CN115011610B - MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，MdTCP17与MdWOX11蛋白存在互作，MdWOX11诱导MdLBD29的表达；苹果MdLBD29启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.1，来自苹果砧木圆叶海棠，MdTCP17抑制MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用。本发明首次研究苹果MdWOX11与MdTCP17蛋白是否存在互作，以及MdTCP17是否调控MdWOX11的转录调控，对了解苹果砧木不定根发育调控机制具有重要意义。同时，本发明对开发无性系砧木繁育调控技术和优良不定根发生能力砧木的分子育种具有潜在价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用。
背景技术
目前，苹果(Malus domestica Mill)是世界上具有商业重要性的果树之一，也是世界温带地区的主要果树作物，据世界粮农组织(FAO)统计显示我国的苹果生产发展迅猛，2017年世界苹果面积493.38万公顷，产量为8313.93万吨，中国2017年苹果总面积222.02万公顷，总产量4139.00万吨，占世界总面积和总产量分别为45.00％和49.78％，排名世界第一(FAOSTAT数据)。中国的自然生态环境有利于苹果树的生长发育，优良砧木的推广至关重要，因而不定根的诱导是砧木繁育的关键所在。开展不定根发生的分子机制研究不仅有利于解决某些苹果砧木的难生根问题，还可以通过分子生物学技术探讨不定根发生的调控网络，从而为生产中提供促进根系发育的有利措施。
WOX家族基因的表达都具有时空特异性，可能都以不同的作用机制参与植物顶端发育的调控。WOX家族基因与相关基因之间的调控网络尚不十分清楚。TCP家族基因是编码植物特异性的一类转录因子，家族成员含有一个b HLH motif，能够与DNA结合或者促使蛋白质之间的互作。现在有关TCP基因功能的研究越来越多，它们调整植物的生长发育，也对分生组织和侧生器官的生长有重要影响，有利于产生新的农业性状。TCP蛋白可以作为转录激活子或者转录抑制子，但是TCP家族基因与相关基因之间的调控网络有待解析。
LBD是高等植物所特有的一类转录因子，它能够响应很多信号比如激素、营养元素、生物以及非生物胁迫等，LBD(Lateral Organ Boundaries Domain)是高等植物所特有的一类转录因子，该家族成员通常在N一端包含一个保守的LOB结构域。根据序列相似性，植物LBD家族成员可分为Class I和Class II 2大类。已有研究结果表明，I类LBD成员主要在侧生器官原基边界表达，调控侧生器官包括侧根侧芽等的起始，从而调节植物多个器官的生长发育。II类LBD成员则参与植物花青素的合成以及氮代谢调控过程。很多研究表明LBD家族成员参与了多种生物学过程，在激素介导的植物次生代谢、植物侧生器官发育、植物营养元素吸收以及逆境胁迫过程中起着重要作用。LBD家族非常庞大，各个成员之间的功能差异也比较大，但是参与根系发育的基因大多集中在侧根发育调控方面，其对不定根发生的调控作用报道很少。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于WOX11的互作蛋白报道很少，尚未有关TCP17的报道，同时关于LBD家族对不定根发生的调控作用报道很少。针对苹果砧木生根难的产业问题，现有的技术集中于优化培养基配方和施加试剂来进行诱导生根，尚未有关分子层面的相关研究，本发明从基因层面上找到了三个调控根系发育的关键转录因子，并从中分析了这三个基因之间的调控关系，初步回答了苹果砧木不定根发生分子机制的科学问题，并将分子机制应用在不定根调控技术的开发上，对于解决苹果砧木难生根的产业问题具有重要的指导意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用。
本发明是这样实现的，一种MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，所述MdTCP17与MdWOX11蛋白存在互作。
进一步，所述MdWOX11诱导MdLBD29的表达。
进一步，所述MdTCP17抑制MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用。
进一步，所述过表达MdWOX11并且干扰MdTCP17促进MdLBD29的表达。
本发明的另一目的在于提供一种苹果MdLBD29启动子，所述苹果MdLBD29启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
进一步，所述苹果MdLBD29启动子核苷酸序列来自苹果砧木圆叶海棠。
本发明的另一目的在于提供一种验证过表达MdWOX11并且干扰MdTCP17促进MdLBD29表达的方法，所述验证过表达MdWOX11并且干扰MdTCP17促进MdLBD29表达的方法包括：
利用苹果组培苗瞬时转化证实过表达MdWOX11并且干扰MdTCP17促进MdLBD29的表达；其中，苹果瞬时转化材料用的是苹果组培苗。
进一步，所述苹果组培苗瞬时转化***的菌液中，采用真空渗透的方式侵染苹果组培苗；优选地，所述MdTCP17干扰载体的菌液OD600浓度为0.6。
进一步，优选地，所述侵染时间为8～10min；
进一步，优选地，所述侵染后苹果叶片培育温度为21℃。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明首次采用苹果转录因子MdTCP17，与转录因子MdWOX11互作，酵母双杂、双分子荧光互补和Co-IP共同验证MdTCP17与MdWOX11蛋白存在互作。双荧光素酶试验证明MdWOX11诱导MdLBD29的表达，而MdTCP17抑制MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用。苹果瞬时转化证明过表达MdWOX11并且干扰MdTCP17促进MdLBD29的表达。
本发明首次研究苹果MdWOX11与MdTCP17蛋白是否存在互作，以及MdTCP17是否调控MdWOX11的转录调控，对了解苹果砧木不定根发育调控机制具有重要意义。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明以探讨MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生具有非常重要的研究意义。本发明对开发无性系砧木繁育调控技术和优良不定根发生能力砧木的分子育种具有潜在价值。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
本发明首次发现MdWOX11和MdTCP17蛋白互作，并且证明MdTCP17抑制MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用。本发明从基因调控水平上填补了国内外行业的技术空白，并揭示了苹果砧木生根难的产业问题，本发明具有开创性的研究意义。
(2)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
苹果砧木生根难是人们一直渴望解决的苹果产业难题，本发明通过基因层面的调控途径初步回答了此问题。即在难生根的苹果砧木中MdWOX11和MdTCP17蛋白互作，MdTCP17抑制了MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用，从而抑制苹果砧木生根。通过深入解析砧木不定根发生生理分子机制与调控规律，开发和优化不定根发生高效调控技术，研究集成配套技术，将不定根技术广泛应用在苹果砧木无糖组培生根和压条繁殖中，从而实现对生根难的苹果砧木材料进行大规模生产，并形成成熟的苗木繁育体系。
(3)本发明的技术方案克服了技术偏见：
现有的技术都是集中于对苹果砧木进行激素及化学试剂处理等方法来促进苹果生根，尚未从基因层面上探讨苹果砧木生根难的问题。本发明克服了传统的生根方法，首次从基因水平上解析苹果砧木生根难的产业问题，从而在基因调控层面提出了苹果难生根砧木的内在机制。即在难生根的苹果砧木中MdWOX11和MdTCP17蛋白互作，MdTCP17抑制了MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用，从而抑制苹果砧木生根。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的酵母双杂验证蛋白MdWOX11与MdTCP17之间的互作图；
图2是本发明实施例提供的双分子荧光互补验证蛋白MdWOX11与MdTCP17之间的互作图；
图3是本发明实施例提供的Co-IP验证蛋白MdWOX11与MdTCP17之间的互作图；
图4是本发明实施例提供的双荧光素酶验证MdWOX11与MdTCP17共表达抑制MdLBD29的表达图；
图5是本发明实施例提供的苹果瞬时转化验证过表达MdWOX11和干扰MdTCP17促进MdLBD29的表达图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的苹果MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，通过酵母双杂、双分子荧光互补和免疫共沉淀试验证实了MdTCP17和MdWOX11蛋白存在互作，而阴性对照不能结合(见图1,2和3)。
本发明实施例通过在苹果砧木圆叶海棠中克隆获得了2652bp的MdLBD29启动子核苷酸序列，上面含有MdWOX11的结合元件WOX-box。通过双荧光素酶试验发现MdWOX11可以与MdLBD29的启动子结合，并且诱导MdLBD29的表达(见图4)。
本发明在双荧光素酶***中，同时加入MdTCP17和MdWOX11，发现MdTCP17和MdWOX11共表达能够抑制MdWOX11对MdLBD29的诱导作用，从而推测MdTCP17抑制了MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用(见图4)。
本发明实施例提供的苹果组培苗瞬时转化证实过表达MdWOX11并且干扰MdTCP17促进MdLBD29的表达。具体是这样实现的：用重悬液混好的菌液采用真空渗透的方式侵染苹果组培苗，侵染菌液的OD600浓度为0.6，侵染时间为8min～10min，侵染完后用无菌滤纸吸干菌液，将组培苗转移至扩繁培养基中，放置于21℃的生化培养箱中暗培养3d。将整株组培苗提取RNA并反转录，分析MdLBD29在其中的表达水平。结果显示过表达MdWOX11并且干扰MdTCP17促进MdLBD29的表达(见图5)。
本发明实施例提供的SEQ ID NO.1MdLBD29启动子核苷酸序列为：
TATCCTATGATAGTTTAGGTATTATGTAACCTTCATAGATGATTGTACCCGATACACATGGATTTTTCCATTAAGAAATAAATCAGAAGTTTTTGCAATCTTTGTTCAGTTTCATGCCTATTTGTGTACCCAGTTTTCTGCTATAGTCAAAATATTCCAAAGTGATGGTGGTGGTGAATGTACAAGCAATAAGTTTCAACAATATTTGTCAAAACATGGTATTTTACATCACAAATCATGTCCATATACACCTGAACATAATGGTTTGGCAGAAAGGAAACATAGGCATCTTGTAGAAACAGCAATTACACTTCTTCAAACTGCAAAATTGCCTAACCAATTTTGGTTTCATGCCTGTGCAACTGCCTCCTATCTGATCAATAGGAAACCTAGTGCTTCTTTAAATATGCAGTCACCATTTCAAAAGTTATATAACACAGTTCCTGAGATCAAACATCTTAGGGTCTTTGGTTGTGCATGTTTTCCCCTTTTAAAACCCTATAACATTTCTAAACTTCAGCCTAAAACAACAACTTGTGTGTTTTTGGGATATGTAGGCCAACATAAGGGTTTCATATGTCTAGATATTGCTCATGGTAAAATTTATGTGGCTAGGCATGTTTTGTTTGATGAATCTACTTTTCCATATTCAAACCCTAGTTTACTTCAACGCTTAAAATTGTCTTCTGCATCATCACAGTTACATTCACCAAATACTTCAAGTTACCCCCGTGTCACTTTCGTGTAAATCTATTAAGGACCTATTATTAATGGGTTCTTCTCGTGTGACCTGATAAAGATCTGATTAGTTATTATGTTGACCCAAAACCCTTTATTTTTGTATCGTTTACGTGTTGTGTAAGAAATTGCCAGGTTTATATGGATCCACCCCTATATGTGTGTGTGTATATATTTATAATATTAATTTACTACCGGTCATCCATTCATTCATGTGCTTAATTAAGTGCTTTGGTGGTAAGAGCTTGTCCAGTAAGCTGATCTGCATGCAGAAGCAAAAGCAGAAAGTTGAACTCAGAATTATCCGTGACATGGGAATGTAGCTTGTGTTGCAAACTGTCATTTTCCTTTGTTAGGATGACGACCTTCTCATTCATTTGAGTTGAAACCTCTTCCCTTGTGGCTTCTAATCTATGCACCAAGTCACAGTACAAAATTTTTATATATGTGCCCTAAGGAGGTGGCAGCTGGTCAATAATAACTCTGATCCCACAGGAGCACCTGTTGTATTATTCATCCATGCATTCATTCATTGAAGTTTACCTTGGATAAATTGGGTCATATACTTGATTGACCACGTTCTATTTTGGTTTTGGTAAAACTGTCTTGTGAGGGACTAGCATAGTTGAAGTGAGGACTTTAGGGTTTTCACCCCATACTATGGGCGCGTTGAGAAAATCTCATATTTTTACTTGTTTGATTTTGTTTATTGATACGAGTGATTGTCTAGTGTTAAAATTACCATACCAAAAGCTTGAACTTTAGAGTCCAGCTAGTCTCATAATACGTAATTGCTTAGATATAAAATTTTAAAGCACCAAACTCTGAAACTTTAAACCTAAAATCGAAGCTCTAAAGGATTATTCTTGATAAGTCAATCATTTGAAAAAAAACGGACCTCCTATAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTATGAGATGTTACTTGTTAGTTGATGCTAACTGAACTAGTTTTTTTTCCCTAATTAACAAAGTATCTGGACTGCAGCAACTAGGATCAGTCAACAAATCCAAAATTTTGCAGTTCTTGTGGTTCAAGTTGAGGCCAGTAGTGACTGAAGGATTTAATTTGTGACAGGTGAGATTTTGGTTTGTGAAAACGATGGCCTTATTAAACCCACTTTTGACTAGTTTTCCTTTTTGTCTCATGTGATCAATGGCATGTTGTATAACGCACGAGGATAACACAACTGCACTCACTTCATTATAGACTTCAAGATCAATCCTTCAGCTACAAGAAAGCACTTATCTCGTCATCTTCTTACGACCCAGTTTCCAAAATCTCGACCTAATCAGAAAATCTTACCTATCTCCGTTTATATTTTTGTGCCCATCTCACTAATTATGTCCTCAATCACATAACCATGAGATAAAAACATACGTATGTAGTATATTCTTCACAAGTAAGTCTTCCTCGTAACAAACACCAAACCAAACCAAAGCAGCACCAATCTTCTTCACCAAGTTGGAGGATTGGAGTCTTGAGCTTGAACAACACTAATGACTAATTAGTTTAATAAATCACTTGCGTATATATGTTTGCAACATTATAAACCCTATTTTAAAACCATATTGCTCAAGGTAACTGAATCATTAGTAATTGTCGGTAGAAAAATATGCCAGAAGAGCTGTGGCAAGTGCAGTGAGTGAACCACAATGTCACAAGGCGACAATTTGCAGCATTTCCCAGGTGCGGCGTTCGGCGGAAAATATAAACATATTCAAACCCTAAAATCAAACTTTGCAATTAAAAAATTGCTAATCATACTCGGTAGCCATTAATCATCCACGCTGGAAAAATATAAAACGAAAAAAGAAATGATTGTATTAAAAATATGATGAATGCTTAAAAAAAGTAGACCCCATGATATTACATAAACCATTAAAAATTGTCCCCTTAG
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
本发明实施例提供了一种苹果MdTCP17和MdWOX11互作调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用。酵母双杂探讨MdTCP17和MdWOX11是否存在蛋白互作。首先构建pGAD424-MdWOX11和pGBT9-MdTCP17载体。分别将MdWOX11和MdTCP17编码区序列用双酶切的方法分别连接至pGAD424和pGBT9载体上。分别提取pGAD424-MdWOX11质粒和pGBT9-MdTCP17质粒，将其共转化到Y2H酵母中(Clontech，PaloAlto，CA，USA)。由于pGBD-MdWOX11有自激活效果，将MdWOX11的自激活区域去掉后将MdWOX11分为N端和C端(标记为MdWOX11N和MdWOX11C)，5个组合分别是MdWOX11N+MdTCP17、MdWOX11C+MdTCP17、MdWOX11N+pGBT9空载体、pGAD424空载体+MdTCP17、pGBT9空载体+pGAD424空载体。将5个组合转化的酵母培养在加入了SD/-Leu/-Trp培养基中正常生长，然后转移到SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade酵母培养基中，后将在此培养基上长出的酵母菌斑在28℃在培养8～12h，后吸取2μL分别滴于DDO/X、DDO/X/A和QDO/X-a-Gal/AbA的酵母培养基上，从酵母菌斑的生长情况来确定蛋白MdWOX11与MdTCP17的互作。结果如图1所示，结果显示MdTCP17和MdWOX11蛋白之间可以相互作用，pGBD-MdWOX11在4缺的培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上培养，酵母菌斑显蓝色(见图1)。MdWOX11的N端与MdTCP17可以互作，转入pGAD-MdTCP17和pGBD-MdWOX11N的酵母培养在QDO/X/A筛选培养基上显示菌斑，酵母***说明MdWOX11蛋白与MdTCP17蛋白相互作用(见图1)。
实施例2
