CN118127187A - 一种基于靶向测序的呼吸道病原微生物检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物检测技术领域，具体公开了一种基于靶向测序的呼吸道病原微生物检测试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒可在一个反应管内同时扩增36种呼吸道病原微生物靶标基因，结合高通量测序技术，可检测样本中可能存在的临床常见病原微生物，具有覆盖度高、灵敏度高等优势。
Description
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于靶向测序的呼吸道病原微生物检测试剂盒及其检测方法。
技术背景
呼吸道常见的病原微生物主要有病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次体等，据统计，90％以上急性呼吸道感染由病毒引起。一种病原微生物可引起多种临床症状，同一临床表现可由多种病原微生物引起。细菌导致呼吸道感染的机率比病毒低，但一旦感染，症状一般比较严重，定位比较明显，如扁桃体炎、气管炎和鼻窦炎等。病毒包括EBV、CMV、HSV、HHV、博卡病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等。
与传统基于分离培养的病原体检测技术相比，宏基因组学第二代测序(mNGS)无需对病原体进行分离培养，也不依赖已知核酸序列，可无偏倚、全覆盖的检测各类微生物(如：病毒、细菌、真菌、寄生虫等)，且无需特异性扩增，大大节省了检测时间，提高了诊断效率，在对未知物种及难以培养的病原体鉴定方面更是具有无可比拟的优势。然而，mNGS检测为非靶向检测，只要是样本中的核酸就可以检测出来，因此如果提取出来的核酸存在大量宿主会导致微量病原核酸淹没在海量的宿主背景之下，导致测不到引起假阴性结果，因此对高宿主含量样本进行高效的宿主剔除是mNGS应考虑的重要环节。
病原靶向测序(targeted Next-Generation Sequencing,tNGS)通过超多重PCR扩增与高通量测序两种技术的结合，能够对待测样本中几十种至几百种已知病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行检测。对低浓度的病原微生物的检测，特别是其毒力和/或耐药基因检测，与病原宏基因组测序(mNGS)相比，tNGS具有病原谱范围明确、测序成本低等优势。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请提出一种基于靶向测序的呼吸道病原微生物检测检测体系、试剂盒及其应用。
具体的，本申请所采用的技术方案如下：
本申请首先提供一种用于呼吸道病原微生物检测的引物组，所述引物针对细菌类病原、真菌类病原和病毒类病原。
进一步的，所述细菌类病原包括：肺炎链球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌复合群、百日咳鲍特菌、白喉棒状杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、土拉热弗朗西斯菌；所述真菌类病原包括：粗球孢子菌、波萨达斯球孢子菌、巴西副球孢子菌、白色念珠菌、皮炎芽生菌、荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌、新生隐球菌、格特隐球菌、尖端赛多孢；所述病毒类病原包括：流感病毒、副流感病毒、腺病毒、人呼吸道合胞病毒A、人呼吸道合胞病毒B、鼻病毒、人偏肺病毒、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、冠状病毒229E型。
进一步的，所述引物还针对耐药基因；所述耐药基因包括：mecA、NDM-1、KPC-2、OXA-48、VIM和mcr-1。
进一步的，所述引物序列包括SEQ ID NO.1-72所示序列，或与SEQ ID NO.1-72所示序列具有80％以上同源性。
进一步的，所述引物中，每条正向扩增引物的5'端连接5'-CTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'；连接；每条反向扩增引物的5'端连接5'-TTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'。
本申请还提供一种试剂盒或产品，其特征在于，所述试剂盒或产品包含上述引物组。
进一步的，所述试剂盒或产品进一步包含还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶；优选的，还可以包括样本DNA/RNA共提取试剂、反转录试剂。
本申请还提供上述引物组在制备呼吸道病原微生物检测试剂中的应用。
进一步的，所述应用包括如下步骤：
