和模式由治疗医师选择，或者在动物的情况下，由治疗兽医选择。在一些实施方案中，施用或其语法上的变化也指具有特定间隔的多于一个剂量。在一些实施方案中，该间隔是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更长。在一些实施方案中，一个剂量重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。合适的剂量制剂和施用药剂的方法是本领域已知的。还可确定施用途径，并且确定最有效的施用途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的、治疗的受试者的健康状况或疾病阶段和靶细胞或组织而变化。施用途径的非限制性示例包括口服施用、腹膜内、输注、鼻腔施用、吸入、注射和局部应用。在一些实施方案中，施用是在特定时间段内输注(例如至受试者的外周血)，该特定时间段诸如约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时或更长。
术语“施用”应包括但不限于通过口服、肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内、脑室内(ICV)、鞘内、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、通过吸入喷雾、鼻腔、***、直肠、舌下、尿道(例如，尿道栓剂)或局部施用途径(例如，凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等)施用，并且可单独或一起配制成含有常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂和适合于每种施用途径的媒介物的合适的剂量单位制剂。本公开不受施用途径、制剂或给药方案限制。
在一些实施方案中，本文所公开的RNA、多核苷酸、载体、细胞或组合物以有效量施用。“有效量”是足以产生有益或期望结果的量。有效量可在一次或多次施用、应用或给药中施用。此类递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间、治疗剂的生物利用度、施用途径等。然而，应当理解，本文所公开的治疗剂对于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，这些因素包括所采用的具体药剂的活性，药剂的生物利用度，施用途径，动物的年龄及其体重，动物的一般健康、性别、饮食，施用时间，***速率，药物组合以及治疗的特定病症的严重性和施用形式。通常，人们将希望施用特定量的药剂，该特定量能有效达到与体内发现有效的浓度相当的血清水平。这些考虑以及有效的制剂和施用方法是本领域熟知的，并且描述于标准教科书中。
在一些实施方案中，本文所公开的RNA、多核苷酸、载体、细胞或组合物以治疗或药学上有效量施用。药剂的“治疗有效量”或“药学上有效量”是指药剂的足以获得药理学上响应的量；或另选地，是药物或药剂在向患有特定病症或疾病的患者施用时足以具有预期效果的量，该预期效果例如，患者中的特定病症或疾病的一种或多种表现的治疗、减轻、改善、缓和或消除。该作用不一定通过施用一个剂量而发生，并且可能仅在施用一系列剂量之后发生。因此，治疗或药学上有效量可在一次或多次施用中施用。
在一些实施方案中，本文所公开的治疗方法可用作一线治疗，或二线治疗，或三线治疗。短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给予的治疗，而二线疗法或三线疗法则分别在一线疗法之后或二线疗法之后给予。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“针对疾病或病症的首次治疗”。在癌症患者中，初步治疗可以是手术、化学疗法、放射疗法或这些疗法的组合。一线疗法也被本领域技术人员称为“初级疗法和初级治疗”。参见美国国家癌症研究所网站www.cancer.gov，最后一次访问时间为2008年5月1日。通常，由于患者对一线疗法未表现出阳性临床或亚临床应答，或由于一线疗法已停止，因此给予患者后续化疗方案。
如本文所用，“抗癌疗法”包括但不限于手术切除、化学疗法、冷冻疗法、放射疗法、免疫疗法和靶向疗法。起减少细胞增殖作用的药剂是本领域已知的，并被广泛使用。仅当癌细胞***时才杀死癌细胞的化疗药物被称为细胞周期特异性的。这些药物包括在S期起作用的药剂，包括拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物。
拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)作用的药物。在化疗过程中，拓扑异构酶控制复制所必需的DNA结构的操作，因此是细胞周期特异性的。拓扑异构酶I抑制剂的示例包括上文所列的喜树碱类似物、伊立替康和拓扑替康。拓扑异构酶II抑制剂的示例包括安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷。
抗代谢物通常是正常代谢底物的类似物，经常干扰染色体复制中涉及的过程。它们在周期中非常特定的阶段攻击细胞。抗代谢物包括叶酸拮抗剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷(foxuridine)、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨；嘌呤拮抗剂，例如6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤；腺苷脱氨酶抑制剂，例如克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨和喷司他丁；等等。
植物生物碱来源于某些类型的植物。长春花生碱是由长春花植物(Catharanthusrosea)制成。紫杉类药物是由太平洋紫杉树(taxus)的树皮制成的。长春花生物碱和紫杉烷也被称为抗微管剂。鬼臼毒素来源于鬼臼果植物。喜树碱类似物来源于亚洲“喜树”(Camptotheca acuminata)。鬼臼毒素和喜树碱类似物也被分类为拓扑异构酶抑制剂。植物生物碱通常是细胞周期特异性的。
这些药剂的示例包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛；鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷；和喜树碱类似物，例如伊立替康和拓扑替康。
在其中癌症是免疫细胞癌症的一些实施方案中，抗癌疗法可包括造血干细胞移植，或基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，治疗剂，诸如本文所公开的细胞，可与另一种抗癌疗法或清除免疫细胞的疗法组合治疗癌症。例如，进行淋巴细胞清除化疗，随后施用本文所公开的细胞，诸如每周输注四次。在进一步的实施方案中，这些步骤可重复一次、两次、三次或更多次，直到观察到部分或完全的效果或达到临床终点。
冷冻疗法包括但不限于涉及降低温度的疗法，例如低温疗法。
放射疗法包括但不限于暴露于辐射，例如如本领域已知的电离辐射、UV辐射。示例性剂量包括但不限于，在至少约2Gy至不超过约10Gy的范围内的电离辐射的剂量，或在至少约5J/m2至不超过约50J/m2的范围内，通常约10J/m2的紫外辐射的剂量。
在一些实施方案中，免疫疗法调节免疫检查点。在进一步的实施方案中，免疫疗法包含免疫检查点抑制剂，诸如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)抑制剂，或程序性细胞死亡1(PD-1)抑制剂，或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在再进一步的实施方案中，免疫检查点抑制剂包含识别并结合免疫检查点蛋白的抗体或其等效物，诸如识别并结合CTLA4的抗体或其等效物(例如Yervoy(伊匹单抗(ipilimumab))、CP-675,206(曲美木单抗(tremelimumab))、AK104(卡度尼利单抗(cadonilimab))或AGEN1884(泽弗利单抗(zalifrelimab)))，或识别并结合PD-1的抗体或其等效物(例如，Keytruda(帕博利珠单抗(pembrolizumab))、Opdivo(纳武利尤单抗(nivolumab))、Libtayo(西米普利单抗(cemiplimab))、Tyvyt(信迪利单抗(sintilimab))、BGB-A317(替雷利珠单抗(tislelizumab))、JS001(特瑞普利单抗(toripalimab))、SHR1210(卡瑞利珠单抗(camrelizumab))、GB226(杰洛利单抗(geptanolimab))、JS001(特瑞普利单抗)、AB122(赛帕利单抗(zimberelimab))、AK105(派安普利单抗(penpulimab))、HLX10(斯鲁利单抗(serplulimab))、BCD-100(帕洛利单抗(prolgolimab))、AGEN2034(巴替利单抗(balstilimab))、MGA012(瑞弗利单抗(retifanlimab))、AK104(卡度尼利单抗)、HX008(普特利单抗(pucotenlimab))、PF-06801591(萨善利单抗(sasanlimab))、JNJ-63723283(西利单抗(cetrelimab))、MGD013(特泊利单抗(tebotelimab))、CT-011(匹地利珠单抗(pidilizumab))或Jemperli(多塔利单抗(dostarlimab)))，或识别并结合PD-L1的抗体或其等效物(例如，Tecentriq(阿替利珠单抗(atezolizumab))、Imfinzi(德瓦鲁单抗(durvalumab))、Bavencio(阿维鲁单抗(avelumab))、CS1001(舒格利单抗(sugemalimab))或KN035(恩沃利单抗(envafolimab)))，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
如本文所用，“靶向疗法”是指使用药物或其他物质的癌症疗法，这些药物或其他物质通过干扰参与癌症的生长、进展、复发和扩散的特定分子(“分子靶点”)，诸如T细胞或NK细胞或表达特异性靶向并结合新抗原的嵌合抗原受体(CAR)的其他免疫细胞来阻断癌症的生长和扩散。在一些实施方案中，被这种靶向疗法靶向的新抗原可与由本文所公开的RNA编码的新抗原相同。在其他实施方案中，被这种靶向疗法靶向的新抗原与由本文所公开的RNA编码的新抗原不同。
如本文所用，可切割肽，也被称为可切割接头，意指可被例如酶切割的肽。包含这种可切割肽的一种翻译的多肽可产生两种终产物，因此允许从一个开放阅读框表达多于一种多肽。可切割肽的一个示例是自切割肽，诸如2A自切割肽。2A自切割肽是一类18-22aa长的肽，其可在细胞中诱导重组蛋白的切割。在一些实施方案中，2A自切割肽选自P2A、T2A、E2A、F2A和BmCPV2A。参见例如，Wang Y等人，Sci Rep.，2015年，5:16273，2015年11月5日出版。
如本文所用，术语“T2A”和“2A肽”可互换使用以指任何2A肽或其片段、任何2A样肽或其片段，或在含有共有多肽基序D-V/I-E-X-N-P-G-P的相对短的肽序列(约20个氨基酸长，取决于病毒来源)中包含必需氨基酸的人工肽，其中X是指通常认为是自切割的任何氨基酸(SEQ ID NO:99)。
在一些实施方案中，术语“接头”是指包含总共1至200个氨基酸残基，或约1至10个氨基酸残基、或另选地8个氨基酸、或另选地6个氨基酸、或另选地5个氨基酸的任何氨基酸序列，这些氨基酸残基可重复1至10次、或另选地1至约8次、或另选地1至约6次、或另选地1至约5次、或另选地1至约4次、或另选地1至约3次或另选地1至约2次。例如，接头可包含由重复三次的五肽组成的至多15个氨基酸残基。在一个实施方案中，接头序列是(G4S)n，其中n是1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15(SEQ ID NO:100)。
如本文所用，短语“衍生的”意指分离的、纯化的、突变的或工程化的，或它们的任何组合。例如，ras衍生肽是指从ras基因或RAS蛋白(诸如野生型)工程化的肽。在一些实施方案中，ras衍生肽是RAS突变体或其片段。
在一些实施方案中，“信号肽”是指指导蛋白质转运并定位到细胞内，例如特定细胞器(诸如内质网)和/或转运并定位到细胞表面和/或分泌到细胞外的肽序列。在一些实施方案中，信号肽位于蛋白质的N末端，并可被切割以产生成熟蛋白质。在一些实施方案中，信号肽约15至约30个氨基酸长。
如本文所用，开放阅读框(ORF)是指编码多肽或其部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，ORF是RNA。
如本文所用，突变是指***、取代、缺失、错义突变或其组合。在一些实施方案中，术语“突变”和“突变体”可互换使用。在一些实施方案中，突变体是指突变的多肽、或多核苷酸、或其片段。
如本文所用，术语“ras”指产生参与控制细胞生长和细胞死亡的细胞信号传导途径的蛋白质的基因家族。在某些类型的癌症中可发现ras基因的突变形式。这些变化可引起癌细胞在体内生长和扩散。ras基因家族的成员包括kras(本文也称为k-ras)、hras(本文也称为h-ras)和nras(本文也称为n-ras)。在一些实施方案中，非大写的基因名称也指所编码的蛋白质。在其他实施方案中，大写的名称诸如RAS、KRAS、NRAS，是指所编码的蛋白质。
如本文所用，术语“kras”和“k-ras”是指Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因，或由其编码的蛋白质。该基因编码属于小GTP酶超家族的成员的蛋白质。单个氨基酸取代负责激活突变。产生的转化蛋白与多种恶性肿瘤有关，包括肺腺癌、粘液腺瘤、胰腺导管癌和结肠直肠癌。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可在如下网页中找到：Gene Cards ID:GC12M025204(检索自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝KRAS，最后一次访问日期为2021年10月9日)、HGNC:6407(检索自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/6407，最后一次访问日期为2021年10月9日)、NCBI Entrez Gene:3845(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3845，最后一次访问日期为2021年10月9日)、Ensembl:ENSG00000133703(检索自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary？g＝ENSG00000133703；r＝12:25205246-25250936，最后一次访问日期为2021年10月9日)、190070(检索自omim.org/entry/190070，最后一次访问日期为2021年10月9日)或UniProtKB/Swiss-Prot:P01116(检索自www.uniprot.org/uniprot/P01116，最后一次访问日期为2021年10月9日)，这些内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，KRAS蛋白是野生型KRAS蛋白(诸如健康受试者或没有癌症的受试者的野生型KRAS蛋白)，其包含MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM(SEQ IDNO:101)or MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM(SEQ ID NO:102)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
如本文所用，术语“nras”和“n-ras”指成神经细胞瘤RAS病毒癌基因同源物，或其编码的蛋白质。这是编码在高尔基体和质膜之间穿梭的膜蛋白的N-ras致癌基因。这种穿梭通过ZDHHC9-GOLGA7复合物的棕榈酰化和去棕榈酰化来调节。具有内在的GTP酶活性的所编码蛋白质被鸟嘌呤核苷酸交换因子激活，并被GTP酶激活蛋白灭活。该基因中的突变与体细胞直肠癌、滤泡性甲状腺癌、自身免疫淋巴组织增生综合征、努南综合征和幼年骨髓单核细胞白血病有关。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可在如下网页中找到：GeneCards ID:GC01M114704(检索自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝NRAS，最后一次访问日期为2021年10月9日)、HGNC:7989(检索自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/7989，最后一次访问日期为2021年10月9日)、NCBI EntrezGene:4893(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4893，最后一次访问日期为2021年10月9日)、Ensembl:ENSG00000213281(检索自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary？g＝ENSG00000133703；r＝12:25205246-25250936，最后一次访问日期为2021年10月9日)、164790(检索自omim.org/entry/164790，最后一次访问日期为2021年10月9日)或UniProtKB/Swiss-Prot:P01111(检索自www.uniprot.org/uniprot/P01111，最后一次访问日期为2021年10月9日)，这些内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，NRAS蛋白是野生型NRAS蛋白(诸如健康受试者或没有癌症的受试者的野生型NRAS蛋白)，其包含MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLPTRTVDTKQAHELAKSYGIPFIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQYRMKKLNSSDDGTQGCMGLPCVVM(SEQ IDNO:103)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
