CN117947047A - CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用 - Google Patents
CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117947047A CN117947047A CN202410131242.8A CN202410131242A CN117947047A CN 117947047 A CN117947047 A CN 117947047A CN 202410131242 A CN202410131242 A CN 202410131242A CN 117947047 A CN117947047 A CN 117947047A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cucumber
- gene
- csaux
- application
- fruits
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 89
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 title claims abstract description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 238000005452 bending Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 244000299906 Cucumis sativus var. sativus Species 0.000 title 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims abstract description 89
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 34
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims abstract description 32
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims abstract description 32
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- GHRYSOFWKRRLMI-UHFFFAOYSA-N 1-naphthyloxyacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(=O)O)=CC=CC2=C1 GHRYSOFWKRRLMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 4
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 4
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 4
- 230000005078 fruit development Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- JXTHEWSKYLZVJC-UHFFFAOYSA-N naptalam Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC2=CC=CC=C12 JXTHEWSKYLZVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101150027068 DEGS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000001653 FEMA 3120 Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 244000295923 Yucca aloifolia Species 0.000 description 1
- 235000004552 Yucca aloifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000012044 Yucca brevifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000017049 Yucca glauca Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000002714 localization assay Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用,属于基因工程和遗传修饰育种领域,本发明从分子角度明确生长素运输基因CsAUX1的差异表达是建立生长素梯度分布的关键因素,影响黄瓜果实形状;通过在黄瓜果实过量表达CsAUX1基因,结果显示,黄瓜果实弯曲率为50‑60%,商品率低于50%,而抑制CsAUX1基因表达,黄瓜果实弯曲率为5‑10%。因此,本发明证实生长素运输基因CsAUX1的表达水平影响黄瓜果实弯曲形状,生产中可通过遗传修饰下调目的基因的表达量改良黄瓜果实形状,为黄瓜分子育种提供基因种质资源。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传修饰育种领域,特别是涉及CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用。
背景技术
