CN116287357A - 一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒 - Google Patents

一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒，涉及微生物检测技术领域，所述的试剂盒中包括引物组合，所述的引物组合包括铜绿假单孢菌的上、下游引物，鲍曼不动杆菌的上、下游引物，肺炎链球菌的上、下游引物，金黄色葡萄球菌的上、下游引物和化脓性链球菌的上、下游引物。本发明检测呼吸道病原菌的方法针对临床疑似呼吸道感染样本，采用靶向扩增子测序技术结合多重PCR技术，相对其他靶向检测技术，引入单分子识别标签序列，可以实现对不同检测目标的半定量检测，准确性更高。本发明公开的方法经济、快速、特异性和准确性强，同时结果容易判读，在呼吸道病原体检测方面有较大的应用价值。

Description

一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒。
背景技术
呼吸道感染（Respiratory Tract Infections）是指病原体从人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等部位侵入并进行繁殖导致的有传染性的疾病，是一种常见的感染性疾病。呼吸道感染的病原体可分为细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体和立克次体等类型。传统的分离培养及血清学检测方法费时繁琐，导致检测不及时，灵敏度不高，阳性率较低等不足。
宏基因组二代测序（mNGS）可应用于呼吸***疾病病原体检测，mNGS拥有更高的敏感性，更快的检验速度，但在实际应用中，还有一些难以解决的问题：包括其对于胞内菌、真菌等核酸提取效率低的微生物检测敏感性较低、对低浓度的胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌的检测敏感性偏低、高宿主背景、测序结果标准难以统一、高成本等，限制了其广泛应用。
中国专利CN202110024096.5中公开了一种引物组合物、测序试剂盒及检测方法，该组合物包括第一组引物组合物、第二组引物组合物和16S引物对，所述的第一组引物组合物包括多个用于检测引起呼吸道感染的病毒病原体的引物对，第二组引物组合物包括多个用于检测引起呼吸道感染的细菌病原体的引物对，所述的16S引物对用于与所述的第一引物组合物或第二引物组合物同时检测引起呼吸道感染的病原体。该发明所提供的引物组合物，可以同时检测30余种呼吸道病原体，部分病原体可根据测序序列进行亚型区分。
中国专利CN202111356118.4中公开了一种检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物、试剂盒、方法及用途，所述的组合物包括甲型流感病毒的上、下游引物和探针、乙型流感病毒的上、下游引物和探针、鼻病毒的上、下游引物和探针、呼吸道腺病毒的上、下游引物和探针，该发明所述的组合物结合荧光探针法，能够使用两个管在一次试验中同时进行，其成本低、通量高。使得单次试验一管能给出4个靶点的信息，并且操作简单，结果的读取过程可通过CT值进行判定，并且避免了样本间交叉感染引起的假阳性和环境污染。
中国专利CN202011098442.6中公开了一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒，所述的试剂盒包括引物探针组合，所述的引物探针组合包括检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的上下游引物和探针，该试剂盒的检测准确性好、特异性强、灵敏度高，重复性好、假阴性和假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒或细菌引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。
本发明提供的基于靶向测序的呼吸道病原菌检测方法，无需进行人源基因组DNA的去除，即可达到对靶标病原微生物的富集。本发明的检测试剂盒可实现金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿色假单胞菌、化脓性链球菌的同时检测，本发明的检测试剂盒搭配快速测序的技术，可以快速获得检测结果，实现快速即时检测，应用于呼吸道感染性疾病的诊断。
发明内容
本发明的术语和声明：
本发明中，术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序。
本发明中，术语“引物”是指人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。
本发明中，术语“病原菌”是指能入侵宿主引起感染的微生物，有细菌、真菌、病毒等，它们能产生致病物质，造成宿主感染。
本发明中，术语“铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）”是假单胞菌种最常见的造成呼吸道感染、伤口感染的条件致病菌。
本发明中，术语“鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）”是一种革兰氏阴性的非发酵短杆菌。