如本文所用，术语“hras”和“h-ras”指Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，或其编码的蛋白质。由这些基因编码的产物在信号转导途径中起作用。这些蛋白质可结合GTP和GDP，并且它们具有内在的GTP酶活性。这种蛋白质经历去棕榈酰化和再棕榈酰化的连续循环，调节了其在质膜和高尔基体之间的快速交换。该基因的突变引起Costello综合征，这是一种以产前阶段生长增加、产后阶段生长不足、易患肿瘤、认知障碍、皮肤和肌肉骨骼异常、独特的面部外观和心血管异常为特征的疾病。该基因的缺陷与多种癌症有关，包括膀胱癌、滤泡性甲状腺癌和口腔鳞状细胞癌。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可在如下网页中找到：Gene Cards ID:GC11M001525(检索自www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝HRAS，最后一次访问日期为2021年10月9日)、HGNC:5173(检索自www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#！/hgnc_id/5173，最后一次访问日期为2021年10月9日)、NCBI Entrez Gene:3265(检索自www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3265，最后一次访问日期为2021年10月9日)、Ensembl:ENSG00000174775(检索自useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary？g＝ENSG00000174775；r＝11:532242-537321，最后一次访问日期为2021年10月9日)、190020(检索自omim.org/entry/190020，最后一次访问日期为2021年10月9日)或UniProtKB/Swiss-Prot:P01112(检索自www.uniprot.org/uniprot/P01112，最后一次访问日期为2021年10月9日)，这些内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，HRAS蛋白是野生型HRAS蛋白(诸如健康受试者或没有癌症的受试者的野生型HRAS蛋白)，其包含MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQHKLRKLNPPDESGPGCMSCKCVLS(SEQ IDNO:104)或MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQGSRSGSSSSSGTLWDPPGPM(SEQ ID NO:105)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在其突变导致癌症的所有基因中，ras家族是最早鉴定的基因家族之一，也是最常见的基因家族之一。在30多年前发现了ras基因。它们编码具有188个氨基酸残基的蛋白质家族，该蛋白质家族具有GTP酶活性，并在调节包括控制细胞生长和死亡在内的多种正常细胞功能的细胞信号转导途径中起重要作用。然而，三种人ras基因(即，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras)、成神经细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(nras)和Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(hras))的突变已被证明是人类癌症的驱动力。在这三种基因中，仅kras就被认为与大约三分之一的人类癌症病例有关。事实上，ras基因突变是三种最致命的癌症(肺癌、结肠直肠癌和胰腺癌)中最常见的驱动突变之一。
很久以前就已经提出将靶向ras的功能获得性突变作为潜在的有效癌症治疗方法。然而，尽管在该领域投入了大量的研究和开发努力，但尚未成功开发出阻断RAS蛋白的突变形式的功能的RAS特异性抑制剂，无论是小分子还是生物制剂。
由于RAS蛋白的位置、功能和结构，开发RAS抑制剂面临巨大的技术挑战。首先，作为细胞内蛋白，RAS对于许多生物制剂和小分子来说是不可及的。其次，RAS是球状蛋白，在其表面上没有小分子抑制剂可有效结合的大的颈(cervices)或沟槽。最后，正常ras是在维持基本细胞功能中起重要作用的管家基因。仅关闭突变的RAS蛋白的活性而不会对正常RAS产生不希望的影响是极具挑战性的。通常，RAS突变体中只有单个氨基酸发生变化。在这种微型尺度上靶向抑制正常RAS和突变RAS之间的序列差异仍然是基于ras的癌症药物开发的目标。
实施本公开的模式
癌症治疗方式传统上包括手术、化学疗法和放射疗法。最近，随着对癌症分子病理学的深入了解，已开发了靶向疗法和免疫疗法。这两种疗法都已在癌症控制中显示了有希望的结果。癌症靶向疗法利用序列信息来抑制癌症驱动突变的蛋白质产物的活性。因为大多数体细胞突变超出了单一的解剖部位或癌症类型，所以靶向疗法可应用于具有相同的潜在突变的不同肿瘤，而不考虑它们的组织位置如何。自2017年以来，美国食品药品监督管理局(FDA)已批准了若干种用于特定遗传缺陷而不考虑组织分布如何的治疗。示例包括帕博利珠单抗，其被批准用于患有不可切除的或转移性的高微卫星不稳定(MSI-H)或错配修复功能缺陷(dMMR)的实体瘤的患者，以及恩曲替尼(entrectinib)，其用于患有NTRK(神经营养酪氨酸受体激酶)基因融合的患者。
与靶向疗法类似，癌症免疫疗法也具有治疗多于一种类型的癌症的潜力。癌症免疫疗法利用患者的免疫***对抗肿瘤细胞。一些癌症免疫疗法主要集中于免疫***的体液成分，抗体，以通过抑制由癌细胞表达的蛋白质的功能来杀死癌细胞。其他癌症免疫疗法通过具有直接破坏肿瘤细胞能力的细胞毒性T细胞发挥其功能。人免疫***以其正常功能的一部分，通过识别在正常细胞中不出现的突变基因产物来监视和杀死异常细胞，从而预防或抑制癌症的生长。由癌细胞产生的蛋白质的突变形式通常被称为肿瘤相关抗原，也被称为新抗原。通过将免疫***暴露于癌症新抗原，可增强人免疫***靶向并杀死肿瘤细胞的能力。这种方式称为癌症治疗疫苗。人肿瘤细胞裂解物或纯化的肿瘤新抗原可用于刺激来自癌症患者的肿瘤特异性免疫应答。免疫***的许多不同的细胞成分可用于产生癌症疫苗。将由肿瘤新抗原、***酸性磷酸酶和佐剂粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组成的融合蛋白作为第一种FDA批准的癌症治疗疫苗加载到患者自身的树突细胞中。树突细胞作为负责展示待被细胞毒性细胞识别的新抗原的初级抗原呈递细胞(APC)起作用。其他细胞也可作为APC起作用。
尽管癌症治疗疫苗前景巨大，但是从免疫表位发现到疫苗制造存在大量技术挑战。基于RNA的疫苗被提出作为应对这些挑战的可能的解决方案，并且已在临床前和临床研究中显示出前景。mRNA疫苗的关键优势是可在实验室中使用容易获得的材料从DNA模板产生mRNA，比可能需要使用鸡蛋或其他哺乳动物细胞的常规疫苗生产更便宜且更快。此外，mRNA疫苗具有简化疫苗发现和开发的潜力，并促进对出现的感染性疾病的快速应答(参见例如，Maruggi等人，Mol Ther.，2019年，第27卷第4期：第757-772页)。
在过去的二十年中，存在对用于开发预防性和治疗性疫苗的基于RNA的技术的广泛的兴趣。在该领域中，mRNA疫苗已被广泛研究用于感染性疾病预防以及用于癌症预防和治疗。临床前和临床试验已表明mRNA疫苗在动物模型和人中提供安全和持久的免疫应答。表达感染性病原体的抗原的mRNA疫苗诱导强效的T细胞和体液免疫应答(Pardi等人，NatRev Drug Discov.，2018年，第17卷：第261–279页)。如前所述，如果与全微生物疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗的生产相比，生成mRNA疫苗的生产方法是完全无细胞的、简单且快速的。这种快速且简单的生产方法使得mRNA成为有前景的生物产物，其有可能填补新出现的感染性疾病和对有效疫苗的迫切需求之间的空白。
与传统的基于质粒和病毒的方法相比，该方法允许设计患者个性化的mRNA，这些mRNA也得益于不需要穿过核膜(与DNA不同)，因此基因组整合的风险很小或没有基因组整合的风险。此外，mRNA疫苗是安全、简单且廉价的，并且具有最大的灵活性。特别是与肽疫苗相比，它们具有自佐剂特性，缺乏MHC单倍型限制，并且不需要进入细胞核(Schlake等人，RNA Biol.，2012年，第9卷第11期：第1319-1330页)。mRNA不会整合到基因组中，因此它避免了肿瘤发生和诱变(McNamara等人，J Immunol Res.，2015年，2015:794528)。由于在几天内的早期代谢降解，这些疫苗是临时的信息载体。最后但同样重要的是，可编码任何蛋白质用于开发治疗性和预防性疫苗，而不会影响mRNA的特性。
最近，自扩增mRNA疫苗已被证明对人类病毒病原体(例如，流感)是安全且有效的。流感mRNA疫苗具有巨大的前景，其为一种无需鸡蛋的平台，并导致在哺乳动物细胞中高保真度地产生抗原。最近公布的结果表明，由鸡蛋适应的H3N2疫苗株的血凝素(HA)中的突变导致的糖基化位点丢失导致在接种的人和雪貂中循环H3N2病毒的中和作用较差(Zost等人，Proc Natl Acad Sci USA.，2017年，第114卷：第12578-12583页)。相反，mRNA疫苗生产过程是无需鸡蛋的，并且在疫苗施用之后，mRNA编码的蛋白质在宿主细胞中被适当地折叠和糖基化，从而避免了产生不正确抗原的风险。
在婴儿和老年人中产生强大的免疫应答一直是流感疫苗的问题。然而，mRNA疫苗的益处可在于它们已被证明在甚至非常年轻和非常年老的小鼠中诱导对甲型流感病毒感染的平衡的、长期的和保护性的免疫。基于mRNA或RNA复制子的疫苗也已被证明在多种动物模型中是免疫原性的，这些动物模型包括非人灵长类动物(Maruggi等人，Vaccine.，2017年，第35卷第2期：第361-368页)。pan-ras mRNA疫苗的靶点选择
由于ras基因在癌症分子病理学中的突出作用，已经进行了大量的临床前和临床研究来研究在许多不同类型的癌症中特定ras突变、突变的RAS蛋白的活性和随后的肿瘤细胞转化之间的关系。当大规模基因组测序技术可用于表征癌细胞的体细胞突变时，ras基因体细胞突变的性质便能得到广泛描绘。癌症基因组图谱项目(TCGA)是迄今为止最大和最全面的表征驱动人类癌症的遗传变化的努力，在超过30种癌症类型和超过10,000个肿瘤样品中记录了ras基因的突变图谱。使用不同测序技术的组合包括外显子组或全基因组测序，以及RNAseq(用于转录和miRNA)和甲基化分析(用于表观遗传相关性)，已记录了不同体细胞ras突变的频率和组织类型。突变序列频率为基于mRNA的ras疫苗选择潜在的新抗原表位奠定了基础。具体地，使用下一代测序技术来比较肿瘤和匹配的正常样品的序列数据两者以鉴定新抗原。ras突变诸如单核苷酸变异(SNV)和***/缺失已经用统计学软件表征，然后验证其刺激CD4和CD8 T细胞应答的能力。这种RAS候选新抗原预测过程涉及多个步骤，包括体细胞突变鉴定、HLA分型、肽加工和肽-MHC结合预测。使用HLA结合预测算法对所选的SNV进行选择，以筛选和鉴定具有强HLA结合亲和力的候选肽序列。这些肽被认为最有可能在人体内引发强效应T细胞。然后使用癌症患者来源的外周血单核细胞(PBMC)来验证通过计算方法预测的肽候选物，以测量它们在体外诱导强T细胞活性的能力。已证明具有体外活性的新抗原肽候选物的序列用于mRNA表达构建体。总的来说，一般的工作流程已经在图3的图表中示出，包括下一代测序读取比对、bam文件处理、体细胞检出、假阳性过滤、新抗原预测、HLA分型、HLA结合，以及新抗原优先化、递送和验证。选择和验证新抗原的细节在图3中进一步阐明。
pan-ras mRNA疫苗及其表达载体的构建
单个mRNA分子可被工程化以表达已如本文所述选择的多肽，并被递送到人细胞中。表达的突变的ras肽可被加工并呈递在APC的表面上，并引发细胞毒性T细胞靶向破坏表达突变体ras蛋白的细胞诸如肿瘤细胞。此外，由于APC所呈递的表位的大小通常为20-27个氨基酸残基长，因此单个RNA表达构建体具有表达不同序列的多种ras突变肽的能力。因此，可将几种Ras突变肽包装到单个RNA表达产物中，该RNA表达产物具有针对不止一种类型的ras突变引发效应T细胞的能力。因此，可以这种方式生产pan ras RNA疫苗。
具体地，在一些实施方案中，每种ras新抗原(在本文中也称为ras的免疫原性片段或ras衍生肽)具有25个氨基酸残基，其中突变的氨基酸残基占据ras新抗原的第13位。具有不同突变序列的多种ras新抗原可串联排列，由非免疫原性甘氨酸/丝氨酸接头(P01-P07或GGSGGGGSGG的起始接头LQ，SEQ ID NO:83；中间接头GGSGGGGSGG，SEQ ID NO:84；和末端接头GGSLGGGGSG，SEQ ID NO:85)分开。将编码“串联小基因”构型的多种ras新抗原的合成DNA片段***mRNA表达载体中。本文公开了生产这种pan-ras疫苗的详细肽序列。
如本文所述，鉴定了高频率体细胞ras突变序列，并基于此确定了最有可能诱导针对ras突变驱动的癌细胞的临床上显著的效应T细胞活性的多肽序列。已使用配制在药学上可接受的载体中的免疫原性组合物开发了若干种pan kras疫苗，该免疫原性组合物包含信使核糖核酸(mRNA)，或基本由其组成，或进一步由其组成，该信使核糖核酸包含编码不同ras突变的一个或多个肽的开放阅读框(ORF)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括聚合物纳米颗粒或脂质体纳米颗粒或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。组合物可以特定量施用于受试者，该特定量在该受试者中有效诱导针对ras新抗原的特异性免疫应答。
因此，在一方面，提供了分离的核糖核酸(RNA)，该RNA包含编码ras衍生肽的开放阅读框(ORF)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，RNA配制在载体(诸如药学上的载体)中。在进一步的实施方案中，RNA被包封在纳米颗粒中。在一些实施方案中，所编码的ras衍生肽包含以下突变中的任何一个或多个(诸如任何一个、或任何两个、或任何三个、或任何四个、或所有五个)突变：
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的苯丙氨酸(F)(本文称为L19F)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)或丝氨酸(S)(本文分别称为A59T、A59G、A59E或A59S)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)(本文分别称为G60D、G60E、G60V或G60R)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的天冬酰胺(N)或R(本文分别称为K117N或K117R)；或者
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T、V或脯氨酸(P)(本文分别称为A146T、A146V或A146P)。
在一些实施方案中，所编码的ras衍生肽还包含以下突变中的任何一个或多个(诸如任何一个、或任何两个、或所有三个)突变：
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、R、S或V(本文分别称为G12D、G12A、G12C、G12R、G12S或G12V)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D、A、C、R、S或V(本文分别称为G13D、G13A、G13C、G13R、G13S或G13V)；或者
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的组氨酸(H)、E、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、P或R(本文分别称为Q61H、Q61E、Q61K、Q61L、Q61P或Q61R)。
