CN118109397A - 人多能干细胞分化来源的软骨微组织的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
提供了制备人多能性干细胞分化来源的软骨微组织的制备方法及用途。本文所述的软骨细胞微组织包含人多能性干细胞分化来源的软骨细胞和其分泌的细胞外基质蛋白,并且与成体原代软骨细胞相比具有更高的细胞外基质蛋白COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和SOX9表达量和相似的HAPLN1表达量,并且降低的MFAP5表达。本文所述的软骨细胞微组织比目前市场上自体软骨细胞产品具有更高的软骨细胞外基质相关基因COL2A1、ACAN、SOX9、COL9A1、COL11A1、SPARC和透明软骨细胞标志物基因HAPLN1表达量,以及更低的纤维软骨细胞标志物基因MFAP5表达量。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域,具体地涉及基于人多能性干细胞分化来源的软骨微组织的制备方法及用途。
背景技术
人多能性干细胞包括人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,iPSC,iPS细胞),后者是通过向成体细胞导入特定的转录因子诱导细胞发生命运转变,成为具有自我复制、扩增和多谱系定向分化能力的多能干细胞。该技术避免了再生医学研究领域的免疫排斥问题和伦理道德问题,是生命科学领域的一次巨大革命。与胚胎干细胞(ESC)一样,iPS细胞能够自我更新并维持未分化状态,具有与ESC相同的细胞形态、核型、端粒酶活性、体外分化潜能,同时表达多能干细胞特异的表面标志分子。iPS细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值,iPS细胞在体外可定向诱导分化出多种成熟的组织细胞,在治疗血液***疾病、神经***疾病、退行性疾病等多种疾病中发挥重要的作用,被视为未来再生医学的重要细胞材料。
人多能性干细胞已经被证明能够向包括外胚层、中胚层和内胚层在内的多个不同组织类型定向分化。之前的研究表明人多能性干细胞在体外能够成功定向分化为软骨细胞。
目前,制备软骨细胞微组织的方法主要有(1)软骨细胞自发聚集培养形成,(2)间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)定向诱导分化,(3)MSC或软骨细胞结合生物材料共培养。然而,使用上述方法制备软骨细胞微组织分别具有各自的缺陷与不足:(1)以德国Spherox产品为代表的自体软骨细胞自发聚集形成软骨细胞微组织方法为例,其软骨细胞全部来源于自体非负重区关节软骨,软骨组织经过酶消化后需要在体外长时间培养(5~10周)才能形成足够患者使用的软骨细胞微组织(Huang B J,Hu J C,AthanasiouKA.Cell-based tissue engineering strategies used in the clinical repair ofarticular cartilage[J].Biomaterials,2016,98:1-22)。另外,由于个体差异以及软骨细胞本身体外培养增殖能力差和去分化现象,使得这种方法制备的软骨细胞微组织疗效有限;同时二次手术容易引发供区病变,临床患者接受度大大降低。(2)MSC定向诱导分化成软骨细胞微组织是一个多因素控制的过程,需要优化多种组分比例,现有诱导技术诱导分化率比较低,时间周期长,需要14-28天才能形成软骨,而且不能有效地使所有MSC都分化为均一稳定的软骨细胞微组织,从而导致诱导后的软骨密度低,不够致密,软骨品质差,不利于在组织工程中的使用;另外,由于MSC批次间差异大,难以做到大规模、稳定、均一化制备。(3)MSC或软骨细胞结合生物材料共培养制作的软骨细胞微组织除了受到上述种子细胞来源限制,还会伴随生物材料本身特性如生物相容性、体内降解速率、残留及安全性问题。
因此,为了进一步将人多能性干细胞定向分化来源的软骨细胞应用转化,需要建立能够应用于临床软骨修复移植的高通量、大规模制备软骨微组织的培养方法。
发明内容
本发明旨在开发以人多能性干细胞定向分化来源的软骨细胞,大规模制备稳定、均一性的具有疗效功能的软骨细胞微组织的方法,用于治疗关节软骨损伤相关疾病。以人iPS细胞为代表,发明人完成了人多能性干细胞向软骨细胞定向分化方案的确定、药效学研究、质量研究及工艺研究。
相较于传统二维平面贴壁分化培养的软骨细胞,三维培养的软骨细胞微组织能够表达更高的软骨细胞功能成熟相关基因(如COL2A1,ACAN,SOX9等),同时分泌大量的II型胶原和聚集蛋白聚糖等天然透明软骨细胞外基质。在体内修复关节软骨缺损的动物试验研究中,也证实了三维培养的软骨细胞微组织具有更强大的透明软骨损伤修复能力。然而,受限于技术和成本的原因,之前的研究多为分离的原代软骨细胞经过短时间体外培养或者在实验室小规模生成不规则的微组织。
本发明的主要目的是通过使用人多能性干细胞定向分化为软骨细胞微组织及其鉴定,并大规模制备稳定、均一性、具有疗效的软骨细胞微组织,通过优化培养条件,诱导成熟的软骨细胞能够在微孔板中自发发生聚集,自我组装,生成软骨细胞微组织。
发明人成功开发了全新的大规模制备人软骨细胞三维微组织的方法,该方法能够显著提高人多能性干细胞诱导后软骨细胞微组织的产量和品质。由iPS细胞诱导分化的三维软骨细胞微组织比目前市场上自体软骨细胞产品(以MACI为代表的2D自体软骨细胞产品,以德国Spherox为代表的3D自体软骨细胞微组织产品)具有更高的软骨细胞外基质相关基因COL2A1、ACAN、SOX9、COL9A1、COL11A1、SPARC和透明软骨细胞标志物基因HAPLN1表达量,以及更低的纤维软骨细胞标志物基因MFAP5表达量。
在一方面,本文提供了制备软骨细胞微组织的方法,其包括:
(A1)将iPS细胞分化为软骨前体细胞,其中软骨前体细胞对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性;
(B1)在软骨前体细胞培养基中以3D细胞培养方式静置培养软骨前体细胞,以聚集形成单独的球体或类球体,其中软骨前体细胞培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含1%-10% Knockout血清替代品、10-40ng/ml EGF和10-40ng/ml FGF2;
(C1)将软骨前体细胞培养基更换为软骨细胞微组织培养基并且静置培养单独的球体或类球体1-28天,其中软骨细胞微组织培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含0.5%-10% Knockout血清替代品、0.5%-10%的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、0.5-10mM丙酮酸钠、50-200U/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、0.05-1mM抗坏血酸钠、0.05-1uM***、10-100μg/mL脯氨酸、10-100ng/mL TGF-β3和10-100ng/mL BMP2;以及
(D1)在软骨细胞微组织培养基中摇动培养悬浮的单独的球体或类球体,直至获得软骨细胞微组织。
在一个实施方案中,软骨细胞微组织的直径范围为100μm-2000μm。在一个实施方案中,摇动培养是以60rpm-80rpm的摇动培养。
在一个实施方案中,步骤(A1)包括:
(1)在诱导iPS细胞分化的培养基中培养iPS细胞20-28小时,该培养基包含DMEM/F12培养基并且包含0.5-5%青霉素、0.5-5%链霉素、0.5-5% ITS-A、1-10% B27、0.5-5%NEAA和50-200μMβ-巯基乙醇;
(2)在10-50ng/mL WNT3a和50-100ng/mL Activin A的存在下诱导20-28小时;
(3)在10-50ng/mL WNT3a、10-50ng/mL Activin A和10-50ng/mL FGF2的存在下诱导20-28小时;
(4)在10-50ng/mL WNT3a、5-50ng/mL Activin A、10-50ng/mL FGF2及20-80ng/mLBMP4的存在下诱导20-28小时;
(5)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4、1-10ng/mL NT4及100ng/mLFollistatin的存在下将细胞进行传代,并且培养3-5天;
(6)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4及1-10ng/mL NT4的存在下诱导20-28小时;
(7)在10-50ng/mL FGF2、10-50ng/mL BMP4、10-50ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞进行传代,并且培养1-3天;和
(8)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞培养3-6天;然后将细胞传代15代以上,得到软骨前体细胞。
以上步骤中的“%”为体积百分比。
在一个实施方案中,在步骤(B1)中培养软骨前体细胞2-5天以聚集形成球体或类球体。在一个实施方案中,在步骤(D1)中在软骨细胞微组织培养基中摇动培养球体或类球体1-16天。在一个实施方案中,摇动培养是以60rpm-80rpm的摇动培养。在一个实施方案中,步骤(B1)和(C1)在选自24孔板、96孔板、384孔板或948孔板的多孔板中进行。多孔板可以是EB-disk948。
在另一个方面,本发明提供了制备软骨细胞微组织的方法,其包括:
(A2)将诱导性多能干细胞iPS细胞分化为软骨前体细胞,其中软骨前体细胞对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性;
(B2)在软骨前体细胞培养基中以3D细胞培养方式静置培养软骨前体细胞,以聚集形成单独的球体或类球体,其中软骨前体细胞培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含1%-10% Knockout血清替代品、10-40ng/ml EGF和10-40ng/ml FGF2;
(C2)将软骨前体细胞培养基更换为软骨细胞微组织培养基并且将单独的球体或类球体静置培养1-4天,其中软骨细胞微组织培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含0.5%-10% Knockout血清替代品、0.5%-10%的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、0.5-10mM丙酮酸钠、50-200U/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、0.05-1mM抗坏血酸钠、0.05-1uM***、10-100μg/mL脯氨酸、10-100ng/mL TGF-β3和10-100ng/mL BMP2;以及
(D2)在软骨细胞微组织培养基中摇动培养悬浮的多个球体或类球体,直至获得软骨细胞微组织融合体,其包含多个粘连的球体或类球体并且具有0.8mm-3mm的直径,优选地摇动培养是以60rpm-80rpm的摇动培养。
以上步骤中的“%”为体积百分比。
在一个实施方案中,在步骤(B2)中培养软骨前体细胞2-5天以聚集形成球体或类球体。在一个实施方案中,步骤(B2)和(C2)在选自24孔板、96孔板、384孔板或948孔板的多孔板中进行。在一个实施方案中,步骤(A2)包括:
(1)在诱导iPS细胞分化的培养基中培养iPS细胞20-28小时,该培养基包含DMEM/F12培养基并且包含0.5-5%青霉素、0.5-5%链霉素、0.5-5% ITS-A、1-10% B27、0.5-5%NEAA和50-200μMβ-巯基乙醇;