S1、获得待测样本的核酸；
S2、以步骤S1获得的核酸样本为模板，逆转录得到cDNA；
S3、再以样本中DNA和逆转录得到的cDNA为模板，利用上述引物组分别进行多重PCR扩增，将DNA扩增产物和cDNA扩增产物按照一定比例制成产物混合液；
S4、以步骤S3获得的产物混合液作为模板，利用接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S5、对步骤S4获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S6、将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S7、利用下述公式计算病原微生物标准化reads数：
其中，RPM：1M reads病原微生物检出数；Pathogen reads number:病原检出的reads数；Clean reads number:样本预处理后的有效reads数
本申请还提供一种呼吸道病原微生物检测方法，包括如下步骤：
S1、获得待测样本的核酸；
S2、以步骤S1获得的核酸样本为模板，逆转录得到cDNA；
S3、再以样本中DNA和逆转录得到的cDNA为模板，利用上述所述的引物组分别进行多重PCR扩增，将DNA扩增产物和cDNA扩增产物按照一定比例制成产物混合液；
S4、以步骤S3获得的产物混合液作为模板，利用接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S5、对步骤S4获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S6、将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S7、利用下述公式计算病原微生物标准化reads数：
其中，RPM：1M reads病原微生物检出数；Pathogen reads number:病原检出的reads数；Clean reads number:样本预处理后的有效reads数。
本申请有益技术效果：
1)本申请通过反复优化设计，获得一种适于呼吸道病原微生物检测的靶向测序的高重扩增引物组体系和试剂盒等，该高重体系可在一个反应管内同时扩增36种病原微生物靶标基因，结合后高通量测序技术，可高效、灵敏、特异、精准的检出样本中可能存在的临床常见病原微生物。
2)本申请方法具有覆盖度高优势：本申请一次检测可覆盖临床常见36种病原微生物，包括细菌、真菌、病毒及支原体、衣原体等；针对临床疑似感染样本，通过检测其中的常见病原微生物，辅助临床精准识别常见病原体，能够制定精准诊疗方案。
3)本申请除鉴定病原微生物外，同时还可检测耐药基因，本申请的引物体系涵盖耐药基因序列，可通过测序分析检测样本中是否存在耐药基因。
4)本申请可同时检测DNA及RNA病毒，本申请样本处理涵盖了常见以DNA为遗传物质的细菌、真菌、寄生虫、支原体、衣原体、DNA病毒，以及以RNA为遗传物质的RNA病毒，如呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒等。
附图说明
图1、白色念珠菌引物优化前后的扩增效果表现。其中，左图是引物未优化前的两对引物扩增产物分析结果；右图是引物优化后的两对引物扩增产物分析结果。
图2、引物优化前QPCR单筛扩增曲线和溶解曲线；
图3、引物优化后QPCR单筛扩增曲线和溶解曲线；
图4、多重扩增体系的优化前后产物电泳检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
部分术语定义
除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本申请中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
本申请的用于呼吸道病原微生物检测的引物组，是针对细菌类病原、真菌类病原和病毒类病原。
在一些实施方式中，所述细菌类病原包括：肺炎链球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌复合群、百日咳鲍特菌、白喉棒状杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、土拉热弗朗西斯菌；所述真菌类病原包括：粗球孢子菌、波萨达斯球孢子菌、巴西副球孢子菌、白色念珠菌、皮炎芽生菌、荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌、新生隐球菌、格特隐球菌、尖端赛多孢；所述病毒类病原包括：流感病毒、副流感病毒、腺病毒、人呼吸道合胞病毒A、人呼吸道合胞病毒B、鼻病毒、人偏肺病毒、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、冠状病毒229E型。