在一些实施方案中，所编码的ras衍生肽包含以下突变：与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D(G12D)；与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D(G13D)；与SEQID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的F(L19F)；与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的T(A59T)；与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的D(G60D)；与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H(Q61H)；与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N(K117N)；或与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T(A146T)。
在一些实施方案中，ras衍生肽包含SEQ ID NO:70所示的多肽或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:70的等效物保留了以下突变：与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D(G12D)；与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D(G13D)；与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的F(L19F)；与SEQ IDNO:70的第59位氨基酸残基对齐的T(A59T)；与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的D(G60D)；与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H(Q61H)；与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N(K117N)；以及与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T(A146T)。
在一个实施方案中，该组合物包含编码八种不同的kras高频突变肽的一种mRNA，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，这些肽中的每种肽包含以下的突变：突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的苯丙氨酸(F)(本文称为L19F)；突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)或丝氨酸(S)(本文分别称为A59T、A59G、A59E或A59S)；突变残基，诸如与SEQID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)或精氨酸(R)(本文分别称为G60D、G60E、G60V或G60R)；突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的天冬酰胺(N)或R(本文分别称为K117N或K117R)；突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T、V或脯氨酸(P)(本文分别称为A146T、A146V或A146P)；突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、R、S或V(本文分别称为G12D、G12A、G12C、G12R、G12S或G12V)；突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D、A、C、R、S或V(本文分别称为G13D、G13A、G13C、G13R、G13S或G13V)；或突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的组氨酸(H)、E、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、P或R(本文分别称为Q61H、Q61E、Q61K、Q61L、Q61P或Q61R)。在一些实施方案中，这些肽中的每种肽包含以下的突变：与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D(G12D)；与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D(G13D)；与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的F(L19F)；与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的T(A59T)；与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的D(G60D)；与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H(Q61H)；与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N(K117N)；或与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T(A146T)。在进一步的实施方案中，肽彼此不同，即包含不同的突变。在cDNA克隆的基础上，使用BepiPred线性表位预测算法来选择8个可能作为靶点的潜在表位的短肽片段。所选短肽长度为25个氨基酸残基，其中突变的氨基酸残基占据中心位置(氨基酸残基13)。基于这些短肽序列，设计了相应的mRNA序列。
在另一个实施方案中，提供了编码一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种hras衍生肽的mRNA序列。在一些实施方案中，mRNA编码四种衍生肽，并且这些肽包含以下四种突变：
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D、A、C、R、S或V(本文分别称为G12D、G12A、G12C、G12R、G12S或G12V)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D、C、R、S或V(本文分别称为G13D、G13C、G13R、G13S或G13V)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H、K、L、P或R(本文分别称为Q61H、Q61K、Q61L、Q61P或Q61R)；以及
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N(本文称为K117N)。
在另一个实施方案中，提供了编码一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种nras衍生肽的mRNA序列。在一些实施方案中，mRNA编码四种衍生肽，并且这些肽包含以下四种突变：
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D、A、C、R、S或V(本文分别称为G12D、G12A、G12C、G12R、G12S或G12V)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D、A、C、R、S或V(本文分别称为G13D、G13A、G13C、G13R、G13S或G13V)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D、C、R、S或V(本文分别称为G13D、G13C、G13R、G13S或G13V)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的E、V或R(本文分别称为G60E、G60V或G60R)；
突变残基，诸如与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H、E、K、L、P或R(本文分别称为Q61H、Q61E、Q61K、Q61L、Q61P或Q61R)。
在本文的描述中，SEQ ID NO:70已被用作鉴定ras突变时的参考序列。然而，本领域技术人员可将SEQ ID NO:70所示的序列与另一种ras多肽比对，并使用另一种ras多肽作为参考序列来鉴定本文所公开的ras突变。例如，使用在www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/可访问的Clustal Omega以默认设置进行SEQ ID NO:70、101、103和104所示的序列之间的比对。结果提供于图14中。将序列从第1个氨基酸残基到第175个氨基酸残基相互比对。因此，本文所公开的突变可通过参考SEQ ID NO:70或另选地通过参考SEQ ID NO:101、103或104中的任一者来鉴定，而不改变指定的氨基酸编号。
在另一个实施方案中，提供了编码十六种肽的mRNA序列，这十六种肽对应于八种kras突变、四种hras突变和四种不同的nras突变。
除了传统的基于mRNA的疫苗之外，还开发了自扩增mRNA(SAM)疫苗。SAM疫苗利用宿主细胞的转录***产生靶抗原来刺激适应性免疫。SAM疫苗编码相同组的新抗原。SAM疫苗能以高水平表达抗原。
通过适当的修饰和优化，以及明确定义的递送载体和施用途径，pan-ras mRNA疫苗在小鼠和非人灵长类动物(NHP)模型中均表现出改善的稳定性、增加的翻译效率和增强的免疫原性。
在一方面，提供了核糖核酸(RNA)，该RNA包含编码一种或多种ras衍生肽的开放阅读框(ORF)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该一种或多种ras衍生肽中的每一种由23至29个氨基酸残基组成。在进一步的实施方案中，该一种或多种ras衍生肽中的每一种由约25个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所编码的肽选自SEQID NO:1-69所示的组或它们中每一者的等效物。在一些实施方案中，ras衍生肽选自kras衍生肽，例如SEQ ID NO:1-31所示的kras衍生肽或它们中每一者的等效物。在一些实施方案中，ras衍生肽选自nras衍生肽，例如SEQ ID NO:32-52所示的nras衍生肽或它们中每一者的等效物。在一些实施方案中，ras衍生肽选自hras衍生肽，例如SEQ ID NO:53-69所示的hras衍生肽或它们中每一者的等效物。在一些实施方案中，这些ras衍生肽不包含SEQ IDNO:1-18、32-49或53-68中的任一者或多者。另外地或另选地，ras衍生肽选自SEQ ID NO:19-31、50-52或69所示的组。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-69中的任一者的等效物保留了SEQ ID NO:1-69中的一者的突变。
ras新抗原的肽序列：
KRAS
SEQ ID NO:1G12C:mteyklvvvgacgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:2G12A:mteyklvvvgaagvgksaltiqliq
SEQ ID NO:3G12D:mteyklvvvgadgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:4G12R:mteyklvvvgargvgksaltiqliq
SEQ ID NO:5G12S:mteyklvvvgasgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:6G12V:mteyklvvvgavgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:7G13C:mteyklvvvgagcvgksaltiqliq
SEQ ID NO:8G13A:mteyklvvvgagavgksaltiqliq
SEQ ID NO:9G13D:mteyklvvvgagdvgksaltiqliq
SEQ ID NO:10G13R:mteyklvvvgagrvgksaltiqliq
SEQ ID NO:11G13S:mteyklvvvgagsvgksaltiqliq
SEQ ID NO:12G13V:mteyklvvvgagvvgksaltiqliq
SEQ ID NO:13Q61E:etclldildtageeeysamrdqymr
SEQ ID NO:14Q61H:etclldildtagheeysamrdqymr
SEQ ID NO:15Q61K:etclldildtagkeeysamrdqymr
SEQ ID NO:16Q61L:etclldildtagleeysamrdqymr
SEQ ID NO:17 Q61P:etclldildtagpeeysamrdqymr
SEQ ID NO:18 Q61R:etclldildtagreeysamrdqymr
SEQ ID NO:19 A146T:qdlarsygipfietstktrqrvedafytlv
SEQ ID NO:20 A146V:qdlarsygipfietsvktrqrvedafytlv
SEQ ID NO:21 A146P:qdlarsygipfietspktrqrvedafytlv
SEQ ID NO:22 G60D:getclldildtadqeeysamrdqym
SEQ ID NO:23 G60V:getclldildtavqeeysamrdqym
SEQ ID NO:24 G60R:getclldildtarqeeysamrdqym
SEQ ID NO:25 K117N:dsedvpmvlvgnncdlpsrtvdtkq
SEQ ID NO:26 K117R:dsedvpmvlvgnrcdlpsrtvdtkq
SEQ ID NO:27 A59T:dgetclldildttgqeeysamrdqy
SEQ ID NO:28 A59G:dgetclldildtggqeeysamrdqy
SEQ ID NO:29 A59E:dgetclldildtegqeeysamrdqy
SEQ ID NO:30 A59S:dgetclldildtsgqeeysamrdqy
SEQ ID NO:31 L19F:vvvgaggvgksaftiqliqnhfvde
NRAS
SEQ ID NO:32 Q61R:etclldildtagreeysamrdqymr
SEQ ID NO:33 Q61K:etclldildtagkeeysamrdqymr
SEQ ID NO:34 Q61L:etclldildtagleeysamrdqymr
SEQ ID NO:35 Q61H:etclldildtagheeysamrdqymr
SEQ ID NO:36 Q61P:etclldildtagpeeysamrdqymr
SEQ ID NO:37 Q61E:etclldildtageeeysamrdqymr
SEQ ID NO:38 G12D:mteyklvvvgadgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:39 G12A:mteyklvvvgaagvgksaltiqliq
SEQ ID NO:40 G12C:mteyklvvvgacgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:41 G12R:mteyklvvvgargvgksaltiqliq
SEQ ID NO:42 G12S:mteyklvvvgasgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:43 G12V:mteyklvvvgavgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:44 G13C:mteyklvvvgagcvgksaltiqliq
SEQ ID NO:45 G13A:mteyklvvvgagavgksaltiqliq
SEQ ID NO:46 G13D:mteyklvvvgagdvgksaltiqliq
SEQ ID NO:47 G13R:mteyklvvvgagrvgksaltiqliq
SEQ ID NO:48 G13S:mteyklvvvgagsvgksaltiqliq
SEQ ID NO:49 G13V:mteyklvvvgagvvgksaltiqliq
SEQ ID NO:50 G60E:getclldildtaeqeeysamrdqym
SEQ ID NO:51 G60R:getclldildtarqeeysamrdqym
SEQ ID NO:52 G60V:getclldildtavqeeysamrdqym
HRAS
SEQ ID NO:53 Q61R:etclldildtagreeysamrdqymr
SEQ ID NO:54 Q61H:etclldildtagheeysamrdqymr
SEQ ID NO:55 Q61K:etclldildtagkeeysamrdqymr
SEQ ID NO:56 Q61L:etclldildtagleeysamrdqymr
SEQ ID NO:57 Q61P:etclldildtagpeeysamrdqymr
SEQ ID NO:58 G13R:mteyklvvvgagrvgksaltiqliq
SEQ ID NO:59 G13C:mteyklvvvgagcvgksaltiqliq
SEQ ID NO:60 G13D:mteyklvvvgagdvgksaltiqliq
SEQ ID NO:61 G13S:mteyklvvvgagsvgksaltiqliq
SEQ ID NO:62 G13V:mteyklvvvgagvvgksaltiqliq