本发明中，术语“肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）”是一种条件致病革兰阳性球菌。
本发明中，术语“金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）”是一种革兰氏阳性菌，隶属于葡萄球菌属。
本发明中，术语“化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes，S.pyogenes）”是一类以人作为宿主的链球菌，广泛存在于人的粪便和鼻咽部位，可引起从普通非侵袭性疾病到侵袭性和严重侵袭性疾病的常见人类专性致病菌。
为了有效检测出上述呼吸道病原菌，本发明提供了一种检测呼吸道病原菌的试剂盒及其应用，并且本发明通过引入单分子识别标签序列，可以实现对不同检测目标的半定量检测，特异性更强、准确性更高，同时结果容易判读，在呼吸道病原体检测方面有较大的应用价值。
本发明技术方案包括：
第一方面，本发明提供了一种检测呼吸道病原菌的引物组合，所述的引物组合包括铜绿假单孢菌的上游引物、铜绿假单孢菌的下游引物、鲍曼不动杆菌的上游引物、鲍曼不动杆菌的下游引物、肺炎链球菌的上游引物、肺炎链球菌的下游引物、金黄色葡萄球菌的上游引物、金黄色葡萄球菌的下游引物、化脓性链球菌的上游引物、化脓性链球菌的下游引物；
所述的铜绿假单孢菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的铜绿假单孢菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的鲍曼不动杆菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的鲍曼不动杆菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的肺炎链球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的肺炎链球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的金黄色葡萄球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述的金黄色葡萄球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的化脓性链球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述的化脓性链球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
又一方面，本发明提供了上述的引物组合在制备用于检测呼吸道病原菌的试剂盒中的应用。
又一方面，本发明提供了一种检测呼吸道病原菌的试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面的引物组合。
优选地，所述的呼吸道病原菌包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿色假单胞菌和化脓性链球菌。
优选地，所述的试剂盒中包括正向引物F1和反向引物R1；
进一步优选地，所述的正向引物F1包括连接序列Read 1、单分子识别标签序列SMB和上述的上游引物序列，三者按5'-3'方向首尾连接。
进一步优选地，所述的连接序列Read 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
进一步优选地，所述的单分子识别标签SMB的序列为NNNNNNNN，其中N代表A、T、C、G任一种。
优选地，所述的正向引物F1的序列碱基组成如下(5'-3')：
F1：CTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:11）+ SMB +Primer F。
优选地，所述的反向引物R1包括连接序列Read 2和上述下游引物序列，二者按5'-3'方向首尾连接。
进一步优选地，所述的连接序列Read 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
优选地，所述的反向引物R1的序列碱基组成如下(5'-3')：
R1：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC（SEQ ID NO:12）+Primer R。
优选地，所述的试剂盒包括第二轮PCR扩增引物，所述的第二轮PCR扩增引物包括正向引物F2和反向引物R2；所述的正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述的反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
具体的，所述的反向引物R2的序列碱基组成如下(5'-3')：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT+Index+GTGACTGGAGTTCAGACGTGT（SEQ ID NO:14）；
具体地，所述的Index为样本识别条码序列。所述的Index的核苷酸序列为适用于Illumina测序仪的任意一种Index。
