CN117965406A - 一株池塘贪铜菌Cupriavidus lacunae及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株池塘贪铜菌Cupriavidus lacunae及其应用。本发明要解决的技术问题是为盐碱地的改良提供一种新选择。本发明的技术方案是一株池塘贪铜菌Cupriavidus lacunae H9于2023年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No.28786。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株池塘贪铜菌Cupriavidus lacunae及其应用。
背景技术
全球不同类型的盐碱化土地总面积已达到1×109 hm2，广泛分布于亚洲、美洲、欧洲、澳洲等地，且以每年10%的速度递增，我国盐碱土面积位列世界第三，总面积约达9913万公顷，集中分布于西北、华北、东北及滨海地区，影响着23个省区市总面积超过5亿亩的耕地，其中具有农业利用价值的占中国耕地总面积的10%以上。
针对盐碱地土壤含盐量高、碱性强、物理结构差、养分匮乏等缺点，人们提出了很多治理的措施，具体可以分为物理改良措施、化学改良措施、生物改良措施等等，其中生物改良具有脱盐持久、稳定且有利于水土保持以及生态平衡的效果，被认为是目前最具有生态效益的措施。生物改良措施具体又分为植物改良措施和微生物改良措施两种。生物改良法效果稳定，持久性强，越来越多的应用于盐碱土改良上，在盐碱土上种植盐生植物和抗盐植物，能使盐碱土脱盐，而微生物可以直接或间接促进盐碱地上植物的生长。
微生物是土壤肥力的隐形提供者，土壤和根系微生物相互作用调节植物的生长发育过程。根际促生菌可通过诱导植物建立抵抗或忍耐机制有效提高植物的抗胁迫能力，其中固氮菌可直接利用空气中的氮作为氮素营养；在偏酸和偏碱的条件下，菌株均能保持较强的生长势和较高的固氮酶活性，并能通过调节自身代谢适应环境的酸、碱变化，使土壤趋近中性；解钾菌能够分解钾长石，磷灰石等不溶的硅铝酸盐的无机矿物；促进难溶性的钾、磷、镁等养分元素转化成为可溶性养分，增加土壤中速效养分含量；促进作物生长发育，提高产量。解磷菌能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态。
目前开展盐碱地改良微生物的筛选鉴定及其沃土、修复机制的研究仍较少，从土壤中分离出的耐盐碱促生细菌主要分布于芽孢杆菌(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、假单胞菌属（Pseudomonas sp.），对内蒙古典型盐渍化土壤中的原土著微生物尚无***研究，且对于贪铜菌属的细菌又集中于医学以及对土壤重金属影响方面的研究，而既具有耐盐碱特性，又有促生功能的贪铜菌属(Cupriavidus)尚未有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为盐碱地的改良提供一种新选择。
本发明的技术方案是一株池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9于2023年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No.28786。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明还提供了所述池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9在提高植物耐盐碱能力中的应用。
进一步的，本发明还提供了所述池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9在促进植物生长中的应用。
特别的，所述促进植物生长为促进植物株高和/或增加产量。
具体的，所述植物为禾本科植物。
进一步的，所述禾本科植物为高粱或黑麦草。
本发明还提供一种促进植物生长的微生物制剂，包括池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9或者池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9的发酵物或分泌物。
进一步的，所述池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9的浓度为108CFU/mL。
特别的，所述促进植物生长为促进植物株高和/或增加产量。
具体的，所述植物为禾本科植物。
进一步的，所述禾本科植物为高粱或黑麦草。
本发明还提供了一种提高植物耐盐碱能力的微生物制剂，包括池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9或者池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9的发酵物或分泌物。
进一步的，所述池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9的浓度为108CFU/mL。
具体的，所述植物为禾本科植物。
进一步的，所述禾本科植物为高粱或黑麦草。
本发明还提供了所述池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9在制备调节土壤pH的产品中的应用。
