CN118147035A - 重组微生物及其在制备l-赖氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组微生物及其在制备L‑赖氨酸中的应用。本发明提供了重组微生物：将Ncgl1531基因或Ncgl1531基因相关生物材料导入宿主微生物，得到的重组微生物；将突变体基因或突变体基因相关生物材料导入宿主微生物，得到的重组微生物；将宿主微生物基因组中的Ncgl1531基因替换为突变体基因，得到的重组微生物。本发明还提供了Ncgl1531蛋白或突变体蛋白在正调控微生物生产L‑赖氨酸中的应用。发明人发现，Ncg11531基因突变后有利于提高L‑赖氨酸产量，在微生物中提高Ncg11531基因的表达活性(点突变或者过表达)则有利于L‑赖氨酸的积累。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及重组微生物及其在制备L-赖氨酸中的应用。
背景技术
L-赖氨酸(CAS号为56-87-1)广泛应用于各个领域，其在全球的需求量每年递增，因此正在进行多种研究以开发出用于生产L-赖氨酸的高效微生物菌株和发酵工艺技术。例如，在微生物菌株中过表达参与L-赖氨酸合成的关键基因，使其活性增加；或在微生物菌株中删除不需要表达的基因(副产物或影响细胞生长的毒素等)。但是，随着对L-赖氨酸的需求逐年增加，仍然需要进行研究以有效增加L-赖氨酸生产能力。
赖氨酸(Lysine)，化学名称为2,6-二氨基己酸。赖氨酸为碱性必需氨基酸，机体不能自身合成，必须从食物中补充。赖氨酸主要存在于动物性食物和豆类中，谷类食物中赖氨酸含量很低,在加工过程中易被破坏而缺乏,故称为第一限制性氨基酸。
赖氨酸在促进人体生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化、缓解焦虑情绪等方面都具有积极的营养学意义，同时也能促进某些营养素的吸收，能与一些营养素协同作用，更好的发挥各种营养素的生理功能。赖氨酸可以调节人体代谢平衡，赖氨酸为合成肉碱提供结构组分，而肉碱会促使细胞中脂肪酸的合成。向食物中添加少量的赖氨酸，可以刺激胃蛋白酶与胃酸的分泌，提高胃液分泌功效，起到增进食欲促进幼儿生长与发育的作用。赖氨酸还能提高钙的吸收及其在体内的积累，加速骨骼生长。如缺乏赖氨酸，会造成胃液分泌不足而出现厌食、营养性贫血，致使中枢神经受阻、发育不良。赖氨酸在医药上还可作为利尿剂的辅助药物，治疗因血中氯化物减少而引起的铅中毒现象，还可与酸性药物(如水杨酸等)生成盐来减轻不良反应，与蛋氨酸合用则可抑制重症高血压病，还有研究表明，补充赖氨酸能加速疱疹感染的康复并抑制其复发。
发明内容
本发明的目的是提供重组微生物及其在制备L-赖氨酸中的应用。
本发明提供了重组微生物，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)将Ncgl1531基因或Ncgl1531基因相关生物材料导入宿主微生物，得到的重组微生物；
(a2)将突变体基因或突变体基因相关生物材料导入宿主微生物，得到的重组微生物；
(a3)将宿主微生物基因组中的Ncgl1531基因替换为突变体基因，得到的重组微生物。
本发明还提供了所述重组微生物在制备L-赖氨酸中的应用。
本发明还提供了Ncgl1531蛋白或突变体蛋白在正调控微生物生产L-赖氨酸中的应用。
本发明还提供了Ncgl1531基因或突变体基因在正调控微生物生产L-赖氨酸中的应用。
本发明还提供了Ncgl1531基因或Ncgl1531基因相关生物材料或突变体基因或突变体基因相关生物材料在制备用于提高微生物生产L-赖氨酸的能力的产品中的应用。
具体的，所述Ncgl1531蛋白包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
示例性的，所述Ncgl1531蛋白如SEQ ID NO:2所示。
示例性的，所述Ncgl1531蛋白由SEQ ID NO:2所示蛋白和标签蛋白组成。
所述Ncgl1531基因为编码Ncgl1531蛋白的基因。
具体的，所述Ncgl1531基因包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
示例性的，所述Ncgl1531基因如SEQ ID NO:1所示。
示例性的，所述Ncgl1531基因由SEQ ID NO:1所示区段和编码标签蛋白的区段组成。
所述Ncgl1531基因相关生物材料为具有所述Ncgl1531基因的表达盒或重组载体。
示例性的，具有所述Ncgl1531基因的重组载体为将所述Ncgl1531基因***表达载体得到的重组表达载体。
示例性的，所述表达载体为pK18mobsacB质粒或pXMJ19质粒。
示例性的，所述重组表达载体可为重组质粒pK18-Ncgl1531OE或重组质粒pXMJ19-Ncgl1531。
与pK18mobsacB质粒相比，重组质粒pK18-Ncgl1531OE的差异仅在于用特异DNA分子(自上游至下游依次由SEQ ID NO:7所示双链DNA分子、SEQ ID NO:5中第542-1581位所示双链DNA分子、SEQ ID NO:8所示双链DNA分子组成)取代了pK18mobsacB质粒中的“AGGATCCCC”。
与pXMJ19质粒相比，重组质粒pXMJ19-Ncgl1531的差异仅在于用SEQ ID NO:5中第542-1581位所示双链DNA分子取代了pXMJ19质粒中的“tctagaggatccccg”。
所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白进行一个或几个氨基酸残基的突变得到的。
