CN117925757A - 一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用，涉及基因编码的多肽库修饰和环化技术领域。本发明首次建立了一种基于天冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidase,AEP)催化的体系来制备大环肽文库的平台技术，通过运用于噬菌体展示的多肽文库的酶法环化修饰产生大规模噬菌体展示的环肽库，并用于筛选针对目标蛋白的环肽配体。本发明中涉及的酶催化多肽环化技术具有反应条件温和、环化效率高、序列特异性高的优势，其产生的噬菌体环肽库可用于发现独特环状结构的环肽配体，是一种强大的环肽体外筛选平台技术。

Description

一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法及在噬菌体展示肽 库中的应用
技术领域
本发明涉及基因编码的多肽库修饰和环化技术领域，具体涉及一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用。
背景技术
环肽分子在多肽药物研发中占据了非常重要的地位，是肽药物重要的分子框架，例如环孢菌素、伏环孢素和去氨加压素都属于环状结构多肽药物。相对短序列的线性多肽，环肽具有刚性的结构，因而在抵抗蛋白酶水解、靶标亲和力和特异性、细胞膜通透性等方面都具有优势，已经成为当前多肽药物设计和发现的重要基础。设计和发现具有理想生物活性的环肽可以为多肽药物的研发提供宝贵的先导分子。动植物体内发现的多肽类毒素是肽药物研发的珍贵宝藏，特别是其中含有丰富的由半胱氨酸组成的多肽分子。这些富含半胱氨酸的多肽通过空气自然氧化形成由二硫键组成的特殊框架环肽，例如芋螺毒素肽和植物环肽。然而，二硫键在还原性条件下(例如体内高浓度的谷胱甘肽)不稳定，易于被还原为自由巯基，并发生非理想的二硫键重组。因此，构建还原条件稳定的环肽分子库十分重要，能促进高附加值环肽先导分子的发现。
噬菌体展示的环肽文库是环肽药物先导分子发现的重要源泉。Heinis等利用三溴甲基苯或其类似物与三个半胱氨酸残基的烷基化反应，创造了噬菌体展示的双环肽技术(参见Nat Chem Biol 2009,5,502-507)，为肽药物的发现提供了一种强大的平台。这种基于巯基烷基化构建的环肽是由硫醚键连接的环状框架，在还原条件下仍然稳定。在双环肽基础上，Derda等通过引入Knorr吡唑合成反应，将多种非天然的药效基团引入噬菌体展示的环肽库，进一步拓展噬菌体展示库的多样性(参见JAm Chem Soc 2021,143,5497-5507)。然而，双环肽技术的关键性多肽环化反应大多在弱碱条件下进行的，能够与噬菌体自身的半胱氨酸残基反应(例如pIII蛋白中的半胱氨酸)，降低噬菌体的侵染性。
基于酶的多肽大环化是制备环肽的另一种重要途径。酶法环化反应通常在温和的水溶液中进行，对噬菌体几乎无毒性。例如，通过在噬菌体展示中引入密码子拓展的酶***，可以将生物正交反应性氨基酸引入多肽文库以产生环肽分子库(参见Angew Chem IntEd Engl 2019,58,15904-15909)。但是，密码子拓展***的构建过程相对复杂，而且含非天然氨基酸的噬菌体表达量通常低于天然氨基酸的噬菌体。此外，常用的生物正交反应例如点击化学，通常使用对噬菌体有毒性的过度金属催化剂(参见JAm Chem Soc 2020,142,1882-1894)。最近，Urban等将羊毛硫肽类化合物合成酶引入噬菌体，构建了羊毛硫肽类活性分子库(参见Nat Commun 2017,8,1500)。与化学环化策略相比，多肽的酶法环化相对更加温和，因而在构建噬菌体表面展示环肽方面具有很大潜力，特别是各种多肽修饰酶的发现将为构建具有特定结构框架的环肽文库提供基础。
天冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidase,AEP)属于一种C13肽酶家族的蛋白水解酶，利用活性位点的半胱氨酸作为亲核试剂水解肽键，并且能够被改造作为多肽连接酶工具，其中最为代表的是OaAEP1(Nat Commun 2015,6,10199)和Butelase 1(参见NatChem Biol2014,10,732-738)。OaAEP1酶能够催化一条C端含有Asn-Gly-Leu基序的多肽与另一个N端含Gly-Leu或者Gly-Ile或Gly-Val基序的多肽以肽键连接(参见JAm Chem Soc2017,139,5351-5358)。OaAEP1酶催化的肽连接反应在水溶液中进行，条件温和，应当不影响噬菌体的侵染性。目前已经报道的基于OaAEP1酶的多肽修饰反应要么用于多肽的片段连接，要么用于多肽的主链环化制备头对尾的环肽，尚未构建其它类型的环肽例如侧链到侧链的环肽和头到侧链的环肽。尽管OaAEP1酶在蛋白质修饰和细胞的表面修饰得到广泛应用，但目前仍然没有被用于构建基因编码环肽文库，例如噬菌体表面展示的环肽。通过深入研究OaAEP1酶的催化***，构建基于天冬酰胺内肽酶介导的侧链到侧链或者头到侧链的多肽环化新策略，并将其用于噬菌体表面展示肽库的环化修饰，能够建立一种新的大环肽筛选平台技术。
发明内容
针对二硫键连接环肽的还原条件不稳定性，以及化学环化策略大多存在生物兼容性差且与噬菌体自身半胱氨酸有潜在反应的缺点，本发明提供了一种反应条件更加温和、反应效率高和高度序列特异性的天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，用于构建侧链到侧链和头到侧链的环肽骨架，并用于修饰噬菌体展示多肽文库，针对靶标蛋白进行大环肽配体的发现。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，所述天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法包括以下步骤：
S1、制备含有低反应性基团的天冬酰胺内肽酶识别的多肽类化合物，且该化合物具有以下结构通式：
其中，Xa为亲电体基团、含亲电体基团的由天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种，其中亲电体基团包括氯乙酰基、3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基；Xb为氧(氧酯键)、氮氢(酰胺键)、硫(硫酯键)中的任意一种，Xc为氢或甲基，Xd为氨基、羟基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽序列中的任意一种；
S2、利用以上多肽类化合物在活化状态的天冬酰胺内肽酶存在条件下与N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板在缓冲盐溶液A中发生酶连反应，产生连接中间体；