在一些实施方式中，所述引物还针对耐药基因；所述耐药基因包括：mecA、NDM-1、KPC-2、OXA-48、VIM、mcr-1。
在一些具体的实施方式中，所述引物序列包括SEQ ID NO.1-72所示序列，或与SEQID NO.1-72所示序列具有80％以上同源性。
在一些更具体的实施方式中，所述引物中，每条正向扩增引物的5'端连接5'-CTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'；每条反向扩增引物的5'端连接5'-TTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'。
本申请的试剂盒或产品，包含了上述引物组。在一些具体的实施方式中，所述试剂盒或产品进一步包含还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶；在一些更具体的实施方式中，还可以包括样本DNA/RNA共提取试剂、反转录试剂。
本申请的引物组在制备呼吸道病原微生物检测试剂中的应用；或在呼吸道病原微生物检测中的应用
在一些具体的实施方式中，所述应用包括如下步骤：
S1、获得待测样本的核酸；
S2、以步骤S1获得的核酸样本为模板，逆转录得到cDNA；
S3、再以样本中DNA和逆转录得到的cDNA为模板，利用上述引物组分别进行多重PCR扩增，将DNA扩增产物和cDNA扩增产物按照一定比例制成产物混合液；
S4、以步骤S3获得的产物混合液作为模板，利用接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S5、对步骤S4获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S6、将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S7、利用下述公式计算病原微生物标准化reads数：
其中，RPM：1M reads病原微生物检出数；Pathogen reads number:病原检出的reads数；Clean reads number:样本预处理后的有效reads数
本申请的呼吸道病原微生物检测方法，包括如下步骤：
S1、获得待测样本的核酸；
S2、以步骤S1获得的核酸样本为模板，逆转录得到cDNA；
S3、再以样本中DNA和逆转录得到的cDNA为模板，利用上述所述的引物组分别进行多重PCR扩增，将DNA扩增产物和cDNA扩增产物按照一定比例制成产物混合液；
S4、以步骤S3获得的产物混合液作为模板，利用接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S5、对步骤S4获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S6、将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S7、利用下述公式计算病原微生物标准化reads数：
其中，RPM：1M reads病原微生物检出数；Pathogen reads number:病原检出的reads数；Clean reads number:样本预处理后的有效reads数。
下面结合具体实施例来阐述本申请。
实施例1、病原菌的选择和确立
为实现呼吸道病原的全面和有效的检出，本申请分析了常见呼吸道病原菌的类型和种类，同时结合多重扩增体系的可行性，最终确定靶向物种和耐药基因如下：
其中,针对细菌类病原如下表所示：
针对真菌类病原如下表所示；
| 序号 | 病原中文名 | 病原英文名 |
| 1 | 粗球孢子菌 | Coccidioides immitis |
| 2 | 波萨达斯球孢子菌 | Coccidioides posadasii |
| 3 | 巴西副球孢子菌 | Paracoccidioides brasiliensis |
| 4 | 白色念珠菌 | Candida albicans |
| 5 | 皮炎芽生菌 | Blastomyces dermatitidis |
| 6 | 荚膜组织胞浆菌 | Histoplasma capsulatum |
| 7 | 马尔尼菲篮状菌 | Talaromyces marneffei |
| 8 | 新生隐球菌 | Cryptococcus neoformans |
| 9 | 格特隐球菌 | Cryptococcus gattii |
| 10 | 尖端赛多孢 | Scedosporium apiospermum |
针对的病毒类病原如下表所示
针对的耐药基因如下表所示：
| 序号 | 耐药基因名 | 编码蛋白名 |
| 1 | mecA | 耐甲氧西林基因 |
| 2 | NDM-1 | 新德里金属-β-内酰胺酶编码基因 |
| 3 | KPC-2 | 碳青霉烯酶编码基因 |
| 4 | OXA-48 | 碳青霉烯酶编码基因 |