具体的，所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基由谷氨酸突变为其他氨基酸得到的。
具体的，所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基由谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)得到的。
具体的，所述突变体蛋白包含如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
示例性的，所述突变体蛋白如SEQ ID NO:4所示。
示例性的，所述突变体蛋白由SEQ ID NO:4所示蛋白和标签蛋白组成。
所述突变体基因为编码突变体蛋白的基因。
具体的，所述突变体基因是将所述Ncgl1531基因进行一个或几个核苷酸突变得到的。
具体的，所述突变体基因是将所述Ncgl1531基因进行一个或几个密码子突变得到的。
具体的，所述突变体基因是将所述Ncgl1531基因中编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基的密码子由编码谷氨酸的密码子突变为编码其他氨基酸的密码子得到的。
具体的，所述突变体基因是将所述Ncgl1531基因中编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基的密码子由编码谷氨酸的密码子突变为编码赖氨酸的密码子得到的。
具体的，所述突变体基因包含如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列。
示例性的，所述突变体基因如SEQ ID NO:3所示。
示例性的，所述突变体基因由SEQ ID NO:3所示区段和编码标签蛋白的区段组成。
所述突变体基因相关生物材料为具有所述突变体基因的表达盒或重组载体。
示例性的，具有所述突变体基因的重组载体为将所述突变体基因***表达载体得到的重组表达载体。
示例性的，所述表达载体为pK18mobsacB质粒或pXMJ19质粒。
示例性的，所述重组表达载体可为重组质粒pK18-Ncgl1531E35K、重组质粒pK18-Ncgl1531E35KOE或重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K。
与pK18mobsacB质粒相比，重组质粒pK18-Ncgl1531E35K的差异仅在于用SEQ IDNO:6所示双链DNA分子取代了pK18mobsacB质粒中的“AGGATCCCC”。
与pK18mobsacB质粒相比，重组质粒pK18-Ncgl1531E35KOE的差异仅在于用特异DNA分子(自上游至下游依次由SEQ ID NO:7所示双链DNA分子、SEQ ID NO:9所示双链DNA分子、SEQ ID NO:8所示双链DNA分子组成)取代了pK18mobsacB质粒中的“AGGATCCCC”。
与pXMJ19质粒相比，重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K的差异仅在于用SEQ ID NO:9所示双链DNA分子取代了pXMJ19质粒中的“tctagaggatccccg”。
示例性的，所述重组微生物具体可为重组菌Y-Ncgl1531-1、重组菌Y-Ncgl1531-2、重组菌Y-Ncgl1531-3、重组菌Y-Ncgl1531-4、重组菌Y-Ncgl1531-5、重组菌L-Ncgl1531-1、重组菌L-Ncgl1531-2、重组菌L-Ncgl1531-3、重组菌L-Ncgl1531-4或重组菌L-Ncgl1531-5。
与谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组DNA相比，重组菌L-Ncgl1531-1的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区取代了SEQ ID NO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区。
与谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组DNA相比，重组菌L-Ncgl1531-3的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:9所示双链DNA分子取代了基因组DNA中SEQ ID NO:7所示上游同源臂和SEQ ID NO:8所示下游同源臂中间的区段。重组菌L-Ncgl1531-3的基因组DNA中，具有1个拷贝的野生型Ncgl1531基因和1个拷贝的Ncgl1531E35K基因。
与重组菌L-Ncgl1531-3的基因组DNA相比，重组菌L-Ncgl1531-2的基因组DNA的差异仅在于：整合至基因组DNA的外源片段中，用SEQ ID NO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区取代了SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区。重组菌L-Ncgl1531-2的基因组DNA中，具有两个拷贝的野生型Ncgl1531基因。
重组菌L-Ncgl1531-4：将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531导入谷氨酸棒杆菌YP097158，得到重组菌L-Ncgl1531-4。
重组菌L-Ncgl1531-5：将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K导入谷氨酸棒杆菌YP097158，得到重组菌L-Ncgl1531-5。
与谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA相比，重组菌Y-Ncgl1531-1的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区取代了SEQ ID NO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区。
与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA相比，重组菌Y-Ncgl1531-3的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:9所示双链DNA分子取代了基因组DNA中SEQ ID NO:7所示上游同源臂和SEQ ID NO:8所示下游同源臂中间的区段。重组菌Y-Ncgl1531-3的基因组DNA中，具有1个拷贝的野生型Ncgl1531基因和1个拷贝的Ncgl1531E35K基因。
与重组菌Y-Ncgl1531-3的基因组DNA相比，重组菌Y-Ncgl1531-2的基因组DNA的差异仅在于：整合至基因组DNA的外源片段中，用SEQ ID NO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区取代了SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区。重组菌Y-Ncgl1531-2的基因组DNA中，具有两个拷贝的野生型Ncgl1531基因。
重组菌Y-Ncgl1531-4：将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌Y-Ncgl1531-4。
重组菌Y-Ncgl1531-5：将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌Y-Ncgl1531-5。
应用所述重组微生物制备L-赖氨酸的方法包括如下步骤：发酵所述重组微生物。
本领域技术人员可以采用现有技术中的发酵方法进行发酵。也可通过常规试验进行发酵方法的优化和改进。可以在本领域中已知的发酵条件下在合适的培养基中进行细菌的发酵。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。
所述方法还可包括如下步骤：从培养物中获得赖氨酸。从培养物中获得赖氨酸可通过各种方式实现，包括但不限于：用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
所述发酵中，示例性的发酵培养基的配方见表3，余量为水。
所述发酵中，示例性的发酵控制工艺见表4。
示例性的，所述发酵中，完成接种的初始时刻，体系OD600nm值可为0.3-0.5。
具体的，以上任一所述微生物可为细菌。
以上任一所述细菌包括但不限于如下：棒杆菌属细菌，优选嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)。
以上任一所述细菌为具有生产赖氨酸的能力的细菌。
“具有生产赖氨酸的能力的细菌”是指细菌具有以下能力：在培养基和/或细菌的细胞中产生并累积赖氨酸的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集赖氨酸。
所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。
“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述谷氨酸棒杆菌可为谷氨酸棒杆菌ATCC13032或谷氨酸棒杆菌YP097158。
以上任一所述赖氨酸的含义为广义的赖氨酸，包括游离形式赖氨酸、赖氨酸的盐或两者的混合物。
具体的，所述赖氨酸为L-赖氨酸。
以上任何方法或应用还可用于赖氨酸的下游产品的制备。
所述L-赖氨酸可替换为其他产物。
所述重组微生物可替换为重组生物细胞。
即，所述重组生物细胞可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的赖氨酸。所生产的产物还可为谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸和瓜氨酸等。
Ncg11531基因编码膜蛋白(membrane protein)，是细胞膜的组成成分之一，可能跟细胞膜通透性有关。此前虽然在文献中未发现有过这个基因的相关报道，其具体功能及作用机理也并不清楚。发明人对谷氨酸棒杆菌诱变过程中偶然发现，这个基因突变后有利于提高L-赖氨酸产量，同时经过持续研究发现，在微生物中提高这个基因的表达活性(点突变或者过表达)则有利于L-赖氨酸的积累。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pK18mobsacB质粒，双链环形DNA(如SEQ ID NO:13所示)。pXMJ19质粒：BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。NEBuilder酶：NEB公司。引物中，下划线标注的区域用于与质粒骨架上的相同序列进行同源重组。
谷氨酸棒杆菌ATCC13032，即ATCC中编号为13032的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158，已于2016年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.12856。