S3、利用S2中的连接中间体在缓冲盐溶液B中发生分子内大环化反应，产生环肽分子；
S4、选取S2中N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板，通过基因编码融合表达在噬菌体pIII蛋白质的N末端，再经过S2和S3步骤操作来构建噬菌体展示的环肽库，并针对靶标蛋白筛选大环肽配体。
优选的，所述S2中的多肽模板为以下两种：
模板a：G-Z-(X)m-C；模板b：G-Z-(X)m-C-(X)n-C；
其中，模板a用于构建单环肽，模板b用于构建双环肽，G代表甘氨酸，Z代表L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸中的任意一种，X代表任意一种天然L-氨基酸，C代表L-半胱氨酸且位置可以根据要求改变，m和n代表3～20之间的氨基酸数目。
优选的，所述的天冬酰胺内肽酶是其野生型或者突变体，包括OaAEP1、OaAEP1[C247A]、Butelase 1。
优选的，所述S2中多肽类化合物的浓度范围为0.1μM～10.0mM，活化状态的天冬酰胺内肽酶的浓度范围为0.01μM～10.0mM。
优选的，所述S2中活化状态的天冬酰胺内肽酶为未活化的天冬酰胺内肽酶在pH为3.0～5.0的弱酸性缓冲溶液中进行预先活化，所述弱酸性缓冲溶液包括乙酸钠、乙酸、乙酸铵缓冲液中的任意一种。
优选的，所述S2中酶连反应的时间为15分钟～6小时，反应温度为0～45℃，且缓冲盐溶液A的pH在4.5～9.0，缓冲盐溶液A包括乙酸钠、乙酸和乙酸铵缓冲液中的任意一种。
优选的，所述S3中分子内大环化反应时间为15分钟～6小时，反应温度为0～45℃，缓冲盐溶液B的pH为6.6～9.0，且缓冲盐溶液B包括NaOAc、HEPES、Tris和PBS中的任意一种。
优选的，所述S4中噬菌体包括由pCANTAB 5E噬菌粒和辅助噬菌体M13KO7组成的噬菌体***或M13KE噬菌体***。
优选的，所述S4中靶标蛋白筛选大环肽配体的步骤包括：
S4-1、利用所述的天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法构建噬菌体展示的单环肽或双环肽文库；
S4-2、靶标蛋白被固定在磁珠或孔板上，所述S4-1中噬菌体展示的单环肽或双环肽文库与固定化靶标蛋白共孵育，经过2～4轮生物淘选，对淘选后的噬菌体颗粒进行测序；
S4-3、根据测序结果合成富集的目标环肽，并评价与靶标蛋白的结合力和生物活性。
优选的，所述天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化应用于基因编码环肽文库的构建，包括对噬菌体展示的多肽文库进行多肽连接和环化，构建噬菌体展示的单环肽和双环肽库，针对靶标蛋白筛选环肽配体用于药物、检测试剂盒或其它生物医学和生物材料的开发。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优势：
(1)与现有的天冬酰胺内肽酶催化的多肽连接相比，本发明首次实现了基于天冬酰胺内肽酶的方法制备侧链到侧链的环肽和头到侧链的环肽，且本申请通过酶连反应产生连接中间体，并通过连接中间体的分子内大环化反应产生环肽分子，其中分子内大环化反应为连接中间体中的亲电体基团与半胱氨酸残基之间的环化反应。
(2)与现有的化学环化法构建噬菌体环肽库的技术相比，本发明不需要高反应活性的亲电体，不对噬菌体侵染性产生影响，特别适合修饰噬菌体表面展示的多肽文库。
(3)与密码子拓展或者Flexizyme的环肽文库技术相比，本发明无需繁琐的密码子改造和非天然氨基酸的核糖体嵌入，极大减少了构建基因编码环肽文库的难度和成本。
附图说明：
图1为含氯乙酰基多肽氧酯7在OaAEP1[C247A]酶催化下进行多肽单环化及产生噬菌体单环肽库的示意图；
图2为含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10在OaAEP1[C247A]酶催化下进行多肽双环化及产生噬菌体双环肽库的示意图；
图3为多肽1、2、3、4的色谱与质谱；
图4为实施例1-4分别制备的含氯乙酰基多肽5、含氯乙酰基多肽6、含氯乙酰基多肽氧酯7、含氯乙酰基多肽硫酯8的色谱和质谱；
图5为实施例5-7分别制备的含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9、含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10、含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11以及实施13中多肽Biotin-1的色谱和质谱；
图6为实施例1中含氯乙酰基多肽5的合成示意图；
图7为实施例2中含氯乙酰基多肽6的合成示意图；
图8为实施例3中含氯乙酰基多肽氧酯7的合成示意图；
图9为实施例4中含氯乙酰基多肽硫酯8的合成示意图；
图10为实施例5中含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9的合成示意图；
图11为实施例6中含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10的合成示意图；
图12为实施例7中含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11的合成示意图；
图13为OaAEP1酶催化多肽1与含氯乙酰基多肽5发生连接及连接产物12的质谱；
图14为OaAEP1酶催化多肽2与含氯乙酰基多肽氧酯7发生连接及连接产物13的质谱；
图15为OaAEP1酶催化多肽3与含氯乙酰基多肽氧酯7发生连接及连接产物14的质谱；
图16为多肽1与含氯乙酰基多肽5的连接产物12的分子内单环化及环化产物15的质谱；
图17为OaAEP1酶催化多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9发生连接及连接产物16的质谱；
图18为OaAEP1酶催化多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10发生连接及连接产物17的质谱；
图19为OaAEP1酶催化多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11发生连接及连接产物18的质谱；
图20为多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9的连接产物16的分子内双环化及环化产物19的质谱；
图21为多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10的连接产物17的分子内双环化及环化产物20的质谱；
图22为多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11的连接产物18的分子内双环化及环化产物21的质谱；