(2)在10-50ng/mL WNT3a和50-100ng/mL Activin A的存在下诱导20-28小时;
(3)在10-50ng/mL WNT3a、10-50ng/mL Activin A和10-50ng/mL FGF2的存在下诱导20-28小时;
(4)在10-50ng/mL WNT3a、5-50ng/mL Activin A、10-50ng/mL FGF2及20-80ng/mLBMP4的存在下诱导20-28小时;
(5)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4、1-10ng/mL NT4及100ng/mLFollistatin的存在下将细胞进行传代,并且培养3-5天;
(6)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4及1-10ng/mL NT4的存在下诱导20-28小时;
(7)在10-50ng/mL FGF2、10-50ng/mL BMP4、10-50ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞进行传代,并且培养1-3天;和
(8)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞培养3-6天;然后将细胞传代15代以上,得到软骨前体细胞。
在另一个方面,本发明提供了软骨细胞微组织,所述软骨细胞微组织包含软骨细胞和其分泌的细胞外基质蛋白,并且与成体原代软骨细胞相比具有更高的细胞外基质蛋白COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和SOX9表达量和相似的HAPLN1表达量,并且降低的MFAP5表达。
在一个实施方案中,与成体原代软骨细胞相比所述软骨细胞微组织的COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和SOX9蛋白的表达量增加至少2倍。
在一个实施方案中,软骨细胞微组织的HAPLN1表达量是成体原代软骨细胞的HAPLN1的表达量的至少80%。
在一个实施方案中,软骨细胞微组织的MFAP5表达量是成体原代软骨细胞的MFAP5的表达量的至多80%;
在一个实施方案中,软骨细胞微组织的直径范围为100μm-2000μm。
在一个实施方案中,软骨细胞微组织具有在体内发育形成成熟软骨组织的能力。
在一个实施方案中,软骨细胞微组织还表达COLII和Lubricin蛋白。
在一个实施方案中,软骨细胞微组织中的软骨细胞存活率在90%以上。
在一个实施方案中,软骨细胞微组织通过本文所述的方法制备。
在另一个方面,本发明提供了试剂盒,其包含本文所述的软骨细胞微组织。
在另一个方面,本发明提供了软骨组织,其从本文所述的软骨细胞微组织形成。
在另一个方面,本发明提供了本文所述的软骨细胞微组织在制备药物或试剂盒中的用途,所述药物或试剂盒用于治疗治疗软骨缺损、软骨变性、骨变性、骨关节炎,和/或用于软骨再生、骨再生或软骨移植。
本发明的有益效果包括:
1.提供了从人多能性干细胞制备软骨细胞微组织的3D培养方法,其具有极高的分化效率和细胞活率。
2.对于本文的3D培养方法,发明人发现了最佳的培养条件,例如培养基和培养时间。
3.发明人发现iPS细胞分化来源的软骨前体细胞在诱导成软骨微球的第8天-16天(例如9、10、11、12、13、14或15天)时达到软骨细胞标志物的稳定最佳水平(COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和SOX9表达量,HAPLN1表达量以及MFAP5表达)。
4.本发明提供了软骨细胞微组织的大规模生产方法,其利用选自24孔板、96孔板、384孔板或948孔板,如EB-disk948的多孔板进行。
5.本文所述的软骨细胞微组织具有较高的一致性和纯度,体内再生的组织与已报道的人天然透明软骨具有相同机械生物力学性能,弹性模量为27MPa左右。
6.本文所述的软骨细胞微组织不会引起机体产生免疫排斥反应,同时具有在体内发育形成骨软骨组织的潜能。
7.本文所述的软骨细胞微组织对膝关节软骨缺损具有很好的填充和修复效果。
附图说明
图1为iPS细胞定向诱导分化后的P0和P15代软骨前体细胞(ipCDC)形态(左图为P0,右图为P15)。
图2为iPS细胞定向诱导分化后的P10代ipCDC表面抗原表达情况。红色(左)和蓝色(右)分别表示同型对照抗体(Isotype antibody control)直方图和相应表面标志物抗体直方图。
图3为iPS细胞定向诱导分化后的P15代ipCDC移植到NOD-SCID小鼠皮下6周后取材,HE染色结果。
图4为3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织形成过程,A图为软骨细胞微组织形态变化;B图为软骨细胞微组织直径变化情况。
图5为3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的不同规格的软骨细胞微组织(从左到右分别为1×104/孔、5×104/孔、1×105/孔的软骨小球,直径分别为0.5mm、0.8mm、1.0mm)。
图6为3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织的大规模制备,ipCDC接种到EB-Disk948(中间左)中,诱导形成的软骨微组织转移到10cm培养皿(中间右)中60rpm-80rpm摇床培养(上图左为2×104个细胞/微孔,上图右为5×104个细胞/微孔,下图左放大倍数为40×,下图右为手机拍摄照片)。
图7的A-B图为软骨细胞微组织细胞活率检测。图7的A图为3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织和成体组织来源的软骨细胞微组织死/活细胞染色(3D7d、3D14d、CDC 3D7d,绿色表示活细胞、红色表示死细胞)。图7的B图为流式细胞仪检测软骨细胞微组织(3D20d)消化成单细胞后细胞活率结果。
图8为3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织特殊染色结果(3D10d,从左到右分别为HE染色、番红O固绿染色、甲苯胺蓝染色)。
图9为3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织免疫荧光染色,分别为诱导5d、10d、15d的软骨细胞微组织。
图10A-10C为2D和3D诱导方法获得人iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织与自体关节软骨细胞及自体软骨细胞微组织在基因表达水平上的差异(CDC P0为人原代关节软骨细胞,CDC P2 3D8d为人P2代关节软骨细胞形成的软骨微球,EB948 3D8d为EB948 disk法诱导8天的软骨细胞微组织)。图10A为2D方法诱导分化形成的软骨细胞微组织基因表达情况;图10B图为3D方法诱导分化形成的软骨细胞微组织基因表达情况;图10C图为3D方法诱导分化形成的软骨细胞微组织CRTAC1和EBF3基因表达情况。
图11为3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织在NOD-SCID小鼠和C57BL/6小鼠皮下移植6周后,大体观察及病理染色结果,(A)大体观察,(B)病理染色。
图12为3D诱导方法获得人iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织在NOD-SCID小鼠皮下移植8周后取出,进行机械力学性能测试结果。
图13为人3D诱导方法获得iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织填充修复兔子膝关节负重区软骨缺损。
(A)体外预试验
移植物:软骨细胞微组织3D8d,移植数量:每个损伤区域20~30个
(B)体内动物试验
移植物:软骨细胞微组织3D8d,移植数量:每个损伤区域20个
(C)3D诱导方法获得的软骨细胞微组织修复兔子负重区软骨缺损移植1个月后的动物实验结果(黄色虚线表示软骨缺损,从上到下分别为大体观察、HE、番红O固绿、阿利新蓝、甲苯胺蓝染色、马松masson染色)。
(D)计算3D诱导方法获得的软骨细胞微组织修复兔子负重区软骨缺损移植1个月后的软骨再生修复比例。
图14为iPS分化来源的软骨前体细胞定向分化的软骨细胞微组织形态(2D诱导方法)。
图15的A图为不同诱导时间的软骨细胞微组织(3D2d、3D3d、3D4d)集中摇床培养后相互粘连形成更大体积的软骨细胞微组织融合体;图15的B图为不同直径的软骨细胞微组织相互粘连融合过程;图15的C图为直径为2mm的软骨细胞微组织(3D2d+3D3d)相互粘连融合局部放大图,白色箭头表示相邻的软骨细胞微组织表面的细胞相互粘连融合现象。
图16显示了iPS细胞向软骨前体细胞分化过程示意图。
图17显示了iPS分化来源的软骨前体细胞向软骨细胞微组织分化过程(2D诱导方法)示意图。
图18显示了iPS分化来源的软骨前体细胞向软骨细胞微组织分化过程(3D诱导方法)示意图。
图19为人iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织(3D8d)单细胞测序结果。图19的A图为非线性降维tSNE细胞聚类Cluster分析;图19的B图为Cluster与细胞类型对应关系;图19的C图为不同细胞类型的细胞数量;图19的D图为细胞类型鉴定结果;图19的E图为不同细胞类型的打分值。
具体实施方式
如本文所使用,术语“包含”与“包括”、“含有”同义,并且是包括端点在内或是开放式的,并且不排除额外的未叙述的要素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的技术术语,意思指存在所述要素,但也可以增加其它要素并且仍形成在所述权利要求范围内的构造或方法。
如本文中所用,“软骨细胞微组织”又称为软骨微组织,是由软骨前体细胞经过3D培养形成。软骨细胞微组织可以包含软骨细胞,并且任选可以包含软骨细胞分泌的细胞外基质蛋白。软骨细胞分泌的细胞外基质蛋白包括但不限于COL2A1(collagen type IIalpha 1chain)、ACAN(aggrecan)、COL9A1(collagen type IX alpha 1chain)、SPARC(secreted protein acidic and cysteine rich)、COL11A1(collagen type XI alpha1chain)、SOX9(SRY-box transcription factor 9)、HAPLN1(hyaluronan andproteoglycan link protein 1)和/或MFAP5(Microfibril Associated Protein 5)。本文所述的软骨细胞微组织与成体原代软骨细胞相比,具有COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和/或SOX9的更高的表达量。本文所述的软骨细胞微组织与成体原代软骨细胞相比可以具有相似的HAPLN1表达量。本文所述的软骨细胞微组织与成体原代软骨细胞相比可以具有降低的MFAP5表达。例如,与成体原代软骨细胞相比所述软骨细胞微组织的COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和SOX9蛋白的表达增加至少2倍,例如3-20倍,诸如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19倍。软骨细胞微组织的HAPLN1表达量可以是成体原代软骨细胞的HAPLN1的表达量的至少80%,例如85%-300%,诸如90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、或290%。软骨细胞微组织的HAPLN1表达量可以是成体原代软骨细胞的MFAP5的表达量的至多80%,例如20%-75%,例如30%、40%、50%、60%或70%。本文所述的软骨细胞微组织还可以表达COLII(Collagen II)和Lubricin(又称为PRG4,proteoglycan 4)蛋白。