经测序验证，谷氨酸棒杆菌ATCC13032和谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组DNA中均具有如下区段：SEQ ID NO:5所示区段(模板链)(其中第1236-1581位为启动子，第654-1235位为野生型Ncgl1531基因)、SEQ ID NO:7所示区段(对应于NCgl1740基因部分编码区以及NCgl1741基因启动子区及部分编码区)、SEQ ID NO:8所示区段(对应于NCgl1742基因部分编码区)。
野生型Ncgl1531基因的编码区如SEQ ID NO:1所示，编码SEQ ID NO:2所示的野生型Ncgl1531蛋白。Ncgl1531E35K基因的编码区如SEQ ID NO:3所示，编码SEQ ID NO:4所示的Ncgl1531E35K蛋白。与野生型Ncgl1531蛋白相比，Ncgl1531E35K蛋白的差异仅在于将第35位氨基酸残基由谷氨酸(E)突变为了赖氨酸(K)。与野生型Ncgl1531基因相比，Ncgl1531E35K基因的差异仅在于将编码区第103位核苷酸由G突变为了A。
实施例1、L-赖氨酸发酵实验
供试菌株：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、重组菌Y-Ncgl1531-1、重组菌Y-Ncgl1531-2、重组菌Y-Ncgl1531-3、重组菌Y-Ncgl1531-4、重组菌Y-Ncgl1531-5、重组菌Y-Ncgl1531-6；谷氨酸棒杆菌YP097158、重组菌L-Ncgl1531-1、重组菌L-Ncgl1531-2、重组菌L-Ncgl1531-3、重组菌L-Ncgl1531-4、重组菌L-Ncgl1531-5、重组菌L-Ncgl1531-6。重组菌分别是由实施例3、实施例4、实施例5和实施例6制备得到的。
采用BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)进行发酵。发酵培养基的配方见表1。发酵控制工艺见表2。完成接种的初始时刻，体系OD600nm值为0.3-0.5。发酵结束后，采用茚三酮比色法检测L-赖氨酸产量。设置至少3个生物学重复，结果取平均值±标准差。
茚三酮染色检测发酵液赖氨酸产量的方法如下：
①发酵结束后，5000rpm/min离心5min，收集上清液。
②取96孔板，每孔加入5μL步骤①得到的上清液、0.066mL溶液I与0.037mL溶液II，充分混合均匀，用胶质96孔封口盖子盖严。
溶液I：630mL缓冲液+6g三氯化铁+373mL甲基溶纤剂。溶液II：1g茚三酮溶于100mL缓冲液。缓冲液(pH2.2)：称取1.43g Na2HPO4和18.8g无水柠檬酸，加水至1L。
③完成步骤②后，将所述96孔板100℃恒温保持40min，然后迅速用水冷却至室温。
④完成步骤③后，每孔加入200μL DMSO，充分混匀。
⑤完成步骤④后，取样200μL至96孔酶标板中，利用酶标仪测定480nm的吸收峰值。
利用L-赖氨酸标准品制作标准曲线，然后利用吸收峰值计算L-赖氨酸产量。
结果见表3和表4。在谷氨酸棒杆菌中过表达野生型Ncgl1531基因或Ncgl1531E35K基因均有助于提高L-赖氨酸产量。将谷氨酸棒杆菌中的野生型Ncgl1531基因定点突变为Ncgl1531E35K基因有助于提高L-赖氨酸产量。将谷氨酸棒杆菌中的野生型Ncgl1531基因敲除，降低L-赖氨酸产量。相对于过表达野生型Ncgl1531基因，在谷氨酸棒杆菌中过表达Ncgl1531E35K基因可以更显著的提高L-赖氨酸产量。
表1发酵培养基配方
| 成分 | 在培养基中的浓度 |
| 淀粉水解糖 | 30g/L |
| 硫酸铵 | 12g/L |
| 硫酸镁 | 0.87g/L |
| 糖蜜 | 20g/L |
| 酸化玉米浆 | 3mL/L |
| 磷酸 | 0.4mL/L |
| 氯化钾 | 0.53g/L |
| 消泡剂(2％泡敌) | 4mL/L |
| 硫酸亚铁 | 120mg/L |
| 硫酸锰 | 120mg/L |
| 烟酰胺 | 42mg/L |
| 泛酸钙 | 6.3mg/L |
| 维生素B1 | 6.3mg/L |
| 硫酸铜 | 0.9mg/L |
| 硫酸锌 | 1.0mg/L |
| 生物素 | 0.88mg/L |
表2发酵控制工艺
表3以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌的改造菌的发酵产量
表4以谷氨酸棒杆菌YP097158为出发菌的改造菌的发酵产量
实施例2、构建表达Ncgl1531E35K基因的重组载体
1、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P1和P2组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
2、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P3和P4组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
3、用限制性内切酶Xbal I和BamH I对pK18mobsacB质粒进行双酶切，回收约6kb的线性化质粒骨架。
4、将步骤1获得的扩增产物、步骤2获得的扩增产物和步骤3获得的线性化质粒骨架利用NEBuilder酶进行连接(50℃，30min)，得到重组质粒pK18-Ncgl1531E35K。重组质粒pK18-Ncgl1531E35K已进行测序验证。与pK18mobsacB质粒相比，重组质粒pK18-Ncgl1531E35K的差异仅在于用SEQ ID NO:6所示双链DNA分子取代了pK18mobsacB质粒中的“AGGATCCCC”。