图23为噬菌体侵染性测试结果柱状图；
图24为功能性单环肽22与靶标蛋白TEAD4结合力测试结果展示图；
图25为功能性双环肽23与靶标蛋白TEAD4结合力测试结果展示图；
图26为功能性双环肽24与靶标蛋白TEAD4结合力测试结果展示图；
图27为功能性双环肽25与靶标蛋白TEAD4结合力测试结果展示图；
具体实施方式
为了更加清晰地说明本发明，以下将通过实施案例和附图进一步说明。
本发明包括的步骤如下：
(1)两种具有以下特征的N末端为甘氨酸的多肽骨架模板：
模板a：G-Z-(X)m-C
模板b：G-Z-(X)m-C-(X)n-C
其中，模板a用于构建单环肽，模板b用于构建双环肽，G代表甘氨酸，Z代表L-亮氨酸或L-异亮氨酸或L-缬氨酸，X代表任意一个天然L-氨基酸，C代表L-半胱氨酸，m和n代表3～20之间的氨基酸数目。
根据上述模板特征，我们合成了四条N末端为甘氨酸的多肽如下：
H-GLYDPANIHPKGWCGGSG-NH2(模板多肽1)
H-GIYDPANIHPKGWCGGSG-NH2(模板多肽2)
H-GVYDPANIHPKGWCGGSG-NH2(模板多肽3)
H-GLYDPANCIHPKGWCGGSG-NH2(模板多肽4)
所述多肽均由L-型氨基酸组成，N末端为甘氨酸的α-氨基，C端为甘氨酸的酰胺，序列中的四肽GGSG基序是柔性连接臂。这里提供的四条多肽序列仅仅用于阐明本发明的技术细节和具体实施方案，不能作为本专利的全部内容。在构建环肽文库时，模板中半胱氨酸的具***置可以根据需求进行改变，模板中的氨基酸具体数目根据实际需求可以进行减少或者增加，变换后的多肽模板仍属于本专利保护的范畴。因此，在该专利的基础上做出的多肽骨架类型改变以及修饰，仍处于本专利保护范围。
(2)一种具有以下特征的化学合成的多肽类化合物：
其中，Xa为亲电体基团、含亲电体基团的由天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种，其中亲电体基团包括氯乙酰基、3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基；Xb为氧(氧酯键)、氮氢(酰胺键)、硫(硫酯键)中的任意一种，Xc为氢或甲基，Xd为氨基、羟基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽序列中的任意一种；所有在本专利基础上做出的对该多肽类化合物的简单改变和修饰仍然在本专利所保护的范围之内。
(3)在活化状态的天冬酰胺内肽酶存在下，上述化学合成的多肽类化合物与上述N-末端含Gly-Leu或Gly-Ile或Gly-Val基序且序列中含半胱氨酸的多肽模板在缓冲盐溶液中发生多肽连接，产生连接中间体。
其中，天冬酰胺内肽酶是其野生型或者突变体包括OaAEP1，OaAEP1[C247A]或Butelase 1等，所述的多肽化合物浓度范围为0.1μM～10.0mM，活化状态的天冬酰胺内肽酶的浓度范围为0.01μM～10.0mM，活化状态的天冬酰胺内肽酶为未活化的天冬酰胺内肽酶在弱酸性(pH3.0～5.0)缓冲溶液如乙酸钠或者乙酸或者乙酸铵缓冲液中被预先活化，酶连反应的时间为15分钟～6小时，反应温度为0～45℃，缓冲溶液(pH4.5～9.0)为乙酸钠或者乙酸或者乙酸胺缓冲液等，所有在本专利基础上做出的对该条件的简单改变仍然在本专利所保护范围之内。
(4)连接中间体在缓冲盐溶液中发生分子内大环化反应，产生环肽产物
其中，大环化反应的时间为15分钟～6小时，反应温度为0～45℃，缓冲溶液为常见的缓冲液(pH6.6～9.0)例如NaOAc、HEPES、Tris和PBS等。
(5)噬菌体展示环肽文库的构建及应用：
在噬菌体表面展示的双环多肽文库序列特征：
GLXXXXXXCXXXXXXCGGSG(由N到C端，X是天然氨基酸的任意一种，通过NNK方式编码，在序列12个位置进行随机性氨基酸突变，其中GGSG是柔性氨基酸连接臂并且位于双环肽文库与噬菌体表面pIII蛋白之间)。
根据该多肽序列特征设计合成两个DNA序列：
引物A：
5’-TTGGTCTCGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTG-3’；
引物C：
5’-TTTGGTCTCAGCACCGCCAGAGCCGCCGCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNGCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNCAAACCGGCCATGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGG-3’(文库的模板链，其中N为A/T/C/G，M为C/A，K为G/T，划线碱基为BsaI酶切位点)。
上述的两个DNA以pCANTAB 5E突变载体(不含BsaI酶切位点)为模板，在高保真聚合酶例如KeyPo酶存在下进行全质粒PCR反应，然后通过BsaI和DpnI处理并随后经T4连接酶连接和电转化感受态TG1细胞，滴度测定文库多样性为1.0×109，再通过与辅助噬菌体M13KO7包装成展示了多肽库的噬菌体。
所述的噬菌体展示多肽文库与所述的含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽类化合物共孵育，在活化状态的天冬酰胺内肽酶例如OaAEP1[C247A]的介导下产生双环肽噬菌体文库，并以固定化靶标蛋白TEAD4为靶点进行3轮筛选，随机挑选噬菌体克隆测序并依据富集的多肽序列化学合成对应的双环肽，进行靶蛋白的偏振荧光测试，确定该技术的实际效果。
(6)本发明中提及的一系列不同特征的多肽模板均能够通过天冬酰胺内肽酶介导的多肽连接和环化来生成环状骨架的多肽，并用于构建大规模基因编码编码的环肽文库，用于靶标蛋白的功能性环肽配体的发现。
噬菌体表面展示的N-末端含Gly-Leu或Gly-Ile或Gly-Val基序且序列中含一个半胱氨酸的多肽模板与含氯乙酰基的多肽类化合物共孵育，在天冬酰胺内肽酶OaAEP1[C247A]的介导下发生多肽连接和环化，产生噬菌体展示的单环肽文库，用于针对目标靶蛋白筛选单环肽配体。噬菌体表面展示的N-末端含Gly-Leu或Gly-Ile或Gly-Val基序且序列中含两个半胱氨酸的多肽模板与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽类化合物共孵育，在天冬酰胺内肽酶OaAEP1[C247A]的介导下发生多肽连接和环化，产生噬菌体展示的双环肽文库，用于针对目标靶蛋白筛选双环肽配体。