黄瓜是世界上重要的经济作物之一,是日常饮食中不可缺少的鲜食蔬菜。随着消费层次和生活理念的改变,人们从追求充足的蔬菜供应转变为追求外观品质和食用价值。果实弯曲直接导致黄瓜外观品质和商品价值下降,给农民带来巨大经济损失。因此,减少弯曲果实比率,培育顺直、大小、粗细整齐一致果实是黄瓜育种和实际生产中亟待解决的重要问题之一。
黄瓜果实弯曲是多基因控制的数量性状(张鹏,秦智伟,王丽莉,等.黄瓜果实弯曲性状的QTL定位[J].东北农业大学学报,2010,41(11):28-31.),国内外研究学者对黄瓜弯曲果实形成研究集中在生理因素、物理因素和防治方法上,分子和遗传机理研究基础仍然很薄弱。
发明内容
本发明的目的是提供CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用,以解决上述现有技术存在的问题,本发明证实生长素运输基因CsAUX1的表达水平影响黄瓜果实弯曲形状,生产中可通过遗传修饰下调目的基因的表达量改良黄瓜果实形状,为黄瓜分子育种提供基因种质资源。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供CsAUX1基因在以下任一项中的应用:
(1)在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用;
(2)在培育顺直形黄瓜品种中的应用;
(3)在提高黄瓜商品率中的应用;
其中,所述CsAUX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供上述的CsAUX1基因编码的蛋白在以下任一项中的应用:
(1)在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用;
(2)在培育顺直形黄瓜品种中的应用;
(3)在提高黄瓜商品率中的应用;
其中,所述CsAUX1基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供调控上述的CsAUX1基因表达水平的制剂在以下任一项中的应用:
(1)在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用;
(2)在培育顺直形黄瓜品种中的应用;
(3)在提高黄瓜商品率中的应用。
进一步地,抑制所述CsAUX1基因的表达水平,使黄瓜果实弯曲率降低,果实形状顺直。
进一步地,抑制所述CsAUX1基因的表达水平,调节生长素分布,使黄瓜果实弯曲率降低,果实形状顺直。
本发明还提供一种改良黄瓜果实弯曲形状的方法,包括在黄瓜中下调CsAUX1基因表达水平的步骤;所述CsAUX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明公开了以下技术效果:
1.本发明从分子角度明确生长素运输基因CsAUX1的差异表达是建立生长素梯度分布的关键因素,影响黄瓜果实形状。
2.本发明通过在黄瓜果实过量表达CsAUX1基因,结果显示,黄瓜果实弯曲率为50-60%,商品率低于50%,而抑制CsAUX1基因表达,黄瓜果实弯曲率为5-10%。因此,本发明证实生长素运输基因CsAUX1的表达水平影响黄瓜果实弯曲形状,生产中可通过遗传修饰下调目的基因的表达量改良黄瓜果实形状,为黄瓜分子育种提供基因种质资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施方案的流程图;
图2为黄瓜顺直果实和弯曲果实两侧生长素含量;S-A:顺直果实一侧;S-B:顺直果实另一侧;Concave:弯曲果实凹面;Convex:弯曲果实凸面;
图3为CsAUX1基因在黄瓜顺直和弯曲果实中表达模式;S-A:顺直果实一侧;S-B:顺直果实另一侧;C1:弯曲果实凹面;C2:弯曲果实凸面;
图4为CsAUX1基因的克隆与验证;M1:DNAmarker 2000;M2:DNAmarker 15000;a)中1和2:PCR产物;b)中3:Xho I、EcoR I双酶切pGreenⅡ载体;c)中4和5:菌液PCR验证;
图5为CsAUX1蛋白亚细胞定位分析结果;Bright:明场;GFP:绿色荧光场;DAPI:蓝色荧光场;Merged:叠加场;比例尺=100μm;箭头所指代表细胞膜;
图6为过量表达CsAUX1基因黄瓜果实形状;CK:对照;OE2:过量表达CsAUX1基因植株2号;OE5:过量表达CsAUX1基因植株5号;比例尺=1cm;
图7为向黄瓜弯曲果实凸面喷施外源生长素运输抑制剂NOA和NPA,抑制CsAUX1基因表达水平的统计图;
图8为抑制CsAUX1基因表达黄瓜果实形状;NOA和NPA:生长素运输抑制剂;比例尺=1cm;
图9为黄瓜果实弯曲率;a)为过量表达CsAUX1基因黄瓜果实弯曲率;b)为抑制表达CsAUX1基因黄瓜果实弯曲率;
图10为黄瓜果实两侧生长素含量;a)为过量表达CsAUX1基因果实两侧生长素含量;b)为抑制表达CsAUX1基因果实两侧生长素含量;S-A:顺直果实一侧;S-B:顺直果实另一侧;C1:弯曲果实凹面;C2:弯曲果实凸面。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明下述实施例中所使用材料、载体、试剂等如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中所用仪器、设备等,如无特殊说明,均为本领域常规仪器、设备。
下述实施例中黄瓜品种密刺型黄瓜品系L18(果实弯曲率52.56%)、D0859(果实弯曲率28.21%)、D0328-3(果实弯曲率39.28%),来自东北农业大学黄瓜分子育种实验室(参考文献:Shengnan Li,Chunhua Wang,Xiuyan Zhou,et al.The curvature of cucumberfruits is associated with spatial variation in auxin accumulation andexpression of a YUCCA biosynthesis gene.[J].Horticulture research,2020,7(1):135-135.),黄瓜品系C16(果实弯曲率<5%)来自黑龙江大学园艺研究团队。