双分子荧光互补(BiFC)进一步探讨蛋白质MdWOX11和MdTCP17之间是否存在互作，双分子荧光互补试验将MdTCP17和MdWOX11基因的全长编码序列***载体35S：pSPYNE-nYFP和35S：pSPYCE-cYFP中，将构建的载体以及空载体转化到农杆菌菌株EHA105中，取500μL的过夜培养的农杆菌菌液至50mL的培养基中培养至OD600＝0.6～0.7左右，室温5000rpm离心10min后用悬浮液冲洗并离心，后用悬浮液调OD600至0.3～0.5左右，将含有不同载体的悬浮液分为三个组合混合，这三个组合分别是MdTCP17-nYFP+MdWOX11-cYFP、MdTCP17-nYFP+pSPYCE-cYFP空载体、pSPYNE-nYFP空载体+MdWOX11-cYFP，分别将相应的悬浮液等体积混合后静止1～2h。将3个不同组合的农杆菌菌液混合并注射本氏烟草叶片，然后在23℃避光恒温条件下培养2～3d，在488nm激发的共聚焦激光扫描显微镜下检测注射部位烟草叶片的YFP荧光(Zeiss LSM 510Meta，Jena，Germany)。双分子荧光互补结果如图2所示，共转化MdWOX11-nYFP和MdTCP17-cYFP的烟草叶片的细胞核中发现了非常强的黄色荧光信号，用细胞核基本染料DAPI染色细胞核，细胞核呈现蓝色信号，GFP和DAPI两个视野整合在一起的图片显示互作信号确实是存在于细胞核中。用空载体nYFP+MdTCP17-cYFP或MdWOX11-nYFP+空载体cYFP转化的本氏烟草细胞未见荧光信号，BiFC试验说明MdWOX11蛋白在体内与MdTCP17蛋白相互作用(见图2)。
实施例3
为进一步明确MdWOX11与MdTCP17互作关系，进行了免疫共沉淀(Co-IP)实验。首先将MdWOX11和MdTCP17基因的全长编码序列分别***载体pCXSN-Myc和pCAMBIA2300-GFP中，拟南芥原生质体分离后将表达MdTCP17-GFP和MdWOX11-Myc蛋白的质粒通过PEG介导法转入拟南芥原生质体，培养18h后收集细胞用于Co-IP试验。最后通过western-blot进行检测。结果如图3所示，融合Myc标签蛋白的MdWOX11蛋白可以被融合GFP标签蛋白的MdTCP17蛋白免疫沉淀，而与由pCXSN-Myc和pCAMBIA-TCP17-GFP质粒共转的组合却没有检测到杂交条带(见图3)。
实施例4
已知MdWOX11转录调控MdLBD29，那么MdWOX11-MdTCP17的相互作用后MdTCP17是否会影响MdWOX11对MdLBD29的转录活性。随后，在本氏烟草叶片中进行了双荧光素酶报告试验来验证这一设想。首先将MdLBD29启动子序列***到pGreen II 0800-LBD29-LUC载体中，MdLBD29启动子序列如SEQ ID NO.1所示。MdWOX11和MdTCP17基因的全长编码序列***载体pGreen II62-SK中，分别将pGreen II 0800-LBD29-LUC、pGreen II 62-SK、pGreen II62-WOX11-SK和pGreen II 62-TCP17-SK转入农杆菌GV3101中。将处理好的菌液分为4组分别注射烟草叶片，分别是pGreen II 0800-LBD29-LUC+pGreen II62-SK、pGreen II 0800-LBD29-LUC+pGreen II 62-WOX11-SK、pGreen II0800-LBD29-LUC+pGreen II 62-TCP17-SK、pGreen II 0800-LBD29-LUC+pGreen II 62-WOX11-SK+pGreen II 62-TCP17-SK，取侵染3d后的烟草叶片测定LUC/REN值，双荧光素酶报告基因测定结果如图4所示，在MdWOX11-SK、MdTCP17-SK与ProLBD29-LUC共同转化后，LUC/REN水平显著低于MdWOX11-SK和ProLBD29-LUC，结果表明，MdTCP17抑制MdWOX11对MdLBD29的转录激活活性(见图4)。
实施例5
为了进一步证实MdWOX11和MdTCP17的相互作用后MdTCP17会影响MdWOX11对MdLBD29的转录活性，进行了苹果组培苗瞬时转化试验。首先将构建好的MdWOX11过表达和MdTCP17干扰载体分别转化至农杆菌感受态EHA105中。取500μL的过夜培养的农杆菌菌液至50mL的培养基中培养至OD600＝0.8左右，室温5000rpm离心10min后用悬浮液冲洗并离心，后用悬浮液调OD600至0.6左右。苹果组培苗瞬时转化***的菌液中，采用真空渗透的方式侵染苹果组培苗。具体操作是将苹果组培苗从组培瓶中取出，放入到含有农杆菌重悬液的针管中反复抽打，以真空渗透的方式侵染苹果组培苗，侵染时间为8～10min，侵染完后用无菌滤纸吸干菌液，将组培苗放到扩繁培养基中暗培养3d，期间的培养温度为21℃，扩繁培养基配方为每升4.43g MS粉、30g蔗糖、7.8g琼脂，0.2mg 6-BA和0.2mg IBA。将整株苹果组培苗从扩繁培养基中取出，用液氮研磨成粉末，提取RNA并反转录成cDNA。设计定量引物，并做定量PCR。结果如图5所示，过表达MdWOX11促进MdLBD29的表达，过表达MdWOX11和干扰MdTCP17抑制MdLBD29的表达(见图5)。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