一种以GL-(X)12-C为特征的多肽模板融合表达在噬菌体pIII的N末端，与含氯乙酰基的多肽类化合物在天冬酰胺内肽酶OaAEP1[C247A]介导下发生多肽连接和分子内大环化，构建出库容量为1.5×109的单环肽文库。以生物素化且固定在链霉亲和素磁珠的TEAD4为靶点，经过3轮噬菌体筛选和噬菌体克隆测序，发现了一种高度富集的多肽序列，并通过合成相应的单环肽和偏振荧光确定其结合TEAD4的亲和力为3.9μM，充分展示了本专利技术在噬菌体展示单环肽构建和功能性单环肽配体发现方面的效果。
一种以GL-(X)6-C-(X)6-C为特征的多肽模板融合表达在噬菌体pIII的N末端，与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽类化合物在天冬酰胺内肽酶OaAEP1[C247A]介导下发生多肽连接和分子内大环化，构建出库容量为1.0×109的单环肽文库。以生物素化且固定在链霉亲和素磁珠的TEAD4为靶点，经过3轮噬菌体筛选和噬菌体克隆测序，发现了高度富集的3种双环肽，通过偏振荧光确定其结合TEAD4的亲和力在139～305nM范围，充分说明本专利技术在噬菌体展示双环肽构建和功能性双环肽配体发现方面的效果。
实施例1：
根据上述内容
含氯乙酰基多肽5的合成
称取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量Fmoc-His(Trt)-OH(557.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。然后用DMF洗涤树脂4次，按照上述相同的流程依次进行Leu、Ala和Asn的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Asn的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量氯乙酸(85mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)放到震荡反应器中常温反应60分钟，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到白色粉末状粗肽。
取10.0mg粗肽进行高效液相色谱制备，冷冻干燥后得到目的含氯乙酰基多肽5(8mg，序列为ClAcAsn-Ala-Leu-His-NH2，ClAcAsn：Asn的α-氨基被氯乙酰基修饰)，制备流程如图6所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C21H33ClN8O6:528.2；found:528.3。
含氯乙酰基多肽5用于多肽的酶催化环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例2：
含氯乙酰基多肽6的合成
称取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量Fmoc-His(Trt)-OH(557.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。然后用DMF洗涤树脂4次，按照上述相同的流程依次进行Leu、Gly和Asn的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Asn的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量氯乙酸(85mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)放到震荡反应器中常温反应60分钟，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到白色粉末状粗肽。
取10.0mg粗肽进行高效液相色谱制备，冷冻干燥后得到目的含氯乙酰基多肽6(8mg，序列为ClAcAsn-Gly-Leu-His-NH2，ClAcAsn：Asn的α-氨基被氯乙酰基修饰)，制备流程如图7所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C20H31ClN8O6:514.2；found:514.2。
含氯乙酰基多肽6用于多肽的酶催化环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例3：
含氯乙酰基多肽氧酯7的合成
称取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量Fmoc-His(Trt)-OH(557.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。然后用DMF洗涤树脂4次，按照上述相同的流程依次进行Leu、羟基乙酸的固相缩合。用10％水合肼处理30分钟，洗涤树脂。取5.0当量Fmoc-Asn(Trt)-OH(596.0mg)、5.0当量HOBt(135.1mg)、5.0当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(140.0μL)及2.5mg的DMAP溶解在3mL DCM/DMF(9:1，体积比)的混合溶液中，加入树脂，并一同转移到15-mL规格的离心管中，25℃反应12h。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Asn的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量氯乙酸(85.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，震荡反应器常温反应60分钟，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到白色粉末状粗肽。
取10.0mg粗肽进行高效液相色谱制备，冷冻干燥后得到目的含氯乙酰基多肽氧酯7(7.0mg，序列为ClAcAsn-Ogly-Leu-His-NH2，ClAcAsn：Asn的α-氨基被氯乙酰基修饰，Ogly：羟基乙酸)，制备流程如图8所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C20H30ClN7O7:515.1；found:515.2。
含氯乙酰基多肽氧酯7用于多肽的酶催化环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例4：
含氯乙酰基多肽硫酯8的合成
取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)，按照Fmoc固相合成组装多肽序列8A，其中的N端巯基乙酸的缩合条件为：4.5当量Trt保护的巯基乙酸、4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺和4.5当量oxyma，55℃反应40分钟。经TFA裂解和***沉淀得到60.0mg粉末状粗肽8A，取Boc-Asn(Trt)-OH(38mg)、N-羟基琥珀酰亚胺(20.0mg)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(32μL)，溶于1.0mL DMF，常温反应6小时。然后，加入粗肽8A(7.4mg)和10.0μL DIPEA，常温反应30分钟。反应液被3.0mL色谱水淬灭，经HPLC纯化得到8B。称取8B(5.0mg)加入400.0μL的TFA与100.0μL水的混合溶液。常温静置1小时后，加入9倍体积的预冷却***，离心得到4mg的白色粉末状粗肽。该粗肽溶于250.0μL的DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量氯乙酸(2.0mg)、4.5当量oxyma(5.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(5.0μL)，常温反应60分钟。反应液被3.0mL的色谱水淬灭，经HPLC纯化和冷冻干燥后得到含氯乙酰基多肽硫酯8(3.0mg，序列为ClAcAsn-Sgly-Leu-His-Arg-Leu-His-NH2，ClAcAsn：Asn的α-氨基被氯乙酰基修饰，Sgly：巯基乙酸结构)，制备流程如图9所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C38H60ClN15O9S:937.4；found:937.6。
含氯乙酰基多肽硫酯8用于多肽的酶催化环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例5：
含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9的合成
取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)于5.0mL规格固相合成反应器中，加入3.0mL的DMF，室温溶胀15分钟。20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，重复一次Fmoc的脱保护。DMF洗涤树脂后，加入2.0mL含氨基酸的DMF溶液(含4.5当量Fmoc-His(Trt)-OH、4.5当量oxyma和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺)，55℃震荡反应40分钟。DMF洗涤树脂4次后，按照多肽固相合成流程依次进行Leu和羟基乙酸的缩合。10％水合肼的DMF溶液处理树脂30分钟后，加入3.0mL含氨基酸的DCM/DMF溶液(9：1，v:v)，其中含5.0当量Fmoc-Asn(Trt)-OH、5.0当量HOBt、5.0当量N,N'-二异丙基碳二亚胺和2.5mg的DMAP)。树脂和反应溶液转移到15.0-mL规格的离心管。25℃反应12h后，树脂被DMF洗涤4次，加入20％哌啶的DMF溶液去除Fmoc保护基。树脂被DMF洗涤后，加入2.0mL含氨基酸的DMF溶液，其中含有4.5当量Fmoc-Lys(Boc)-OH、4.5当量oxyma和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺。55℃震荡反应40分钟后，DMF洗涤树脂4次，脱除Fmoc保护基。洗涤树脂后，加入2.0mL的封闭试剂(DMF：乙酸酐：2，6-二甲基吡啶＝89：5：6，体积比)。常温反应2分钟后，树脂依次被DMF和DCM洗涤。常温晾干树脂，加入TFA裂解液(TFA：间甲酚：水：三异丙基硅烷＝88：5：5：2，体积比)。常温反应2小时后，收集多肽裂解液，加入9倍体积的冰冷却***，离心得到白色粉末状粗肽(序列为AcNH-Lys-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，Ogly：羟基乙酸)。
取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸(15.2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(23.0mg)溶于0.8mL DMF，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(31.2μL)。常温反应60分钟，加入3.0mL的色谱水相/色谱有机相(1：1，体积比)淬灭反应，经液相色谱纯化得到3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸的活化酯。
取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸的活化酯(10.0mg)溶于0.2mL DMF中，依次加入粗肽(4.5mg，序列为AcNH-Lys-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，Ogly：羟基乙酸))和N,N-二异丙基乙胺(2.0μL)。常温反应60分钟后，加入3.0mL的色谱水相淬灭反应，经过高效液相色谱纯化和冷冻干燥后得到含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9(3.8mg，序列为AcNH-CabLys-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，CabLys：Lys的侧链被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰，Ogly：羟基乙酸结构)，制备流程如图10所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculatedfor C37H51Cl2N11O11:895.3；found:895.4。
合成的3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9用于多肽的酶催化双环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化双环化及筛选功能性双环肽配体。
实施例6：
含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10的合成