SEQ ID NO:63 G12V:mteyklvvvgavgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:64 G12A:mteyklvvvgaagvgksaltiqliq
SEQ ID NO:65 G12C:mteyklvvvgacgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:66 G12D:mteyklvvvgadgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:67G12R:mteyklvvvgargvgksaltiqliq
SEQ ID NO:68G12S:mteyklvvvgasgvgksaltiqliq
SEQ ID NO:69K117N:dsddvpmvlvgnncdlaartvesrq
PAN-RAS
SEQ ID NO:70G12D、G13D、L19F、A59T、G60D、Q61H、K117N、A146T:
mteyklvvvg addvgksaft iqliqnhfvd eydptiedsy rkqvvidget clldildttdheeysamrdq ymrtgegflc vfainntksf edihhyreqi krvkdsedvp mvlvgnncdl psrtvdtkqaqdlarsygip fietstktrq rvedafytlv reirqyrlkk iskeektpgc vkikkciim
在一些实施方案中，这些ras衍生肽中的每一种可由单个ORF编码。在其他实施方案中，ras衍生肽可由多于一个ORF(诸如两个ORF、三个ORF、或四个ORF、或更多个ORF)编码。
在一些实施方案中，该ORF编码SEQ ID NO:70所示的多肽或其等效物。在一些实施方案中，SEQ ID NO:70的等效物保留了以下突变：与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D(G12D)；与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D(G13D)；与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的F(L19F)；与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的T(A59T)；与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的D(G60D)；与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H(Q61H)；与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N(K117N)；以及与SEQ IDNO:70的第146位氨基酸残基对齐的T(A146T)。
在一些实施方案中，该ORF包含AUGUUUGUUUUUCUUGUUUUAUUGCCACUAGUCUCUAGUCAGUGUAUGACUGAAUAUAAACUUGUGGUAGUUGGAGCUGAUGACGUAGGCAAGAGUGCCUUUACGAUACAGCUAAUUCAGAAUCAUUUUGUGGACGAAUAUGAUCCAACAAUAGAGGAUUCCUACAGGAAGCAAGUAGUAAUUGAUGGAGAAACCUGUCUCUUGGAUAUUCUCGACACAACAGAUCACGAGGAGUACAGUGCAAUGAGGGACCAGUACAUGAGGACUGGGGAGGGCUUUCUUUGUGUAUUUGCCAUAAAUAAUACUAAAUCAUUUGAAGAUAUUCACCAUUAUAGAGAACAAAUUAAAAGAGUUAAGGACUCUGAAGAUGUACCUAUGGUCCUAGUAGGAAAUAAUUGUGAUUUGCCUUCUAGAACAGUAGACACAAAACAGGCUCAGGACUUAGCAAGAAGUUAUGGAAUUCCUUUUAUUGAAACAUCAACAAAGACAAGACAGAGAGUGGAGGAUGCUUUUUAUACAUUGGUGAGAGAGAUCCGACAAUACAGAUUGAAAAAAAUCAGCAAAGAAGAAAAGACUCCUGGCUGUGUGAAAAUUAAAAAAUGCAUUAUAAUGUAA(SEQ ID NO:88)所示的多核苷酸、或SEQID NO:88的核苷酸(nt)1至nt 612、或编码相同ras衍生肽的它们中每一者的等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，该ORF编码多肽，该多肽包含两种或更多种(诸如两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种、或九种、或十种、或更多种)ras衍生肽和任选的在任何两种相邻ras衍生肽之间的肽接头，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该接头包含含有约1aa至约200aa(包括该范围内的任何整数或子范围)的随机氨基酸的肽，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，该接头包含SEQ ID NO:83-85中任一项所示的肽，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。另外地或另选地，该接头包含可切割肽，诸如自切割肽，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，所编码的一种或多种ras衍生肽包含与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的野生型残基(即未突变残基，诸如甘氨酸(G))，或与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的野生型残基(即未突变残基，诸如G)，或两者。
在一些实施方案中，该ORF进一步编码信号肽。在进一步的实施方案中，信号肽位于ras衍生肽的N末端，诸如直接或间接缀合至ras衍生肽的N末端。在一些实施方案中，单一肽属于或源自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的表面糖蛋白，或白蛋白，或白介素-2(IL-2)。在一些实施方案中，信号肽包含MFVFLVLLPLVSSQC(SEQ ID NO:87)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，信号肽包含MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:86)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，RNA还包含3'-UTR和5'-UTR。在一些实施方案中，RNA还包含稳定RNA并增强由ORF编码的肽表达的一种或多种另外的元件。
在一些实施方案中，该5'-UTR包含m7G帽子结构和起始密码子，或基本上由其组成，或还进一步包含其。在一些实施方案中，该5'-UTR包含AGGACAUUUGCUUCUGACACAACUGUGUUCACUAGCAACCUCAAACAGACACCGCCACC(SEQ ID NO:89)或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步包含其。
在一些实施方案中，该3'-UTR包含终止密码子和polyA尾，或基本上由其组成，或还进一步包含其。在一些实施方案中，该3'-UTR包含GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCCAAUAGGCCGAAAUCGGCAAGCGCGAUCGC(SEQ ID NO:90)或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，RNA通过在体外转录(IVT)***中转录编码RNA的多核苷酸来制备。在一些实施方案中，RNA通过转录编码RNA的质粒DNA(pDNA)载体来制备。在一些实施方案中，该载体是pUC57、或pSFV1、或pcDNA3、或pTK126。在一些实施方案中，该载体包含TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTTAATACGACTCACTATAAGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCGCCACCATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGACGTAGGCAAGAGTGCCTTTACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAACAGATCACGAGGAGTACAGTGCAATGAGGGACCAGTACATGAGGACTGGGGAGGGCTTTCTTTGTGTATTTGCCATAAATAATACTAAATCATTTGAAGATATTCACCATTATAGAGAACAAATTAAAAGAGTTAAGGACTCTGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGAAATAATTGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGACACAAAACAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAACATCAACAAAGACAAGACAGAGAGTGGAGGATGCTTTTTATACATTGGTGAGAGAGATCCGACAATACAGATTGAAAAAAATCAGCAAAGAAGAAAAGACTCCTGGCTGTGTGAAAATTAAAAAATGCATTATAATGTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCAATAGGCCGAAATCGGCAAGCGCGATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTCCTCGAGGCGCGCCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA(SEQ ID NO:91)或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:91的等效物仍然表达ras衍生肽。
在一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)。
在一些实施方案中，全长RNA的GC含量为总RNA含量的约35％至约70％(包括该范围内的任何百分比或任何子范围)，诸如约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％或约70％。
在一些实施方案中，RNA是经化学修饰的。在一些实施方案中，该化学修饰包括掺入N1-甲基-假尿苷残基或掺入假尿苷残基中的一者或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，RNA中至少约50％至约100％的尿苷残基是N1-甲基假尿苷或假尿苷。在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的残基被本文所公开的一种或多种修饰化学修饰。在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的尿苷残基被本文所公开的一种或多种修饰化学修饰。在一些实施方案中，RNA的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比的尿苷残基是N1-甲基假尿苷或假尿苷。
在一些实施方案中，在体外转录期间尿苷残基中的全部或一些尿苷残基被假尿苷替换。这种修饰在细胞中稳定mRNA免于酶促降解，导致mRNA翻译效率增强。所用的假尿苷可以是N1-甲基-假尿苷，或本领域熟知的其他修饰，诸如N6-甲基腺苷(m6A)、肌苷、假尿苷、5-甲基胞苷(m5C)、5-羟甲基胞苷(hm5C)和N1-甲基腺苷(m1A)。任选地，修饰在整个mRNA中进行。技术人员将认识到，其他修饰的RNA残基可用于稳定蛋白质的三维结构并增加蛋白质翻译。
还提供了编码本文所公开的RNA的多核苷酸、或与该多核苷酸互补的多核苷酸、或两者。在一些实施方案中，该多核苷酸选自：脱氧核糖核酸(DNA)、RNA、DNA和RNA的杂交体或它们中的每一者的类似物。在进一步的实施方案中，该类似物包含肽核酸或锁核酸或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，该多核苷酸还包含指导其转录的调控序列。在一些实施方案中，该调控序列适用于体外转录***。在进一步的实施方案中，该调控序列包含启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在再进一步的实施方案中，该启动子包括噬菌体RNA聚合酶启动子，诸如T7启动子、或SP6启动子或T3启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该多核苷酸包含选自可检测标志物、纯化标志物或选择标志物的标志物。
在进一步的方面，提供了包含本文所公开的多核苷酸、或基本上由其组成，或还进一步由其组成的载体。
在一些实施方案中，该载体还包含与多核苷酸可操作地连接以指导其转录的调控序列。在一些实施方案中，该调控序列适用于体外转录***。在进一步的实施方案中，该调控序列包含启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在再进一步的实施方案中，该启动子包括噬菌体RNA聚合酶启动子，诸如T7启动子、或SP6启动子或T3启动子，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该载体还包含选自可检测标志物、纯化标志物或选择标志物的标志物。
在一些实施方案中，该载体还包含与多核苷酸可操作地连接以指导其复制的调控序列。在进一步的实施方案中，该调控序列包含以下项中的一者或多者：复制起点或引物退火位点、启动子或增强子，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在进一步的实施方案中，非病毒载体是质粒、或脂质体、或胶束。在一些实施方案中，载体是pUC57、或pSFV1、或pcDNA3、或pTK126或在addgene或欧洲标准质粒骨架体系(Standard European Vector Architecture，SEVA)可获得的其他质粒。在一些实施方案中，该载体包含SEQ ID NO:91或其等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO:91的等效物仍然表达ras衍生肽。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在进一步的实施方案中，病毒载体选自腺病毒载体、或腺相关病毒载体、或逆转录病毒载体、或慢病毒载体或植物病毒载体。
在又一方面，提供了包含以下项中的一者或多者的细胞：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸或本文所公开的载体。在一些实施方案中，该细胞适用于复制以下项中的任一者或多者：RNA、多核苷酸或载体，从而产生以下项中的一者或多者：RNA、多核苷酸或载体。在一些实施方案中，该细胞适用于将多核苷酸或载体转录成RNA，从而产生RNA。
在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在进一步的实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。
在一些实施方案中，细胞是真核細胞。在进一步的实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞中的任一者。
在一些实施方案中，本文所公开的细胞适用于产生(诸如转录或表达)本文所公开的RNA。这种产生可以是体内的或体外的。例如，细胞可用于在体外产生RNA。然后将这种RNA任选地与合适的药学上可接受的载体一起施用于有需要的受试者。另选地，细胞可用作细胞疗法，并任选地与合适的药学上可接受的载体一起直接施用于有需要的受试者。在进一步的实施方案中，细胞疗法可另外将其他预防剂或治疗剂递送至受试者。在一些实施方案中，用作细胞疗法的细胞是免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突细胞、骨髓细胞、单核细胞或巨噬细胞。
在一方面，提供了包含载体和以下项中的一者或多者的组合物：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体或本文所公开的细胞，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该载体是药学上可接受的载体。在一些实施方案中，该组合物还包含另外的抗癌疗法。另外地或另选地，该组合物还包含佐剂。
在进一步的方面，提供了产生RNA(诸如本文所公开的那些RNA)的方法。在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达RNA(诸如将DNA转录成RNA)的条件下培养本文所公开的细胞，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该细胞包含编码本公开的RNA的DNA。在一些实施方案中，该方法包括在适用于表达RNA(诸如将DNA转录成RNA)的条件下，使本文所公开的多核苷酸或本文所公开的载体与RNA聚合酶、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、鸟苷-5'-三磷酸(GTP)和三磷酸尿苷(UTP)或经化学修饰的UTP接触，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该方法还包括分离RNA。在一些实施方案中，该方法还包括储存RNA。