| 5 | VIM | 金属-β-内酰胺酶编码基因 |
| 6 | mcr-1 | 粘菌素抗性基因 |
实施例2、靶向区域筛选和引物设计
1)靶向区域的筛选过程
在确定病原微生物种类后，本申请为实现多重检测过程中的特异性和敏感性，在靶向引物设计时，靶向区域逻辑是特异性能够达到95％以上，覆盖度达到95％以上；另外本申请同时兼顾耐药的检出，部分引物靶向区域还包括耐药位点区。
如下为示例性的展示部分引物序列优化过程。
由于靶向的区域较多，本申请仅以3组引物作的靶向区域优化的为具体示例展示：
本申请在通过覆盖区域的优化和调整后，在检测特异性和覆盖度方面实现显著提升。
2)引物序列的设计、筛选和优化过程：
鉴于高重引物体系，本申请引物设计要求严格，同时需考虑因素很多，引物的整体上经历如下步骤：
1)采用引物设计软件或引物设计网站对超多重PCR引物的初步设计；要求：所述引物扩增子长度为100-600bp，序列GC含量为45-65％，引物长度为17-25bp，两个引物间不超过5个碱基严格互补，引物没有连续超过5个碱基的多聚序列；
2)基于生信分析进行引物筛选，得到高特异性和低二聚体的复筛引物；
3)通过湿实验筛选高扩增效率的超多重PCR引物，并调整具体引物序列；
4)基于电泳灰度评价体系和QPCR评价体系进行引物评价复筛。
此外，本申请引物在使用时，每条正向扩增引物的5'端与正向通用引物5'-CTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'连接；每条反向扩增引物的5'端与反向通用引物5'-TTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'连接。其中正向扩增引物为识别病原靶标并扩增的序列，正向通用引物和反向通用引物序列为MGI测序平台接头序列。
如下为示例性的引物序列优化：
a、单重扩增优化方面
针对白色念珠菌为例，本申请初期设计时和优化后的引物信息如下：
通过单引物扩增效率检测发现，优化前的白念引物扩增效率较低，存在条带弥散等问题(图1左)，单对引物的QPCR验证，存在人源gDNA的非特异扩增(图2)，无法达到多重PCR的混合要求。经生信分析重新设计和优化序列后，引物的扩增效率得到明显提升(图1右)而且仅有靶标特异扩增，无人源gDNA的非特异性扩增(图3)，通过调整后的引物具有显著的扩增效率优势。
b、多重体系的优化
单独筛选过后，混合引物组进行多重扩增。针对肺炎链球菌，初步设计时，在多重体系无法扩增；经过引物组优化后，在多重体系能够有效扩增，具体参见图4。
c.二聚体的优化
虽然本多重体系中已经将各个引物组间的相互关系通过分析进行了最大程度的避免，而且通过单个物种的引物组筛选进行了优化，但是还存在去除不了的小部分二聚体，因此需要通过分析这类测序reads，找到形成二聚体高于1％的引物，将其从引物组中(Mycobacterium_tuberculosis_1_F)删除，重新分析和设计最新的引物组。从而最终减少多重扩增引物组形成二聚体的可能性，最终提高测序数据有效利用率。针对结核分枝杆菌，具体分析结果如下：
综上优化试验，本申请最终确定的多重靶向引物体系如下表所示。
/>
/>
实施例3、试剂盒制备和检测体系建立
1.基于上述引物扩增体系建立本申请的试剂盒，本申请试剂盒包含上述的引物体系，同时还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶等。示例性，PCR缓冲液可以是任意能够完成PCR扩增的缓冲液，包括但不限于dNTPs、MgCl2、Tris-HCl、KCl和(NH4)2SO4等。试剂盒还可以包括样本DNA/RNA共提取试剂、反转录试剂；示例性，样本DNA/RNA提取试剂可以是任意能够提取样本DNA/RNA的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒，例如，可以是利用酶解及化学试剂裂解的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒，通过酶解及化学裂解的方法，消化样本中的蛋白质，裂解细胞，从而释放出核酸。其中，所述酶包括但不限于蛋白酶K，所述化学试剂包括但不限于异硫氰酸胍。
2.建立基于靶向测序的病原微生物检测方法，具体包括以下步骤：
S1、获得待测样本的核酸；
该过程使用ZYMO Quick-DNA/RNATMViral Kit试剂盒(D7020)进行待测样本核酸(DNA和RNA)的提取。操作步骤如下：
(1)配置0.5％β-巯基乙醇(V/V)和80％无水乙醇；
(2)在室温条件下(20-30℃)，往样本中按照1:1比例加入DNA/RNA Shield保护液；
(3)将400μL Viral DNA/RNA Buffer添加到400μL样本中并混合均匀；
(2)将混合物转移到吸附柱Zymo-SpinTMIIC-XLR Column中，放在收集管中，14000g离心2min，并将吸附柱转移到新的收集管中；