可选地，所述的试剂盒中还可以包括Phanta Flash Super-Fidelity DNAPolymerase、dNTP以及MgCl2优化的缓冲体系。
具体地，所述的缓冲液选自Tris缓冲液、硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液中的至少一种。
优选地，所述的检测呼吸道病原菌的反应体系按照体积份数包括以下组分：上述的引物组合1-5份、高保真酶缓冲液20-30份；所述的检测呼吸道病原菌的反应体系按照重量份数包括模板1-5份。
进一步优选地，所述的检测呼吸道病原菌的反应体系按照体积份数包括以下组分：上述的引物组合2份、高保真酶缓冲液25份；所述的检测呼吸道病原菌的反应体系按照重量份数包括模板2份。
优选地，所述的上游引物的体系终浓度为10 μM；
优选地，所述的下游引物的体系终浓度为10 μM；
优选地，检测呼吸道病原菌的反应体系的总体积为50 μL。
优选地，所述的试剂盒的第一轮PCR扩增反应程序为：98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环20次；72℃后延伸1 min，循环1次，4℃保存。
进一步优选地，所述的试剂盒的第二轮PCR扩增反应程序为：98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环6次；72℃后延伸1 min，循环1次，4℃保存。
优选地，使用试剂盒的测序结果鉴定待测样本中的呼吸道病原菌的分析步骤如下：
（1）去除低质量及过短序列；
（2）剩余序列与病原微生物靶标序列进行比对；
（3）统计准确比对上相应靶标的读取数；
（4）分析相同读取数对应的SMB序列，若SMB序列相同，可认为来源于同一母链模板；
（5）统计不同读取数分别对应不同SMB数量；
（6）识别病原微生物靶标序列cut off值应为准确比对读取数大于3且SMB大于1。
优选地，本发明提供了一种呼吸道病原菌的检测方法，包括以下步骤：
S1，获得病原微生物的DNA；
S2，以病原微生物的DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-10的引物组合进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；
S3，以步骤S2获得的第一轮PCR扩增产物为模板，利用正向引物F2和反向引物R2进行第二轮PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物；
S4，对S3获得的第二轮PCR扩增产物进行高通量测序，根据测序结果鉴定待测样本中的呼吸道病原菌。
具体地，所述的S2中的第一轮PCR扩增包括第一轮PCR扩增引物；
进一步具体地，所述的第一轮PCR扩增引物包括正向引物F1和反向引物R1。
优选地，所述的S2中第一轮PCR扩增反应使用的模板DNA含量为100 pg。
优选地，所述的S2中第一轮PCR扩增反应的体系包括：
模板DNA 100 pg，2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，Primer F1 Mix 2 μL，Primer R1 Mix 2 μL。
其中，所述Primer Mix即为所述引物组合，各引物等比例混合，各引物的终浓度为10 μM，体积为2 μL，RNase-free ddH2O补水至50 μL。
具体地，所述的S3中第二轮PCR扩增反应体系包括：第一轮PCR扩增的DNA产物为模板，2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，10 μM上游引物2 μL，10 μM下游引物2 μL，RNase-free ddH2O补水至50 μL。
在本发明的一些实施方案中，在第一轮PCR扩增结束后和第二轮PCR扩增结束后，分别对第一轮PCR扩增产物和第二轮PCR扩增产物进行纯化。
具体地，所述的纯化方式包括但不限于酶消化法、磁珠纯化法。
在本发明的一些实施方案中，使用诺唯赞磁珠进行所述的纯化。
具体地，所述的S4中，对S3得到的第二轮PCR扩增产物进行高通量测序之前，包括文库质控的步骤。
进一步具体地，所述的文库质控包括但不限于使用QPCR测定文库浓度、AgilentBioanalyzer 2100测定文库片段大小。
在本发明的一些实施方案中，所述高通量测序为Illumina测序方法进行，包括但不限于Illumina MiSeq、Nova Seq测序平台。
在本发明的一些实施方案中，所述的呼吸道病原菌的检测方法是基于非诊断、非治疗目的的方法。
本发明的有益效果包括：
（1）准确性高：本发明通过SMB单分子标签序列设计，对每个原始模板核酸进行标记，可以实现每个原始模板核酸只对应一个SMB标签，以校正每个检测目标PCR扩增错误，可对病原微生物进行半定量，检测准确性高。
（2）灵敏度高：本发明采用的引物组合和方法，通过多重PCR富集病原菌靶标，可检测样本中存在的微量核酸，检测灵敏度高。
（3）成本低：本发明仅对检测范围内的靶标病原菌进行多重PCR测序，与现有技术中广泛采用的mNGS方法相比，无人源基因组污染，所需测序数据量低，因此本发明成本相对较低。
（4）通量高：本发明针对同一份样本，一次可检测多种病原细菌，而且在一次测序中，可实现多份样本同时检测。
附图说明
图1为100 pg起始Agilent Bioanalyer 2100检测结果图。
图2为10 pg起始Agilent Bioanalyer 2100检测结果图。
图3为1 pg起始Agilent Bioanalyer 2100检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1检测呼吸道细菌的引物
1、本实施例针对铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌，分别设计正向（F）和反向（R）两条扩增引物，具体如下表1所示：
表1 病原微生物扩增引物
Figure SMS_1
实施例2 呼吸道病原菌的检测
病原细菌的DNA购自北京北纳创联生物技术研究院，利用实施例1的引物组合进行检测。
具体实施步骤如下：
（1）以病原细菌的DNA为模板进行第一轮扩增；
在进行第一轮PCR扩增时，包括正向引物F1和反向引物R1，正向引物F1包括连接序列Read 1、单分子识别标签序列SMB和靶基因特异引物Primer F，三者按5 '-3 '方向首尾连接。
连接序列Read 1：CTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:11）；
正向引物F1的序列碱基组成如下(5'-3')：
F1：CTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:11）+ SMB +Primer F ；
其中SMB即为单分子识别标签，序列为NNNNNNNN，其中N代表A、T、C、G任一种。
反向引物R1包括Read 2和靶基因特异引物Primer R，按5'-3'方向首尾连接。
连接序列Read 2：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC（SEQ ID NO:12）；
反向引物R1的序列碱基组成如下(5'-3')：
R1：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC（SEQ ID NO:12） +Primer R。
（2）以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增；扩增后即可得到满足测序要求的文库。
第二轮PCR扩增的引物包括正向引物F2和反向引物R2。
正向引物F2的序列碱基组成如下(5'-3 ')：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCC+CTACACGACGCTC（SEQ ID NO:13）；
反向引物R2：
R2的序列碱基组成如下(5'-3')：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT+Index+GTGACTGGAGTTCAGACGTGT（SEQ ID NO:14）；
其中，Index的核苷酸序列为适用于Illumina测序仪的任意一种Index。
（3）靶标基因多重PCR第一轮扩增；
反应体系配制靶标基因多重PCR扩增体系：
病原菌模板DNA Mix按照100 pg起始，2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，10 μM上游引物组合物2 μL，10 μM下游引物组合物2 μL，RNase-free ddH2O补水至50 μL。
反应体系具体如下表2：
表2 第一轮PCR反应体系
Figure SMS_2
按如下条件设置靶标基因多重PCR扩增程序：
98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环20次；72℃后延伸1 min，循环1次；4℃保存。
（4）靶标基因多重PCR第一轮扩增产物纯化；
PCR扩增产物纯化使用诺唯赞磁珠，包括以下步骤：
①将诺唯赞磁珠提前30 min从4℃冰箱中取出，颠倒混匀后静置使其温度平衡至室温。
②待诺唯赞磁珠充分混匀后，向0.2 mL低吸附EP管加入1×诺唯赞磁珠，转移全部PCR产物至EP管中，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5 min。
③将管置于磁力架上约2 min，直至液体澄清，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
④加入200 μL80%乙醇，静置30 sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
⑤加入200 μL80%乙醇，静置30 sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠，短暂离心。置于磁力架上约2 min，待磁力架吸附磁珠后，用20 μL移液器将管底残留液体吸取，不要吸到磁珠。
⑥室温晾干2-5 min，至磁珠表面不反光，勿让磁珠晾干至出现裂痕。
⑦从磁力架上取下EP管，加入20 μL无菌水，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，短暂离心，将管置于磁力架上2 min直至液体澄清，小心吸取上清，注意不要吸到磁珠，并转移至新的0.2 mL无菌EP管中。
（5）靶标基因多重PCR第二轮扩增；
以第一轮PCR扩增的DNA产物为模板，2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，上游引物 (10 μM) 2μL，下游引物 (10 μM) 2 μL，RNase-free ddH2O补水至50 μL。