在又一方面，提供了通过本文所公开的方法产生的RNA，或包含所产生的RNA，或基本上由其组成，或还进一步由其组成的组合物。
提高mRNA疫苗表达效率
为了提高mRNA疫苗在哺乳动物细胞中的表达效率，可通过部分化学修饰来增强mRNA稳定性。为了进一步增加翻译效率，去除了来源于异常RNA聚合酶活性的短链和双链RNA。为了提高mRNA疫苗的效力，可使用序列优化，同时使用修饰的核苷(诸如假尿苷5-甲基胞苷(5mC))、Cap-1结构和优化的密码子，从而提高翻译效率。在体外转录mRNA期间，可产生作为污染物的未成熟的mRNA，其通过刺激先天免疫活化来抑制翻译。FPLC和HPLC纯化可用于去除这些污染物。
在本文提出的组合物中，用于体外转录mRNA的模板含有五个顺式作用结构元件，即从5'端到3'端：(i)优化的帽子结构，(ii)优化的5'非翻译区(UTR)，(iii)密码子优化的编码序列，(iv)优化的3'UTR和(v)一段重复的腺嘌呤核苷酸(polyA尾)(图5)。这些顺式作用结构元件进一步优化，以获得更好的mRNA特征。本文提供的5'-UTR包括起始密码子和一些其他元件，但不编码多肽(即，其是非编码的)。在一些实施方案中，本公开的5'-UTR包含具有7-甲基鸟苷(7mG)序列的帽子结构，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。3'-UTR位于终止密码子(代表终止信号的mRNA转录物的密码子)的正下游(3')，并且不编码多肽(非编码的)。polyA尾是位于3'-UTR的下游并且含有多个连续的单磷酸腺苷的mRNA的特定区域。
典型的mRNA生产盒包含在其5'-UTR区的帽子结构，随后是编码相应蛋白质或肽的框内mRNA序列，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，具有polyA尾的3'-UTR是有效mRNA生产所必需的。在一些实施方案中，表达盒不仅用于mRNA生产的效率，而且还用于随后的蛋白质或肽生产(图5)。
在一些实施方案中，通过使用RNA聚合酶(T7、T3或SP6)和不同核苷的混合物，从含有噬菌体启动子、优化的UTR和密码子优化的序列的线性DNA模板通过体外转录(IVT)产生mRNA。在其他实施方案中，线性DNA模板可克隆到作为递送载体的质粒DNA(pDNA)中。质粒载体可适用于mRNA疫苗生产。常用的质粒包括pSFV1、pcDNA3和pTK126(图6)。一种独特的mRNA表达***是pEVL(参见Grier等人，Mol Ther Nucleic Acids.，19；第5卷：第e306页，(2016年)，“pEVL:A Linear Plasmid for Generating mRNA IVT Templates With ExtendedEncoded Poly(A)Sequences”，其公开内容通过引用方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，疫苗包含有效量的mRNA和药学上可接受的载体，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，该mRNA包含编码ras新抗原或其他新抗原中的一者或多者的开放阅读框，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。该有效量是在受试者中有效诱导新抗原特异性(诸如ras特异性)免疫应答的特定量。在一个实施方案中，该载体包括聚合物纳米颗粒或脂质体纳米颗粒，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该载体是组氨酸-赖氨酸共聚物或精胺-脂质体缀合物。在一些实施方案中，该载体还包括DOTAP或MC3或两者。
在一些实施方案中，疫苗包含有效量的mRNA，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，该mRNA包含编码由自切割2A肽位点分开的多种新抗原的开放阅读框、将该新抗原整合到膜中和/或使用不同的信号序列(诸如白蛋白信号序列)分泌的信号序列，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
作为mRNA疫苗递送***的组氨酸-赖氨酸(HK)多肽
尽管在过去几年中，mRNA疫苗的合理设计以及它们的作用机制的阐明取得了显著进展，但是它们的广泛应用因存在普遍存在的核糖核酸酶(RNases)，以及需要促进疫苗进入细胞并随后从核内体中逃逸，并将它们靶向淋巴器官或特定细胞而受到限制。参见例如，Midoux和Pichon，Expert Rev Vaccines.，2015年，第14卷第2期：第221-234页。具有化学载体的mRNA制剂在树突细胞(DC)中提供了更多的特异性和内化，以获得更好的免疫应答并减少剂量。
非病毒递送***比病毒递送***更有利。参见例如，Brito等人，Adv Genet.，2015年，第89卷：第179-233页。一个非限制性示例是非病毒方法由于其安全性和成本效益高而相对于病毒递送***是优选的。参见例如，Juliano等人，Nucleic Acids Res.，2008年，第36卷：第4158-4171页。用于递送疫苗的非病毒方法包括裸mRNA疫苗、基因枪、鱼精蛋白缩合、基于佐剂的疫苗和包封的mRNA疫苗。正义RNA病毒(α病毒)可用于病毒递送***。α病毒的糖蛋白(E1和E2)可用于宿主中的核内体逃逸和细胞靶向。除了通过病毒或非病毒介导的方法直接递送以外，离体转染的mRNA是裸mRNA疫苗接种的另选方案。在该方法中，在施用之前将mRNA转染到单核细胞、巨噬细胞、T细胞、树突细胞(DC)和间充质干细胞(MSC)中，参见例如，Sahin等人，Nat Rev Drug Discov.，2014年，第13卷：第759-780页。与仅提供最佳表达的裸mRNA疫苗接种相比，通过离体转染的mRNA疫苗接种可诱导强的免疫应答。
如本文所述，可应用一系列支链组氨酸-赖氨酸(HK)多肽(HKP)以通过静电作用包封mRNA。本文所用的HKP是由组氨酸和赖氨酸残基组成的一组直链肽和支链肽，并且在大多数情况下，这些肽在与核酸混合时形成球形纳米颗粒。此类多肽公开于2006年7月4日发布的美国专利号7,070,807B2以及2007年1月16日发布的美国专利号7,163,695B2中。这些专利中的每一篇的公开内容通过引用方式整体并入本文。与其他载体相似，HKP载体运载各种核酸的能力不同。例如，四支链HK肽(H2K4b)是质粒的良好载体(参见例如，Chen等人，Nucleic Acids Res.，2001年，第29卷：第1334-1340页；以及Zhang等人，Methods MolBiol.，2004年，第245卷：第33-52页)，但是对于siRNA是不良载体。此外，H3K4b、H3K(+H)4b和H3K8b是siRNA的极好的载体(参见例如，Leng等人，J Gene Med.，2005年，第7卷：第977-986页)，但是仅H3K(+H)4b显示出运载mRNA进入靶细胞的有效性。(参见图8)此外，H3K(+H)4b是比DOTAP脂质体更有效的mRNA载体。此外，如本文所述，可使用H3K(+H)4b、MC3和/或DOTAP的递送载体组合来增强mRNA递送的疗效。本文所述的结果表明，H3k(+H)4b、MC3和/或DOTAP组合是最有效的mRNA载体。这种组合对于其运载mRNA进入细胞的能力是协同的(图8至图12)。
制剂和相关方法
因此，在一方面，提供了组合物(诸如免疫原性组合物)，该组合物包含例如配制在药学上可接受的载体中的有效量的本文所公开的RNA，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，该组合物包含RNA和药学上可接受的载体，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括纳米颗粒，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，纳米颗粒是聚合物纳米颗粒或脂质体纳米颗粒或两者。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括聚合物纳米颗粒或脂质体纳米颗粒或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，聚合物纳米颗粒载体包括组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，HKP包括H3K(+H)4b，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在再进一步的实施方案中，HKP包括H3k(+H)4b，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，HKP包含选自SEQ ID NO:72-81的侧链。
在一些实施方案中，组合物中HKP和RNA的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，组合物中HKP和RNA的质量比为约2.5:1。在另一个实施方案中，组合物中HKP和RNA的质量比为约4:1。
在一些实施方案中，聚合物纳米颗粒载体还包含脂质。在进一步的实施方案中，脂质是阳离子脂质。在再进一步的实施方案中，阳离子脂质是可电离的。
在一些实施方案中，阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA(MC3)或二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，脂质还包括以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，脂质还包括PLA或PLGA。
在一些实施方案中，HKP和mRNA在混合时自组装成纳米颗粒。
在一些实施方案中，脂质体纳米颗粒载体包括精胺-脂质胆固醇(SLiC)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，SLiC选自TM1-TM5，其结构如图13所示。
在一些实施方案中，药学上可接受的载体是脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，脂质是阳离子脂质。在进一步的实施方案中，阳离子脂质是可电离的。在一些实施方案中，LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。
在一些实施方案中，组合物中LNP和RNA的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，组合物中LNP和RNA的质量比为约2.5:1。在另一个实施方案中，组合物中LNP和RNA的质量比为约4:1。
在一些实施方案中，辅助脂质包括以下项中的一者或多者：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、(2R)-3-(十六烷酰氧基)-2-{[(9Z)-十八-9-烯酰基]氧基}丙基2-(三甲基氮杂铵)乙基磷酸酯(POPC)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，胆固醇包括植物胆固醇或动物胆固醇或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质包括以下项中的一者或多者：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)、任选地PEG2000-DMG((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，阳离子脂质和辅助脂质的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，阳离子脂质和辅助脂质的质量比为约1:1。
在一些实施方案中，阳离子脂质和胆固醇的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，阳离子脂质和胆固醇的质量比为约1:1。
在一些实施方案中，阳离子脂质和聚乙二醇化脂质的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，阳离子脂质和聚乙二醇化脂质的质量比为约1:1。
阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的质量比可由本领域技术人员基于如本文所公开的阳离子脂质和辅助脂质、阳离子脂质和胆固醇以及阳离子脂质和聚乙二醇化脂质的比来计算。
在一些实施方案中，LNP包含SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SM-102、DSPC、胆固醇和PEG200-DMG的质量比为约1:1:1:1。在一些实施方案中，SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG的摩尔比为约50:10:38.5:1.5。
在一些实施方案中，本文提供的质量比可用另一参数(诸如摩尔比、相对于总重量的重量百分比、相对于总体积的组分重量或相对于总摩尔量的摩尔百分比)替代。已知组分及其分子量，本领域技术人员将不难将质量比转化为摩尔比或其他等同参数。
在进一步的方面，提供了产生本文所公开的组合物的方法。该方法包括使本文所公开的RNA与HKP接触，从而使RNA和HKP自组装成纳米颗粒，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，接触步骤中HKP和RNA的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，接触步骤中HKP和RNA的质量比为约2.5:1。在另一个实施方案中，接触步骤中HKP和RNA的质量比为约4:1。
在一些实施方案中，该方法还包括使HKP和RNA与阳离子脂质接触。在进一步的实施方案中，阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA(MC3)或DOTAP(二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷)或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在再进一步的实施方案中，接触步骤中阳离子脂质和RNA的质量比为约10:1至约1:10，包括其间的任何范围或比，例如，约5:1至1:5、约5:1至1:1、约10:1、约9.5:1、约9:1、约8.5:1、约8:1、约7.5:1、约7:1、约6.5:1、约6:1、约5.5:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2:5:1，约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1:6、约1:6.5、约1:7、约1:7.5、约1:8、约1:8.5、约1:9、约1:9.5或约1:10。在一个实施方案中，接触步骤中RNA和阳离子脂质的质量比为约1:1。因此，接触步骤中HKP、RNA和阳离子脂质的质量比可基于HKP与RNA之间的比和RNA与阳离子脂质之间的比来计算。例如，如果HKP与RNA的比为约4:1并且RNA与阳离子脂质的比为约1:1，则HKP与RNA与阳离子脂质的比为约4:1:1。
在又一方面，提供了产生本文所公开的组合物的方法。该方法包括使本文所公开的RNA与脂质接触，从而使RNA和脂质自组装成脂质纳米颗粒(LNP)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，辅助脂质包括以下项中的一者或多者：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、(2R)-3-(十六烷酰氧基)-2-{[(9Z)-十八-9-烯酰基]氧基}丙基2-(三甲基氮杂铵)乙基磷酸酯(POPC)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，胆固醇包括植物胆固醇或动物胆固醇或两者，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质包括以下项中的一者或多者：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)、任选地PEG2000-DMG((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，LNP包含SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，SM-102、DSPC、胆固醇和PEG200-DMG的质量比为约1:1:1:1。另外地或另选地，SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG的摩尔比为约50:10:38.5:1.5。
在一些实施方案中，接触步骤在微流体混合器中进行。在进一步的实施方案中，微流体混合器是狭缝叉指型微混合器或交错鱼骨型微混合器(SHM)。
还提供了通过本文所公开的方法制备的组合物。
治疗方法
还提供了治疗患有癌症、或处于患有癌症的风险、或疑似患有癌症的受试者的方法。在一些实施方案中，癌症包含本文所公开的ras突变。在一些实施方案中，ras突变是ras基因的突变。在一些实施方案中，ras突变是RAS蛋白的突变。在一些实施方案中，癌症包含突变的ras基因，该基因编码本文所公开的氨基酸RAS突变。在进一步的实施方案中，癌症包含以下项中的任一者或多者：SEQ ID NO:1至69的突变。确定该方法何时成功的方法是本领域已知的，并且在本文中简要描述。