(3)向吸附柱中加入500μL Viral Wash Buffer，12000g离心30sec，丢弃废液，重复此步骤；
(4)在吸附柱中加入500μL 80％无水乙醇，12000g离心1min，以确保完全去除洗脱液。换新的收集管，空甩12000g离心1min，小心地将柱子转移到新的无核酸酶的1.5mL离心管中；
(5)向吸附膜中间位置悬空滴加35μL的DNase/RNase-Free Water(AmbionTM，Invitrogen)，室温静置1min后，14000g离心1min，保留1.5mL离心管中的洗脱液，弃吸附柱；
(6)取1μL洗脱产物进行Qubit定量(Thermo Fisher)，测定提取核酸浓度；如果提取浓度为0，需要重新取样并提取。
S2、以步骤S1获得的核酸样本为模板，逆转录得到cDNA；
该过程使用SuperScriptTMVILOTMcDNA Synthesis Kit试剂盒对待测核酸进行cDNA合成。具体操作步骤如下：
(1)对于一个单一的反应，将以下组分在冰上的管中混合。为多次反应，制备不含RNA的主混合物。
| 组分 | 体积(μL) |
| 5X VILOTMReaction Mix | 4 |
| 10X SuperScriptTMEnzyme Mix | 2 |
| RNA(up to 2.5μg) | X |
| DEPC-treated water | Up to 20 |
(2)轻轻混合管内容物，在25℃下孵育10分钟。
(3)42℃孵育管60分钟。
(4)在85℃下5分钟终止反应。
(5)将反应产物放到-20℃保存或直接进行下一步反应。
S3、以DNA和cDNA为模板，利用权利要求2所述的引物组分别进行多重PCR扩增，将DNA扩增产物和cDNA扩增产物按照一定比例制成产物混合液；
按照下列体系将各组分加入八连管中进行PCR扩增：
| 组分 | 体积(μL) |
| 酶预混液(天根) | 12.5 |
| 引物组F | 1.0 |
| 引物组R | 1.0 |
| 核酸模板 | 10.0 |
| Nuclease-Free Water | 0.5 |
| Total | 25.0 |
(2)在PCR仪上设置如下程序进行PCR扩增：
S4、以步骤S3获得的产物混合液作为模板，利用权利要求3所述的接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
(1)按照下列体系将各组分加入八连管中进行PCR扩增：
| 组分 | 体积(μL) |
| 酶预混液(天根) | 12.5 |
| 接头通用引物Index(MGI) | 2.0 |
| 步骤S3产物 | 10.0 |
| Nuclease-Free Water | 0.5 |
| Total | 25.0 |
(2)在PCR仪上设置如下程序进行PCR扩增：
(3)对上述的PCR产物进行磁珠(Agencout AMPure XP，Beckman)纯化，最终洗脱体积为30μL。
S5、对步骤S4获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
该步骤使用的测序***为华大智造生产的MGISEQ-200RS测序仪，按照相应操作步骤进行上机测序即可，经过约8h，得到测序序列结果。
S6、将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S7、利用下述公式计算病原微生物标准化reads数：
其中，RPM：1M reads病原微生物检出数；Pathogen reads number：病原检出的reads数；Clean reads number：样本预处理后的有效reads数。
实施例4、检测限性能评价
本实施例通过针对每一个检测物种，挑选一个典型病原代表来进行性能评价，细菌挑选了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，耐药基因挑选了KPC-2(来源于肺炎克雷伯菌)，真菌挑选了白色念珠菌(Candida albicans)，病毒挑选了人呼吸道合胞病毒A(HSV_A)最终的结果如下表所示，所有典型物种的最低检测限(LOD)均可以达到10CFU/mL。
实施例5、临床样本检测验证
本实施例采集临床已知病原菌情况或耐药情况的临床样本20例，通过本申请方法进行检测和比较，结果如下表所示。
/>