按如下条件设置靶标基因多重PCR扩增程序：
98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环6次；72℃后延伸1 min，循环1次；4℃保存。
（6）靶标基因多重PCR第二轮扩增产物纯化；
PCR扩增产物纯化使用诺唯赞磁珠，采用双筛的纯化方式纯化：
①将诺唯赞磁珠提前30 min从4℃冰箱中取出，颠倒混匀后静置使其温度平衡至室温。
②待诺唯赞磁珠充分混匀后，向0.2 mL低吸附EP管加入35 μL诺唯赞磁珠，转移一定的PCR产物至EP管中，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5 min。
③将管置于磁力架上约2 min，直至液体澄清，用移液器小心吸取上清转移至新的0.2 mL低吸附EP管，不要吸到磁珠。
④向上一步的0.2 mL低吸附EP管中加入10 μL诺唯赞磁珠，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5 min。
⑤将管置于磁力架上约2 min，直至液体澄清，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
⑥加入200 μL80%乙醇，静置30 sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠。
⑦加入200 μL80%乙醇，静置30 sec，用移液器小心吸弃上清，不要吸到磁珠，短暂离心。置于磁力架上约2 min，待磁力架吸附磁珠后，用20 μL移液器将管底残留液体吸取，不要吸到磁珠。
⑧室温晾干2-5 min，至磁珠表面不反光，注意勿让磁珠晾干至出现裂痕。
⑨从磁力架上取下EP管，加入16 μL无菌水，低速涡旋振荡混合均匀，室温静置5min，短暂离心，将管置于磁力架上2 min直至液体澄清，小心吸取上清，注意不要吸到磁珠，并转移至新的0.2 mL无菌EP管中。
（7）文库质控
取1 μL第二轮纯化后的PCR扩增产物进行QPCR定量检测；
QPCR定量检测包括以下步骤：
采用绝对定量，准备好标准品，配制体系，选择上机程序进行检测，根据构建的标准曲线和检测结果计算出文库样本的浓度。
定量结果如表3所示：
表3 样本文库QPCR定量结果
Figure SMS_3
取1 μL第二轮纯化后的PCR扩增产物，使用Agilent Bioanalyzer 2100测定文库片段大小，如图1-3所示。
实验步骤：
按照Agilent Bioanalyzer 2100说明制备好芯片，加入1 μL待测样本，于混匀仪中混匀1 min，打开2100检测仪，点击软件打开页面，将芯片放于芯片槽内，固定好后关上机盖。选择好特定程序，开始运行。
把所有文库按照一定比例混合到一个小管中，混为终浓度≥ 3 nM的总文库。
文库质控的标准为：
1）浓度≥3 nM（QPCR定量浓度）；
2）文库检测后剩余体积≥10 μL；
3）检测结果显示无明显adaptor dimer（130 bp 附近起峰）；
4）检测结果显示文库主带集中、单一，且与参考大小接近。
（8）高通量测序
使用Illumina测序平台将上述所得的文库进行上机测序；
上机测序包括以下步骤：
1）变性
将上面做好的混合文库和Illumina测序试剂Phix（用于平衡碱基）一起变性。
2）Flow cell装在一个盐溶液的小管中，拿出来用超纯水反复冲洗，把盐溶液都冲洗干净。然后用擦镜纸小心地擦干净待用。
3）打开Illumina experiment manager软件，选择测序仪等程序，放入各种试剂，flow cell，缓冲液和废液瓶，确认无误后点击Start Run开始运行。
（9）数据分析
下机数据分析步骤如下：
1）使用FastQC去除低质量及过短序列；
2）过滤后剩余序列与病原微生物靶标序列进行比对；
3）统计准确比对上相应靶标的reads数；
4）分析相同reads对应的SMB序列，若SMB序列相同，可认为来源于同一母链模板。
5）统计不同reads分别对应不同SMB数量，即为某种检测目标初始的数量。
6）识别病原微生物靶标序列cut off值应为准确比对reads数大于3且SMB大于1。
实验结果：
本实施例设置的模板起始量为100 pg，检测结果如下表4所示；
表4 实施例1测序结果数据统计
Figure SMS_4
检测结果说明：
准确性：
以100 pg模板起始量，从检测到的reads数来看，reads数量不一，金黄色葡萄球菌检测到的reads数最多，为149,962条；化脓性链球菌检测到的reads数最少，为16,940条。但是从检测到SMB的数量来看，五种菌检测对应的分子标签检测到的数量相差不大，化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌检测到SMB数量的分别为3,043和2,412条，由于投入的模板量基本一致，reads数体现的是扩增后产物的所有的条数，而SMB的数量体现的是反应投入的模板量，因此SMB数量更能体现真实的模板量。本发明通过SMB单分子标签序列设计，对每个原始模板核酸进行标记，以校正每个检测目标PCR扩增错误，同时减少了引物扩增效率不同的影响，检测结果的准确性更高。
对比例1
对比例1与上述的实施例1的区别在于，引物组合物换成已报道的检测呼吸道病原菌的引物组合，其他条件不变。
引物序列如下表5所示：