还提供了抑制肿瘤或癌细胞生长的方法。该方法包括使免疫细胞与以下项中的任一者或多者接触：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞或本文所公开的组合物，从而激活免疫细胞，并使肿瘤或癌细胞与激活的免疫细胞接触，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，癌细胞或肿瘤包含本文所公开的ras突变。在一些实施方案中，ras突变是ras基因的突变。在一些实施方案中，ras突变是RAS蛋白的突变。在一些实施方案中，癌症包含突变的ras基因，该基因编码本文所公开的氨基酸RAS突变。在进一步的实施方案中，癌症包含以下项中的任一者或多者：SEQID NO:1至69的突变。接触步骤中的任一者或两者可以是体外的或体内的。
另外地或另选地，提供了本文所公开的用于个性化或精确方法，或另选地用于测试新组合疗法的筛选方法或方法的筛选步骤。该方法包括检测本文所公开的突变，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，可使用测序、DNA印迹法或RNA印迹法来检测ras基因的突变。在一些实施方案中，可使用流式细胞术或蛋白质印迹法来检测ras蛋白的突变。该方法可在动物中实施以产生用于治疗的动物模型或治疗动物，如由治疗的兽医所确定的。确定该方法何时成功的方法是本领域已知的，并且在本文中简要描述。
在一些实施方案中，癌症是腺癌、腺癌、腺瘤、白血病、淋巴瘤、癌、黑色素瘤、血管肉瘤、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌或***瘤。癌症可以是原发性的或转移性的。有需要的受试者可能患有活动性癌症或处于缓解中，或处于患原发性或继发性癌症的风险中。
另外地或另选地，提供了在有需要的受试者中诱导免疫应答(例如本文所公开的ras突变的免疫应答)的方法。在一些实施方案中，该免疫应答包括以下项中的任一者或多者：Th1免疫应答、CD8+T细胞的活化或促炎细胞因子(诸如白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β))的产生，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。确定该方法何时成功的方法是本领域已知的，并且在本文中简要描述。
这些方法包括向受试者施用例如有效量的(例如，药学上有效量的)以下项中的任一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞或本文所公开的组合物，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
在一些实施方案中，RNA编码SEQ ID NO:70。在进一步的实施方案中，RNA进一步编码SEQ ID NO:87所示的信号肽，其缀合至SEQ ID NO:70的N末端。在一些实施方案中，RNA包含SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:88的(nt)1至nt 612，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，RNA还包含5'UTR(例如包含SEQ ID NO:89，或基本上由其组成，或还进一步由其组成)和3'UTR(例如包含SEQ ID NO:90，或基本上由其组成，或还进一步由其组成)。在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:91，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。在一些实施方案中，组合物包含配制在载体(诸如本文所公开的LNP或HKP纳米颗粒)中的RNA。
在一些实施方案中，施用是瘤内施用、或静脉内施用、或肌内施用、或皮内施用或皮下施用。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物或人。
在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用另外的抗癌疗法。在一些实施方案中，抗癌疗法在以下项中的任一者或多者施用之前、或与其同时或在其施用之后施用：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞或本文所公开的组合物。
在一些实施方案中，施用重复至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或更多次。在进一步的实施方案中，任意两次施用之间的间隔可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更长。
在一些实施方案中，该方法还包括在施用之前检测受试者的生物样品(诸如肿瘤活检组织或循环肿瘤DNA)中的本文所公开的ras突变。
在一些实施方案中，ras突变是ras基因的突变。在一些实施方案中，ras突变是RAS蛋白的突变。
在一些实施方案中，该方法还包括在施用之后监测受试者的生物样品(诸如肿瘤活检组织或循环肿瘤DNA)中的本文所公开的ras突变。
在一些实施方案中，ras突变是ras基因的突变。在一些实施方案中，ras突变是RAS蛋白的突变。
在一些实施方案中，该方法还包括在施用之后检测受试者的生物样品(诸如血液样品)中识别并结合本文所公开的ras突变的抗体。
如本文所用，本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物的有效剂量是在待施用的受试者中产生保护性免疫应答所需的剂量。本文中的保护性免疫应答是治疗受试者的癌症的免疫应答。本文所公开的RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物可施用一次或多次。对疫苗免疫应答的初始测量可通过测量接受RNA、或多核苷酸、或载体、或细胞或组合物的受试者中的抗体的产生来进行。以这种方式测量抗体产生的方法也是本领域熟知的，是预防、抑制癌症的发生或治疗(在一定程度上减轻症状，优选地所有症状)所需的剂量。药学上有效的剂量取决于疾病的类型、所用的组合物、施用途径、所治疗的哺乳动物的类型、所考虑的具体哺乳动物的物理特性、同时给药以及医学领域技术人员将认识到的其他因素。通常，根据配制的组合物的效力，施用量为0.1mg/kg至100mg/kg体重/天的活性成分。
在一些实施方案中，RNA组合物可以足以递送0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg受试者体重每天的剂量水平施用，每天、每周、每月等一次或多次，以获得期望的治疗或预防效果。在一些实施方案中，RNA组合物以约10μg/kg至约500μg/kg体重的剂量，或其中的任何剂量或子范围，诸如约28.5μg/kg至285μg/kg体重的剂量施用。期望的剂量可每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每2个月一次、每三个月一次、每6个月一次等递送。在某些实施方案中，可使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)递送期望的剂量。当采用多次施用时，可使用诸如本文所述的分开给药方案。在一些实施方案中，RNA组合物可以足以递送0.0005mg/kg至0.01mg/kg，例如约0.0005mg/kg至约0.0075mg/kg，例如约0.0005mg/kg、约0.001mg/kg、约0.002mg/kg、约0.003mg/kg、约0.004mg/kg或约0.005mg/kg的剂量水平施用。在一些实施方案中，RNA组合物可以足以递送0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750mg/kg或0.025mg/kg至1.0mg/kg的剂量水平施用一次或两次(或更多次)。
在一些实施方案中，RNA组合物可以总剂量为或足以递送总剂量为0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。本公开涵盖较高和较低的施用剂量和施用频率。例如，RNA组合物可以施用三次或四次。
试剂盒
在一方面，提供了用于本文所公开的方法的试剂盒。
在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞或本文所公开的组合物，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，试剂盒适用于本文所公开的治疗方法。在一些实施方案中，试剂盒还包含抗癌疗法。
在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：本文所公开的RNA、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的细胞、本文所公开的组合物、HKP或脂质，任选地阳离子脂质，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，试剂盒适用于产生本文所公开的RNA或组合物的方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书、本文所公开的多核苷酸或载体、RNA聚合酶、ATP、CTP、GTP和UTP或经化学修饰的UTP，或另选地基本上由其组成，或还进一步由其组成。在进一步的实施方案中，试剂盒适用于产生本文所公开的RNA或组合物的体外方法。
实验方法
以下实施例说明了可在各种情况下用于使本公开生效的方法。
实施例1：设计靶向kras突变的mRNA
如本文所述，疫苗包含合成mRNA，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，该合成mRNA含有编码蛋白质的开放阅读框(ORF)的全部或部分。最佳情况下，ORF两侧有两个元件：“帽”，即通过5′-5′三磷酸连接到5′末端的7-甲基鸟苷残基，和3′末端的polyA尾。在一些实施方案中，mRNA疫苗是包括额外组分的线性RNA片段。构建了这样的mRNA疫苗。进行单一层析步骤以确保mRNA根据大小分离，并去除较短和较长的转录物，产生纯的单一mRNA产物。
在其他实施方案中，mRNA疫苗是基于载体的表达***，该***包含启动子、ORF、任选地转录成polyA的poly(d(A/T))序列和用于线性化载体以确保转录的明确终止的独特限制性位点(帽不是由模板编码)，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。构建了这样的载体。为了便于操作，将对应于单个ras新抗原的DNA片段克隆到特定载体中作为串联小基因(图4)。从该载体转录的RNA分子可通过体外表达***翻译成多肽(图5)，并作为mRNA panras疫苗起作用。
实施例2：在体外将mRNA转染到细胞并测量mRNA表达
使用多种可商购的转染试剂将表达ras新抗原表位的mRNA构建体体外转染至人细胞中。用于这些研究的细胞包括Huh7、Vero细胞、A549细胞等。电穿孔(使用MaxCyte,Gaithersburg,MD的技术)也作为一种递送选择进行了检查。测试并比较了各种递送方法，以确定在各种细胞中具有良好摄取的方法，并评估构建体的后续表达。确定每个构建体的蛋白质产量，并且还确定产物是否从细胞分泌。使用SmartFlare探针(Millipore)或使用Q-RT-PCR在活细胞中检测mRNA。
实施例3：使用SmartFlare技术检测摄取到细胞中的mRNA
SmartFlare探针最近已成为活细胞中特定RNA的可视化和定量的有前途的工具。这些灵光是具有附着序列的珠子，当识别细胞中的RNA序列时，这些珠子产生荧光增加。Smartflares(Merck)是针对沿着构建体的几个区域设计的，以防空间位阻降低来自一个区域的信号。
将Vero或其他细胞在胶原包被的24孔玻璃底板中以每孔1×104个细胞的浓度在1ml RPMI-1640中培养12小时。将预稀释到50μl PBS中的SmartFlare探针(3μl)(Cy3标记的mRNA，或无义序列(scramble)对照检测探针，购自Millipore)一式三份加入到每个孔中。将细胞在37℃和5％ CO2下温育过夜(约16小时)，用荧光显微镜分析，并用类似的曝光拍摄数字照片以了解mRNA表达。
实施例4：检测培养基中的蛋白质表达
使用分析型C18柱(250mm×2.1mm；Phenomenex)通过RP-HPLC鉴定和定量mRNA构建体所表达的蛋白质。蛋白质检测使用双波长检测器。随时间推移调整0.1％ TFA/乙腈的梯度，以允许蛋白质峰的分析分离。在最初的实验中，收集级分并提交质谱分析以确定预期序列的存在。使用蛋白质测序比较分泌的产物和细胞内制造的产物。为了减轻样品的酶降解，在培养基和来自多个孔的浓缩培养基中使用酶抑制剂，以便在HPLC上检测产物。
实施例5：确定用于递送的最佳纳米颗粒
聚合物的序列和结构：马里兰大学的生物聚合物核心设施在Rainin Voyager合成仪(PTI)上合成了HK聚合物。研究了直链、四支链和八支链HK肽运载mRNA的能力。在4支链HK肽中，支链从三赖氨酸核心出发。
体外mRNA转染：检测了几种HK肽运载荧光素酶表达mRNA(TrilinkBiotechnologies,Inc.，CleanCap萤火虫荧光素酶mRNA)进入MDA-MB-231细胞的能力。简言之，将1×105个细胞接种到含有500μl DMEM和10％血清的24孔板中。24小时后，当细胞达到60％-80％汇合时，将每个孔中的培养基更换为Opti-MEM。为了制备HK多聚复合物，将HK肽(4mg至12mg)混合在50ml Opti-MEM中，将mRNA(1mg)短暂加入混合物中，并在室温下保持30分钟。然后将该多聚复合物逐滴加入细胞中。4小时后，除去Opti-MEM培养基，并用1mlDMEM/10％血清代替。二十四小时后，裂解细胞，并测量荧光素酶活性。
HK脂质体复合物的转染与上述类似，只有少数例外。简言之，HK肽最初以各种比例与mRNA混合并在Opti-MEM中温育30分钟。然后加入MC3或DOTAP阳离子脂质体(1,2-二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷；1g或1.5g；Roche)并温育30分钟。然后将Opti-MEM混合物(100l)加入细胞。
凝胶阻滞测定：将各种量的HK肽与1μg mRNA混合，并在室温下温育30分钟。具体地，在水中制备以下HK/mRNA比(w/w)：1/2、1/1、2/1、4/1、8/1。30分钟后，将HK多聚复合物上样到凝胶(含有溴化乙锭的1％琼脂糖)上，然后在TBE缓冲液中以75V恒定电压进行电泳60分钟。通过UV成像仪(ChemiDoc Touch,BIO-RAD,CA)获取图像。例如，参见图9。
肝素置换测定：HK与质粒的复合(4:1wt/wt比)通过在mQ水中的荧光测定评估。如前所述制备复合物，随后加入稀释的SG。对于检测，将复合物(体积的1/5)、水(3/5)和SG(1/5)工作稀释液温育5分钟，并通过荧光计(λex＝300nm，λem＝537nm)(SynergyMx,BioTek)测量荧光。用相同量的裸mRNA、水和SG制备对照样品。对于肝素置换，使用不同浓度的肝素盐(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)溶液代替水，并在加入SG稀释液之前将复合物在37℃下温育30分钟。通过凝胶电泳也证实了复合物的形成。
流式细胞术：简言之，将1×105个MDA-MB-231细胞接种到含有500μlDMEM和10％血清的24孔板中。用包括H3K(+H)4b和H3K4b的HK多肽的转染与上述用花青5标记的mRNA(Trilink Biotechnologies,Inc.，CleanCap Cyanine 5Fluc mRNA)进行的转染相似。在转染后30分钟、1小时、2小时和4小时的时间，消化细胞并用10％血清中和。还收集了没有转染的对照样品。以1000rpm离心1分钟后，将细胞用250μl PBS重悬。为了分析，设置了典型的前向散射门和侧向散射门以排除死细胞和聚集体。使用Beckman Coulter Cytoflex(BeckmanCoulter,CA,USA)收集每个样品中的事件。对照样品的百分比定义为0％。其他样品的值是相对值并记录为多聚复合物摄取百分比。
结果证实H3K4b和H3K(+H)4b在体外作为mRNA载体都是有效的。与其接近的H3K4b类似物相比，H3K(+H)4b作为mRNA载体表现明显更好(图8)。阻滞测定显示了在mRNA和多肽的不同重量比下多肽的作用。结果表明游离mRNA的电泳迁移率被HK多肽阻滞。在H3K(+H)4b和H3K4b为1:2比例和1:4比例的情况下，mRNA被完全捕获在孔中，这表明H3K(+H)4b比H3K4b更紧密地结合mRNA(图9)。在支链的第二HHHK(SEQ ID NO:82)基序中具有额外组氨酸的所有HK肽都是mRNA的有效载体(图9)。在这些肽中，H3k(+H)被确定为mRNA的最佳载体(H3k(+H)4b相对于H3K(+H)4b，P＜0.05)。
实施例6：MC3或DOTAP与HK载体在mRNA递送中的协同活性
H3K(+H)4b和MC3/DOTAP脂质体的组合在运载mRNA进入MDA-MB-231细胞的能力方面具有协同作用(H3K(+H)4b/脂质体相对于脂质体，P＜0.0001)。该组合作为mRNA载体的有效性分别是单独的聚合物和脂质体载体的约3倍和8倍。值得注意的是，并非所有HK肽都表现出与MC3/DOTAP脂质体的协同活性。H3K4b和MC3/DOTAP载体的组合作为荧光素酶mRNA的载体的有效性比DOTAP脂质体低。除了DOTAP和MC3，可与HK肽一起使用的其他阳离子脂质体包括Lipofectin(Invitrogen)、Lipofectamine(Invitrogen)和DOSPER(图11)。