本发明前期研究发现无论生长素的总量如何,只要果实生长素梯度分布建立就会形成弯曲果实,然而生长素梯度是如何建立的尚不明确。因此,本发明从分子角度入手,通过黄瓜弯曲果实凸面和凹面差异基因(DEGs)表达谱聚焦到生长素运输通路,进一步通过生长素定量与定性分析试验筛选到生长素运输基因CsAUX1是影响黄瓜果实形状的关键基因。然而,CsAUX1基因的功能及其对黄瓜果实形状的影响尚未见报道。
本发明为解决黄瓜商品率低的问题,通过调控CsAUX1基因改良黄瓜外观品质,指导黄瓜栽培和育种,进而增加农民收入,具有重要生产应用价值,同时也为顺直黄瓜品种培育提供理论参考和基因种质资源。本发明实施方案的流程图如图1所示。具体研究如下:
实施例1
1.黄瓜果实生长素含量测定
采用Elisa试剂盒(酶免,中国)按照说明书操作进行生长素的提取和测定。选取黄瓜品种L18果实发育期0-10DPA(Days post anthesis,开花后几天)的顺直果实和弯曲果实的外果皮作为生长素水平测定材料,结果发现在果实发育2-10DPA中,顺直果实两侧生长素含量一致,而弯曲果实凸面生长素含量大于凹面生长素含量(图2)。
2.CsAUX1基因表达量分析
(1)采用RNA-easyTM Isolation Reagent(诺维赞,中国)提取黄瓜外果皮总RNA,采用1%琼脂糖凝胶电泳和ND-1000便携式紫外可见分光光度计(ThermoScientific,USA)进行RNA的完整性、纯度及浓度检测。获得样品cDNA第一链的步骤参照PrimeScript RTreagent kit(Takara,日本)反转录试剂盒的说明书。
(2)采用AriaMx Real-Time PCR System***(安捷伦,美国)SYBR染料法(Takara,日本)进行定量分析,反应体系和条件见表1。以CsEF1α为内参基因,采用2-ΔΔCT方法计算目的基因的相对表达量。
(3)选取黄瓜品种L18果实发育期2-10DPA的直瓜和弯瓜,以CsAUX1-qF(GGGCTATTGCGAGGTTACCG)和CsAUX1-qR(CGCAGCGTTCTGACGAGC)为引物进行CsAUX1基因表达量动态分析,选取不同弯曲率黄瓜品种(L18、D0859、D0328-3)果实发育期4DPA的直瓜和弯瓜进行CsAUX1基因表达模式分析。结果发现CsAUX1基因差异表达影响黄瓜果实形状(图3)。
表1 qRT-PCR反应体系和条件
3.从黄瓜基因组中获取黄瓜生长素运输基因CsAUX1的编码区序列(如SEQ IDNO.1所示)和氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示),如下所示:
黄瓜CsAUX1基因编码区核苷酸序列:
ATGTTGCCTCAGAAACAAGCAGAGGAAGCTATAGTTCCTAATGTGAACGAAACAGAGCATGAAGGAAAAGAAGAAGATAAAGAATCTCAGTCTATTTTCAGTGTAAAAAACATCCTCTGGCATGGTGGCTCTGCTTGGGATGCTTGGTTCAGTTGCGCTTCTAATCAAGTTGCTCAGGTTCTGTTAACTCTGCCATATTCATTTTCTCAGCTGGGAATGCTCTCTGGGATCTTGTTTCAAATTTTCTATGGAATCATGGGAAGTTGGACTGCTTATATAATCAGTGTACTGTACATTGAATACAGAAGTAGGAAGGAGAAAGAGAATGTGAGCTTCAAAAACCATGTGATTCAATGGTTTGAAGTTCTTGATGGCTTATTGGGTCCTTATTGGAAAGCCATTGGACTTGCATTTAACTGTACCTTCCTCTTGTTTGGATCAGTCATTCAACTTATTGCTTGTGCAAGCAATATTTATTACATCAATGATCATTTGGACAAGAGAACATGGACTTATATTTTTGGAGCTTGTTGTGCTACCACTGTTTTCATCCCTTCTTTCCATAACTACCGGCTTTGGTCCTTTTTGGGGCTTGGGATGACCACTTACACTGCTTGGTACATGGCCATCGCCGCTCTTGTCCACGGCCAGGTTGAGGGTGTCCAACACTCTGGCCCTAAGAAATTGGTTCTGTACTTCACCGGCGCCACTAACATTCTTTACACATTCGGAGGCCATGCTGTGACTGTTGAAATTATGCACGCTATGTGGAAGCCACAGAAATTCAAATACATCTATTTGATGGCTACCTTATACGTTTTCACCTTAACGCTTCCGTCAGCCACCGCCGTATACTGGGCTTTCGGAGATGAGCTTCTAAACCATTCCAACGCCTTCTCCCTTCTCCCAAAATCCCGCTTCCGTGACGCCGCCGTCATCCTCATGCTTATTCACCAGTTCATTACGTTTGGGTTTGCTTGTACGCCGTTGTACTTTGTGTGGGAGAAAGTGATTGGAATGCATGATACGAAGAGCATTTGTTTAAGGGCTATTGCGAGGTTACCGGTGGTGATTCCAATTTGGTTTTTGGCAATCATTTTCCCGTTCTTTGGGCCAATAAATTCGGCGGTGGGAGCTTTGTTGGTGAGTTTCACAGTATATATTATCCCTGCTATGGCTCATATGCTGACTTACAGAAAGGCCTCTGCTCGTCAGAACGCTGCGGAGAAGCCTCCGTTCTTCATCCCGAGCTGGGTTGGAATGTATGCATTGAACACGTTTGTGGTGGCGTGGGTTCTTGTGGTTGGGTTTGGGTTTGGAGGATGGGCTAGTATGACGAACTTTGTTAGGCAAGTCGACACCTTCGGACTTTTTGCAAAGTGCTATCAATGCAAGGGTCCACCGTTACCTGCGATGGCTCCTATTGCTCATCATTAA(SEQ ID NO.1);