取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)于5.0mL规格固相合成反应器中，加入3.0mL的DMF，室温溶胀15分钟。20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，重复一次Fmoc的脱保护。DMF洗涤树脂后，加入2.0mL含氨基酸的DMF溶液(含4.5当量Fmoc-His(Trt)-OH、4.5当量oxyma和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺)，55℃震荡反应40分钟。DMF洗涤树脂4次后，按照多肽固相合成流程依次进行Leu和羟基乙酸的缩合。10％水合肼的DMF溶液处理树脂30分钟后，加入3.0mL含氨基酸的DCM/DMF溶液(9：1，v:v)，其中含5.0当量Fmoc-Asn(Trt)-OH、5.0当量HOBt、5.0当量N,N'-二异丙基碳二亚胺和2.5mg的DMAP)。树脂和反应液转移到15.0-mL规格的离心管。25℃反应12h后，树脂被DMF洗涤4次，加入20％哌啶的DMF溶液去除Fmoc保护基。树脂被DMF洗涤后，加入2.0mL含氨基酸的DMF溶液，其中含有4.5当量Boc-Gly-OH、4.5当量oxyma和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺。55℃震荡反应40分钟后，树脂依次被DMF和DCM洗涤。常温晾干树脂，加入TFA裂解液(TFA：间甲酚：水：三异丙基硅烷＝88：5：5：2，体积比)。常温反应2小时后，收集多肽裂解液，加入9倍体积的冰冷却***，离心得到白色粉末状粗肽(序列为NH2-Gly-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，Ogly：羟基乙酸)。
取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸(15.2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(23.0mg)溶于0.8mL DMF，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(31.2μL)。常温反应60分钟，3.0mL的色谱水相/色谱有机相(1：1，体积比)淬灭反应，经液相色谱纯化得到3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸的活化酯。
取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸的活化酯(10.0mg)溶于0.2mL DMF中，依次加入粗肽(4.0mg，序列为NH2-Gly-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，Ogly：羟基乙酸))和N,N-二异丙基乙胺(2.0μL)。常温反应60分钟后，3.0mL的色谱水相淬灭反应，经过高效液相色谱纯化和冷冻干燥后得到含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10(3.2mg，序列为CabGly-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，CabGly：Gly的α-氨基被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰，Ogly：羟基乙酸结构)，制备流程如图11所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated forC31H40Cl2N10O10:783.6；found:783.6。
合成的3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10用于多肽的酶催化双环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化双环化及筛选功能性双环肽配体。
实施例7：
含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11的合成取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)于5.0mL规格固相合成反应器中，加入3.0mL的DMF，室温溶胀15分钟。20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，重复一次Fmoc的脱保护。DMF洗涤树脂后，加入2.0mL含氨基酸的DMF溶液(含4.5当量Fmoc-His(Trt)-OH、4.5当量oxyma和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺)，55℃震荡反应40分钟。DMF洗涤树脂4次后，按照多肽固相合成流程依次进行Leu和羟基乙酸的缩合。10％水合肼的DMF溶液处理树脂30分钟后，加入3.0mL含氨基酸的DCM/DMF溶液(9：1，v:v)，其中含5.0当量Fmoc-Asn(Trt)-OH、5.0当量HOBt、5.0当量N,N'-二异丙基碳二亚胺和2.5mg的DMAP)。树脂和反应液体转移到15.0-mL规格的离心管。25℃应12h后，树脂被DMF洗涤4次，加入20％哌啶的DMF溶液去除Fmoc保护基。DMF洗涤树脂4次后，用于后续的3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸缩合。
取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸(30.4mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(46.0mg)溶于0.8mL DMF，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(62.4μL)。常温反应60分钟，6.0mL的色谱水相/色谱有机相(1：1，体积比)淬灭反应，经液相色谱纯化得到3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸的活化酯。
取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸的活化酯(20.0mg)，加入10μmol规模的树脂中(已经接上目标氨基酸序列)，随后加入2.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应60分钟后，树脂分别被DMF和DCM洗涤4次。常温晾干树脂，加入TFA裂解液(TFA：间甲酚：水：三异丙基硅烷＝88：5：5：2，体积比)。常温反应2小时，收集多肽裂解液，加入9倍体积的冰却***，离心得到粗肽。经液相色谱纯化和冷冻干燥后得到含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11(5mg，序列为CabAsn-Ogly-Leu-His-NH2，CabAsn：Asn的α-氨基被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰，Ogly：羟基乙酸结构)，制备流程如图12所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C29H37Cl2N9O9:725.2；found:725.5。
合成的3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11用于多肽的酶催化双环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化双环化及筛选功能性双环肽配体。
实施例8：
OaAEP1酶的突变与改造
从Addgene购买含OaAEP1的DH5α菌株(Addgene，plasmid#89482，其目的OaAEP1酶的N端融合了SUMO),划板挑选单克隆测序，并进行放大培养培养，试剂盒收集含OaAEP1的质粒。
定制两对引物，通过搭桥法对OaAEP1的DNA序列进行突变，以获得含OaAEP1[C247A]的质粒。我们定制了四个DNA，序列如下：引物1序列(正向)：
5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
引物2序列(反向)：
5’-CGGACAATAATAGGCCCAGCTGCTTTCGGTGGTGTTGGT-3’引物3序列(正向)
5’-ACCACCGAAAGCAGCTGGGCCTATTATTGTCCGGCGCAG-3’引物4序列(反向)：
5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。
具体而言，我们以含OaAEP1的质粒为模板，加入引物1和引物2，在PrimeSTAR聚合酶的条件下进行PCR，并直接回收PCR的产物。同时，我们以含OaAEP1的质粒为模板，加入引物3和引物4，在PrimeSTAR聚合酶的条件下进行PCR，并直接回收PCR的产物。接下来，我们将两种PCR产物等比例混合，并加入引物1和引物4，再进行PrimeSTAR聚合酶的PCR，胶回收目的全长的PCR产物(其中包含OaAEP1[C247A])。PCR产物的DNA经过BamHI和Hind III双酶切，回收酶切后的带有粘性末端的DNA。同时，对纯化的含OaAEP1的全长质粒进行BamHI和HindIII双酶切，回收酶切后带有粘性末端的线性质粒。经过酶切的OaAEP1[C247A]片段与带粘性末端的线性质粒进行酶连，并转化到DH5α菌株，挑单克隆菌株，测序获得包含OaAEP1[C247A]目的菌株。
接下来，我们对包含OaAEP1[C247A]的质粒进一步改变，在目的蛋白酶OaAEP1[C247A]与SUMO之间添加TEV酶切位点。我们定制了一对引物，序列如下：
引物5序列(正向)：
5’-GCTGGATCCGAGGATCTGTACTTTCAGAGCGCTCGCGATGGTGATTATCT-3’
引物6序列(反向)：
5’-CGCAAGCTTACGGAATGCTCGCG-3’
以包含OaAEP1[C247A]的质粒为模板，加入引物5和引物6，利用PrimeSTAR聚合酶进行PCR。利用试剂盒回收目的条带被BamHI和HindIII双酶切，随后回收带有粘性末端的目的DNA。同时，对含OaAEP1[C247A]的质粒进行BamHI和HindIII双酶切，并回收带有粘性末端的线性质粒。经过酶切的目的DNA片段与带粘性末端的线性质粒进行酶连，并转化到DH5α菌株，挑单克隆菌株，测序获得目的质粒的菌株(该质粒中，SUMO与OaAEP1[C247A]之间***了EDLYFQS序列，作为TEV的识别序列)。
目的OaAEP1[C247A]质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，划板于含有卡那霉素的LB平板上过夜生长，选择单克隆接种于3.0mL的LB培养基(含卡那霉素)37℃过夜培养。取500.0mL的LB培养基，加入250μL卡那霉素母液(100.0mg/mL),加入过夜培养的菌株1.5mL，37℃培养3小时，至OD600达到0.8附近，加入150.0μL的IPTG母液(1.0mmol/L)，16℃培养20小时。离心收集菌株，用裂解缓冲液(20.0mM Tris,500.0mM NaCl,5％甘油，pH 7.5)离心洗涤菌株，然后加入50.0mL裂解缓冲液，超声破碎菌株，离心去除沉淀物，得到含有目标OaAEP1[C247A]酶的上清溶液，经过镍柱纯化得到纯度在90％左右目的蛋白质，通过超滤浓缩和置换为裂解缓冲液得到OaAEP1[C247A]酶(18mg/mL)。OaAEP1[C247A]酶的浓度稀释到1.0mg/mL，加入10％的TEV酶在25℃切割5h，以去除SuMO标签。经过镍柱去除SUMO蛋白，得到纯度在90％左右的目的蛋白质，超滤置换为裂解缓冲液(20.0mM Tris,500.0mM NaCl,5％甘油，pH7.5)，分装保存在-80℃，每支12μL，含OaAEP1[C247A]酶216μg，用于酶催化的多肽连接和侧链环化反应。
实施例9：
OaAEP1[C247A]介导含氯乙酰基多肽的连接
配置50mM NaOAc溶液(pH4.0)，取125.0μLNaOAc溶液(pH4.0)，加入3μL OaAEP1[C247A](54μg，终浓度为15μM)，37℃静置5小时激活酶。
5小时后，调节pH为5.0，OaAEP1[C247A]的终浓度变为5.0μM。加入3.0μL模板多肽1(序列为H-GLYDPANIHPKGWCGGSG-NH2，23μg，终浓度为50.0μM)，接着加入3.0μL含氯乙酰基多肽5(序列为ClAcAsn-Ala-Leu-His-NH2，ClAcAsn：Asn的α-氨基被氯乙酰基修饰，终浓度为500.0μM)。混合反应溶液后于37℃摇床中，使用高效液相色谱检测反应。注意，多肽1和含氯乙酰基多肽5预先溶解在含1％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液中。
如图13所示，液相色谱分析，在OaAEP1[C247A]酶的存在下，多肽1与含氯乙酰基多肽5发生了多肽连接，生成了连接产物12(理论分子量2017.8；观测分子量:2018.4)。按照类似操作，多肽1与含氯乙酰基多肽6发生了多肽连接反应，生成连接产物12。按照类似操作，多肽1与含氯乙酰基多肽氧酯7发生了多肽连接反应，生成连接产物12。按照类似操作，多肽1与含氯乙酰基多肽硫酯8发生了多肽连接反应，生成连接产物12。
按照类似的流程，模板多肽2(H-GIYDPANIHPKGWCGGSG-NH2)、模板多肽3(H-GVYDPANIHPKGWCGGSG-NH2)与含氯乙酰基多肽氧酯7发生了多肽连接，分别生成连接产物13和连接产物14，分别如图14和图15所示。
实施例10：
酶连接产物的分子内单环化
当多肽1和含氯乙酰基多肽5发生酶连反应后，缓慢加入6.0MNaOH水溶液，使溶液pH调节至8.0。反应液在37℃中震荡30分钟后，色谱跟踪确定连接产物12完全转变为单环肽产物15(理论分子量：1980.9；观测分子量:1981.0)，如图16所示。