软骨细胞微组织可以呈现球体或类球体,并且可以具有500-1200um的直径范围。软骨细胞微组织包含软骨细胞微组织形成的致密结构。在该软骨细胞微组织中软骨细胞存活率为90%以上,例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。重要的是,本文所述的软骨细胞微组织具有在体内发育形成成熟软骨组织的能力。软骨细胞微组织也可以是多个球体或类球体相互粘连形成的具有0.8mm-3mm的直径的软骨细胞微组织融合体。
如本文中所用,“软骨前体细胞”是指通过诱导手段(诸如现有技术中已有的诱导手段)将诱导性多能干细胞(iPS细胞)诱导而成的软骨细胞。尽管现有技术中已经存在将iPS细胞诱导成软骨细胞,但是这并不意味着承认本发明的软骨前体细胞的制备方法是已知的或完全已知的。通过本文的方法可以将软骨前体细胞聚集成软骨细胞微组织。本文所述的软骨前体细胞可以对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且可以对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性。
软骨前体细胞的制备方法
在本文中,软骨前体细胞可以通过特定的方法制备。例如,方法可以包括以下一个或多个步骤:
(1)在诱导iPS细胞分化的培养基中培养iPS细胞20-28小时,该培养基包含DMEM/F12培养基并且包含0.5-5%青霉素、0.5-5%链霉素、0.5-5% ITS-A、1-10% B27、0.5-5%NEAA和50-200μMβ-巯基乙醇;
(2)在10-50ng/mL WNT3a和50-100ng/mL Activin A的存在下诱导20-28小时;
(3)在10-50ng/mL WNT3a、10-50ng/mL Activin A和10-50ng/mL FGF2的存在下诱导20-28小时;
(4)在10-50ng/mL WNT3a、5-50ng/mL Activin A、10-50ng/mL FGF2及20-80ng/mLBMP4的存在下诱导20-28小时;
(5)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4、1-10ng/mL NT4及100ng/mLFollistatin的存在下将细胞进行传代,并且培养3-5天;
(6)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4及1-10ng/mL NT4的存在下诱导20-28小时;
(7)在10-50ng/mL FGF2、10-50ng/mL BMP4、10-50ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞进行传代,并且培养1-3天;和
(8)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞培养3-6天;然后将细胞传代15代以上,得到软骨前体细胞。
在步骤(1)中,可以在诱导iPS细胞分化的培养基中培养iPS细胞20-28小时,例如21、22、23、24、25、26、27小时。作为基础培养基,该培养基可以包含DMEM/F12培养基。培养基可以进一步包含0.5-5%青霉素,例如1%、2%、3%或4%青霉素。培养基可以包含0.5-5%链霉素,例如1%、2%、3%或4%链霉素。培养基可以包含0.5-5% ITS-A,例如1%、2%、3%或4% ITS-A。培养基可以包含1-10% B27,例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或9%B27。培养基可以包含0.5-5%NEAA,例如1%、2%、3%或4%NEAA。培养基可以包含50-200μMβ-巯基乙醇,例如60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM或190μM。
在步骤(2)中,在10-50ng/mL WNT3a和50-100ng/mL Activin A的存在下诱导20-28小时,例如21、22、23、24、25、26、27小时。WNT3a的浓度为10-50ng/mL,例如20、30、40ng/mL。Activin A的浓度为50-100ng/mL,例如60、70、80或90ng/mL。
在步骤(3)中,可以在10-50ng/mL WNT3a、10-50ng/mL Activin A和10-50ng/mLFGF2的存在下诱导20-28小时,例如21、22、23、24、25、26、27小时。WNT3a的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。Activin A的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。FGF2的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。
在步骤(4)中,可以在10-50ng/mL WNT3a、5-50ng/mL Activin A、10-50ng/mLFGF2及20-80ng/mL BMP4的存在下诱导20-28小时,例如21、22、23、24、25、26、27小时。WNT3a的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。Activin A的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。BMP4的浓度可以为20-80ng/mL,例如30、40、50、60或70ng/mL。
在步骤(5)中,可以在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4、1-10ng/mL NT4及50-500ng/mL Follistatin的存在下将细胞进行传代,并且培养3-5天,例如4天。FGF2的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。BMP4的浓度可以为20-80ng/mL,例如30、40、50、60或70ng/mL。Follistatin的浓度可以为100、200、300或400ng/mL。NT4的浓度可以为2、3、4、5、6、7、8、9ng/mL NT4。
在步骤(6)中,可以在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4及1-10ng/mL NT4的存在下诱导20-28小时,例如21、22、23、24、25、26、27小时。FGF2的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。BMP4的浓度可以为20-80ng/mL,例如30、40、50、60或70ng/mL。NT4的浓度可以为2、3、4、5、6、7、8、9ng/mL NT4。
在步骤(7)中,可以在10-50ng/mL FGF2、10-50ng/mL BMP4、10-50ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞进行传代,并且培养1-3天,例如2天。FGF2的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。BMP4的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。GDF5的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。NT4的浓度可以为2、3、4、5、6、7、8、9ng/mL NT4。TGFβ3的浓度可以为10、15、20、25、30、35或40ng/mL
在步骤(8)中,可以在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞培养3-6天,例如4或5天。FGF2的浓度可以为10-50ng/mL,例如20、30或40ng/mL。NT4的浓度可以为2、3、4、5、6、7、8、9ng/mL NT4。TGFβ3的浓度可以为10、15、20、25、30、35或40ng/mL。GDF5的浓度可以为30、40、50、60或70ng/mL。
在步骤(1)前,可以将iPS加入Vitronectin(Nuwacell,RP01002)包被的培养皿里培养1-3天,例如24h或2天。培养用的培养基为mTESR1(Stem Cell Technologies,85850)。培养基可以包含1-5%双抗(青霉素和链霉素)。培养基可以包含1-50um(例如10、20、30、40μM)Y27632(Stem Cell Technologies,72308)。添加的细胞浓度可以为5000个细胞每平方厘米以上,例如10000细胞每平方厘米的细胞浓度。在步骤(1)-(8)中,诱导iPS分化的培养基含有DMEM/F12,1-5%(例如2%、3%、4%)双抗,0.5-10%(例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)ITS-A、1-10%(例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)B27、0.5-10%(例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)NEAA及10-200μM(例如50、90、100、150、160、170μM)β-巯基乙醇作为基础培养基。
本文所述的软骨前体细胞可以对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且可以对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性。
软骨细胞微组织的制备方法
本发明提供了制备软骨细胞微组织的方法,其包括以下一项或多项:
(A1)将诱导性多能干细胞iPS细胞分化为软骨前体细胞,其中软骨前体细胞对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性;
(B1)在软骨前体细胞培养基中以3D细胞培养方式静置培养软骨前体细胞,以聚集形成球体或类球体,其中软骨前体细胞培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含1%-10% Knockout血清替代品、10-40ng/ml EGF和10-40ng/ml FGF2;
(C1)将软骨前体细胞培养基更换为软骨细胞微组织培养基并且静置培养球体或类球体1-28天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28天),优选5-9天,其中软骨细胞微组织培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含0.5%-10% Knockout血清替代品、0.5%-10%的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、0.5-10mM丙酮酸钠、50-200U/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、0.05-1mM抗坏血酸钠、0.05-1uM***、10-100μg/mL脯氨酸、10-100ng/mL TGF-β3和10-100ng/mL BMP2;以及