黄瓜CsAUX1基因编码的氨基酸序列:
MLPQKQAEEAIVPNVNETEHEGKEEDKESQSIFSVKNILWHGGSAWDAWFSCASNQVAQVLLTLPYSFSQLGMLSGILFQIFYGIMGSWTAYIISVLYIEYRSRKEKENVSFKNHVIQWFEVLDGLLGPYWKAIGLAFNCTFLLFGSVIQLIACASNIYYINDHLDKRTWTYIFGACCATTVFIPSFHNYRLWSFLGLGMTTYTAWYMAIAALVHGQVEGVQHSGPKKLVLYFTGATNILYTFGGHAVTVEIMHAMWKPQKFKYIYLMATLYVFTLTLPSATAVYWAFGDELLNHSNAFSLLPKSRFRDAAVILMLIHQFITFGFACTPLYFVWEKVIGMHDTKSICLRAIARLPVVIPIWFLAIIFPFFGPINSAVGALLVSFTVYIIPAMAHMLTYRKASARQNAAEKPPFFIPSWVGMYALNTFVVAWVLVVGFGFGGWASMTNFVRQVDTFGLFAKCYQCKGPPLPAMAPIAHH*(SEQ ID NO.2)。
4.CsAUX1基因的克隆与载体构建
(1)采用下表所列体系和程序,以CsAUX1-F、CsAUX1-R为引物(表2),以L18外果皮cDNA为模板进行PCR扩增CsAUX1编码区序列,扩增体系和程序见表3。
表2CsAUX1基因克隆引物序列
表3PCR体系和程序
(2)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,胶回收CsAUX1目的条带并纯化,方法根据北京天根胶回收试剂盒说明书进行。
(3)将Xho I和EcoR I双酶切pGreenⅡ载体质粒并进行胶回收,酶切体系见表4。将回收片段与目的基因片段以同源重组(诺维赞,中国)方式37℃连接30min,连接体系见表5;取5μL连接产物转化50μLTop10大肠杆菌感受态(唯地,中国)中,加入700μL无抗生素无菌液体LB培养基,在恒温振荡器中37℃,200r/min复苏60min;5000r/min离心1min收菌,留取100μL左右上清重悬涂板(LB,含卡纳霉素kan 50μg/ml),37℃倒置进行单菌落的培养;过夜培养后挑取白色单菌落,在含有50μg/ml kan的培养基中活化,并送测序,选择测序正确的菌液进行质粒(天根,中国)提取,具体步骤均按照试剂盒说明书操作。结果表明CsAUX1克隆成功,表达载体构建成功(图4)。
表4酶切体系
表5同源重组反应体系
5.CsAUX1蛋白亚细胞定位分析
(1)将构建成功的pGreenⅡ-CsAUX1表达载体和空载pGreenⅡ转入GV3101(pSoup)农杆菌,具体转化方法参照上海唯地生物GV3101(pSoup)菌株说明书。
(2)采用农杆菌注射法转化烟草,取4-5周苗龄长势优良的本氏烟草;将pGreenⅡ-CsAUX1和pGreenⅡ阳性克隆转至50mL含有50μg/ml kan和25μg/ml rif的LB液体培养基中,28℃200r/min摇菌16h,至OD600=1.0;5000r/min,10min收集菌体,弃上清,加入渗透缓冲液(10mmol/LMgCl2,10mmol/LMES,0.2mmol/LAS)重悬菌液至OD600=0.8左右;取1mL重悬后的pGreenⅡ-CsAUX1和pGreenⅡ农杆菌菌液,用针头在烟草叶背面划一个小伤口,用无菌注射器注射烟草,尽量将整片叶子完全浸润,并标记;将烟草置于黑暗条件下培养2-3d。
(3)用镊子撕取烟草叶片表皮细胞,并用DAPI染色,在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果发现CsAUX1蛋白定位于细胞膜(图5)。
6.CsAUX1基因过量表达和抑制表达对黄瓜果实形状影响
(1)采用农杆菌介导遗传转化方式,使用pGreen-CsAUX1表达载体农杆菌菌液侵染黄瓜品种C16子叶节,经过抗性筛选和鉴定后,获得过量表达CsAUX1基因植株OE2、OE5和OE9株系。结果发现过量表达CsAUX1基因植株中黄瓜弯曲(图6)。
(2)采用外源生长素运输抑制剂NOA(1-萘氧基乙酸,1-naphthyloxyacetic acid)和NPA(抑草生,N-1-naphthylphthalamic acid)喷施弯曲果实凸面(0DPA),抑制果实凸面生长素运输作用,进一步发现CsAUX1基因表达受到抑制,果实两侧CsAUX1基因表达量一致(图7),结果发现黄瓜果实为顺直形(4DPA)(图8)。
(3)采用统计方法调查黄瓜果实弯曲率,结果发现CsAUX1基因过量表达植株中果实弯曲率为50-60%,而抑制CsAUX1基因表达植株中,果实弯曲率小于5%(图9)。
(4)采用ELISA方法测定CsAUX1基因过量表达和抑制表达植株中果实两侧生长素含量,结果发现CsAUX1基因通过调节生长素分布影响黄瓜果实形状(图10)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.CsAUX1基因在以下任一项中的应用:
(1)在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用;
(2)在培育顺直形黄瓜品种中的应用;
(3)在提高黄瓜商品率中的应用;
其中,所述CsAUX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的CsAUX1基因编码的蛋白在以下任一项中的应用:
(1)在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用;
(2)在培育顺直形黄瓜品种中的应用;
(3)在提高黄瓜商品率中的应用;