本发明还提供了调节土壤pH的微生物制剂，包括池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9或者池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9的发酵物或分泌物。
进一步的，所述调节土壤pH为降低土壤pH。
本发明还提供了所述池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9在制备固氮、解磷或/和解钾的产品中的应用。
本发明还提供了一种固氮、解磷或/和解钾的微生物制剂，包括池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9或者池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9的发酵物或分泌物。
本发明的有益效果：通过筛选鉴定盐碱土中的耐盐碱细菌，并探究其促生功能，得到一株耐盐碱的池塘贪铜菌，可以在盐碱土壤中生存繁殖。该菌株还具有固氮、解磷、解钾的功能，能够通过调节自身代谢调节土壤pH，并提高土壤养分；还可以提高植物耐盐碱性的能力，还可以促进植物生长，提高产量。
本发明的池塘贪铜菌Cupriavidus lacunaeH9于2023年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No.28786。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
附图说明
图1是本发明H9在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落生长观察图。
图2是本发明H9革兰氏染色后的细胞形态。
图3是本发明H9飞行时间质谱***检测图谱；在质谱图中，横坐标表示离子的质荷比（m/z）值，从左到右质荷比的值增大，对于带有单电荷的离子，横坐标表示的数值即为离子的质量；纵坐标表示离子流的强度，即把最强的离子流强度定为100%，其它离子流的强度以其百分数表示。
图4是本发明H9序列与近种之间的***发育关系。
图5是种植在盐碱性土壤的高粱幼苗接种H9后的生长观察图。
图6是种植在盐碱性土壤的高粱幼苗与黑麦草幼苗接种H9后的干重与鲜重测定结果图。
图7是种植在盐碱性土壤的高粱幼苗与黑麦草幼苗接种H9后的株高测定结果图。
图8是种植在盐碱性土壤的高粱幼苗与黑麦草幼苗接种H9后的SOD活性测定结果图。
图9是种植在盐碱性土壤的高粱幼苗与黑麦草幼苗接种H9后的POD活性测定结果图。
具体实施方式
下述实施例中用到的培养基、试剂和设备来源如下：
Gibbons培养基：酵母提取物10.0g，干酪素5.0g，氯化钾2.0g，柠檬酸钠3.0g，七水合硫酸镁2.0g，胰蛋白胨5.0g，氯化钠约100.0g，蒸馏水，1000mL，琼脂粉20g，pH值为9.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，pH 为7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20 min。
LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl，10 g；蒸馏水1000mL，pH为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH为7.0，琼脂粉16g，121℃高压蒸汽灭菌20min。
阿须贝培养基：KH2PO40.2g；NaCl 0.2g；Mg/LSO4·7H2O 0.5g；CaSO40.2g；K2SO4·2H2O 0.2g；CaCO35.0g；Glucose 10.0 g/L；琼脂粉20g；蒸馏水，1000mL，pH为7.0。
蒙金娜有机磷固体培养基：葡萄糖 10g；(NH4)2SO40.5g；KCl 0.3g；NaCl 0.3g；FeSO4·7H2O 0.03g；MgSO4·7H2O 0.3g；MnSO4·4H2O 0.03g；CaCO35g；卵磷脂0.2g，琼脂粉20g，蒸馏水，1000mL，pH为7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌，20min。
蒙金娜无机磷固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g；KCl 0.3g；NaCl 0.3g；FeSO4·7H2O 0.03g；MgSO4·7H2O 0.3g；MnSO4·4H2O 0.03g；Ca3(PO4)210g；琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.5，115℃蒸汽灭菌，20min。
硅酸盐固体培养基：蔗糖5g/L，MgSO40.5g/L，CaCO30.1g/L，NaHPO42g/L，FeCl30.005g/L，玻璃粉1g/L，琼脂粉20g，pH为7.0；121℃高压灭菌20min。
试剂仪器设备来源：分光光度计为T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），16S rRNA基因扩增引物为通用引物27F/1492R及细菌DNA提取试剂盒（Takara，Japan），2×Taq Plus PCR Master Mix （Takara）； PCR仪（伯乐）；超净工作台SW-CJ-2F（苏州安泰空气技术有限公司，离心机 H2-I6K （湖南可成仪器设备有限公司），电子天平 FA1204B （上海天美天平仪器有限公司）。
实施例1 菌株筛选及鉴定