可以看出，针对20例不同病原或耐药的样本，本申请方法的预测准确率非常高，为100％，而且与此同时，本申请方法还能检出一些常规标准方法无法检出的病原，比如S14，S19和S20等。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于呼吸道病原微生物检测的引物组，其特征在于，所述引物针对细菌类病原、真菌类病原和病毒类病原。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述细菌类病原包括：肺炎链球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌复合群、百日咳鲍特菌、白喉棒状杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、土拉热弗朗西斯菌；所述真菌类病原包括：粗球孢子菌、波萨达斯球孢子菌、巴西副球孢子菌、白色念珠菌、皮炎芽生菌、荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌、新生隐球菌、格特隐球菌、尖端赛多孢；所述病毒类病原包括：流感病毒、副流感病毒、腺病毒、人呼吸道合胞病毒A、人呼吸道合胞病毒B、鼻病毒、人偏肺病毒、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、冠状病毒229E型。
3.根据权利要求1-2任一所述的引物组，其特征在于，所述引物还针对耐药基因；所述耐药基因包括：mecA、NDM-1、KPC-2、OXA-48、VIM和mcr-1。
4.根据权利要求1-3任一所述的引物组，其特征在于，所述引物序列包括SEQ ID NO.1-72所示序列，或与SEQ ID NO.1-72所示序列具有80％以上同源性。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述引物中，每条正向扩增引物的5'端连接5'-CTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'；每条反向扩增引物的5'端连接5'-TTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'。
6.试剂盒或产品，其特征在于，所述试剂盒或产品包含权利要求1-5任一所述引物组。
7.权利要求5所述的试剂盒或产品，其特征在于，所述试剂盒或产品进一步包含还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶；优选的，还可以包括样本DNA/RNA共提取试剂、反转录试剂。
8.权利要求1-5任一所述引物组在制备呼吸道病原微生物检测试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
S1、获得待测样本的核酸；
S2、以步骤S1获得的核酸样本为模板，逆转录得到cDNA；
S3、再以样本中DNA和逆转录得到的cDNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的引物组分别进行多重PCR扩增，将DNA扩增产物和cDNA扩增产物按照一定比例制成产物混合液；
S4、以步骤S3获得的产物混合液作为模板，利用接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S5、对步骤S4获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S6、将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S7、利用下述公式计算病原微生物标准化reads数：
其中，RPM为1M reads病原微生物检出数；Pathogen reads number为病原检出的reads数；Clean reads number为样本预处理后的有效reads数。
10.一种呼吸道病原微生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、获得待测样本的核酸；
S2、以步骤S1获得的核酸样本为模板，逆转录得到cDNA；
S3、再以样本中DNA和逆转录得到的cDNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的引物组分别进行多重PCR扩增，将DNA扩增产物和cDNA扩增产物按照一定比例制成产物混合液；
S4、以步骤S3获得的产物混合液作为模板，利用接头序列引物对进行添加接头PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；
S5、对步骤S4获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；
S6、将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；
S7、利用下述公式计算病原微生物标准化reads数：
其中，RPM为1M reads病原微生物检出数；Pathogen reads number为病原检出的reads数；Clean reads number为样本预处理后的有效reads数。
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