P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGGTGACATCCTGGAAATAG-3'；
P2：5'-CAGCGATGCGGAAATTCAGAAATACACCGCAGCTTTC-3'；
P3：5'-GAAAGCTGCGGTGTATTTCTGAATTTCCGCATCGCTG-3'；
P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCACAAGCACGCAGTAGATG-3'。
实施例3、构建用Ncgl1531E35K基因同源替换野生型Ncgl1531基因的重组菌
一、制备重组菌L-Ncgl1531-1
1、将重组质粒pK18-Ncgl1531E35K电击导入谷氨酸棒杆菌YP097158，然后采用含50mg/L卡那霉素的固体培养基甲平板30℃培养40h。挑取单菌落，采用P1和P4组成的引物对进行PCR扩增并回收扩增产物进行测序验证，具有SEQ ID No.6所示测序结果的菌株为目标菌株。
固体培养基甲(pH7.0)：含蔗糖10g/L、多聚蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、尿素2g/L、氯化钠2.5g/L和琼脂粉18g/L，余量为水。下同。
2、将步骤1获得的目标菌株划线接种至固体培养基乙平板上，30℃培养40h。
固体培养基乙(pH7.0)：含蔗糖150g/L、多聚蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、尿素2g/L、氯化钠2.5g/L和琼脂粉18g/L，余量为水。下同。
3、完成步骤2后，从平板上挑取单菌落，分别接种至非抗菌平板和抗菌平板上，选择在抗菌平板上不生长且在非抗菌平板上生长的菌株，即为目标菌株。
非抗菌平板：固体培养基甲平板。下同。
抗菌平板：含50mg/L卡那霉素的固体培养基甲平板。下同。
4、取步骤3获得的目标菌株，采用P1和P4组成的引物对进行PCR扩增并回收扩增产物进行测序验证，如果扩增产物中具有Ncgl1531E35K基因编码区且不具有野生型Ncgl1531基因编码区，该菌株即为重组菌L-Ncgl1531-1。
经测序验证，与谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组DNA相比，重组菌L-Ncgl1531-1的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区取代了SEQ IDNO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区。
二、制备重组菌Y-Ncgl1531-1
用谷氨酸棒杆菌ATCC13032代替谷氨酸棒杆菌YP097158，其他同步骤一。
得到重组菌Y-Ncgl1531-1。
经测序验证，与谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA相比，重组菌Y-Ncgl1531-1的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区取代了SEQ IDNO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区。
实施例4、构建基因组上过表达野生型Ncgl1531基因或Ncgl1531E35K基因的重组菌
一、构建重组质粒pK18-Ncgl1531OE
1、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P5和P6组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。经测序验证，扩增产物中具有SEQ ID NO:7所示的上游同源臂。
2、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P7和P8组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。经测序验证，扩增产物如SEQ ID NO:5中第542-1581位所示。
3、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P9和P10组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。经测序验证，扩增产物中具有SEQ ID NO:8所示的下游同源臂。
4、用限制性内切酶Xbal I和BamH I对pK18mobsacB质粒进行双酶切，回收约6kb的线性化质粒骨架。
5、将步骤1获得的扩增产物、步骤2获得的扩增产物、步骤3获得的扩增产物和步骤4获得的线性化质粒骨架利用NEBuilder酶进行连接(50℃，30min)，得到重组质粒pK18-Ncgl1531OE。重组质粒pK18-Ncgl1531OE已进行测序验证。与pK18mobsacB质粒相比，重组质粒pK18-Ncgl1531OE的差异仅在于用特异DNA分子(自上游至下游依次由SEQ ID NO:7所示双链DNA分子、SEQ ID NO:5中第542-1581位所示双链DNA分子、SEQ ID NO:8所示双链DNA分子组成)取代了pK18mobsacB质粒中的“AGGATCCCC”。
二、构建重组质粒pK18-Ncgl1531E35KOE
1、以重组菌L-Ncgl1531-1的基因组DNA为模板，采用P5和P6组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
2、以重组菌L-Ncgl1531-1的基因组DNA为模板，采用P7和P8组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