耐盐碱菌株的分离过程：采集呼和浩特市舍必崖村的盐碱土，称取5g盐碱土样，溶于45mL无菌水中，30℃、180r/min震荡30min，静置得到土壤原液。吸取上清液，将其稀释到10-4~10-7倍后，依次涂布到pH为9的牛肉膏蛋白胨培养基与Gibbons培养基上，30℃倒置培养5d。5d后在固体培养基上长出若干种单菌落，从中挑取不同类型的单菌落反复划线进行纯化，直到获得每种单菌落的纯化菌株。将挑取纯化到的纯菌株接种于10mL LB液体培养基中，过夜培养。带有菌株的LB培养液与80%甘油比例为2︰1混匀于1.5mL离心管中，编号保存于-80℃冰箱。剩余菌株斜面培养基上30℃恒温培养2d后，存于4℃冰箱以进行后续试验。
提高培养基盐浓度（NaCl）筛选：在LB液体培养基中添加NaCl，调节其浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%共8个梯度。将活化好的菌株依次接种于不同浓度的LB液体培养基中，每株菌设置3个重复。接种后将培养基放置摇床180r/min，30℃振荡过夜培养，将菌液移至96孔板中，每4小时用酶标仪测其在620nm处的吸光度，绘制生长曲线。
菌株固氮能力的测定：将分离得到的菌株划线接种于阿须贝培养基上，30℃倒置培养。以“+” 代表菌株的固氮能力。划线第二天开始观察记录其生长情况，长出菌落记为“+++++”，延迟一天减少一个“+”，记录7d，观察菌株的固氮能力。
菌株解磷能力测定：将分离得到的菌株分别接种到蒙金娜有机磷固体培养基和蒙金娜无机磷固体培养基上，30℃培养5d后，观察筛选得到既解有机磷又解无机磷的菌。将其用牙签接种于蒙金娜固体培养基上30℃倒置培养至解磷圈无明显变化。观察测量解磷圈的大小，记录溶磷圈直径（D）、菌落直径（d），计算D/d，判断解磷能力的强弱。生长但未产生透明圈的菌株记“＋”；透明圈直径和菌落直径比1<D/d<1.5的菌株记“＋＋”；比值≥1.5的菌株记“＋＋＋”；未生长的菌株排除。
菌株解钾能力测定：用牙签将菌株接种到硅酸盐固体培养基上，观察菌落周围是否产生透明的解钾圈，判断其是否具有解钾功能。
菌种飞行时间质谱***检测：用移液枪头（10 μL 量程，白色）或塑料接种环挑取适量菌体，均匀涂抹在靶板的样品孔内，在室温下待其自然晾干。再用移液枪滴加 1～2 μL基质溶液覆盖样品，自然晾干后进行采谱。用无菌接种环挑取 5~10 mg 新鲜菌体于 1.5mL 离心管中（不带琼脂）； 加 300μL 无菌水充分悬浮。加入 900 μL 无水乙醇，涡旋振荡混匀；12000 rpm 离心 2～3 min，弃上清后再次离心 1 min，去除残余上清液，室温下干燥沉淀 5 min（乙醇挥发干即可）。加入 80 μL 70%甲酸水溶液（如菌体量少，应适当减少甲酸和乙腈），用移液枪吹打混匀，室温放置 5 min（对于革兰氏阳性菌和部分真菌可适当延长时间）；加入 80 μL 乙腈，充分混匀后，12000 rpm 离心 3 min，将上清液转移至干净的离心管中等待点样，或置于-20 ℃保存。吸取 1 μL 提取样品点至靶点中心，自然晾干后，再滴加 1 μL 基质溶液上清覆盖样品，自然晾干或置于真空干燥靶箱干燥。
菌株PCR鉴定：使用TGuide S96 磁珠法土壤基因组 DNA 提取试剂盒完成核酸的提取。检测方法：使用酶标仪（厂家：基因有限公司GeneCompang Limited，型号 synergyHTX）对核酸进行浓度检测，根据进行检测扩增，扩增后 PCR 产物使用浓度 1.8%的琼脂糖进行电泳检测对完整性进行检测。用引物27F（SEQ ID No.1，AGAGTTTGATCTTGGCTCAG）和1492R（SEQ ID No.2，GGTTACCTTGTTACGACTT）扩增菌株的16S rRNA全长。扩增后序列（SEQID No.3）与NCBI数据库对比，获得同源性较高的物种序列，对所选的序列进行最大似然分析Maximum Likelihood (ML)分析，并利用软件MEGA 11构建***发育树。结果表明菌株H9与Cupriavidus lacunae的基因相似性最高为98.52%。
SEQ ID No.3 16s rRNA
GGGGGGCTGCCTTACCATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGCTTCGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTAGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGCAAGGCCTCGCGCTACAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATGGCCTGGGTGAATACCCCGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATCATGTGCCTGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATACCCAGGGCTTGT。
从土壤中分离到的80株细菌中，通过提高培养基盐浓度（NaCl）筛选法筛选具有耐盐碱及促生能力的细菌菌株，筛选得到30株耐盐碱细菌。进一步验证其固氮、解磷、解钾能力后得到一株可以在pH值为9.0、盐浓度为10%的培养基上生长的具有固氮、解磷、解钾能力的细菌H9（表1）。通过飞行时间质谱***检测（图3）以及16s rRNA***发育树结果（图4）显示该菌为池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）。
表1 细菌H9具有固氮、解磷、解钾能力