(D1)在含有软骨细胞微组织培养基的培养皿中摇动培养悬浮的球体或类球体,直至获得软骨细胞微组织。
软骨细胞微组织的直径范围可以为100μm-2000μm,例如110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800或1900μm。
在步骤(A1)中,可以将人iPS细胞定向分化来源的符合质检要求的软骨前体细胞接种到1个T175培养瓶中,接种密度为50000/cm2,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。待软骨前体细胞汇合度达到80%~90%,细胞形态呈圆形、卵圆形、多边型或短梭状(图1),细胞表面标志物满足软骨前体细胞表面标志物的标准(图2)。
在步骤(B1)中,可以培养软骨前体细胞2-5天(例如2.5、3、3.5、4或4.5天)以聚集形成球体或类球体。软骨前体细胞的接种量为1×104/孔-9×105/孔,例如1×104/孔、5×104/孔或1×105/孔。
在步骤(D1)中,在含有软骨细胞微组织培养基的培养皿中摇动培养球体或类球体1-16天(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天)。
在本文中,步骤(A1)-(D1)可以在室温和CO2的条件下进行。摇动培养可以是以60rpm-80rpm(例如65、70或75rpm)的摇动培养。步骤(B1)和(C1)可以在选自24孔板、96孔板、384孔板或948孔板的多孔板中进行。优选地,多孔板是低附着或超低附着的多孔板。该多孔板可以实现细胞的3D细胞培养。
制备相互粘连形成的软骨细胞微组织融合体的方法
本文还提供了制备相互粘连形成的软骨细胞微组织融合体的方法,其包括:
(A2)将诱导性多能干细胞iPS细胞分化为软骨前体细胞,其中软骨前体细胞对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性;
(B2)在软骨前体细胞培养基中以3D细胞培养方式静置培养软骨前体细胞,以聚集形成单独的球体或类球体,其中软骨前体细胞培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含1%-10% Knockout血清替代品、10-40ng/ml EGF和10-40ng/ml FGF2;
(C2)将软骨前体细胞培养基更换为软骨细胞微组织培养基并且将单独的球体或类球体静置培养1-4天,其中软骨细胞微组织培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含0.5%-10% Knockout血清替代品、0.5%-10%的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、0.5-10mM丙酮酸钠、50-200U/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、0.05-1mM抗坏血酸钠、0.05-1uM***、10-100μg/mL脯氨酸、10-100ng/mL TGF-β3和10-100ng/mL BMP2;以及
(D2)在软骨细胞微组织培养基中摇动培养悬浮的多个球体或类球体,直至获得体积更大的软骨细胞微组织融合体,其包含多个粘连的球体或类球体并且具有0.8mm-3mm的直径,优选地摇动培养是以60rpm-80rpm的摇动培养。
在本文中,软骨前体细胞培养基可以包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含1%-10%(例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)Knockout血清替代品、10-40ng/ml(例如20、25、30、35ng/ml)EGF和10-40ng/ml(例如20、25、30、35ng/ml)FGF2。
软骨细胞微组织培养基可以包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含0.5%-10%(例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)Knockout血清替代品、0.5%-10%(例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、0.5-10mM丙酮酸钠、50-200U/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、0.05-1mM(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mM)抗坏血酸钠、0.05-1uM(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9uM)***、10-100μg/mL(例如20、30、40、50、60、70、80、90μg/mL)脯氨酸、10-100ng/mL(例如20、30、40、50、60、70、80、90ng/mL)TGF-β3和10-100ng/mL(例如20、30、40、50、60、70、80、90ng/mL)BMP2。
可以在将软骨前体细胞培养基中的软骨前体细胞悬浮液接种于多孔板的孔后进行离心以使软骨前体细胞沉降到孔底部。多孔板可以为24孔板、96孔板、384孔板或948孔板。多孔板可以是EB-disk948。
药物或试剂盒
本文所述的软骨细胞微组织可以与其他必要的成分,诸如培养基等制备成试剂盒或药物。试剂盒可以进一步包含用于移植用的器械或试剂,诸如缓冲液等。本文所述的软骨细胞微组织可以以一定的数量直接应用于体内,或者也可以在体外形成软骨组织,然后再将软骨组织应用于受试者。该受试者可以是需要软骨移植的受试者,诸如哺乳动物,特别是人。该受试者可以患有软骨缺损、软骨变性、骨变性、骨关节炎,和/或需要软骨再生、骨再生或软骨移植。
实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述,本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本申请,而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。
实施例1:人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞制备软骨细胞微组织
材料和方法
材料:
人iPS细胞:赛贝,CA4025106
GMP级细胞消化液TryplE:Thermo Fisher,12563029。
人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞培养基:DMEM高糖培养基(gbico,12430062),5% Knockout血清替代品(Thermo Fisher,12618013)、20ng/ml EGF(Stemimmune,EME-EF-1000),20ng/ml FGF2(Stemimmune,HST-F2-1000)。
软骨细胞微组织培养基:DMEM高糖培养基(gbicol,12430062)、1%Knockout血清替代品(Thermo Fisher,12618013)、1%的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(gbicol,41400-045)、1mM丙酮酸钠(gbicol,11360070)、100U/mL青霉素100μg/mL链霉素(gbicol,10378016)、0.1mM抗坏血酸钠(MCE,HY-107837)、0.1uM***(sigma,D4902)、40μg/mL脯氨酸(sigma,P5607)、20ng/mL TGF-β3(Stemimmune,HST-TB3-1000)、20ng/mL BMP2(peprotech,120-02C)。
方法:
人iPS细胞定向分化为软骨前体细胞
参考Griffith L A,Arnold K M,Sengers B G,et al.Ascaffold-free approachto cartilage tissue generation using human embryonic stem cells.[J].NaturePublishing Group,2021(1)的分化方法。首先将iPS以10000细胞每平方厘米的细胞浓度加入Vitronectin包被的培养皿里培养24h,其培养基为mTESR1,1%双抗和10μM Y27632;之后所有诱导iPS分化的培养基含有DMEM/F12,1%双抗,1% ITS-A、2% B27,1% NEAA及90μMβ-mercatoethanol作为基础培养基1。iPS经培养24h后,弃去原培养基,加入含有基础培养基1,25ng/mL WNT3a及50ng/mL Activin A的第一诱导培养基继续培养24h。弃去第一诱导培养基,加入含有基础培养基1,25ng/mL WNT3a、25ng/mL Activin A及20ng/mL FGF2的第二诱导培养基继续培养24h。弃去第二诱导培养基,加入含有基础培养基1,25ng/mL WNT3a、10ng/mL Activin A、20ng/mL FGF2及40ng/mL BMP4的第三诱导培养基继续培养24h;弃去第三诱导培养基,PBS清洗一遍细胞,加入2ml TrypLETM Select 37℃消化细胞3min,细胞收集到50ml离心管后,1200rpm离心5min,加入含有基础培养基1,20ng/mL FGF2、40ng/mLBMP4、2ng/mL NT4及100ng/mL Follistatin的第四诱导培养基重悬细胞,按照1:2的比例传代,继续培养4天;弃去第四诱导培养基,加入含有基础培养基1,20ng/mL FGF2、40ng/mLBMP4及2ng/mL NT4的第五诱导培养基继续培养24h;弃去第五诱导培养基,PBS清洗一遍细胞,加入2ml TrypLETM Select 37℃消化细胞3min,细胞收集到50ml离心管后,1200rpm离心5min,加入含有基础培养基1,20ng/mL FGF2、20ng/mL BMP4、20ng/mL GDF5、2ng/mL NT4及10ng/mL TGFβ3的第六诱导培养基重悬细胞,按照1:2的比例传代,继续培养2天;弃去第六诱导培养基,加入含有基础培养基1,20ng/mL FGF2、40ng/mL GDF5、2ng/mL NT4及10ng/mLTGFβ3的第七诱导培养基继续培养4天,即可得到软骨前体细胞。在此诱导分化期间,需要每天更换新的第七诱导培养基。以上的培养在37℃、5% CO2培养箱中进行。然后,软骨前体细胞可按照1:2-1:3比例在人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞培养基中进行传代扩增至少15代以上(图16)。
细胞形态测定
iPS细胞分化来源的软骨前体细胞接种到含有人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞培养基的培养皿后,每天通过倒置显微镜(Zeiss,Primovert)观察细胞形态变化,并拍照记录。iPS细胞分化来源的软骨前体细胞体积较小,形态呈圆形、卵圆形、多边型或短梭状(图1)。
流式细胞仪检测细胞表面标志物
在第七诱导培养基中培养4天后,弃去原培养基,使用PBS清洗一遍细胞,向培养皿中加入2ml TrypLETM Select 37℃消化细胞3min,细胞收集到50ml离心管,1200rpm离心5min,加入PBS重悬细胞。取20ul细胞悬液,使用细胞计数仪(Countstar,IC1000)计数,调整细胞密度为1×107/ml。取14支流式管,每管加入0.1ml调整浓度后的细胞悬液,然后按照抗体说明书向各管加入以下相应的抗体:IgG1 ISO-PE(Thermo Fisher,12-4714-82)、CD73-PE(Thermo Fisher,12-0739-42)、CD105-PE(Thermo Fisher,12-1057-42)、CD11b-PE(Thermo Fisher,12-0118-42)、IgG1 ISO-FITC(Thermo Fisher,11-4714-81)、CD90-FITC(Thermo Fisher,11-0909-42)、CD19-FITC(Thermo Fisher,11-0199-42)、CD31-FITC(Thermo Fisher,11-0319-42)、CD34-FITC(Thermo Fisher,11-0349-42)、CD45-FITC(Thermo Fisher,11-0459-42)、IgG2bISO-FITC(Thermo Fisher,11-4031-82)、CD44-FITC(Thermo Fisher,11-0441-82)、IgG2b ISO-FITC(Thermo Fisher,11-4732-81)、HLA-DR-FITC(Thermo Fisher,11-9956-42),4℃避光,孵育30min。加入2ml PBS,温和混匀细胞,400g离心5分钟,移走上清液。加入2ml PBS,温和混匀,400g离心5分钟,移走上清液。加入0.5ml PBS,温和混匀细胞,使用Lyric流式细胞仪检测细胞表面标志物。用空白对照管细胞在FS/SS散点图上圈出收集目标细胞群,用FITC/PE同型对照抗体管细胞调节荧光阈值,界定阳性细胞范围。然后收集样品管的荧光信号,每管收集10000个单细胞,记录保存数据。软骨前体细胞表面标志物应为CD73、CD90、CD105、CD44阳性率95%以上和CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLADR阳性率2.0%以下(图2)。NOD-SCID小鼠移植软骨前体细胞及新生组织HE 染色
为了研究人iPS定向分化来源的软骨前体细胞在体内分化为软骨组织的能力,我们将iPS细胞分化来源的P15代软骨前体细胞移植到NOD-SCID免疫缺陷型小鼠(8-10周)大腿内侧肌肉。首先收集软骨前体细胞,使用matrigel(Corning,354277)重悬细胞,用1ml注射器抽取细胞悬液,冰上转运至动物房。用注射器将1×107个软骨前体细胞注射到8-10周龄NOD-SCID免疫缺陷型小鼠大腿内侧肌肉。观察注射部位凸起情况,6周后对小鼠实施安乐死,剥离受体小鼠上的新生组织并进行切割,将新生组织块用4%多聚甲醛进行4℃过夜固定,脱水、石蜡包埋、5μm切片,使用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝,G1120)进行特殊染色。
结果:iPS定向分化来源的P15代软骨前体细胞移植到NOD-SCID免疫缺陷型小鼠体内6周后,HE染色结果发现,新生组织是由大量“铺路石”样软骨细胞及胞外基质组成的类软骨组织(图3)。这说明,iPS细胞定向分化来的软骨前体细胞在体内具有分化成软骨组织的潜能。
2D诱导方法制备软骨细胞微组织
首先将人iPS细胞定向分化来源的符合质检要求的软骨前体细胞接种到1个T175培养瓶中,接种密度为50000/cm2,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。待软骨前体细胞汇合度达到80%~90%,细胞形态呈圆形、卵圆形、多边型或短梭状(图1),细胞表面标志物满足软骨前体细胞表面标志物的标准(图2),随后向培养瓶中加入5mL GMP级细胞消化液TryplE,轻轻水平旋转使消化液均匀分布,平放37℃培养箱中静置消化5min。举起培养瓶在灯下肉眼观察细胞脱落,镜下观察细胞被消化成明亮的单细胞(如消化过程较慢,可轻轻拍打培养瓶侧壁,通过震动加速细胞脱落)。待细胞全部脱落后,立即加入5mL人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞培养基,旋转混合终止消化,向培养瓶中加入10mL PBS清洗细胞,然后将细胞转移至50mL离心管。再次加入10mL PBS,清洗收集剩余细胞,置于离心管中,配平,1200rpm离心5min,轻轻去除上清液。加入50mL PBS重悬细胞,再次1200rpm离心5min,小心吸走上清液。使用20mL软骨前体细胞培养基重悬细胞沉淀,吸取20uL细胞悬液加入到Countstar计数板中计数,计算细胞数量。使用软骨前体细胞培养基调整细胞浓度至1.66×105/mL,接种于TC-96孔板(康宁,3599)中,每孔加入100μL细胞悬液,即每孔含1.66×104个细胞,放置于37℃,5%CO2培养箱中培养。在培养3天后,弃掉孔中培养基,缓慢加入100μL 37℃预热的PBS清洗1遍细胞,弃掉PBS,然后向孔板中缓慢加入100μL 37℃预热的软骨细胞微组织培养基开始向软骨细胞分化,此时记为2D0d。在向软骨细胞分化第7天时(2D7d),将软骨细胞微组织转移到10cm培养皿中,置于摇床上,设置转速60-80rpm,继续培养至第22天(2D22d),期间每隔2~3天换液一次(图17)。结果:
如图14所示,人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞在接种到TC96孔板培养4小时后,软骨前体细胞开始贴壁,逐渐铺展延伸。继续培养3天后,细胞汇合度达到约85%-90%,细胞形态呈圆形、卵圆形、多边型或短梭状。此时切换到软骨细胞微组织培养基开始向软骨细胞分化,记为2D0d,细胞形态多为圆形;在诱导分化培养2D5d时,细胞密度显著增加并呈现多层细胞状态,细胞聚集形成多个软骨结节,并从孔板边缘向中央自发卷起;在诱导分化培养2D7d时,细胞逐渐聚集成不规则微组织,从孔板底部脱落,此时将这种软骨细胞微组织转移到15cm培养皿中,加入软骨细胞微组织培养基,置于水平摇床上60rpm-80rpm培养;在培养至2D12-2D15d软骨细胞微组织呈乳白色,表面光滑明亮,质地密实,继续培养至2D22d,持续观察人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞诱导分化成软骨细胞微组织过程中细胞形态与培养基颜色变化、软骨细胞微组织的内部细胞状态、软骨细胞微组织之间的粘连融合情况。
3D诱导方法制备软骨细胞微组织
首先将人iPS细胞定向分化来源的符合质检要求的软骨前体细胞接种到1个T175培养瓶中,接种密度为50000/cm2,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。待软骨前体细胞汇合度达到80%~90%,细胞形态呈圆形、卵圆形、多边型或短梭状(图1),细胞表面标志物满足软骨前体细胞表面标志物的标准(图2),随后向培养瓶中加入5mL GMP级细胞消化液TryplE,轻轻水平旋转使消化液均匀分布,平放37℃培养箱中静置消化5min。举起培养瓶在灯下肉眼观察细胞脱落,镜下观察细胞被消化成明亮的单细胞(如消化过程较慢,可轻轻拍打培养瓶侧壁,通过震动加速细胞脱落)。待细胞全部脱落后,立即加入5mL人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞培养基,旋转混合终止消化,向培养瓶中加入10mL PBS清洗细胞,然后将细胞转移至50mL离心管。再次加入10mL PBS,清洗收集剩余细胞,置于离心管中,配平,1200rpm离心5min,轻轻去除上清液。加入50mL PBS重悬细胞,再次1200rpm离心5min,小心吸走上清液。使用20mL软骨前体细胞培养基重悬细胞沉淀,吸取20uL细胞悬液加入到Countstar计数板中计数,计算细胞数量。使用软骨前体细胞培养基调整细胞浓度至5×105/mL,接种于ULA-96孔板(Corning,7007)中,每孔加入100uL细胞悬液,即每孔含5×104个细胞(同时还设置了不同细胞接种量诱导形成软骨细胞微组织实验,即每孔接入1×104个细胞,每孔接入1×105个细胞),放置于37℃,5% CO2培养箱中培养。接种培养24小时后,人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞开始聚拢逐渐呈不规则球形。第2天换液,在培养第3天时,弃掉孔中旧培养基,缓慢加入100uL 37℃预热的PBS清洗1遍细胞,弃掉PBS,然后向孔板中缓慢加入100uL 37℃预热的软骨细胞微组织培养基开始向软骨细胞分化,此时记为3D0d,在向软骨分化第3D7d时,将软骨细胞微组织转移到15cm培养皿中,置于摇床上,设置转速60-80rpm,继续培养至3D22d,期间每隔2~3天换液一次。图18显示了iPS分化来源的软骨前体细胞向软骨细胞微组织分化过程(3D诱导方法)示意图。
结果
如图4的A图所示,软骨前体细胞接种到ULA-96孔板2h后,细胞团边缘逐渐自发聚拢,1天后细胞聚集形成规则的球体,培养2-3天后球体成乳白色,表面光滑明亮,质地密实,此时切换成软骨细胞微组织培养基。在随后的3D0d-3D6d之间,细胞形成致密的软骨细胞微组织,体积逐渐轻微缩小,随后体积基本保持不变,直径约700um,呈乳白色规则球体,光泽明亮、表面光滑、有一定硬度(图4的B图)。在3D7d时,将这种软骨细胞微组织转移到15cm培养皿中,加入软骨细胞微组织培养基,置于水平摇床上60rpm-80rpm培养至3D22d,持续观察培养基颜色变化、软骨细胞微组织的内部细胞状态、软骨微球之间的粘连融合情况。
我们还发现,不同的软骨前体细胞接种量可制备不同大小的软骨细胞微组织。如图5所示,每孔接入1×104个细胞、5×104个细胞、1×105个细胞可分别形成直径约0.5mm、0.8mm、1.0mm的软骨细胞微组织。
一般1个T175瓶可收获3×107个细胞,可用于6个ULA-96孔板,最终获得6×96=576个软骨细胞微组织,每位患者需求量按照40-70个小球计算,1个T175瓶的细胞量可供8-14名患者临床使用。按每个细胞培养箱可容纳300个ULA-96孔板,则每个细胞培养箱可生产96×300=28800个软骨细胞微组织,可供411-720名临床患者使用。
多个软骨细胞微组织相互粘连融合形成软骨细胞微组织融合体
如图15的A图所示,将不同诱导时间的iPS细胞定向分化的软骨细胞微组织转移到BeaverNanoTM6孔悬浮细胞培养板(海狸生物,40406)中,每孔放入8个软骨细胞微组织,加入4mL软骨细胞微组织培养基,置于水平摇床上培养,设置转速60rpm-80rpm,使所有软骨小球聚集在孔板中央,记为3DXd+3DYd。
结果:将多个软骨细胞微组织(3D2d、3D3d、3D4d)分别转移集中到一起摇床培养后(3D诱导培养共8天),软骨细胞微组织之间会发生接触粘连,逐渐融合成一个较大的球体(软骨细胞微组织融合体)。
如图15的B和图15的C所示,将不同直径大小的iPS细胞定向分化的软骨细胞微组织(3D2d)分别转移到BeaverNanoTM6孔悬浮细胞培养板(海狸生物,40406)中,每孔放入8个软骨细胞微组织,加入4mL软骨细胞微组织培养基,置于水平摇床上培养,设置转速60rpm-80rpm,使所有软骨小球聚集在孔板中央,此时记为3D2d+3D0d。在培养3D2d+3D3d时,软骨细胞微组织之间开始相互粘连,相邻软骨细胞微组织表面的细胞发生粘连融合;在培养3D2d+3D5d时,软骨细胞微组织边缘的细胞粘连融合度更高,难以分辨单个软骨细胞微组织;在培养3D2d+3D6d时,多个软骨细胞微组织紧密连接在一起,形成一个体积更大的乳白色类软骨组织,光泽明亮、表面光滑、有一定硬度。软骨细胞微组织直径分别从0.45mm、0.75mm、1.2mm增加到1.0mm(约2.2倍)、1.8mm(约2.4倍)、2.6mm(2.2倍)。在此基础上,可调整单个软骨细胞微组织的直径、数量或模具的形状,以获得不同形状、大小的软骨细胞微组织融合体,这样由多个软骨细胞微组织相互粘连形成的更大的软骨细胞微组织,在移植时比单个软骨细胞微球更容易粘附并固定在软骨缺损部位,不易发生脱落,提高手术治疗效果;同时可以满足不同软骨缺损面积患者的临床需求。