在基因水平上发现MdWOX11和MdLBD29的表达与不定根发生能力正相关，MdTCP17与不定根发生能力负相关。在难生根的苹果砧木中，MdTCP17的表达量较高，MdTCP17与MdWOX11蛋白互作，MdTCP17抑制MdWOX11对MdLBD29的转录激活作用，从而抑制苹果砧木不定根发生。将不定根发生的分子机制已经成功应用在苹果产业中，我们在生产实践中通过激素处理促进MdWOX11和MdLBD29两个基因的表达，以及抑制MdTCP17的表达来促进苹果砧木不定根的发生，成功开发和优化了一套不定根调控技术体系。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
通过外源生长素处理可以促进MdWOX11和MdLBD29的表达，抑制MdTCP17的表达，明显促进不定根发生，主要通过促进不定根的数目和不定根发生率来促进不定根发生。其次通过外源细胞***素处理可以促进MdTCP17的表达，抑制MdWOX11和MdLBD29的表达，明显抑制不定根发生。在一些难生根的苹果砧木如SH系砧木中，通过外源生长素以及细胞***素抑制剂处理，可以明显增加苹果不定根的数目，主要通过促进MdWOX11和MdLBD29的表达，并抑制MdTCP17的表达来促进不定根发生。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
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tatcctatgatagtttaggtattatgtaaccttcatagatgattgtacccgatacacatggatttttccattaagaaataaatcagaagtttttgcaatctttgttcagtttcatgcctatttgtgtacccagttttctgctatagtcaaaatattccaaagtgatggtggtggtgaatgtacaagcaataagtttcaacaatatttgtcaaaacatggtattttacatcacaaatcatgtccatatacacctgaacataatggtttggcagaaaggaaacataggcatcttgtagaaacagcaattacacttcttcaaactgcaaaattgcctaaccaattttggtttcatgcctgtgcaactgcctcctatctgatcaataggaaacctagtgcttctttaaatatgcagtcaccatttcaaaagttatataacacagttcctgagatcaaacatcttagggtctttggttgtgcatgttttccccttttaaaaccctataacatttctaaacttcagcctaaaacaacaacttgtgtgtttttgggatatgtaggccaacataagggtttcatatgtctagatattgctcatggtaaaatttatgtggctaggcatgttttgtttgatgaatctacttttccatattcaaaccctagtttacttcaacgcttaaaattgtcttctgcatcatcacagttacattcaccaaatacttcaagttacccccgtgtcactttcgtgtaaatctattaaggacctattattaatgggttcttctcgtgtgacctgataaagatctgattagttattatgttgacccaaaaccctttatttttgtatcgtttacgtgttgtgtaagaaattgccaggtttatatggatccacccctatatgtgtgtgtgtatatatttataatattaatttactaccggtcatccattcattcatgtgcttaattaagtgctttggtggtaagagcttgtccagtaagctgatctgcatgcagaagcaaaagcagaaagttgaactcagaattatccgtgacatgggaatgtagcttgtgttgcaaactgtcattttcctttgttaggatgacgaccttctcattcatttgagttgaaacctcttcccttgtggcttctaatctatgcaccaagtcacagtacaaaatttttatatatgtgccctaaggaggtggcagctggtcaataataactctgatcccacaggagcacctgttgtattattcatccatgcattcattcattgaagtttaccttggataaattgggtcatatacttgattgaccacgttctattttggttttggtaaaactgtcttgtgagggactagcatagttgaagtgaggactttagggttttcaccccatactatgggcgcgttgagaaaatctcatatttttacttgtttgattttgtttattgatacgagtgattgtctagtgttaaaattaccataccaaaagcttgaactttagagtccagctagtctcataatacgtaattgcttagatataaaattttaaagcaccaaactctgaaactttaaacctaaaatcgaagctctaaaggattattcttgataagtcaatcatttgaaaaaaaacggacctcctataaaaaaaaaaaaaaaatctctatgagatgttacttgttagttgatgctaactgaactagttttttttccctaattaacaaagtatctggactgcagcaactaggatcagtcaacaaatccaaaattttgcagttcttgtggttcaagttgaggccagtagtgactgaaggatttaatttgtgacaggtgagattttggtttgtgaaaacgatggccttattaaacccacttttgactagttttcctttttgtctcatgtgatcaatggcatgttgtataacgcacgaggataacacaactgcactcacttcattatagacttcaagatcaatccttcagctacaagaaagcacttatctcgtcatcttcttacgacccagtttccaaaatctcgacctaatcagaaaatcttacctatctccgtttatatttttgtgcccatctcactaattatgtcctcaatcacataaccatgagataaaaacatacgtatgtagtatattcttcacaagtaagtcttcctcgtaacaaacaccaaaccaaaccaaagcagcaccaatcttcttcaccaagttggaggattggagtcttgagcttgaacaacactaatgactaattagtttaataaatcacttgcgtatatatgtttgcaacattataaaccctattttaaaaccatattgctcaaggtaactgaatcattagtaattgtcggtagaaaaatatgccagaagagctgtggcaagtgcagtgagtgaaccacaatgtcacaaggcgacaatttgcagcatttcccaggtgcggcgttcggcggaaaatataaacatattcaaaccctaaaatcaaactttgcaattaaaaaattgctaatcatactcggtagccattaatcatccacgctggaaaaatataaaacgaaaaaagaaatgattgtattaaaaatatgatgaatgcttaaaaaaagtagaccccatgatattacataaaccattaaaaattgtccccttag
Claims (8)
1.一种MdTCP17蛋白和MdWOX11蛋白互作在负调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，其特征在于，所述MdTCP17蛋白抑制MdWOX11蛋白对MdLBD29基因的转录激活作用，所述MdTCP17蛋白负调控苹果不定根的发生。
2.如权利要求1所述MdTCP17蛋白和MdWOX11蛋白互作在负调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，其特征在于，所述MdWOX11蛋白诱导MdLBD29基因的表达。
3.如权利要求1所述MdTCP17蛋白和MdWOX11蛋白互作在负调控MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，其特征在于，所述MdLBD29基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述MdTCP17蛋白和MdWOX11蛋白互作在负调控苹果MdLBD29基因表达和不定根发生的应用，其特征在于，所述过表达MdWOX11基因并且干扰MdTCP17基因促进MdLBD29基因的表达。
5.一种促进苹果不定根发生的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用苹果组培苗瞬时转化MdWOX11基因过表达载体和MdTCP17基因干扰载体。
6.如权利要求5所述促进苹果不定根发生的方法，其特征在于，所述苹果组培苗瞬时转化***的菌液中，采用真空渗透的方式侵染苹果组培苗；
所述MdTCP17基因干扰载体的农杆菌菌液OD600的浓度为0.6。
7.如权利要求6所述促进苹果不定根发生的方法，其特征在于，所述侵染时间为8~10min。
8.如权利要求6所述促进苹果不定根发生的方法，其特征在于，所述侵染后苹果组培苗培育温度为21℃。
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