3、以重组菌L-Ncgl1531-1的基因组DNA为模板，采用P9和P10组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
4、用限制性内切酶Xbal I和BamH I对pK18mobsacB质粒进行双酶切，回收约6kb的线性化质粒骨架。
5、将步骤1获得的扩增产物、步骤2获得的扩增产物、步骤3获得的扩增产物和步骤4获得的线性化质粒骨架利用NEBuilder酶进行连接(50℃，30min)，得到重组质粒pK18-Ncgl1531E35KOE。重组质粒pK18-Ncgl1531E35KOE已进行测序验证。与pK18mobsacB质粒相比，重组质粒pK18-Ncgl1531E35KOE的差异仅在于用特异DNA分子(自上游至下游依次由SEQ IDNO:7所示双链DNA分子、SEQ ID NO:9所示双链DNA分子、SEQ ID NO:8所示双链DNA分子组成)取代了pK18mobsacB质粒中的“AGGATCCCC”。
三、制备重组菌L-Ncgl1531-3
1、将重组质粒pK18-Ncgl1531E35KOE电击导入谷氨酸棒杆菌YP097158，然后采用固体培养基甲平板30℃培养40h。挑取单菌落，采用P11和P12组成的引物对进行PCR扩增并回收扩增产物进行测序验证，如果扩增产物为1629bp，该菌为目标菌。扩增产物的测序结果如SEQ ID NO:10所示。
2、将步骤1获得的目标菌划线接种至固体培养基乙平板上，30℃培养40h。挑取单菌落，采用P13和P14组成的引物对进行PCR扩增并回收扩增产物进行测序验证，如果扩增产物为1359bp，该菌为目标菌，即重组菌L-Ncgl1531-3。扩增产物的测序结果如SEQ ID NO:11所示。
经测序验证，与谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组DNA相比，重组菌L-Ncgl1531-3的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:9所示双链DNA分子取代了基因组DNA中SEQ ID NO:7所示上游同源臂和SEQ ID NO:8所示下游同源臂中间的区段。重组菌L-Ncgl1531-3的基因组DNA中，具有1个拷贝的野生型Ncgl1531基因和1个拷贝的Ncgl1531E35K基因。
四、制备重组菌L-Ncgl1531-2
1、将重组质粒pK18-Ncgl1531OE电击导入谷氨酸棒杆菌YP097158，然后采用固体培养基甲平板30℃培养40h。挑取单菌落，采用P11和P12组成的引物对进行PCR扩增并回收扩增产物进行测序验证，如果扩增产物为1629bp，该菌为目标菌。
2、将步骤1获得的目标菌划线接种至固体培养基乙平板上，30℃培养40h。挑取单菌落，采用P13和P14组成的引物对进行PCR扩增并回收扩增产物进行测序验证，如果扩增产物为1359bp，该菌为目标菌，即重组菌L-Ncgl1531-2。
经测序验证，与重组菌L-Ncgl1531-3的基因组DNA相比，重组菌L-Ncgl1531-2的基因组DNA的差异仅在于：整合至基因组DNA的外源片段中，用SEQ ID NO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区取代了SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区。重组菌L-Ncgl1531-2的基因组DNA中，具有两个拷贝的野生型Ncgl1531基因。
五、制备重组菌Y-Ncgl1531-3
用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032代替谷氨酸棒杆菌YP097158，其他同步骤三。
得到重组菌Y-Ncgl1531-3。
经测序验证，与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA相比，重组菌Y-Ncgl1531-3的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:9所示双链DNA分子取代了基因组DNA中SEQ IDNO:7所示上游同源臂和SEQ ID NO:8所示下游同源臂中间的区段。重组菌Y-Ncgl1531-3的基因组DNA中，具有1个拷贝的野生型Ncgl1531基因和1个拷贝的Ncgl1531E35K基因。
六、制备重组菌Y-Ncgl1531-2
用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032代替谷氨酸棒杆菌YP097158，其他同步骤四。
得到重组菌Y-Ncgl1531-2。
经测序验证，与重组菌Y-Ncgl1531-3的基因组DNA相比，重组菌Y-Ncgl1531-2的基因组DNA的差异仅在于：整合至基因组DNA的外源片段中，用SEQ ID NO:1所示的野生型Ncgl1531基因编码区取代了SEQ ID NO:3所示的Ncgl1531E35K基因编码区。重组菌Y-Ncgl1531-2的基因组DNA中，具有两个拷贝的野生型Ncgl1531基因。
P5：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG-3'；
P6：5'-GACACAGCCCAAGGCAACTAGTGCACCGAGAACAGATG-3'；
P7：5'-CATCTGTTCTCGGTGCACTAGTTGCCTTGGGCTGTGTC-3'；
P8：5'-GATTTAATTGCGCCATCTGCTTGCCCACGTAGATCAC-3'；