其中,所述CsAUX1基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.调控如权利要求1所述的CsAUX1基因表达水平的制剂在以下任一项中的应用:
(1)在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用;
(2)在培育顺直形黄瓜品种中的应用;
(3)在提高黄瓜商品率中的应用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用,其特征在于,抑制所述CsAUX1基因的表达水平,使黄瓜果实弯曲率降低,果实形状顺直。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,抑制所述CsAUX1基因的表达水平,调节生长素分布,使黄瓜果实弯曲率降低,果实形状顺直。
6.一种改良黄瓜果实弯曲形状的方法,其特征在于,包括在黄瓜中下调CsAUX1基因表达水平的步骤;所述CsAUX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410131242.8A CN117947047A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410131242.8A CN117947047A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117947047A true CN117947047A (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=90791986
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410131242.8A Pending CN117947047A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117947047A (zh) |
-
2024
- 2024-01-31 CN CN202410131242.8A patent/CN117947047A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107435047B (zh) | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 | |
CN115011610B (zh) | MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用 | |
CN115992153A (zh) | 小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS、其编码蛋白及应用 | |
CN111909941A (zh) | 一种百合转录因子基因LrWRKY-L1及应用 | |
CN111621504B (zh) | 一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用 | |
CN114958906B (zh) | 与烟草低钾胁迫相关的基因、启动子及其应用 | |
CN114214333B (zh) | 一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用 | |
CN108251435B (zh) | 野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4及其应用 | |
CN105950632A (zh) | 棉花纤维发育相关的GhFSN1基因鉴定及应用 | |
CN114540372B (zh) | 陆地棉GhLTP17-A及其调控纤维发育方面的应用 | |
CN114480414B (zh) | 一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法 | |
CN111518803B (zh) | 一种RNAi片段及其用于调控木质素合成的应用 | |
CN117947047A (zh) | CsAUX1基因在调控黄瓜果实弯曲形状中的应用 | |
CN114507674A (zh) | 茶树昼夜节律基因lux在提高植物抗寒性上的应用 | |
CN114292855A (zh) | 一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因及其应用 | |
CN108841831B (zh) | 成花素基因GmFT2a的应用 | |
CN115948454B (zh) | 一种葡萄VvDREB2c基因在提高植物耐热能力中的应用 | |
CN104560906B (zh) | 纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1 like‑1及其应用 | |
CN112626081B (zh) | 一种龙眼开花调控基因DlWRKY25及其调控蛋白与应用 | |
CN116731139B (zh) | 毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用 | |
CN111454987B (zh) | GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用 | |
CN114908106B (zh) | 一种玫瑰耐盐基因RrLBD40及其应用 | |
CN116445502A (zh) | 二色补血草基因Lb2G12567及其应用 | |
CN116622722A (zh) | 二色补血草基因LbSAD2及其应用 | |
CN115927309A (zh) | 月季根特异表达启动子proRcPRX10及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |