CN118119278A - 生产用于环境储存的发酵乳制品的方法 - Google Patents

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CN118119278A CN202280067249.7A CN202280067249A CN118119278A CN 118119278 A CN118119278 A CN 118119278A CN 202280067249 A CN202280067249 A CN 202280067249A CN 118119278 A CN118119278 A CN 118119278A
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Abstract

本发明是乳制品技术领域。本发明涉及生产包含活细菌的发酵乳制品的方法，该发酵乳制品在环境温度下储存时没有后酸化或后酸化程度较低/减少。本发明还涉及通过该方法生产的发酵乳制品。

Description

生产用于环境储存的发酵乳制品的方法
技术领域
本发明涉及用于生产发酵乳制品的方法。特别是用于环境储存的含活细菌的低后酸化的发酵乳制品。
背景技术
发酵乳制品及其生产方法是本领域已知的。一般来说，发酵乳制品需要在低温下储存和配送，以防止起子培养物中包含的菌株在生产完成后进一步发酵和酸化(即后酸化)，并降低任何会导致产品变质的有害微生物的活性。在冷藏和配送困难或不理想的地区，已经开发出用于生产在环境温度下或多或少稳定的发酵乳制品的方法。特别是，控制后酸化的方式已经得到解决。
已经描述了包括灭活起子培养物菌株和不需要的微生物的步骤的方法，并且传统上应用热处理作为灭活步骤。然而，热可能会影响产品特性，如外观、质地、风味等。
在一些国家，立法要求在产品中存在活细菌，才能将其标记为“酸奶”。此外，产品中某些活细菌如益生菌的存在可能为制造商提供了声称有健康益处的理想选择。然而，由于特别是后酸化所致，活细菌的存在特别是在环境温度下提供了挑战。
例如，乳糖缺乏型菌株的使用已被应用于一些旨在减少所生产产品后酸化的方法中。
US10072310(Ling)涉及一种制备在环境温度下保持高活细胞计数的发酵乳饮料的方法，包括使用乳糖缺乏型菌株ATCC53103。
WO2005/089560(Nestec S.A.)描述了包含不能使用乳糖作为营养物的活微生物的耐储存的乳制品以及制造这种产品的方法。然而，已描述的是用单一菌株CNCM I-2116进行的仅仅一步发酵。
WO2019/092064(Tetra Laval Holdings&Finance S.A)描述了用于生产包含用于环境配送的发酵乳制品的包装的方法，该发酵乳制品包含活的专用培养物(不含可消耗乳糖的细菌)。
WO2019/206754(Chr.Hansen)描述了通过用乳糖缺乏型菌株发酵乳基质并随后添加益生菌菌株来生产乳制品的方法。
然而，仍然需要生产包含活细菌的发酵乳制品的改进方法，当在环境温度下储存时，这些产品没有后酸化或后酸化程度较低/减少。
发明内容
本发明提供了一种发酵乳制品的制备方法。
在第一发明中，本发明提供一种用活细菌生产发酵乳制品的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供包含至少一种碳水化合物的乳基质和包含一种或更多种乳酸菌菌株的第一培养物，该乳酸菌菌株能够代谢所述碳水化合物并产生至少一种单糖；
(b)在不超过45℃的第一温度发酵乳基质一段时间直至达到不超过pH 4.7的第一目标pH，以获得包含至少一种单糖的第一发酵乳基质；
(c)处理第一发酵乳基质，从而使第一培养物中包含的菌株失活或去除；
(d)将包含一种或更多种乳酸菌菌株的第二培养物添加到经处理的第一发酵乳基质中，其中所述菌株是乳糖缺乏型的并且能够代谢在第一次发酵期间产生的至少一种单糖；
(e)在不超过45℃的第二温度发酵经处理的第一发酵乳基质一段时间直至达到不超过pH 4.4的第二目标pH，以获得发酵乳制品，其中第二目标pH是通过消耗至少一种单糖来确定的，并且其中第二目标pH低于第一目标pH。
在第二发明中，本发明提供通过该方法制造的发酵乳制品。
定义
在更详细地概述本发明之前，定义一组术语及约定：
术语“乳”应理解为通过对动物(如任何哺乳动物，包括但不限于奶牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、lama、母马和鹿)挤奶而获得的乳汁。在优选的实施方式中，乳是牛乳。
本文所用的“均质化”是指充分混合以获得可溶性悬浮液或乳液。如果在发酵前进行均质化，则可以将乳脂分解成更小的尺寸，使其不再与乳分离。这可以通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。
本文所用的“巴氏灭菌”是指对乳基质进行处理，以减少或消除活生物体如微生物的存在。优选地，巴氏灭菌是通过在规定的时间段内保持规定的温度来实现的。通常通过加热达到指定的温度。可以选择温度和持续时间以杀死或灭活某些细菌，如有害细菌。随后可能会进行快速冷却步骤。
在本发明的上下文中，术语“起子培养物”是一种培养物，它是一种或更多种细菌菌株(如乳酸菌菌株)的制剂(组合物)，以帮助发酵过程的开始，从而制备发酵制品，如各种食品、饲料和饮料。
在本发明的上下文中，“酸奶起子培养物”是一种细菌培养物，其包含一种或更多种保加利亚乳杆菌菌株和一种或更多种嗜热链球菌菌株。根据本文，“酸奶”是指可通过用包含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株的组合物接种和发酵乳基质而获得的发酵乳制品。
在本发明的上下文中，术语“环境温度”或“室温”是指高于10℃；15℃；20℃；25℃；或在10℃至50℃；10℃制40℃；10℃至30℃；15℃至45℃；15℃至35℃；15℃至25℃；20℃至40℃；或20℃至30℃之间的温度。
就乳酸菌菌株而言，术语“CFU”或“cfu”是指通过在37℃厌氧条件下孵育3天的MRS琼脂平板上的生长(形成菌落)确定的菌落形成单位。参见实施例中与本发明相关使用的细节。
具体实施方式
发酵乳制品如酸奶，可以由脂肪和蛋白质含量标准化、均质化和巴氏灭菌的乳基质生产。在一般方法中，用包含选定微生物如乳酸菌(LAB)的起子培养物接种乳基质。发酵在规定条件(时间、温度、氧等)下进行，直至达到所需的目标pH，之后通常通过降低温度来终止发酵。发酵乳制品优选冷藏储存，通常在4℃。发酵乳制品的特点是用于发酵的特定起子培养物。
在缺乏发酵乳制品的冷运和/或冷藏时，或者在冷链不完善的情况下，不希望的酸化可能在发酵后继续，并导致pH降低，即乳制品中的后酸化。后酸化可能会使产品的性质发生不必要的变化，例如外观、味道和质地。此外，根据后酸化的程度，存在于产品中的任何细菌的生存能力可能会受到影响，导致生存能力降低甚至细菌死亡。
可以通过灭活包含在起子培养物中的微生物来防止由起子培养物引起的后酸化。然而，用活细菌(例如益生菌)生产产品的需求需要在灭活步骤后添加活细菌。添加的活细菌可以在室温或环境温度下继续使乳制品酸化，并使所述乳制品发生变化。
本发明涉及用于生产适于在环境温度下储存的发酵乳制品的两步发酵方法。目前制备发酵乳制品例如巴氏杀菌后酸奶(PPY)的方法较难减少最终产品中存在的活细菌引起的后酸化。令人惊讶的是，如本发明所证明的，在巴氏杀菌后加入的活细菌的酸化可以有利地用于发酵过程中以生产乳制品。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种用活细菌生产发酵乳制品的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供包含至少一种碳水化合物的乳基质和包含一种或更多种乳酸菌菌株的第一培养物，该乳酸菌菌株能够代谢所述碳水化合物并产生至少一种单糖；
(b)在不超过45℃的第一温度发酵乳基质一段时间直至达到不超过pH 4.7的第一目标pH，以获得包含至少一种单糖的第一发酵乳基质；
(c)处理第一发酵乳基质，从而使第一培养物中包含的菌株失活或去除；
(d)将包含一种或更多种乳酸菌菌株的第二培养物添加到经处理的第一发酵乳基质中，其中所述菌株是乳糖缺乏型的并且能够代谢在第一次发酵期间产生的至少一种单糖；
(e)在不超过45℃的第二温度发酵经处理的第一发酵乳基质一段时间直至达到不超过pH 4.4的第二目标pH，以获得发酵乳制品，其中第二目标pH是通过消耗至少一种单糖来确定的，并且其中第二目标pH低于第一目标pH。
乳基质可以是任何原料和/或加工的乳成分或衍生自乳的其他材料，其可以根据本发明的方法进行发酵。因此，有用的乳基质包括但不限于任何含有蛋白质的乳或乳样产品的溶液或悬浮液，如全脂乳(whole milk)、全脂奶(full fat milk)、无脂乳、低脂乳、脱脂乳、酪乳、降乳糖乳、浓缩乳、复原乳粉、炼乳、乳粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、乳糖结晶母液、乳清蛋白浓缩物或奶油。显然，乳基质可以来源于任何哺乳动物，例如基本上纯的哺乳动物乳或复原乳粉。优选地，乳基质中的至少一部分蛋白质是哺乳动物乳中天然存在的蛋白质，如酪蛋白或乳清蛋白。
在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中乳基质来源于动物，例如哺乳动物。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中哺乳动物选自由奶牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、lama、母马和鹿组成的组。在优选的实施方式中，哺乳动物是奶牛。
在发酵之前，可以根据本领域已知的方法对乳基质进行均质化和巴氏灭菌。
源自哺乳动物的乳基质包含乳糖作为主要碳水化合物。乳糖在发酵过程中被乳酸菌水解为单糖葡萄糖和半乳糖。如果乳酸菌不能代谢乳糖，即是乳糖缺乏型的，则可能需要向乳基质中添加合适的碳水化合物以获得至少一种碳水化合物，用于产生至少一种可用于第二次发酵的乳酸菌的单糖。
术语“乳糖缺乏型”在本发明的上下文中用于表征部分或完全丧失了使用乳糖作为维持细胞活力或细胞生长来源的能力的乳酸菌。乳糖缺乏型细菌能够代谢一种或更多种选自蔗糖、半乳糖、葡萄糖和/或其他可发酵碳水化合物的碳水化合物。由于这些碳水化合物存在于乳中的天然含量不足以支持乳糖缺乏型细菌的发酵，因此必须将其添加到乳基质中。
要添加的合适的碳水化合物由第一培养物的一种或更多种乳酸菌和第二培养物的一种或几种乳酸菌必须可获得的单糖来确定。合适的碳水化合物的实例是乳糖、蔗糖、麦芽糖或海藻糖。蔗糖水解成单糖葡萄糖和果糖，麦芽糖水解成葡萄糖，海藻糖水解成葡萄糖。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中乳基质中的至少一种碳水化合物选自乳糖、蔗糖、麦芽糖或海藻糖。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中乳基质中的至少一种碳水化合物是添加到乳基质中的。
存在于乳基质中的碳水化合物的量必须足以进行第一次发酵以产生至少一种必须可用于第二次发酵的单糖。然而，如果第二培养物的一种或更多种乳酸菌能够代谢碳水化合物，则碳水化合物的量不能过量。在第一和第二培养物二者的乳酸菌都能够代谢碳水化合物的情况下，必须选择所述碳水化合物的量，即限制碳水化合物在第一次发酵后被耗尽，或者作为选择在第二次发酵达到第二目标pH时被耗尽。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中至少一种碳水化合物的量在第一次发酵期间被耗尽。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中当第二次发酵达到第二目标pH时，至少一种碳水化合物的量被耗尽。
当第一培养物被添加到乳基质中时，第一次发酵开始。第一培养物可以是任何起子培养物，例如酸奶起子培养物。本发明上下文中使用的术语“起子”或“起子培养物”是指一种或更多种食品级微生物，特别是乳酸菌的培养物，其负责乳基质的酸化。起子培养物可以是新鲜的、冷冻的或冷干的。在一个实施方式中，本发明涉及所一种方法，其中第一培养物的一种或更多种乳酸菌菌株选自链球菌属如嗜热链球菌，或乳酸杆菌属如德氏乳杆菌保加利亚亚种。
第一培养物的一种或更多种乳酸菌菌株可以是乳糖缺乏型的。合适的乳糖缺乏菌株的实例可以在WO2015/193459中找到。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中第一培养物的一种或更多种乳酸菌菌株是乳糖缺型的。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中第一培养物的乳糖缺乏性菌株选自由：DSM28952、DSM28953、DSM28910、DSM32600、DSM32599组成的组。
当已经产生足够量的至少一种单糖时，终止第一次发酵。当已经达到第一目标pH时，终止第一发酵。第一目标pH必须高于第二目标pH，并且必须被选择为提供允许在第二次发酵期间进一步酸化的pH范围。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中第一目标pH为不超过pH 4.70；4.65；4.60；4.55；4.50；4.45；4.40；或在pH 4.70-4.00；4.70-4.10；4.70-4.20；4.70-4.30；4.70-4.40；4.70-4.45；4.65-4.50；4.60-4.55的范围内；或为约4.70；4.65；4.60；4.55；4.50；4.45；或4.40。
温度影响发酵的速度，在第一次发酵期间应优选保持稳定或恒定在限定的温度。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中第一温度为不超过25℃；30℃；35℃；36℃；37℃；38℃；39℃；40℃；41℃；42℃；43℃；44℃；45℃；或在20℃至45℃；25℃至45℃；30℃至45℃；40℃至45℃；25℃至40℃；30℃至40℃；35℃至40℃的范围内；或为约20℃；25℃；30℃；35℃；36℃；37℃；38℃；39℃；40℃；41℃；42℃；43℃；44℃；45℃。
为了终止和防止第一培养物的进一步发酵，必须将其灭活或去除。第一发酵乳基质可以通过数种方式失活。在一个实施方式中，本发明涉及所述方法，其中第一发酵乳基质的处理是用热、超声、辐射例如UV辐射、离心法除菌或微滤进行的处理。用热进行的处理或热处理也可称为后巴氏灭菌。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中热处理在65℃至75℃的范围内进行至少1分钟至30分钟；或在至少60℃；65℃；70℃；或75℃进行1分钟；5分钟；10分钟；15分钟；20分钟；25分钟；或30分钟；或在70℃至90℃的范围内进行10秒至50秒；或在至少70℃；75℃；80℃；85℃；或90℃进行至少10秒；15秒；20秒；25秒；30秒；35秒；40秒；45秒；或50秒；或在65℃至90℃；70℃至85℃；75℃至80℃的范围内进行10秒至50秒；或在75℃进行25秒；75℃进行50秒。
在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中通过冷却步骤终止第一次发酵。优选地，冷却步骤所用的温度为约4℃，如2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。
优选地，在无菌条件下加入第二培养物，即不引入或引入最低限度的除第二培养物的一种或更多种乳酸菌以外的任何微生物。第二培养物可以作为一个或多个料块或作为连续进料加入到生产线中。第二培养物可以以液体培养物、冷冻培养物或冻干培养物的形式加入。优选地，培养物是浓缩培养物。
第二培养物的一种或更多种乳酸菌菌株是乳糖缺乏型的，并且代谢至少一种在第一次发酵期间产生的单糖。因此，当至少一种单糖已经从第一发酵乳基质中耗尽并且已经达到第二目标pH时，终止第二次发酵。在一个实施方式中，本发明涉及所述方法，其中第二目标pH为不超过pH 4.5；4.4；4.3；4.2；4.1；4.0；3.9；3.8；3.7；3.6；3.5，或在pH 4.50至3.50；4.50至4.05；4.45至4.10；4.45至4.15；4.40至4.20；4.40至4.25；4.35至4.30；4.00至3.50；3.95至3.50；3.90至3.55；3.85至3.60；3.80至3.65；3.75至3.60的范围内；或为约pH4.40；4.35；4.30；4.25；4.20；4.15；4.10；4.05；4.00；3.90；3.80；3.70；3.60；3.50。
在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中第二培养物的一种或更多种乳酸菌选自由乳酸杆菌属如嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、发酵粘液乳杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌和约氏乳杆菌；双歧杆菌属如长双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌动物乳亚种、齿双歧杆菌、链状双歧杆菌、角双歧杆菌、大双歧杆菌、假小链双歧杆菌和婴儿双岐杆菌；或链球菌属如嗜热链球菌的细菌组成的组。
食用益生菌被认为对个人健康有益。因此，发酵乳制品中一定量的活益生菌是合乎需要的。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中第二培养物的一种或更多种乳酸菌是益生菌。
第二培养物的一种或更多种乳酸菌菌株是乳糖缺乏型的，可以选自由：ATCC53103、CNCM I-2116和DSM16572组成的组。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中细菌是ATCC53103、CNCM I-2116和/或DSM16572。
本发明的方法已显示产生没有后酸化或后酸化程度较低/减少的发酵乳制品。在实施例中，这显示为在时间t1之后的储存期中酸化的变化。这可能导致产品中测得的pH发生变化。pH的变化可以是pH的增加或pH的降低。后酸化总是表示为pH的下降。
在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中发酵乳制品在25℃储存6个月后的pH变化为小于0.80；0.70；0.60；0.50；0.40；0.35；0.30、0.25、0.20、0.18、0.16、0.14、0.12、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01pH单位。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中发酵乳制品在37℃储存2个月或在42℃储存1个月后pH变化为小于0.80；0.70；0.60；0.50；0.40；0.35；0.30、0.25、0.20、0.18、0.16、0.14、0.12、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0,04、0.03、0.02或0.01pH单位。