P9：5'-GTGATCTACGTGGGCAAGCAGATGGCGCAATTAAATC-3'；
P10：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC-3'。
P11：5'-TCCAAGGAAGATACACGCC-3'(对应上同源臂NCgl1740的外侧)；
P12：5'-GAAGTTACGCACCTCAACG-3'(对应Ncgl1531基因内部)；
P13：5'-GAGCAACGAACAACATCAAC-3'(对应Ncgl1531基因内部)；
P14：5'-TGGTCGTTGGAATCTTGC-3'(对应下同源臂NCgl1742的外侧)。
实施例5、构建质粒上过表达野生型Ncgl1531基因或Ncgl1531E35K基因的重组菌
一、构建重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K
1、以重组菌L-Ncgl1531-1的基因组DNA为模板，采用P15和P16组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
2、用限制性内切酶Xbal I和BamH I对pXMJ19质粒进行双酶切，回收约6kb的线性化质粒骨架。
3、将步骤1获得的扩增产物和步骤2获得的线性化质粒骨架利用NEBuilder酶进行连接(50℃，30min)，得到重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K。重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K已进行测序验证。与pXMJ19质粒相比，重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K的差异仅在于用SEQ IDNO:9所示双链DNA分子取代了pXMJ19质粒中的“tctagaggatccccg”。
二、构建重组质粒pXMJ19-Ncgl1531
1、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P15和P16组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
2、用限制性内切酶Xbal I和BamH I对pXMJ19质粒进行双酶切，回收约6kb的线性化质粒骨架。
3、将步骤1获得的扩增产物和步骤2获得的线性化质粒骨架利用NEBuilder酶进行连接(50℃，30min)，得到重组质粒pXMJ19-Ncgl1531。重组质粒pXMJ19-Ncgl1531已进行测序验证。与pXMJ19质粒相比，重组质粒pXMJ19-Ncgl1531的差异仅在于用SEQ ID NO:5中第542-1581位所示双链DNA分子取代了pXMJ19质粒中的“tctagaggatccccg”。
三、制备重组菌
将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531导入谷氨酸棒杆菌YP097158，得到重组菌L-Ncgl1531-4。
将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K导入谷氨酸棒杆菌YP097158，得到重组菌L-Ncgl1531-5。
将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌Y-Ncgl1531-4。
将重组质粒pXMJ19-Ncgl1531E35K导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌Y-Ncgl1531-5。
P15：5'-CAGAATAATTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTAGTTGCCTTGGGCTGTGTC-3'；
P16：5'-CCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCTTGCCCACGTAGATCAC-3'。
实施例6、构建基因组上缺失野生型Ncgl1531基因的重组菌
一、制备重组质粒pK18-ΔNcgl1531
1、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P17和P18组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
2、以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用P19和P20组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
3、用限制性内切酶Xbal I和BamH I对pK18mobsacB质粒进行双酶切，回收约6kb的线性化质粒骨架。
4、将步骤1获得的扩增产物、步骤2获得的扩增产物和步骤3获得的线性化质粒骨架利用NEBuilder酶进行连接(50℃，30min)，得到重组质粒pK18-ΔNcgl1531。重组质粒pK18-ΔNcgl1531已进行测序验证。与pK18mobsacB质粒相比，重组质粒pK18-ΔNcgl1531的差异仅在于用SEQ ID NO:12所示双链DNA分子取代了pK18mobsacB质粒中的“AGGATCCCC”。
二、制备重组菌L-Ncgl1531-6
1、将重组质粒pK18-ΔNcgl1531电击导入谷氨酸棒杆菌YP097158，然后采用固体培养基甲平板30℃培养40h。挑取单菌落，采用P17和P20组成的引物对进行PCR扩增，能同时扩增得到大小为1540bp和1979bp条带的菌株为阳性菌株。