表5 已报道的检测呼吸道病原菌的引物
Figure SMS_5
实施例3
使用实施例2中的检测步骤检测实施例1的引物组合和对比例1的引物组合的灵敏性。
灵敏性：
本实施例3同时设置了不同的模板起始量，分别为100 pg、10 pg和1 pg以检测实施例1和对比例1引物组合的灵敏性。
实施例1的检测结果如下表6所示；
表6 实施例1引物组合测序结果数据统计
Figure SMS_6
对比例1的实验结果如下表7-8所示：
表7 对比例1文库QPCR定量结果
Figure SMS_7
表8 对比例1引物组合测序结果数据统计
Figure SMS_8
从灵敏度实验结果表中可以看出，使用本申请的引物组合，病原菌能检测出更多的reads数和SMB数，说明本申请的引物组合特异性更好、更灵敏的特点。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种检测呼吸道病原菌的引物组合，其特征在于，所述的引物组合包括铜绿假单孢菌的上游引物、铜绿假单孢菌的下游引物、鲍曼不动杆菌的上游引物、鲍曼不动杆菌的下游引物、肺炎链球菌的上游引物、肺炎链球菌的下游引物、金黄色葡萄球菌的上游引物、金黄色葡萄球菌的下游引物、化脓性链球菌的上游引物和化脓性链球菌的下游引物；
所述的铜绿假单孢菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的铜绿假单孢菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的鲍曼不动杆菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的鲍曼不动杆菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的肺炎链球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的肺炎链球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的金黄色葡萄球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述的金黄色葡萄球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的化脓性链球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述的化脓性链球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合在制备用于检测呼吸道病原菌的试剂盒中的应用。
3.一种检测呼吸道病原菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的呼吸道病原菌包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿色假单胞菌和化脓性链球菌。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括正向引物F1和反向引物R1；
所述的正向引物F1包括连接序列Read 1和单分子识别标签序列SMB；
所述的连接序列Read 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述的单分子识别标签SMB的序列为NNNNNNNN，其中N代表A、T、C、G任一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的反向引物R1包括连接序列Read2；所述的连接序列Read 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括第二轮PCR扩增引物，所述的第二轮PCR扩增引物包括正向引物F2和反向引物R2；所述的正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述的反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的第一轮PCR扩增反应程序为：98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环20次；72℃后延伸1 min，循环1次。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的第二轮PCR扩增反应程序为：98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环6次；72℃后延伸1 min，循环1次。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，使用试剂盒的测序结果鉴定待测样本中的呼吸道病原菌的分析步骤如下：
（1）去除低质量及过短序列；
（2）剩余序列与病原微生物靶标序列进行比对；
（3）统计准确比对上相应靶标的读取数；
（4）分析相同读取数对应的SMB序列，若SMB序列相同，可认为来源于同一母链模板；
（5）统计不同读取数分别对应不同SMB数量；
（6）识别病原微生物靶标序列cut off值应为准确比对读取数大于3且SMB大于1。
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