在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中发酵乳制品在25℃储存6个月后包含至少1.0E+03；1.0E+04；1.0E+05；1.0E+06；1.0E+07；1.0E+08；1.0E+09；1.0E+10cfu/g活细菌。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中发酵乳制品在37℃储存2个月或在42℃储存1个月后包含至少1.0E+06cfu/g活细菌。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中发酵乳制品在45℃储存2、3、4或5周后包含至少1.0E+07cfu/g活细菌。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中活细菌包含或含有益生菌。
在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中第二培养物的一种或更多种乳酸菌能够在第二发酵期间或在第二次发酵期间和之后两种情况增殖并增加细胞计数。在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中细胞计数增加0.5；1.0；1.5；2.0；2.5；或3.0logs。
在一个实施方式中，本发明涉及的方法进一步包括添加调味剂、增稠剂、乳化剂和/或稳定剂，例如果胶(例如HM果胶、LM果胶)、明胶、CMC、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、卡拉胶、藻酸盐、琼脂和瓜尔胶。在一个实施方式中，本发明涉及的方法进一步包括添加甜味剂，如化学/人工甜味剂(三氯蔗糖、异麦芽酮糖、安赛蜜钾等)、糖醇(麦芽糖醇或异麦芽糖醇l(12-碳)、赤藓糖醇(4-碳)、木糖醇(5-碳)、山梨醇(6-碳)等)。糖醇的碳数不同，且在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中糖醇选自由4-碳、5-碳、6-碳或12-碳糖醇组成的组。在一个实施方式中，本发明涉及的方法进一步包括糖醇赤藓糖醇和/或麦芽糖醇。在一个实施方式中，赤藓糖醇：麦芽糖醇的质量比为(0.5-4.0):(0-4.0)。基于发酵乳制品的总重量，糖醇的使用总量可为0.5-8.0、2.5-6.0或4.5w/w％。
在一个实施方式中，本发明涉及通过该方法制造的发酵乳制品。本文所用的术语“发酵乳制品”是指食品或饲料，其中食品或饲料的制备涉及用本发明的乳酸菌发酵乳基质。本文使用的“发酵乳制品”包括但不限于乳制品如酸奶。在一个实施方式中，本发明涉及发酵乳制品品，其是食品或饲料。在一个实施方式中，本发明涉及发酵乳制品，其是乳制品如酸奶(凝固或搅拌)；希腊酸奶；基于酸奶的产品，如水果酸奶和基于酸奶的饮料；酪乳；克非尔；浓缩酸奶、夸克。优选地，发酵乳制品是酸奶。
在一个实施方式中，本发明涉及发酵乳制品，其中所述产品是环境储存的发酵乳制品。术语“环境储存的发酵乳制品”是指适合环境储存一段时间的发酵乳制品。储存期可以为1至12个月，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
发酵乳产品通常含有2.0％w/w至3.5％w/w水平的蛋白质。发酵乳制品可以是蛋白质水平为1.0％w/w至2.0％w/w的低蛋白质产品。作为选择，发酵乳制品可以是蛋白质水平高于3.5％w/w或5.1％w/w，例如为3.5％w/w至5.1％w/w、3.5％w/w至10.5％w/w或5.1％w/w至10.5％w/w的高蛋白质产品。蛋白质可以来源于乳，例如乳清或酪蛋白。
建议摄入一定量的益生菌以获得健康益处。因此，希望发酵乳制品包含一定水平的益生菌。在一个实施方式中，本发明涉及该发酵乳制品，其中所述产品包含至少1.0E+05；1.0E+06；1.0E+07；1.0E+08；1.0E+09；1.0E+10；1.0E+11；1.0E+12cfu/份的益生菌。
分类学
应注意的是，乳酸杆菌属的分类学在2020年进行了更新。新的分类学公开于Zheng等人的2020Int.J.Syst.Evol.Microbiol.DOI 10.1099/ijsem.0.004107中，如果未另行说明，将与本文一致。为了本发明的目的，下表提供了与本发明相关的一些乳杆菌物种的新名称和旧名称的列表。
表1.与本发明相关的乳酸杆菌物种的新名称和旧名称。
表2.菌株
菌株 参考
ATCC53103 US10072310
CNCM I-2116 WO2005/089560
DSM16572 WO2017/194650
DSM28910 WO2015/193459
DSM28952 WO2015/193459
DSM28953 WO2015/193459
DSM32599 WO2019/043115
DSM32600 WO2019/043115
实施例
实施例1-YF-L904&LGG
用活细菌制备用于两步发酵环境酸奶的限定乳基质。限定乳基质适合于使用普通酸奶培养物作为第一发酵培养物。在这种限定乳基质发酵中，正常的酸奶培养物使用乳糖产生乳酸，同时半乳糖留在酸奶中。在不同的pH停止发酵，半乳糖的含量会有所不同。采用热处理使第一培养物失活，将第二乳糖阴性培养物LGG无菌地加入经热处理的酸奶中，LGG使用第一次发酵留下的半乳糖以继续降低pH，当半乳糖发酵结束时，最终酸奶的pH保持在稳定的范围内，同时，LGG生长到高细胞数并在环境储存中保持稳定。
材料：
表3.乳基质
培养物
F-DVS YF-L904(批次3551191科汉森)
F-DVS(批次3584797科汉森)
方法：
根据上表制备乳基质，并在134℃巴氏灭菌4秒。
第一次发酵-将YF-L904 100u/T(单位/吨)接种到乳基质中，在43℃发酵，直至达到第一目标pH 4.7、4.6或4.5。
打碎凝乳，在75℃加热处理三种不同pH的酸奶基质25秒。
第二次发酵-将F-DVS-LGG无菌接种到三种不同pH的巴氏酸奶中，剂量为100u/T(时间t0)。在25℃、30℃或35℃进行第二次发酵，直至达到稳定的pH。
储存-在25℃的环境温度
鼠李糖乳杆菌的细胞计数通过使用Difco-MRS琼脂、倾注平板法在37℃厌氧培养3天来测定。
结果：