2、将步骤1获得的阳性菌株划线接种至固体培养基乙平板上，30℃培养40h。
3、完成步骤2后，从平板上挑取单菌落，分别接种至非抗菌平板和抗菌平板上，选择在抗菌平板上不生长且在非抗菌平板上生长的菌株，即为阳性菌株。
4、取步骤3获得的阳性菌株，采用P17和P20组成的引物对进行PCR扩增，仅能扩增得到1540bp条带的菌株为阳性菌株，即为重组菌L-Ncgl1531-6。
经测序验证，与谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组DNA相比，重组菌L-Ncgl1531-6的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:12所示的DNA分子取代了SEQ ID NO:5所示的DNA分子。
三、制备重组菌Y-Ncgl1531-6
用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032代替谷氨酸棒杆菌YP097158，其他同步骤二。
得到重组菌Y-Ncgl1531-6。
经测序验证，与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA相比，重组菌Y-Ncgl1531-6的基因组DNA的差异仅在于：用SEQ ID NO:12所示的DNA分子取代了SEQ ID NO:5所示的DNA分子。
P17：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGTTGAGTTTGCGAGTGAC-3'；
P18：5'-GTTTGACGCCTCGGTTTACTTCATCGGAACTCGTTTC-3'；
P19：5'-GAAACGAGTTCCGATGAAGTAAACCGAGGCGTCAAAC-3'；
P20：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAGAAGGTGGGACTTGAAGG-3'。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.重组微生物，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)将Ncgl1531基因或Ncgl1531基因相关生物材料导入宿主微生物，得到的重组微生物；
(a2)将突变体基因或突变体基因相关生物材料导入宿主微生物，得到的重组微生物；
(a3)将宿主微生物基因组中的Ncgl1531基因替换为突变体基因，得到的重组微生物；
所述Ncgl1531基因为编码Ncgl1531蛋白的基因；
所述Ncgl1531基因相关生物材料为具有所述Ncgl1531基因的表达盒或重组载体；
所述突变体基因为编码突变体蛋白的基因；
所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白进行一个或几个氨基酸残基的突变得到的；
所述突变体基因相关生物材料为具有所述突变体基因的表达盒或重组载体。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：所述Ncgl1531蛋白包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于：所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基由谷氨酸突变为其他氨基酸得到的。
4.如权利要求3所述的重组微生物，其特征在于：所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基由谷氨酸突变为赖氨酸得到的。
5.权利要求1至4中任一所述重组微生物在制备L-赖氨酸中的应用。
6.Ncgl1531蛋白或突变体蛋白在正调控微生物生产L-赖氨酸中的应用；
所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白进行一个或几个氨基酸残基的突变得到的。
7.Ncgl1531基因或突变体基因在正调控微生物生产L-赖氨酸中的应用；
所述Ncgl1531基因为编码Ncgl1531蛋白的基因；
所述突变体基因为编码突变体蛋白的基因；
所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白进行一个或几个氨基酸残基的突变得到的。
8.Ncgl1531基因或Ncgl1531基因相关生物材料或突变体基因或突变体基因相关生物材料在制备用于提高微生物生产L-赖氨酸的能力的产品中的应用；
所述Ncgl1531基因为编码Ncgl1531蛋白的基因；
所述Ncgl1531基因相关生物材料为具有所述Ncgl1531基因的表达盒或重组载体；
所述突变体基因为编码突变体蛋白的基因；
所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白进行一个或几个氨基酸残基的突变得到的；
所述突变体基因相关生物材料为具有所述突变体基因的表达盒或重组载体。
9.如权利要求6至8中任一所述的应用，其特征在于：所述Ncgl1531蛋白包含如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基由谷氨酸突变为其他氨基酸得到的；
优选的，所述突变体蛋白是将所述Ncgl1531蛋白中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基由谷氨酸突变为赖氨酸得到的。
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