实施例2:大规模制备软骨微组织
按上文实施例1中基于96孔板形成软骨微组织的方法虽然可以规模化制备可以满足早期临床需求的软骨细胞微组织数量,但是此方法需要相对较多的人力和时间成本,且不适于后期更大规模的工业生产。为进一步解决上述问题,我们对此工艺进行了进一步改进并发现了一种生产规模更大且更加便于操作的制备软骨微组织的方法。具体描述如下:
待软骨前体细胞汇合度达到80%~90%时,向瓶中加入临床级消化液TryplE铺满瓶底,置于37℃培养箱中消化3~5min。加入预热的软骨前体细胞培养基终止消化,吹打均匀,收集细胞于50mL离心管中,1200rpm离心5min,弃上清。使用预热的软骨前体细胞培养基调整细胞浓度为2.37×108/mL,使用1mL移液吸头轻轻吹打3次,混匀细胞。吸取2mL上述细胞悬液轻轻加入到每个EB-disk948(直径6cm左右)上,使细胞悬液覆盖EB-disk948表面。静置2分钟,使细胞均匀分布在EB-Disk948表面。然后300g离心1分钟,使细胞沉降到每个微孔的底部。返回生物安全柜,轻轻从EB-Disk948的侧壁添加6mL软骨前体细胞培养基,避免破坏被播种的细胞。将EB-Disk948置于37℃、5%CO2培养箱中培养。3天后,轻轻弃去旧培养基,向EB-Disk948加入软骨细胞微组织培养基开始向软骨细胞微组织诱导分化(记为3D0d)。7天(3D7d)后将形成的软骨细胞微组织转移到10cm培养皿(或培养袋、生物反应器)中,60rpm-80rpm摇床继续培养15天(3D22d),期间每隔2~3天换液一次。在3D0d至3D22d期间,每隔2天收集软骨细胞微组织,使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,74004)按照产品说明书从iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织(EB948 3D8d)中分离总RNA,进行柱上DNase I酶切。取1μg总RNA作为模板,使用iScript cDNA synthesis kit(BioRad,1708891)合成cDNA,-20℃保存备用。待诱导成软骨细胞微组织后,每个EB-Disk948可制备948个软骨细胞微组织,每位患者需求量按照40-70个小球计算,可供13~23名患者使用(图6)。按每个培养箱可容纳300个EB-Disk948,则每个培养箱可生产300×948=284400个软骨细胞微组织,可供4062-7110名临床患者使用。因此,利用这种方法可实现大规模制备和生产稳定、均一的软骨细胞微组织,满足临床患者需求。
实施例3:人iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织进行死活细胞染色和流式细胞仪检测细胞活率
细胞死活染色试剂盒(live/dead cell viability assay kit,abcam,ab287858,Lot:GR3451473-4)提供了一种双色荧光方法,基于使用两种不同的染料同时测定活细胞和死细胞。活细胞染料很容易完整地渗透细胞膜,活细胞和细胞内酯酶水解染料产生亲水的强荧光化合物,保留在细胞细胞质中,可以在Ex/Em=485/530nm测量。死细胞染料进入受损细胞膜,与核酸结合后荧光增强40倍,在死细胞中产生亮红色荧光(Ex/Em=495/635nm)。
取iPS细胞分化来源的软骨前体细胞在诱导分化第7天、14天形成的软骨细胞微组织(3D7d、3D14d)和成体组织来源的软骨细胞微组织(CDC 3D7d)于TC96孔板中,加入200ulPBS清洗2遍软骨细胞微组织,弃掉PBS,加入200μl测定缓冲液含死活细胞染色液浸泡软骨细胞微组织,对照组仅加入测定缓冲液不含死活细胞染色液,37℃孵育15min,然后用荧光显微镜(基恩士,BZ-X800)进行图像的观察与采集。
取12个由iPS细胞分化来源的软骨前体细胞在诱导分化20天形成的软骨细胞微组织(3D20d)于15ml离心管中,使用PBS清洗2遍软骨细胞微组织,弃掉PBS,向管中加入2ml0.2% II型胶原酶,37℃消化60min后,加入2ml软骨细胞微组织培养基终止反应,即可得到软骨细胞微组织单细胞悬液。取20μl细胞悬液计数,用PBS重悬细胞后分装到4个1.5ml离心管中,每管含1×106个细胞,500g离心5min,去上清,向管中加入1ml测定缓冲液含死活细胞染色液(见下表),37℃避光孵育15min。使用PBS清洗一遍细胞,弃掉上清液,最终重悬于0.5ml测定缓冲液中,使用Lyric流式细胞仪检测细胞活率。FITC通道表示活细胞,APC通道表示死细胞。
表1:各组别的流式细胞测定实验配置
染色结果表明,在诱导分化的第7天、14天,软骨细胞微组织内部含有大量细胞,细胞状态良好,呈圆形或椭圆形,大多为活细胞,死细胞极少,来源于成体组织的软骨细胞微组织(CDC 3D7d)内部细胞形态多呈现为梭形成纤维状,内部细胞分布不均匀,死细胞多(图7的A图)。另外,软骨细胞微组织经消化成单细胞后按照产品说明书使用流式细胞仪检测细胞活率,结果显示,iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织内部细胞活率为99.7%(图7的B图)。
实施例4:人iPS定向分化来源的软骨细胞微组织病理切片染色
在体外诱导分化第5天、10天、15天时,使用4%多聚甲醛(PFA)固定软骨细胞微组织,对软骨微组织进行脱水、石蜡包埋、5μm切片,分别使用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝,G1120)、甲苯胺蓝染色试剂盒(索莱宝,G3668)、改良番红O-固绿染色试剂盒(索莱宝,G1371)进行特殊染色。对于免疫荧光染色,将白片依次浸入到二甲苯10min 3次,100%乙醇5min2次,95%乙醇5min,85%乙醇5min,75%乙醇5min,50%乙醇5min,然后用纯水清洗干净。用PBS在摇床上洗涤3次,每次5min;用0.4%Triton X-100室温通透1h;用PBS在摇床上洗涤3次,每次5min;在湿盒中滴加5%驴血清,室温30min,封闭非特异性结合位点。磕掉多余的驴血清,在湿盒中滴加用5%驴血清稀释的一抗:COLII(abcam,ab185430)、ACAN(abnova,PAB27837)、Lubricin(abcam,ab28484)、SOX9(santa cruz biotech,sc-166505),将湿盒放入4℃过夜。用PBS在摇床上洗涤3次,每次10min;在湿盒中,避光环境下滴加加了荧光素标记的二抗,室温反应70min;用PBST在摇床上洗涤3次,每次5min,再用纯水清洗干净;在湿盒中滴加DAPI(Thermo fisher,62247),室温反应10min;用PBST在摇床上洗涤3次,每次5min,再用纯水清洗干净;用抗荧光衰减封片剂封片,荧光显微镜(基恩士,BZ-X800)进行图像的观察与采集。
甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)染液是一种碱性染料,能与细胞中阳离子结合,细胞核染色呈***或深蓝色,细胞质染色呈浅蓝色。改良番红O-固绿(Safranin O/Fastgreen)软骨染色法的染色原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色。番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料,其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团(硫酸软骨素或硫酸角质素)结合。番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系,间接反映了基质中蛋白多糖的含量和分布。特殊染色结果表明,iPS细胞分化来源的软骨前体细胞向软骨细胞微组织诱导分化10天后,软骨细胞微组织内部含有大量细胞,细胞周围被丰富的II型胶原和蛋白聚糖包裹(图8)。
Lubricin(又称PRG4)基因编码的蛋白质是一种大型蛋白多糖,由位于关节软骨表面的软骨细胞和一些滑膜细胞合成。这种蛋白质含有硫酸软骨素和硫酸角蛋白糖胺聚糖。它在软骨表面起边界润滑剂的作用,有助于滑膜液的弹性吸收和能量耗散。免疫荧光染色结果显示,在诱导分化的第5天、第10天和第15天,软骨细胞微组织表达COLII、ACAN、Lubricin和SOX9,且随诱导时间延长逐渐增强(图9)。
实施例5:人iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织单细胞测序
取适量由iPS细胞分化来源的软骨前体细胞在诱导分化8天形成的软骨细胞微组织(3D8d)于15ml离心管中,使用PBS清洗2遍软骨细胞微组织,弃掉PBS,向管中加入2ml0.2% II型胶原酶,37℃消化60min后,加入2ml软骨细胞微组织培养基终止反应,即可得到软骨细胞微组织单细胞悬液。委托科研服务检测机构(北京极客基因科技有限公司)进行10×单细胞转录组测序。
10×单细胞转录组测序结果表明,由iPS细胞分化来源的软骨前体细胞在诱导分化8天形成的软骨细胞微组织(3D8d)内部绝大多数细胞类型为软骨细胞(Chondrocytes),其他少量细胞仅为间充质干细胞(MSC),无ips细胞残留,软骨细胞纯度为95.22%(图19的A-E)。
本方法中,人iPS细胞分化来源的软骨前体细胞诱导分化为成熟软骨细胞的分化效率极高(图8、9、19的A-E)。
实施例6:人iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织基因表达情况
材料
CDC P0为P0代人关节软骨细胞(Sciencell,#4650)。
人关节软骨细胞培养基为DMEM高糖(gbicol,12430062)、10%FBS(gbicol,10099141)、20ng/ml TGFb3(Stemimmune,HST-TB3-1000)、100U/mL青霉素100μg/mL链霉素(gbicol,10378016)。
CDC P2 3D8d为人P2代关节软骨细胞3D培养8天形成的软骨细胞微组织。制备方法为:将P0代人关节软骨细胞从液氮中取出,立即放入37℃水浴锅中解冻,将1ml解冻好的P0代人关节软骨细胞加入到9ml预冷的α-MEM(Hyclone,SH30265.01)中,1200rpm离心5min;去掉上清液,使用人关节软骨细胞培养基重悬细胞,按照10000/cm2的密度接种到T75培养瓶中,置于37℃、5% CO2培养箱中培养3-5天。待细胞汇合度达到80%-90%时,向培养瓶中加入3mL GMP级细胞消化液TryplE,轻轻水平旋转使消化液均匀分布,平放37℃培养箱中静置消化5min。举起培养瓶在灯下肉眼观察细胞脱落,镜下观察细胞被消化成明亮的单细胞(如消化过程较慢,可轻轻拍打培养瓶侧壁,通过震动加速细胞脱落)。待细胞全部脱落后,立即加入3mL人关节软骨细胞培养基,旋转混合终止消化,收集细胞至15mL离心管,然后使用8mlPBS清洗培养瓶,收集细胞至15ml离心管。1200rpm离心5min,轻轻去除上清液,得到P1代人关节软骨细胞。以相同传代方法获得P2代人关节软骨细胞,使用人软骨细胞培养基调整细胞浓度至5×105/mL,接种于ULA-96孔板(Corning,7007)中,每孔加入100uL细胞悬液,即每孔含5×104个细胞,放置于37℃,5% CO2培养箱中培养。培养24小时后,人关节软骨细胞开始聚拢逐渐呈不规则球形,继续培养至8天,期间每隔2~3天换液一次。在人关节软骨细胞微组织培养第8天时,使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,74004)按照产品说明书从人关节软骨细胞微组织(CDC P2 3D8d)中分离总RNA,进行柱上DNase I酶切。取1μg总RNA作为模板,使用iScript cDNA synthesis kit(BioRad,1708891)合成cDNA,-20℃保存备用。
EB948 3D8d:在实施例2大规模制备软骨微组织中,经EB948 disk方法制备培养8天的软骨细胞微组织,记为EB948 3D8d。
方法
在体外诱导分化成软骨细胞微组织的过程中,每隔2天使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,74004)按照产品说明书从软骨细胞微组织中分离总RNA,进行柱上DNase I酶切。取1μg总RNA作为模板,使用iScript cDNA synthesis kit(BioRad,1708891)合成cDNA。使用TB green Premix Ex Taq(TAKARA,RR820A)qPCR试剂盒在CFX96 Real Time PCRDetection System(Bio Rad)上使用两步法PCR扩增程序进行实时PCR,使用公式2-ΔΔCt来计算基因相对表达量,ACTB或B2M进行基因归一化,引物序列见下表。参考Yamashita(Yamashita A,Morioka M,Yahara Y,Okada M,Kobayashi T,Kuriyama S,Matsuda S,Tsumaki N.Generation of scaffoldless hyaline cartilaginous tissue from humaniPSCs.Stem Cell Reports.2015Mar 10;4(3):404-18)和Kawata(Kawata M,Mori D,KankeK,Hojo H,Ohba S,Chung UI,Yano F,Masaki H,Otsu M,Nakauchi H,Tanaka S,SaitoT.Simple and Robust Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells towardChondrocytes by Two Small-Molecule Compounds.Stem Cell Reports.2019Sep 10;13(3):530-544)及G.罗尔(用于制备可移植性软骨组织的方法,授权公告号CN110944684B)等人发表的文章或专利。
表2:测定标志物的引物
人关节透明软骨细胞外基质编码基因主要包括COL2A1(II型胶原)、ACAN(蛋白聚糖)、COL9A1(Ⅸ型胶原)、COL11A1(XI型胶原),其中ACAN基因在软骨细胞微组织中的表达量与移植后软骨再生修复能力呈正相关关系,因此可以潜在地用作药效释放测试,通常被认为是软骨细胞微组织质量和产品放行的标准(参考文献Vonk,L.A.,G.,Hernigou,J.,Kaps,C.,&Hernigou,P.(2021).Role of Matrix-Associated AutologousChondrocyte Implantation with Spheroids in the Treatment of Large ChondralDefects in the Knee:A Systematic Review.International Journal of MolecularSciences,22(13),7149.)。SOX9(SRY-Box转录因子9)是一种蛋白质编码基因,决定软骨细胞分化过程中II型胶原的合成与分泌,在软骨细胞分化和骨骼发育过程中起重要作用。SPARC(分泌酸性和富半胱氨酸蛋白)基因编码一种富含半胱氨酸的酸性基质相关蛋白,这种编码的蛋白质是骨骼中的胶原蛋白钙化所必需的,但它也参与细胞外基质的合成和促进细胞形状的改变。HAPLN1(透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1)是一个蛋白质编码基因,是关节软骨细胞特异性的生物标志物,MFAP5(微纤维相关蛋白5)基因编码一种25-kD微纤维相关糖蛋白,该糖蛋白是细胞外基质微纤维的组成部分,被认为是成纤维细胞特异性的生物标志物。
在专利CN110944684B(G.罗尔等人,用于制备可移植性软骨组织的方法,授权公告号CN110944684B)中,表示软骨细胞微组织的软骨形成一致性标志物基因CRTAC1(智人软骨酸性蛋白1,NM_018058)和软骨形成纯度标志物基因EBF3(智人早期B-细胞因子3,NM_001005463)的表达量满足以下条件时:CRTAC1/R≥0.012,EBF3/R≤0.1,说明软骨细胞微组织具有较高的一致性和纯度。
结果
如图10A和表3所示,与成体原代软骨细胞(CDC P0)和成体软骨细胞微组织(CDCP2 3D8d)相比,iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织(2D诱导方法)高表达软骨细胞外基质相关基因COL2A1、COL9A1、COL11A1、SPARC和SOX9转录因子,并且其表达量随着诱导分化时间的延长呈先增加后下降趋势;而ACAN、HAPLN基因的表达量除3D8d以外均低于成体原代软骨细胞(CDC P0);另外,代表纤维软骨细胞的标志物基因MFAP5的表达量在诱导分化成软骨细胞早期快速提升,远高于成体原代软骨细胞(CDC P0)及成体软骨细胞微组织(CDC P23D8d)的表达量。这表明,2D诱导方法得到的软骨细胞微组织可能更倾向于形成纤维软骨,而非临床需要的透明软骨组织。
表3:2D方法诱导分化形成的软骨细胞微球qPCR原始CT值
表3续:2D方法诱导分化形成的软骨细胞微球qPCR原始CT值
表3续:2D方法诱导分化形成的软骨细胞微球qPCR原始CT值
如图10B和表4所示,与成体原代软骨细胞(CDC P0)和成体软骨细胞微组织(CDCP2 3D8d)相比,iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织(3D诱导方法)高表达软骨细胞外基质相关基因COL2A1、ACAN、COL9A1、COL11A1、HAPLN1、SPARC和SOX9转录因子,并且其表达量随着诱导分化时间的延长基本呈逐渐增加趋势,并在3D8d时基本维持稳定的高表达(图10B)。另一方面,iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织与成体原代软骨细胞具有相似或较高的MFAP5表达水平(图10B),说明其中包含极少量成纤维细胞或间充质干细胞,这与10×单细胞测序结果相吻合(图19)。从2D和3D诱导方法获得的软骨细胞微组织在基因表达水平上的差异来看,3D诱导方法可上调透明软骨细胞相关基因表达量,如COL2A1、ACAN、COL9A1、COL11A1、SPARC、HAPLN1、SOX9,并下调纤维软骨细胞标志物基因MFAP5的表达量。
表4:3D方法诱导分化形成的软骨细胞微球qPCR原始CT值
表4续:3D方法诱导分化形成的软骨细胞微球qPCR原始CT值
表4续:3D方法诱导分化形成的软骨细胞微球qPCR原始CT值
如图10C和表5所示,在本方法中利用3D诱导方法获得的iPS定向诱导分化来的软骨细胞微组织(3D8d)CRTAC1/R=60≥0.012,EBF3/R=0≤0.1,表明其具有较高的一致性和纯度,这与10×单细胞测序结果相一致(图19)。G.罗尔等人的专利(用于制备可移植性软骨组织的方法,授权公告号CN110944684B)中要求CRTAC1/R≥0.012,EBF3/R≤0.1,即可说明软骨细胞微组织具有较好的一致性和纯度。
表5:3D方法诱导分化形成的软骨细胞微球CRTAC1和EBF3 qPCR原始CT值:
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以上数据充分说明,本方法中利用3D诱导方法获得的iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织为主要为透明软骨,而非纤维软骨;同时说明,iPS细胞分化来源的软骨前体细胞在诱导成软骨微球的第8天(3D8d)时达到稳定最佳水平。
实施例7:测定人iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织体内发育成软骨组织的能力。
方法
体内植入
为了研究人iPS定向分化来源的软骨细胞微组织(3D8d软骨细胞微组织)在体内形成畸胎瘤和发育成熟为透明软骨组织的能力,我们将iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织移植到NOD-SCID免疫缺陷型小鼠(8-10周)和C57BL/6N小鼠(7-8周)皮下。首先保定小鼠,剃掉腹背侧皮肤两侧被毛,2.5%三溴乙醇麻醉小鼠,待小鼠无明显疼痛反射后,将皮肤用碘酊和酒精消毒,将皮肤开0.5cm的创口,用镊子沿皮肤开口处钝性分离出1.5cm深的通道。从培养液中取出软骨细胞微组织,使用PBS清洗一次,然后将软骨细胞微组织放入皮下通道底部,每个部位移植1个软骨细胞微组织,开口处用皮肤缝合器缝合。观察腹背侧皮肤凸起情况。6周后处死动物,对再生组织大体观察、病理染色和生物力学检测。
再生组织大体观察
如图11的A图所示,在NOD-SCID小鼠和C57BL/6小鼠皮下移植软骨细胞微组织6周,肉眼可见皮下均有较大组织凸起,移植部位未形成畸胎瘤,且未见免疫排斥反应及其他不良反应。移植6周后,手术取出NOD-SCID小鼠和C57BL/6小鼠皮下移植的软骨细胞微组织,发现软骨细胞微组织体积均较移植前变大,再生组织呈乳白色、表面光滑、有一定硬度,软骨细胞微组织在皮下生长发育良好。
再生组织生物力学检测
方法:具体实施按照Yang等人(Yang Y,Wang X,Zha K,Tian Z,Liu S,Sui X,WangZ,Zheng J,Wang J,Tian X,Guo Q,Zhao J.Porcine fibrin sealant combined withautologous chondrocytes successfully promotes full-thickness cartilageregeneration in a rabbit model.J Tissue Eng Regen Med.2021Sep;15(9):776-787)的方法,首先将在NOD-SCID免疫缺陷型小鼠皮下再生的类软骨组织表面垂直于压痕轴线放置,使用直径为1mm的圆柱形平端压头(BOSE3220 EM USA),以0.005mm/s的速度连续记录施加在再生的类软骨上的力和位移,持续300s。根据应力-应变曲线计算修复后软骨的弹性模量。
结果:人iPSC来源的软骨细胞微组织皮下移植到小鼠体内8周后的再生组织与已报道的人天然透明软骨具有相同机械生物力学性能,弹性模量为27MPa左右(图12和表6)。
表6:人iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织在NOD-SCID小鼠皮下移植8周后取出,进行机械力学性能测试结果。
病理染色
取NOD-SCID免疫缺陷型小鼠和C57BL/6小鼠皮下移植软骨细胞微组织6周后再生的类软骨组织,使用4%多聚甲醛(PFA)固定2天,对再生类软骨组织进行脱水、石蜡包埋、5μm切片,分别使用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝,G1120)、甲苯胺蓝染色试剂盒(索莱宝,G3668)、改良番红O-固绿染色试剂盒(索莱宝,G1371)和阿利新蓝染色试剂盒(索莱宝,G1562)进行特殊染色。阿利新蓝(阿尔新蓝)是一种类铜钛花青共轭染料,这种阳离子染料与酸性基团结合,即阿利新蓝与组织内含有的阴离子基团如羧基和硫酸根形成不溶性复合物。阿利新蓝由中央含铜的酞菁环与四个异硫脲基通过硫醚键相连而成。该异硫脲基呈中度碱性,使阿利新蓝带阳离子,利用染液的不同pH值可区分粘液物质的类属。
结果:如图11的A图所示,NOD-SCID免疫缺陷型小鼠和C57BL/6小鼠皮下再生类软骨组织均由大量细胞外基质蛋白聚糖包裹的透明软骨细胞组成,内部细胞呈典型的“铺路石”状排列。
结果
NOD-SCID免疫缺陷型小鼠和C57BL/6小鼠皮下移植软骨细胞微组织6周后再生的类软骨组织大体观察、病理染色和生物力学检测的结果显示,皮下移植软骨细胞微组织6周后均未形成畸胎瘤,软骨细胞微组织在皮下生长发育良好(图11的A图)。组织病理切片结果显示,再生组织是由大量细胞外基质蛋白聚糖包裹的透明软骨细胞组成(图11的B图),并与天然透明软骨具有相同机械生物力学性能的人骨软骨组织(图12),这说明iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织不会引起机体产生免疫排斥反应,同时具有在体内发育形成骨软骨组织的潜能。
实施例8:人iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织填充修复兔子膝关节负重区软骨缺损
构建兔子膝关节负重区软骨缺损模型
将检疫合格的新西兰兔称重,经耳缘静脉注射2.5%异戊巴比妥钠溶液麻醉动物(1mL/kg~3mL/kg)。后腿双膝剪毛备皮,仰卧位固定四肢,铺巾后碘伏消毒2次。取新西兰兔后肢膝关节内侧切口(或髌骨外侧纵向切口)3.0~4.0cm,暴露关节面。检查膝关节腔有无积液或粘连,关节软骨平坦,色泽正常后,在股骨内侧髁采用4mm角膜环钻打孔,用刮匙去除残余的软骨碎片并修理平整底部(图13的A图)。将髌骨复位,逐层缝合关节囊和皮肤切口。术后立即肌肉注射青霉素以防止感染,连续注射7天。建立全层关节软骨缺损动物模型。缺损部位直径4mm,深度1~2mm。每天观察并记录各组动物的食量、大小便、精神状态、伤口感染情况等。
人iPS细胞定向分化来源的软骨细胞微组织填充修复兔子膝关节负重区软骨缺损
移植手术过程
参考Boehm等人方法(Boehm E,Minkus M,Scheibel M.Autologous chondrocyteimplantation for treatment of focal articular cartilage defects of thehumeral head.J Shoulder Elbow Surg.2020Jan;29(1):2-11)。成功建立兔子膝关节负重区软骨缺损模型后,用刮匙去除损伤部位残余的软骨碎片并修理平整底部,将iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织均匀平铺填充在关节软骨缺损处,建议每平方厘米移植10~70个软骨细胞微组织,保持血液干燥,静置15min使软骨小球与关节组织充分黏附(图13的A、B图),逐层缝合伤口。分别于术后1个月、3个月取材,取材部位包括修复区域的软骨、周围正常软骨、软骨下骨和松质骨,将所有样品固定在4%多聚甲醛中,在10% EDTA中脱钙并脱水。
结果
大体观察和组织病理染色结果表明,模型组软骨缺损部位基本无新生组织再生。iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织移植到兔子软骨缺损部位,1个月后,缺损部位被再生组织填充覆盖(图13的C图)。HE、甲苯胺蓝、番红O固绿、阿利新蓝和马松masson染色结果表明,再生的软骨组织富含大量的软骨细胞及软骨细胞外基质,如蛋白聚糖、胶原纤维等,与周围天然软骨融合度高。经过Image J软件分析,模型对照组和iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织治疗组的再生组织面积占缺损区的比例分别为30.05%和63.30%(图13的D图和表7)。这表明,iPS细胞分化来源的软骨细胞微组织对兔子膝关节软骨缺损具有很好的填充和修复效果。
表7:计算软骨再生修复比例
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.制备软骨细胞微组织的方法,其包括:
(A1)将iPS细胞分化为软骨前体细胞,其中软骨前体细胞对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性;
(B1)在软骨前体细胞培养基中以3D细胞培养方式静置培养软骨前体细胞,以聚集形成单独的球体或类球体,其中软骨前体细胞培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含1%-10%Knockout血清替代品、10-40ng/ml EGF和10-40ng/ml FGF2;
(C1)将软骨前体细胞培养基更换为软骨细胞微组织培养基并且静置培养单独的球体或类球体1-28天,优选地5-9天,其中软骨细胞微组织培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含0.5%-10%Knockout血清替代品、0.5%-10%的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、0.5-10mM丙酮酸钠、50-200U/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、0.05-1mM抗坏血酸钠、0.05-1uM***、10-100μg/mL脯氨酸、10-100ng/mL TGF-β3和10-100ng/mL BMP2;以及
(D1)在软骨细胞微组织培养基中摇动培养悬浮的单独的球体或类球体,直至获得软骨细胞微组织,优选地直径范围为100μm-2000μm,优选地摇动培养是以60rpm-80rpm的摇动培养。
2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤(A1)包括:
(1)在诱导iPS细胞分化的培养基中培养iPS细胞20-28小时,该培养基包含DMEM/F12培养基并且包含0.5-5%青霉素、0.5-5%链霉素、0.5-5%ITS-A、1-10%B27、0.5-5%NEAA和50-200μMβ-巯基乙醇;
(2)在10-50ng/mL WNT3a和50-100ng/mL Activin A的存在下诱导20-28小时;
(3)在10-50ng/mL WNT3a、10-50ng/mL Activin A和10-50ng/mL FGF2的存在下诱导20-28小时;
(4)在10-50ng/mL WNT3a、5-50ng/mL Activin A、10-50ng/mL FGF2及20-80ng/mLBMP4的存在下诱导20-28小时;
(5)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4、1-10ng/mL NT4及100ng/mL Follistatin的存在下将细胞进行传代,并且培养3-5天;
(6)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL BMP4及1-10ng/mL NT4的存在下诱导20-28小时;
(7)在10-50ng/mL FGF2、10-50ng/mL BMP4、10-50ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞进行传代,并且培养1-3天;和
(8)在10-50ng/mL FGF2、20-80ng/mL GDF5、1-10ng/mL NT4及5-50ng/mL TGFβ3的存在下将细胞培养3-6天;然后将细胞传代15代以上,得到软骨前体细胞。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法,其中在步骤(B1)中培养软骨前体细胞2-5天以聚集形成球体或类球体;和/或在步骤(D1)中在软骨细胞微组织培养基中摇动培养球体或类球体1-28天;和/或其中步骤(B1)和(C1)在选自24孔板、96孔板、384孔板或948孔板,如EB-disk948的多孔板中进行。
4.制备软骨细胞微组织的方法,其包括:
(A2)将诱导性多能干细胞iPS细胞分化为软骨前体细胞,其中软骨前体细胞对于CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性,并且对于CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45和HLADR呈阴性;
(B2)在软骨前体细胞培养基中以3D细胞培养方式静置培养软骨前体细胞,以聚集形成单独的球体或类球体,其中软骨前体细胞培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含1%-10%Knockout血清替代品、10-40ng/ml EGF和10-40ng/ml FGF2;
(C2)将软骨前体细胞培养基更换为软骨细胞微组织培养基并且将单独的球体或类球体静置培养1-28天,其中软骨细胞微组织培养基包含DMEM高糖培养基作为基础培养基,并且包含0.5%-10%Knockout血清替代品、0.5%-10%的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、0.5-10mM丙酮酸钠、50-200U/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、0.05-1mM抗坏血酸钠、0.05-1uM***、10-100μg/mL脯氨酸、10-100ng/mL TGF-β3和10-100ng/mL BMP2;以及
(D2)在软骨细胞微组织培养基中摇动培养悬浮的多个球体或类球体,直至获得体积更大的软骨细胞微组织融合体,其包含多个粘连的球体或类球体,优选地具有0.8mm-3mm的直径,优选地摇动培养是以60rpm-80rpm的摇动培养。
5.根据权利要求4所述的方法,其中在步骤(B2)中培养软骨前体细胞2-5天以聚集形成球体或类球体;和/或其中步骤(B2)和(C2)在选自24孔板、96孔板、384孔板或948孔板,如EB-disk948的多孔板中进行;和/或步骤(A2)包括权利要求1中的步骤(A1)。
6.软骨细胞微组织,所述软骨细胞微组织包含人多能性干细胞分化来源的软骨细胞和其分泌的细胞外基质蛋白,并且与成体原代软骨细胞相比具有更高的细胞外基质蛋白COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和SOX9表达量和相似的HAPLN1表达量,并且降低的MFAP5表达;
优选地,与成体原代软骨细胞相比所述软骨细胞微组织的COL2A1、ACAN、COL9A1、SPARC、COL11A1和SOX9蛋白的表达量增加至少2倍;
优选地,所述软骨细胞微组织的HAPLN1表达量是成体原代软骨细胞的HAPLN1的表达量的至少80%;
优选地,所述软骨细胞微组织的MFAP5表达量是成体原代软骨细胞的MFAP5的表达量的至多80%;
优选地,所述软骨细胞微组织的直径范围为100μm-2000μm;
优选地,所述软骨细胞微组织具有在体内发育形成成熟软骨组织的能力;
优选地,所述软骨细胞微组织还表达COLII和Lubricin蛋白;
优选地,所述软骨细胞微组织中的软骨细胞存活率在90%以上。
7.根据权利要求6所述的软骨细胞微组织,其通过根据权利要求1-5中任一项所述的方法制备。
8.试剂盒,其包含根据权利要求6或7所述的软骨细胞微组织。
9.软骨组织,其从根据权利要求6或7所述的软骨细胞微组织形成。
10.根据权利要求6或7所述的软骨细胞微组织在制备药物或试剂盒中的用途,所述药物或试剂盒用于治疗治疗软骨缺损、软骨变性、骨变性、骨关节炎,和/或用于软骨再生、骨再生或软骨移植。
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