表4. 35℃第二次发酵的后酸化
表5. 30℃第二次发酵的后酸化
表6. 25℃第二次发酵的后酸化
表7.LGG计数
YF-L904将乳中天然存在的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。葡萄糖被代谢，半乳糖留在乳基质中。LGG能够代谢半乳糖。
不同的第一目标pH导致不同的第二目标pH。第一次发酵终止的pH越高，第二次发酵达到稳定pH的pH就越高。因此，应根据最终产品的要求来确定第一目标pH。在第二次发酵期间LGG在高温下比在低温下(35℃对30℃和25℃)更快地达到稳定的pH。在所有第二次发酵温度下，LGG达到的细胞计数水平为>1.0E+08cfu/g。
实施例2-Acidifix&LGG，2次发酵期间温度的影响
在本实验中制备了含限量糖(0.75％)的乳基质。用Acidifix 1.0进行第一次发酵至稳定的pH。通过LGG进行第二次发酵。第二次发酵培养物代谢第一次发酵期间产生的单糖，以达到稳定的pH。第二次发酵在25℃、33℃和40℃进行，直至pH稳定。然后将产品储存在25℃，以检查不同时间间隔的细胞计数和后酸化。
材料：
表8.乳基质的含量
成分 规格 w/w％
鲜乳 3.8％脂肪，3.15％蛋白质 79.00
低脂乳 1.2％脂肪，3.15％蛋白质 13.60
脱脂乳粉 恒天然(Fonterra)，低热 0.55
糖(蔗糖) 精制糖 0.75
麦芽糖醇 Maltidex 16385 3.50
赤藓糖醇 Zerose 16952 1.00
Clearam CJ 5025 Roquette 1.50
果胶106-AS YA CP Kelco 0.10
培养物：
F-DVSAcidifixTM1.0(批次3586293，科汉森A/S)
F-DVS(批次3584797，科汉森A/S)
方法：
根据上表制备乳基质，并在134℃巴氏灭菌4秒。
第一次发酵-将含限量蔗糖(即0.75w/w)的乳基质与Acidifix 1.0 100u/t乳基质在43℃发酵，直至糖耗尽并达到稳定的pH，即4.50的第一目标pH。
热处理-在75℃持续49.2秒。
第二次发酵-将浓度为3.5E+06cfu/g LGG(1)或9.0E+06cfu/g LGG(2)的乳糖缺乏型LGG添加到包含在第一次发酵(时间t0)期间产生的单糖果糖的发酵乳基质中，并在25℃、30℃或40℃发酵，直到在约pH 4.3的第二目标pH达到稳定pH(时间t1)。
储存-在25℃的环境温度。
结果：
表9.根据本发明的方法pH随时间的变化，其中第二次发酵在25℃、33℃或40℃的温度下进行
2.培养物 t0 t1 第30天 第7周
LGG(1)25℃ 4.50 4.32 4.38 4.38
LGG(2)25℃ 4.50 4.34 4.40 4.38
LGG(1)33℃ 4.50 4.28 - 4.35
LGG(2)33℃ 4.50 4.34 - 4.38
LGG(1)40℃ 4.50 4.32 - 4.37
LGG(2)40℃ 4.50 4.34 - 4.38
表10.根据本发明的方法细胞计数随时间的变化，其中第二次发酵在25℃、33℃或40℃的温度下进行
第二培养物的发酵/酸化是本发明方法的一部分。LGG发酵/酸化经热处理的发酵乳基质，这从pH t0和pH t1之间的pH差可以明显看出。通过比较pH t1和pH第7周可以观察到，在储存期间没有发生进一步的发酵(后酸化)。在所有测试温度下均观察到稳定的pH。稳定的pH对于在保质期内保持产品的味道至关重要。
LGG在第二次发酵期间测试的两种LGG接种剂量下增殖，这从比较t0和t1的细胞计数显而易见。在环境温度(25℃)下储存7周显示出该产品的细胞计数保持稳定。稳定的细胞计数为最终用户提供了足够数量的活细菌。
实施例3-环境温度(25℃)下的储存稳定性
材料：
表11.乳基质
成分 规格 w/w％
鲜乳 蛋白质3.0％，脂肪3.4％ 92.65％
蔗糖 Taigu 0.75％
麦芽糖醇-P200 Roquette 3.5％
赤藓糖醇 Cargill 1.0％
MS淀粉 Roquette 5025 1.5％
WPC80 LACPRODAN 80 0.4％
果胶 CP Kelco 106AS-YA 0.1％
琼脂 Libangda YN-03 0.1％
培养物
F-DVSAcidifixTM1.0(批次3586293科汉森A/S)
F-DVS(批次3584797科汉森A/S)
方法：
根据上表制备乳基质，并在134℃巴氏灭菌4秒。
第一次发酵-将Acidifix 100u/T(单位/吨)接种到乳基质中，在43℃发酵，直至达到第一目标pH 4.50。
打碎凝乳，在75℃加热处理酸奶基质25秒。
第二次发酵-以两种剂量无菌接种F-DVS-LGG。将剂量(1)100u/T，7.0E+06cfu/g。剂量(2)200u/T，1.2E+07cfu/g添加到通过第一次发酵(时间t0)制备的经热处理的酸奶基质中。在25℃、33℃、40℃进行第二次发酵，直至在约pH 4.3(时间t1)的第二目标pH达到稳定的pH。
储存-在25℃的环境温度。
结果：
对于所测试的三个温度，获得了相同的细胞计数。因此，一个温度(25℃)下的储存稳定性数据如下表所示。
表12.在环境温度(25℃)储存期间的pH和细胞计数
LGG 100u/t t1 D+7 D+14 D+21 D+28 第8周
pH 4.29 4.25 4.26 4.31 4.34 4.29
细胞计数(E+08) 1.30 1.70 1.00 0.57 0.55 0.61
LGG 200u/t t1 D+7 D+14 D+21 D+28 第8周
pH 4.30 4.28 4.26 4.33 4.33 4.32
细胞计数(E+08) 1.50 2.00 1.30 0.39 0.38 0.54
在所有测试温度下均达到稳定的pH。在两种LGG接种剂量下，t1时的细胞计数(>1.0E+8cfu/g)均高于接种剂量。在环境储存(25℃)两个月后，产品的pH和细胞计数稳定。
实施例4-六种不同发酵乳制品的保质期
用2种不同类型的培养物(Acidifix 1.0和YF-L 904)进行第一次发酵。通过LGG或Fresh Q2进行第二次发酵。第二次发酵培养物代谢第一次发酵期间产生的单糖，以达到稳定的pH。第二次发酵在25℃进行3天，或直至pH稳定。然后将产品储存在25℃，以检查不同时间间隔的细胞计数和后酸化。
材料：
使用具有不同蔗糖量的三种不同的乳基质，并根据下表制备。无蔗糖、限量蔗糖(0.75％)和过量蔗糖(7.00％)。
表13.乳基质1
成分 规格 w/w％
鲜乳 3.8％脂肪，3.15％蛋白质 79.70
低脂乳 1.2％脂肪，3.15％蛋白质 13.60
脱脂乳粉 恒天然(Fonterra)，低热 0.60
麦芽糖醇 Maltidex 16385 3.50
赤藓糖醇 Zerose 16952 1.00
Clearam CJ 5025 Roquette 1.50
果胶106-AS YA CP Kelco 0.10
表14.乳基质2
表15.乳基质3
成分 规格 w/w％
鲜乳 3.8％脂肪，3.15％蛋白质 79.70
低脂乳 1.2％脂肪，3.15％蛋白质 11.00
脱脂乳粉 恒天然，低热 0.70
糖(蔗糖) 精制糖 7.00
Clearam CJ 5025 Roquette 1.50
果胶106-AS YA CP Kelco 0.10
以下培养物用于发酵，并以100u/t的浓度添加。
F-DVS YF-L904(批次3551191，科汉森A/S)
F-DVSAcidifixTM1.0(批次3586293，科汉森A/S)
F-DVS(批次3584797，科汉森A/S)
F-DVS2(批次3589655，科汉森A/S)
方法：
根据上表制备乳基质，并在134℃巴氏灭菌4秒。根据下表在没有蔗糖(S1)、限量的蔗糖(S2-S3)或(S4-S6)过量蔗糖的情况下设置发酵。YF-L904和FQ2将乳基质中存在的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，其中葡萄糖被消耗，半乳糖留在乳基质中。Acidifix和LGG是乳糖缺乏型的，并将添加到乳奶基质中的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，其中葡萄糖被消耗，果糖留在乳基质中。LGG可能靠果糖生长，在靠半乳糖生长非常缓慢。
第一次发酵-100单位/吨的1。根据下表在乳基质中接种培养物。在43℃进行发酵，直至达到第一目标pH 4.50。
打碎凝乳，在75℃加热处理酸奶基质49.2秒。
第二次发酵-5.0E+06cfu/g的2。将培养物接种在通过第一次发酵制备的经热处理的酸奶基质中(时间t0)。第二次发酵在25℃进行，直至在为约pH 4.3的第二目标pH时达到稳定的pH(时间t1)。
储存-在25℃的环境温度。
表16.发酵设置
设置编号 乳基质 蔗糖 1.培养物 2.培养物
S1 MB1 - F-DVS YF-L904 F-DVS LGG
S2 MB2 0.75％ F-DVSAcidifix 1.0 F-DVS LGG
S3 MB2 0.75％ F-DVSAcidifix 1.0 F-DVS FQ 2
S4 MB3 7.00％ F-DVSAcidifix 1.0 F-DVS LGG
S5 MB3 7.00％ F-DVSAcidifix 1.0 F-DVS FQ 2
S6 MB3 7.00％ F-DVS YF-L 904 F-DVS LGG
结果：
表17.发酵设置1至6的pH和细胞计数
样品 pH t0 pH t1 细胞计数t0 细胞计数t1
S1 4.51 4.20 4.2E+6 3.4E+8
S2 4.48 4.27 4.5E+6 2.5E+8
S3 4.48 4.11 5.1E+6 4.0E+8
S4 4.50 4.06 4.8E+6 3.0E+8
S5 4.50 4.10 5.3E+6 4.0E+8
S6 4.50 4.00 4.7E+6 5.8E+8
表18a.42℃储存期间的pH
样品 t1 第7天 第14天 第21天 第28天
S1 4.20 4.17 4.15 4.17 4.16
S2 4.27 4.28 4.29 4.31 4.28
S3 4.11 3.71 3.51 3.53 3.49
S4 4.06 3.61 3.57 3.29 3.38
S5 4.10 3.48 3.35 3.32 3.40
S6 4.00 3.48 3.38 3.27 3.39
表18b.42℃储存期间的细胞计数
表19a.37℃储存期间的pH
样品 t1 第14天 第28天 第42天 第56天
S1 4.20 4.14 4.16 4.23 4.21
S2 4.27 4.25 4.28 - 4.41
S3 4.11 3.46 3.38 3.45 3.44
S4 4.06 3.35 3.37 3.35 3.27
S5 4.10 3.38 3.32 3.31 3.21
S6 4.00 3.33 3.33 3.32 3.23
表19b.37℃储存期间的细胞计数
样品 t1 第14天 第28天 第42天 第56天
S1 3.4E+8 8.0E+7 4.6E+6 5.3E+6 9.2E+6
S2 2.5E+8 1.0E+8 7.0E+7 1.5E+7 2.8E+7
S3 4.0E+8 4.3E+7 7.8E+5 <1000 <10
S4 3.0E+8 5.7E+7 5.6E+6 <1000 <10
S5 4.0E+8 <1.0E+4 <1000 <10 <10
S6 5.8E+8 1.4E+6 1.4E+6 <1000 <10
表20a.25℃储存期间的pH
样品 t1 第28天 第56天 第3个月 第4个月 第5个月 第6个月
S1 4.20 4.16 4.18 4.14 4.14 4.15 4.13
S2 4.27 4.30 4.27 4.25 4.24 4.25 4.26
S3 4.11 3.52 3.44 3.32 3.33 3.33 3.31
S4 4.06 4.07 3.40 3.35 3.38 3.39 3.38
S5 4.10 3.55 3.67 3.40 3.44 3.42 3.39
S6 4.00 3.81 3.24 3.26 3.27 3.25 3.24
表20b.25℃储存期间的细胞计数
根据本发明的方法在S1和S2中示出，其中储存期间的后酸化非常低或不存在。对照S3和S5显示，如果使用乳糖发酵培养物作为第二培养物，则发生后酸化。在对照S4、S5和S6中，蔗糖被过量添加因此可用于第二次培养进行后酸化。
实施例5-甜味剂存在下的后酸化
根据本发明，在不同甜味剂的存在下制备产品，并在25℃储存，在此期间，在不同的时间点测定酸化。
材料：
根据下表制备各自包含不同甜味剂(麦芽糖醇、异麦芽酮糖和赤藓糖醇)的三种不同乳基质。
表21.含麦芽糖醇(MB-M)的乳基质
成分 来源 w/w％
鲜乳 三元(3.4％脂肪，3.3％蛋白质) 92.90
糖 Taigu 0.73
麦芽糖醇 Roquette 4.50
Clearam CJ 5025 Roquette 1.30
WPC 80 Arla 0.40
果胶106-AS YA CP Kelco 0.10
琼脂YN-03 LiBangDa 0.10
表22.含异麦芽酮糖(MB-I)的乳基质
成分 来源 w/w％
鲜乳 三元(3.4％脂肪，3.3％蛋白质) 92.90
糖 Taigu 0.73
异麦芽酮糖 HIYEE 4.50
Clearam CJ 5025 Roquette 1.30
WPC 80 Arla 0.40
果胶106-AS YA CP Kelco 0.10
琼脂YN-03 LiBangDa 0.10
表23.含赤藓糖醇(MB-E)的乳基质
以下培养物以100u/t的浓度用于发酵：
F-DVSAcidifixTM1.0(批次3586293，科汉森A/S)
F-DVS(批次3584797，科汉森A/S)
方法：
根据上表制备的乳基质在134℃巴氏灭菌4秒。
对于第一次发酵，将100单位/吨的培养物接种在乳基质中，并在43℃进行发酵直至达到第一目标pH 4.50。
将凝乳打碎，将酸奶基质在75℃热处理49.2秒。
在第一次发酵制备的热处理酸奶基质中接种5.0E+06cfu/g的进行第二次发酵。第二次发酵在25℃进行，并在72小时(第0天)后终止。
产品在25℃、37℃和42℃的温度储存，并根据中国国家标准(GB 5009.239-236食品酸度的食品安全国家标准测定)在储存期间测量可滴定酸度TA(°T)。
结果：
表24.在环境温度25℃储存期间的TA
乳基质 第0天 第1周 第4周
MB-M 69.7 78.3 82.6
MB-I 70.3 78.2 86.0
MB-E 69.3 71.3 73.6
表25.在37℃储存期间的TA
表26.在42℃储存期间的TA
乳基质 第0天 第1周 第2周 第3周 第4周 第6周
MB-M 69.7 81.2 82.9 86.7 91.1 110.2
MB-I 70.3 82.0 85.0 90.4 97.7 109.4
MB-E 69.3 74.2 76.2 74.8 76.7 80.1
通过两步发酵法生产的产品会产生后酸化，这种后酸化因所用甜味剂的不同而不同。
实施例6-使用替代的乳糖缺乏型菌株进行第二次发酵
本发明的方法使用乳糖缺乏型菌株干酪乳杆菌02进行第二次发酵。
材料：
根据实施例1中的表3(不含蔗糖的MB1)和实施例3中的表11(含0.75％蔗糖的MB2)制备具有不同蔗糖量的两种不同乳基质。
以下培养物以100u/t的浓度用于发酵：
F-DVSAcidifixTM1.0(批次3586293，科汉森A/S)
F-DVS YF-L904(批次3551191，科汉森A/S)
F-DVS干酪乳杆菌02(批次3565988，科汉森A/S)
表27.发酵设置
方法：
根据表格制备乳基质并在134℃巴氏杀菌4秒。
第一次发酵-将YF-L904 100u/T(单位/吨)接种在MB1中，将Acidifix 100u/T(单位/吨)接种在MB2中，在43℃发酵，直至达到第一目标pH 4.50。
打碎凝乳，在75℃加热处理酸奶基质25秒。
第二次发酵-在第一次发酵(时间t0)制备的经热处理的酸奶基质中无菌接种剂量为0.00663％(相当于5.5E+6cfu/g)的F-DVS干酪乳杆菌02。
在25℃进行第二次发酵，直至达到为约pH 4.2-4.3的第二目标pH的稳定pH(时间t1)。
在25℃、37℃和42℃的温度储存。
如实施例1中所述测定细胞计数。
结果：
表28.在25℃储存的样品的后酸化测量为pH
样品 t0 t1 第1个月 第2个月 第3个月
S7 4.51 4.20 3.81 3.75 3.81
S8 4.48 4.27 4.28 4.23 4.27
表29.在25℃储存的样品的细胞计数
样品 t0 第1个月 第2个月 第3个月
S7 4.00E+5 2.43E+8 6.00E+6 3.15E+6
S8 2.80E+5 3.47E+8 2.16E+8 2.06E+8
表30.在37℃储存的样品的后酸化测量为pH
样品 t0 W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8
S7 4.50 3.80 3.79 3.82 3.82 3.82 3.76 3.78 3.77
S8 4.56 4.29 4.17 4.35 4.34 4.34 4.27 4.31 4.25
表31.在37℃储存的样品的细胞计数
表32.在42℃储存的样品的后酸化测量为pH
样品 t0 W1 W2 W3 W4
S7 4.50 3.92 3.87 3.95 3.94
S8 4.56 4.30 4.22 4.27 4.22
表33.在42℃储存的样品的细胞计数
样品 t0 W1 W2 W3 W4
S7 4.0E+5 1.6E+7 <1.0E+5 <1.0E+3 <10
S8 2.8E+5 6.4E+6 1.0E+6 1.36E+6 1.81E+6
S7和S8二者在25℃、37℃和42℃的储存期间均达到稳定的pH水平。然而，S7需要更长的时间才能达到这样的pH水平，并且pH水平低于S8。这表明，与S8相比，S7中起子培养物在第一次发酵中留下的单糖的类型和量不同。干酪乳杆菌02表现出与观察到的相似的效果。
在S7和S8两种情况下，干酪乳杆菌02都可以从接种水平生长到更高的细胞计数，然而，不同温度下的稳定性不同。在25℃观察到S8的最稳定细胞计数，其中细胞计数在1.0E+8cfu/g以上持续3个月。

Claims (20)

1.一种用活细菌生产发酵乳制品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含至少一种碳水化合物的乳基质和包含一种或更多种乳酸菌菌株的第一培养物，所述乳酸菌菌株能够代谢所述碳水化合物并产生至少一种单糖；
b)在不超过45℃的第一温度发酵所述乳基质一段时间直至达到不超过pH 4.7的第一目标pH，以获得包含所述至少一种单糖的第一发酵乳基质；
c)处理所述第一发酵乳基质，从而使所述第一培养物中包含的菌株失活或去除；
d)将包含一种或更多种乳酸菌菌株的第二培养物添加到经处理的第一发酵乳基质中，其中所述菌株是乳糖缺乏型的并且能够代谢在第一次发酵期间产生的所述至少一种单糖；
e)在不超过45℃的第二温度发酵经处理的第一发酵乳基质一段时间直至达到不超过pH 4.4的第二目标pH，以获得发酵乳制品，其中所述第二目标pH是通过消耗所述至少一种单糖来确定的，并且其中所述第二目标pH低于所述第一目标pH。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述乳基质中的至少一种碳水化合物选自乳糖、蔗糖、麦芽糖或海藻糖。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳基质中的至少一种碳水化合物是添加到所述乳基质中的。
4.根据前述权利要求所述的方法，其中至少一种碳水化合物的量在第一次发酵期间被耗尽。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养物的一种或更多种乳酸菌菌株选自链球菌属(Streptococcus)如嗜热链球菌(S.thermophilus)，或乳酸杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养物的一种或更多种乳酸菌菌株是乳糖缺乏型的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述乳糖缺乏型菌株选自由以下组成的组：DSM28952、DSM28953、DSM28910、DSM32600和DSM32599。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一目标pH为不超过pH 4.70；4.65；4.60；4.55；4.50；4.45；4.40；或在pH 4.70-4.00；4.70-4.10；4.70-4.20；4.70-4.30；4.70-4.40；4.70-4.45；4.65-4.50；4.60-4.55的范围内；或为约4.70；4.65；4.60；4.55；4.50：4.45；或4.40。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一温度不超过25℃；30℃；35℃；36℃；37℃；38℃；39℃；40℃；41℃；42℃；43℃；44℃；45℃；或在20℃至45℃；25℃至45℃；30℃至45℃；40℃至45℃；25℃至40℃；30℃至40℃；35℃至40℃的范围内；或为约20℃；25℃；30℃；35℃；36℃；37℃；38℃；39℃；40℃；41℃；42℃；43℃；44℃；45℃。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一发酵乳基质的处理是热处理，其中所述热处理在65℃至75℃的范围内进行至少1分钟至30分钟；或在至少60℃；65℃；70℃；或75℃进行1分钟；5分钟；10分钟；15分钟；20分钟；25分钟；或30分钟；或在70℃至90℃的范围内进行10秒至50秒；或在至少70℃；75℃；80℃；85℃；或90℃进行至少10秒；15秒；20秒；25秒；30秒；35秒；40秒；45秒；或50秒；或在65℃至90℃；70℃至85℃；75℃至80℃的范围内进行10秒至50秒；或在75℃进行25秒；75℃进行50秒。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二目标pH为超过pH 4.5；4.4；4.3；4.2；4.1；4.0；3.9；3.8；3.7；3.6；3.5，或在pH 4.50至3.50；4.50至4.05；4.45至4.10；4.45至4.15；4.40至4.20；4.40至4.25；4.35至4.30；4.00至3.50；3.95至3.50；3.90至3.55；3.85至3.60；3.80至3.65；3.75至3.60的范围内；或为约pH 4.40；4.35；4.30；4.25；4.20；4.15；4.10；4.05；4.00；3.90；3.80；3.70；3.60；3.50。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二培养物的一种或更多种乳酸菌选自由以下的细菌组成的组：乳酸杆菌属(Lactobacillus)，如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)；双歧杆菌属(Bifidobacterium)，如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌动物乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)和婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)；或链球菌属，如嗜热链球菌。
13.根据前述权利要求所述的方法，其中所述第二培养物的一种或更多种乳酸菌是益生菌。
14.根据前述权利要求所述的方法，其中所述细菌是ATCC53103、CNCM I-2116和/或DSM16572。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵乳制品在25℃储存6个月后的pH变化小于0.80；0.70；0.60；0.50；0.40；0.35；0.30、0.25、0.20、0.18、0.16、0.14、0.12、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01pH单位。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中发酵乳制品在25℃储存6个月后包含至少1.0E+03；1.0E+04；1.0E+05；1.0E+06；1.0E+07；1.0E+08；1.0E+09；或至少1.0E+10cfu/g的活细菌。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二培养物的一种或更多种乳酸菌能够在第二次发酵期间或在第二发酵期间和之后两种情况增殖并增加细胞计数。
18.根据前述权利要求所述的方法，其中所述细胞计数增加0.5；1.0；1.5；2.0；2.5；或3.0log。
19.一种发酵乳制品，所述发酵乳制品通过权利要求1至18中任一项所述的方法制造。
20.根据权利要求19所述的制品，其中所述发酵乳制品包含至少1.0E+05；1.0E+06；1.0E+07；1.0E+08；1.0E+09；1.0E+10；1.0E+11；1.0E+12cfu/份的益生菌。
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