| 菌株编号 | 固氮能力 | 溶有机磷 | 溶无机磷 | 解钾能力 |
| H 9 | +++++ | + | + | + |
。
所述H9在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养4d，菌落呈乳白色，菌落表面光滑、湿润、粘稠、凸起、且边缘整齐（图1）。革兰氏染色后的细胞形态如图2所示。
此外，还进一步检测了H9菌株调节土壤pH的能力。具体操作如下：
处理组：从呼和浩特舍必崖村采集回来的天然盐碱土与花卉营养土比例为2︰1混装在花盆中，种植材料（高粱、黑麦草）以及菌液处理之前对其进行pH值进行测定，种植材料之后经过菌液处理三次（每隔15天浇灌一次），再让植物生长45天，种植后90天测定盆栽土壤的pH值。土壤pH值测定方法参照吕贻忠等著的《土壤学实验》进行。
对照组：从呼和浩特舍必崖村采集回来的天然盐碱土与花卉营养土比例为2︰1混装在花盆中，种植材料（高粱、黑麦草）之前对其进行pH值进行测定(同上)，后期只用水进行浇灌，材料种植后90天测定盆栽土壤的pH值。结果见表2。
表2 土壤pH值测定
| 材料 | 种植前土壤pH | 种植后90天，经过浇水处理的土壤pH | 种植后90天，经过菌液处理三次的土壤pH |
| 高粱 | 8.5 | 8.5 | 7.3 |
| 黑麦草 | 8.5 | 8.5 | 7.0 |
。
实施例2 H9对高粱与黑麦草的生长影响
盆栽实验：将高粱种子浸泡在0.1%升汞溶液中消毒10min。用无菌水冲洗干净后放入垫有两层滤纸的培养皿中，于光照培养箱30℃、光/暗各12h培养。选取发芽一致的种子播种于盐碱土与营养土比例为2︰1的花盆中，10d后，选取40株长势一致的幼苗进行实验。
菌液的配制：将菌株接种于5mL LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养12h，按1%接种量接种至20mL LB液体培养基中，培养12h后，4000rpm离心10min，倒掉上清再用无菌水稀释到20mL。每株幼苗接种2mL菌液，对照不做特殊处理，每个处理设置10个平行，每隔15d补交一次菌液共浇三次。
形态指标的测定：高粱种植后70 天，测量植株株高、茎粗、地上鲜/干重、地下鲜/干重。
植物生理指标的测定：植株的过氧化物酶（POD）活性测定参照李小芳、张志良著《植物生理学实验指导（第5版）》88-89页进行，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照侯钰晨等，作物杂志，2023。
黑麦草的处理方法参照对高粱的处理。
基础数据整理与分析：采用Excel 2021进行数据统计和图表制作，利用SPSS 27.0进行同一处理不同材料间的单因素ANOVA检验方差分析。
结果如图5～9所示。在盐碱土壤生长环境下，与对照相比，用所述菌株的菌液处理过的高粱以及黑麦草植株生长情况明显更具优势。
结果如图5～9所示。用H9的菌液对高粱以及黑麦草进行处理，与空白对照相比，高梁与黑麦草株高、鲜重与SOD、POD活性与空白对照相比显著提高。说明菌株H9可以显著提高植物高粱与黑麦草对盐碱胁迫的耐受性。因此，所述菌株H9可以促进盐碱肋迫环境下高粱生长和发育，从而增加其生物量、提高盐碱土壤的利用率。
Claims (10)
1.一株池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9，保藏号CGMCC No.28786。
2.权利要求1所述池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9在提高植物耐盐碱能力中的应用。
3.权利要求1所述池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9在促进植物生长中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述促进植物生长为促进植物株高和/或增加产量。
5.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于：所述植物为禾本科植物。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述禾本科植物为高粱或黑麦草。
7.一种促进植物生长的微生物制剂，其特征在于：包括权利要求1所述池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9或者池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9的发酵物或分泌物。
8.一种提高植物耐盐碱能力的微生物制剂，其特征在于：包括权利要求1所述池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9或者池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9的发酵物或分泌物。
9.根据权利要求7或8所述微生物制剂，其特征在于：所述池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9的浓度为108CFU/mL。
10.权利要求1所述池塘贪铜菌（Cupriavidus lacunae）H9在制备固氮、解磷、解钾或/和调节土壤pH的产品的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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