H3k(+H)4b的D-异构体(其中支链中的L-赖氨酸被D-赖氨酸取代)是最有效的聚合物载体(H3k(+H)4b相对于H3K(+H)4b，P＜0.05)。mRNA的D-异构体/脂质体载体的有效性分别是单独的H3k(+H)4b和脂质体载体的近4倍和10倍。尽管D-H3K(+H)k4b/脂质体组合比L-H3K(+H)4b/脂质体的有效性略高，但该比较在统计学上没有差异(图12)。
实施例7：精胺-脂质体缀合物/mRNA纳米颗粒制剂
还开发了精胺-脂质体缀合物(SLiC)递送***(图13)。首先尝试了常规方法诸如薄膜法、溶剂注射等来制备具有新合成的SLiC分子的脂质体，但没有获得很大的成功。如本文所述，溶解在乙醇中的脂质处于所谓的亚稳态，其中脂质体不是非常稳定并且易于聚集。然后使用修饰的Norbert Maurer方法制备未上样或预先形成的脂质体。发现通过简单地将乙醇稀释至12.5％(v/v)的最终浓度，可制备稳定的脂质体溶液。通过将溶解在乙醇中的脂质(阳离子SLiC/胆固醇，50:50，mol％)加入到无菌dd-H2O中制备脂质体。在快速混合下缓慢加入乙醇脂质溶液。
缓慢加入乙醇并快速混合被证明能成功制备SLiC脂质体，因为该方法允许形成小的和更均匀的脂质体。与在脂质体配制过程中上样mRNA且在制备结束时除去乙醇或其他溶剂的常规方法不同，这些SLiC脂质体与仍留在溶液中的乙醇一起配制，使得脂质体被认为仍处于亚稳态。当mRNA溶液与脂质体溶液阳离子基团混合/上样时，脂质与阴离子mRNA相互作用并凝结形成核心。SLiC脂质体的亚稳态有助于或促进脂质体结构转化，以更有效地截留mRNA。由于mRNA的截留，SLiC脂质体变得更紧凑和均匀。
实施例8：用于体内递送mRNA的纳米颗粒的开发和表征
开发基于mRNA的疫苗包括将mRNA成功递送到细胞中。作为疫苗递送方法的示例，收集并定量了用基于线性化质粒的构建体在体外表达的mRNA，该构建体具有5’UTR和3’UTR，包括poly-A尾。在一个示例中，mRNA、HKP+H聚合物和MC3混合物以1:2:4的重量比制备。在另一个示例中，mRNA、HKP+H聚合物和PLA混合物以1:2:4的重量比制备。在又一个示例中，使用摩尔比为50:10:38.5:1.5的MC3、DSPC、CHOL和DSPE-PEG2000的混合物制备脂质纳米颗粒。然后将LNP与mRNA以4:1的重量比混合。在注射到动物体内之前，测试所有制剂的粒度、mRNA包封和内毒素。将单一剂量的50μl-200μl溶液注射到小鼠中。递送方法包括瘤内注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和皮下注射。在一个具体示例中，用不同的HK肽配制表达ras新抗原表位的mRNA构建体，并将其注射入小鼠(30μg/剂量)，通过ELISA评估RAS抗体滴度(图15)。
SEQ ID NO:70的pan-RAS抗原含有所有已识别的RAS氨基酸改变。可通过将递送纳米颗粒添加到全长突变的ras mRNA而直接包装全长突变的ras mRNA，而不需要如上所述的接头或小基因的构建。
实施例9：设计靶向kras突变的mRNA
如本文所述，疫苗包含合成mRNA，或基本上由其组成，或还进一步由其组成，该合成mRNA含有几种编码蛋白质的开放阅读框(ORF)的全部或部分。特别是ras新抗原，其还包含SARS-Cov2信号序列。
实施例10：癌症疫苗：pan-ras新抗原
KRAS突变(EGFR蛋白的下游)导致RAS-RAF-ERK途径的组成型激活，并且假设会导致抗EGFR疗法的耐药性。大多数突变是在三个突变热点之一处：G12、G13和Q61(COSMICv92)。突变也位于其他密码子处，诸如19、117和146已显示具有与热点突变相似的表型，热点突变诸如表3或cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis？ln＝KRAS(最后一次访问日期为2021年9月21日)中公开的那些突变。在一些实施方案中，所选突变包含在突变点处具有最高频率的那些突变，或基本上由其组成，或还进一步由其组成。
表3.在选定氨基酸处KRAS突变的频率。
如图16所示，615bp ras基因编码204aa的RAS蛋白，其包含覆盖所有突变热点的8个突变。使用了来自SARS-COV-2的刺突蛋白的信号序列。设计的RNA从两个供应商Trillink和Codex处订购。
RAS表达用蛋白质印迹分析来证实。如图17所示，从Trilink提供的RNA中检测到强得多的RAS条带，而Codex RNA显示为有功能的但表达水平低得多。上样对照显示相似的蛋白质含量。此外，背景噪声信号非常低。
使用LNP或HKP(H)制剂进一步评价体外RAS表达。代表性的结果如图18和图19所示。在用HKP(H)配制的ras mRNA或LNP配制的ras mRNA转染后观察到RAS蛋白的显著表达。
实施例11：动物研究：小鼠体内研究—治疗方法
如图20所示，用ras mRNA疫苗对Balb/c小鼠进行肌内(i.m.)免疫，该ras mRNA疫苗用各种纳米颗粒配制，诸如LNP(1:3)、HKP(H)/MC3(4:1:1)或HKP/DOTAP(4:1:1)。每组测试2只小鼠。在第一次增强免疫前的第28天和第一次增强免疫后的第14天(即，第42天)收集血清。对第28天和第42天收集的血清进行ELISA以检测诱导的抗RAS抗体以及鉴定抗体的IgG同种型。处死小鼠，取出脾脏，然后提取RNA用于qRT-PCR，以测量Th1和Th2相关基因和其他基因的基因表达。
在收集的血清中检测抗RAS抗体所获得的ELISA结果示于图21中。这表明增强免疫后，在小鼠血清中容易检测到抗RAS抗体。
Th1细胞因子促进抗肿瘤细胞介导的免疫应答的发展。因此，对于理想的KRAS癌症疫苗，Th1应答是关键的。参见，例如Lin等人，(2017年)International Journal of Headand Neck Science，第1卷，第2期，2017年6月1日，第105-113页。幼稚T细胞在不同因子刺激后变成Th1细胞或Th2细胞。在Th1免疫中，细胞产生促炎细胞因子，诸如白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)。在Th2免疫中，细胞产生抗炎细胞因子，诸如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。在正常情况下，Th1免疫和Th2免疫接***衡。但是，肿瘤细胞的存在破坏了这种平衡。由于适应性免疫的下调，这种情况增加了Th2免疫并降低了Th1免疫。这最终导致了肿瘤进展。然而，如果Th1免疫占优势，则这种免疫刺激可导致肿瘤消退。
IgG同种型可预测动物模型中参与启动免疫应答的T辅助细胞表型：IgG2a和IgG2b与Th1应答相关；IgG1与Th2应答相关；IgG3通常在应答早期出现。因此，评价了在小鼠中诱导的抗RAS抗体的IgG同种型，并且结果示于图22中。用Ras疫苗免疫的小鼠中主要IgG同种型显示为IgG2b。
此外，评价Th1和Th2相关基因的基因表达。简言之，从脾脏分离出RNA。使用qRT-PCR和NGS评价Th1相关基因诸如Tbet(Tbx21)、IFN-γ、IL-2和TNF，以及Th2相关基因诸如GATA3、IL-4和IL-10。RT-PCR结果示于图23中。没有使用实际的阴性对照，而提供小鼠#5作为相对对照。
还使用下一代测序(NGS)评价所获得的RNA的转录组学分析。简言之，从6只小鼠的脾脏分离出RNA，并使用NGS分析。质量控制后，使用来自小鼠#1、#2、#3和#5的RNA进行NGS。这种小鼠编号也用于图21至图23中的编号相关联。另外，基于ELISA结果，#5小鼠用作相对阴性对照。
然后，本文公开了NGS分析结果。简言之，差异表达的基因在图24中绘制，而前20个KEGG途径(包括Th1和Th2细胞分化途径)在图25中识别。此外，在图26B中，将参与Th1和Th2细胞分化途径的六种基因(即，Notch 1、Notch 3、Lat、Lck、Plcg1和Zap70)的表达水平绘制为FKPM计数。还使用NGS分析了如图23所示使用qRT-PCR研究的Th1和Th2相关基因，并且结果绘制在图28中。结果表明：当与小鼠#5相比时，在两只小鼠中Th1的主转录因子Tbx21略有增加，而在三只小鼠中Th2的主转录因子GATA3略有减少；Th1相关基因IL-2和TNF增加；并且观察到Th2相关基因IL4和IL10没有变化或略有增加，这与qRT-PCR结果一致，如图23所示。这表明所测试的配制的mRNA刺激抗癌Th1免疫应答。
另外评价了参与抗原加工和呈递途径的四种基因的表达水平，包括Rfx1、Rfx5、Gm89096和H2-Q7。
已经鉴定了CD8+T细胞活化的几种标志物，诸如LFA-1和CTLA-4。参见，例如，Slifka MK和Whitton JL.J Immunol.2000年1月1日，第164卷第1期：第208-216页，其以引用方式全文并入本文。因此，也评价了活化的CD8+细胞的这两种表型标志物，并且结果示于图29中。观察到表达增加，表明CD8+细胞的活化通过所测试的配制的mRNA得到改善。
还在体内测试了配制的mRNA的抗肿瘤作用。简言之，Balb/c小鼠在第0天用每只小鼠100μl本文所述制备的配制的mRNA免疫，并且在第10天用每只小鼠另外100μl的配制的mRNA免疫。通过皮下注射将CT26细胞接种到后腿。在第14天使动物安乐死。
每天测量肿瘤大小，并且结果绘制在图30A中。处死小鼠后，解剖肿瘤块并称重，并且结果绘制在图30B中。在用配制的mRNA处理的小鼠中观察到更小和更轻的肿瘤，表明这种配制的mRNA可用作有前途的抗癌药物。
实施例12：预防性方法
制备配制的mRNA并在体内进行剂量滴定测试，如表4所示。RL003表示使用MC3配制mRNA，而RL007表示使用SM102配制mRNA。MC3制剂用作阴性对照，而SM102配制的ras mRNA被认为是阳性对照。
表4.动物队列和主要实验程序。
如图31所示，在第0天和第14天，用本文所公开的RAS疫苗或对照免疫6-7周龄的小鼠。每组测试5只小鼠，研究了表4所示的总共5组。在第21天收集血液以测量抗RAS抗体的产量。在第28天，用2×105个CT26细胞肌内(i.m.)攻击小鼠。监测肿瘤生长并生成存活曲线。在本文所述研究结束时，评估T细胞介导的免疫应答并进行转录组学分析。在第一次疫苗注射后检测血清中的抗RAS抗体的ELISA结果示于图32中。观察到剂量依赖性效应。
等效物
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
在缺少本文未具体公开的任一个或多个要素、任一个或多个限制的情况下，可以适当地实施本文示例性描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广义地而非限制性地理解。另外，本文所采用的术语和表达已作为描述性术语而非限制性术语使用，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但应认识到，在所要求保护的本技术的范围内，各种修改是可能的。
因此，应当理解，本文提供的材料、方法和实施例是优选方面的代表，仅为示例性，并不旨在作为对本技术的范围进行限制。
应当理解，尽管本发明已经通过某些方面、实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可对这些方面、实施方案和可选特征进行修改、改进和更改，并且这些修改、改进和更改被认为在本公开的范围内。
本技术在此已被广泛地和一般地描述。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚属组也构成本技术的一部分。这包括本技术的一般描述，带有从属中删除任何主题的附带条件或否定限制，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。
此外，在根据马库什组描述本技术的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本技术也因此根据马库什组的任何单独成员或成员子组来描述。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均明确地通过引用方式整体并入，其程度如同每一者均单独以引用方式并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
其他方面在以下权利要求中阐述。

Claims (75)

1.一种分离的核糖核酸(RNA)，所述分离的核糖核酸包含编码ras衍生肽的开放阅读框(ORF)，其中所编码的ras衍生肽包含以下突变中的任何一个或多个突变：
与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的苯丙氨酸(F)；
与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的苏氨酸(T)；
与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的天冬氨酸(D)；
与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的天冬酰胺(N)；或者
与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T，
并且其中所述RNA被包封在纳米颗粒中。
2.根据权利要求1所述的分离的RNA，其中所编码的ras衍生肽还包含以下突变中的任何一个或多个突变：
与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D，
与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D；或者
与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的组氨酸(H)。
3.根据权利要求2所述的分离的RNA，其中所编码的ras衍生肽包含以下突变：
与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D，
与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D；
与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的F；
与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的T；
与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的D；
与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H；
与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N；或者
与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T。
4.根据权利要求3所述的RNA，其中所述ras衍生肽包含SEQ ID NO:70所示的多肽，或其保留以下突变的等效物：
与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D，
与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D；
与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的F；
与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的T；
与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的D；
与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H；
与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N；或者
与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T。
5.一种核糖核酸(RNA)，所述核糖核酸包含编码一种或多种ras衍生肽的开放阅读框(ORF)，其中所述一种或多种ras衍生肽中的每一种由23至29个氨基酸残基组成，并且其中所编码的肽选自SEQ ID NO:1-69所示的组或它们中每一者的等效物。
6.根据权利要求5所述的RNA，其中所述ras衍生肽选自SEQ ID NO:1-31所示的组或它们中每一者的等效物。
7.根据权利要求5所述的RNA，其中所述ras衍生肽选自SEQ ID NO:32-52所示的组或它们中每一者的等效物。
8.根据权利要求5所述的RNA，其中所述ras衍生肽选自SEQ ID NO:53-69所示的组或它们中每一者的等效物。
9.根据权利要求5所述的RNA，其中所述ras衍生肽选自SEQ ID NO:19-31、50-52或69所示的组。
10.根据权利要求9所述的RNA，其中所述ORF编码SEQ ID NO:70所示的多肽，或其保留以下突变的等效物：
与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的D，
与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的D；
与SEQ ID NO:70的第19位氨基酸残基对齐的F；
与SEQ ID NO:70的第59位氨基酸残基对齐的T；
与SEQ ID NO:70的第60位氨基酸残基对齐的D；
与SEQ ID NO:70的第61位氨基酸残基对齐的H；
与SEQ ID NO:70的第117位氨基酸残基对齐的N；或者
与SEQ ID NO:70的第146位氨基酸残基对齐的T。
11.根据权利要求4或10所述的RNA，其中所述ORF包含AUGUUUGUUUUUCUUGUUUUAUUGCCACUAGUCUCUAGUCAGUGUAUGACUGAAUAUAAACUUGUGGUAGUUGGAGCUGAUGACGUAGGCAAGAGUGCCUUUACGAUACAGCUAAUUCAGAAUCAUUUUGUGGACGAAUAUGAUCCAACAAUAGAGGAUUCCUACAGGAAGCAAGUAGUAAUUGAUGGAGAAACCUGUCUCUUGGAUAUUCUCGACACAACAGAUCACGAGGAGUACAGUGCAAUGAGGGACCAGUACAUGAGGACUGGGGAGGGCUUUCUUUGUGUAUUUGCCAUAAAUAAUACUAAAUCAUUUGAAGAUAUUCACCAUUAUAGAGAACAAAUUAAAAGAGUUAAGGACUCUGAAGAUGUACCUAUGGUCCUAGUAGGAAAUAAUUGUGAUUUGCCUUCUAGAACAGUAGACACAAAACAGGCUCAGGACUUAGCAAGAAGUUAUGGAAUUCCUUUUAUUGAAACAUCAACAAAGACAAGACAGAGAGUGGAGGAUGCUUUUUAUACAUUGGUGAGAGAGAUCCGACAAUACAGAUUGAAAAAAAUCAGCAAAGAAGAAAAGACUCCUGGCUGUGUGAAAAUUAAAAAAUGCAUUAUAAUGUAA(SEQ ID NO:88)所示的多核苷酸、或SEQ ID NO:88的核苷酸(nt)1至nt 612、或编码相同ras衍生肽的其等效物。
12.根据权利要求5至9中任一项所述的RNA，其中所述ORF编码多肽，所述多肽包含两种或更多种ras衍生肽和在任何两种相邻ras衍生肽之间的肽接头。
13.根据权利要求1、2或5至9中任一项所述的RNA，其中所编码的一种或多种ras衍生肽包含与SEQ ID NO:70的第12位氨基酸残基对齐的野生型残基，或与SEQ ID NO:70的第13位氨基酸残基对齐的野生型残基，或两者。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的RNA，其中所述ORF进一步编码信号肽，任选地其中所述单个肽包含MFVFLVLLPLVSSQC(SEQ ID NO:87)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的RNA，所述RNA还包含3'-UTR和5'-UTR。
16.根据权利要求15所述的RNA，其中所述5'-UTR包含m7G帽子结构和起始密码子，任选地其中所述5'-UTR包含AGGacaUUUgcUUcUgacacaacUgUgUUcacUagcaaccUcaaacagacaCCGCCACC
(SEQ ID NO:89)或其等效物。
17.根据权利要求15或16所述的RNA，其中所述3'-UTR包含终止密码子和polyA尾，任选地其中所述3'-UTR包含GCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCCAAUAGGCCGAAAUCGGCAAGCGCGAUCGC(SEQ ID NO:90)或其等效物。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的RNA，所述RNA通过在体外转录(IVT)***中转录编码所述RNA的多核苷酸来制备。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的RNA，所述RNA通过转录编码所述RNA的质粒DNA(pDNA)载体来制备，所述载体任选地是pUC57质粒，任选地其中所述质粒包含SEQ ID NO:91或其等效物。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的RNA，其中全长RNA的GC含量为总RNA含量的约35％至约70％。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的RNA，其中所述RNA是经化学修饰的，任选地其中所述化学修饰包括掺入N1-甲基-假尿苷残基或掺入假尿苷残基中的一者或两者，进一步任选地其中所述RNA中至少约50％至约100％的尿苷残基是N1-甲基假尿苷或假尿苷。
22.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至21中任一项所述的RNA，或与所述多核苷酸互补的多核苷酸，或两者。
23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：脱氧核糖核酸(DNA)、RNA、DNA和RNA的杂交体或它们中的每一者的类似物。
24.一种载体，所述载体包含根据权利要求22或23所述的多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的载体，所述载体还包含与所述多核苷酸可操作地连接以指导其转录的调控序列。
26.根据权利要求25所述的载体，其中所述调控序列包含启动子。
27.根据权利要求26所述的载体，其中所述启动子包括：噬菌体RNA聚合酶启动子，任选地T7启动子、或SP6启动子或T3启动子。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的载体，所述载体还包含选自可检测标志物、纯化标志物或选择标志物的标志物。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的载体，其中所述载体是非病毒载体，任选地质粒、或脂质体或胶束。
30.根据权利要求29所述的载体，其中所述质粒包含SEQ ID NO:91或其等效物，或由其组成。
31.根据权利要求24至28中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体，任选地腺病毒载体、或腺相关病毒载体、或逆转录病毒载体、或慢病毒载体或植物病毒载体。
32.一种细胞，所述细胞包含以下项中的一者或多者：根据权利要求1至21中任一项所述的RNA、根据权利要求22或23所述的多核苷酸或根据权利要求24至31中任一项所述的载体。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞，任选地大肠杆菌细胞。
34.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞，任选地哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。
35.一种组合物，所述组合物包含：载体，任选地药学上可接受的载体，和以下项中的一者或多者：根据权利要求1至21中任一项所述的RNA、根据权利要求22或23所述的多核苷酸、根据权利要求24至31中任一项所述的载体或根据权利要求32或34中任一项所述的细胞。
36.一种产生RNA的方法，所述方法包括在适用于将编码所述RNA的DNA转录成所述RNA的条件下培养根据权利要求32至34中任一项所述的细胞。
37.一种产生RNA的方法，所述方法包括在适用于将根据权利要求22或23所述的多核苷酸或根据权利要求24至31中任一项所述的载体转录成所述RNA的条件下，使所述多核苷酸或所述载体与RNA聚合酶、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、鸟苷-5'-三磷酸(GTP)和三磷酸尿苷(UTP)或经化学修饰的UTP接触。
38.根据权利要求36或37所述的方法，所述方法还包括分离所述RNA。
39.一种通过根据权利要求36至38中任一项所述的方法产生的RNA。
40.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含配制在药学上可接受的载体中的有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的RNA。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括聚合物纳米颗粒或脂质体纳米颗粒或两者。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述聚合物纳米颗粒载体包括组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述HKP包括H3K(+H)4b或H3k(+H)4b或两者。
44.根据权利要求42或43所述的组合物，其中所述聚合物纳米颗粒载体还包含脂质，任选地阳离子脂质。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述阳离子脂质是可电离的。
46.根据权利要求44或45所述的组合物，其中所述阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA(MC3)或二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)或两者。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的组合物，其中所述脂质还包括以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的组合物，其中所述脂质还包括PLA或PLGA。
49.根据权利要求42至48中任一项所述的组合物，其中所述HKP和mRNA在混合时自组装成纳米颗粒。
50.根据权利要求41至49中任一项所述的组合物，其中所述脂质体纳米颗粒载体包括精胺-脂质胆固醇(SLiC)。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述SLiC选自TM1-TM5。
52.根据权利要求40所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体是脂质纳米颗粒(LNP)。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述LNP包含脂质，任选地阳离子脂质，任选地其中所述阳离子脂质是可电离的，并且任选地其中所述LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质。
55.根据权利要求47或54所述的组合物，其中所述辅助脂质包括以下项中的一者或多者：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、(2R)-3-(十六烷酰氧基)-2-{[(9Z)-十八-9-烯酰基]氧基}丙基2-(三甲基氮杂铵)乙基磷酸酯(POPC)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
56.根据权利要求47、54或55中任一项所述的组合物，其中所述胆固醇包括植物胆固醇或动物胆固醇或两者。
57.根据权利要求47或54至56中任一项所述的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质包括以下项中的一者或多者：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)、任选地PEG2000-DMG((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的组合物，其中所述LNP包含SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG200-DMG的质量比为约1:1:1:1，并且/或者其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG的摩尔比为约50:10:38.5:1.5。
60.一种产生根据权利要求40至51或55至57中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1至21中任一项所述的RNA与HKP接触，从而使所述RNA和所述HKP自组装成纳米颗粒。
61.根据权利要求60所述的方法，其中在所述接触步骤中所述HKP和所述RNA的质量比为约10:1至约1:10，任选地2.5:1。
62.根据权利要求60或61所述的方法，所述方法还包括使所述HKP和所述RNA与阳离子脂质接触，任选地其中所述阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA(MC3)或DOTAP(二油酰氧基-3-(三甲铵基)丙烷)或两者。
63.根据权利要求62所述的方法，其中在所述接触步骤中所述阳离子脂质和所述RNA的质量比为约10:1至约1:10，任选地1:1。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中在所述接触步骤中所述HKP、所述mRNA和所述阳离子脂质的质量比为约4:1:1。
65.一种产生根据权利要求40或52至59中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1至21中任一项所述的RNA与脂质接触，从而使所述RNA和所述脂质自组装成脂质纳米颗粒(LNP)。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述LNP包含以下项中的一者或多者：8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基}9-十七烷基辛酸酯(SM-102)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)或它们中每一者的等效物。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述LNP还包含以下项中的一者或多者：辅助脂质、胆固醇或聚乙二醇化脂质，任选地其中所述辅助脂质包括以下项中的一者或多者：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、(2R)-3-(十六烷酰氧基)-2-{[(9Z)-十八-9-烯酰基]氧基}丙基2-(三甲基氮杂铵)乙基磷酸酯(POPC)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，任选地其中所述胆固醇包括植物胆固醇或动物胆固醇或两者，并且任选地其中所述聚乙二醇化脂质包括以下项中的一者或多者：PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-DSG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)、任选地PEG2000-DMG((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)]或PEG-DPG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇)。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述LNP包含SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG，任选地其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG200-DMG的质量比为约1:1:1:1，或者任选地其中所述SM-102、DSPC、胆固醇和PEG2000-DMG的摩尔比为约50:10:38.5:1.5。
69.根据权利要求60至68中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在微流体混合器中进行，所述微流体混合器任选地选自狭缝叉指型(slitinterdigital)微混合器或交错鱼骨型(staggered herringbone)微混合器(SHM)。
70.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学上有效量的以下项中的任一者或多者：根据权利要求1至21和39中任一项所述的RNA、根据权利要求22或23所述的多核苷酸、根据权利要求24至31中任一项所述的载体、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35或40至59中任一项所述的组合物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述施用是瘤内施用、或静脉内施用、或肌内施用、或皮内施用或皮下施用。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物或人。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中所述癌症包含以下项中的任一者或多者：SEQ ID NO:1至69的突变。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用另外的抗癌疗法。
75.一种用于根据权利要求70至74中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含使用说明书和以下项中的一者或多者：根据权利要求1至21和39中任一项所述的RNA、根据权利要求22或23所述的多核苷酸、根据权利要求24至31中任一项所述的载体、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞、根据权利要求35或40至59中任一项所述的组合物或抗癌疗法。
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