实施例11：
OaAEP1[C247A]介导含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽的连接
配置50mM NaOAc溶液(pH4.0)，取125.0μLNaOAc溶液(pH4.0)，加入3μL OaAEP1[C247A](54μg，终浓度为15μM)，37℃静置5小时激活酶。
5小时后，pH调节为5.0，OaAEP1[C247A]的终浓度变为5.0μM。加入3.0μL模板多肽4(序列为H-GLYDPANCIHPKGWCGGSG-NH2，终浓度为50.0μM)，接着加入3.0μL含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9(序列为AcNH-CabLys-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，CabLys：Lys的侧链被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰，Ogly：羟基乙酸结构，终浓度为500.0μM)。混合反应溶液后于37℃摇床中，使用高效液相色谱检测反应。注意，多肽4和含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9预先溶解在含1％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液中。
如图17所示，高效液相色谱分析，在OaAEP1[C247A]酶的存在下，多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9发生了多肽连接，生成了连接产物16(ESI-MS(m/z)：calculated for C107H151Cl2N31O31S2:2501.0；found:2501.2)。如图18所示，按照类似操作，多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯10发生了多肽连接反应，生成连接产物17(ESI-MS(m/z)：calculated for C101H140Cl2N30O30S2:2387.9；found:2387.4)。如图19所示，按照类似操作，多肽4与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯11发生了多肽连接反应，生成连接产物18(C99H137Cl2N29O29S2:2330.9；found:2330.8)。
实施例12：
酶连接产物的分子内双环化
当多肽4和含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯9的酶连反应结束后，缓慢加入6.0M NaOH水溶液，使溶液pH至8.0。反应体系在37℃中孵育30分钟后，色谱跟踪反应证实连接产物完全转化为双环肽产物19(ESI-MS(m/z)：calculated for C107H149N31O31S2:2429.0；found:2428.6)，如图20所示。按照类似的流程，多肽4与10的连接产物发生分子内双环化产生双环肽20(ESI-MS(m/z)：calculated for C101H138N30O30S2:2315.9；found:2315.8)，如图21所示。多肽4与11的连接产物也发生分子内双环化反应生成双环肽产物21(ESI-MS(m/z)C99H135N29O29S2:2258.9；found:2258.6，如图22。
实施例13：
OaAEP1[C247A]催化的反应对噬菌体的修饰
1、构建M13KE-GLSFYSHSGX12C噬菌体文库
以M13KE-GX12C多肽文库体噬菌体载体(本实验室以前构建的)为起点，构建M13KE-GLSFYSHSGX12C噬菌体库，其表达的噬菌体pIII末端含有Gly-Leu基序，用于OaAEP1[C247A]的噬菌体修饰测试。根据M13KE-GX12C多肽文库的特征，我们设计了两对包含BsaI酶切位点的引物，从生物生工(上海)公司定制，序列如下：
引物7序列(正向)：
5’-TTGGTCTCGGCTTATCTTTCTATTCTCACTCTGGC-3’
引物8序列(反向)：
5’-TTTGGTCTCAAAGCCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCAC-3’
以M13KE-GX12C质粒为模板，引物7和引物8平行进行全质粒PCR反应，试剂盒回收目的DNA。回收的DNA样品被BsaI和DpnI双酶切反应，产生互补性粘性末端并降解模板质粒。DNA试剂盒直接回收产物后，T4连接酶进行质粒自连反应。试剂盒直接回收连接产物后，电转化ER2738细胞，蓝斑滴度测定多样性为1.15×107。随机挑选噬菌斑并放大培养，回收质粒测序确定文库质量。剩余的噬菌体加入甘油低温保存。
2、链霉亲和素磁珠捕获噬菌体
首先是OaAEP1[C247A]的活化步骤。配置50mM NaOAc溶液(pH4.0)，取125.0μlNaOAc溶液(pH4.0)，加入3.0μl OaAEP1[C247A](终浓度为15μM)，37℃静置5小时。然后，反应液pH调节到5.0，OaAEP1[C247A]的终浓度变为5.0μM。
取M13KE-GLSFYSHSGX12C噬菌体(2×1011pfu),加入375.0μL激活的OaAEP1[C247A]酶溶液中，随后加入3.0μL的Biotin-1(序列为ClAcGly-biotinLys-Gly-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，分子式C38H59ClN12O11S，理论分子量926.3g/mol，观测分子量926.4g/mol，ClAcGly：Gly的α-氨基被氯乙酰基修饰，biotinLys：Lys的侧链氨基修饰了生物素，终浓度为500.0μM)。4℃缓慢旋转1小时后，PEG-8000沉淀噬菌体颗粒。噬菌体颗粒重悬于375.0μL 50.0mM NaOAc(1.0mM TCEP,pH8.0)，37℃及250rpm中孵育30分钟。重复PEG8000沉淀噬菌体后，重悬TBS缓冲液，梯度稀释至105pfu/mL噬菌体液。分别取20.0μL噬菌体溶液(105pfu/mL)转移到2个干净的2.0mL规格离心管，命名A、B管。PBS洗涤链霉素亲和素包裹的磁珠20.0μL，加入50.0μLBinding缓冲液(10.0mM Tris-Cl、150.0mM NaCl、10.0mM MgCl2、1.0mM CaCl2，pH 7.4)和50.0μL Blocking缓冲液(10.0mM Tris-Cl、150.0mM NaCl、10.0mM MgCl2、1.0mM CaCl2，0.3％Tween-20，3％(w/v)BSA)，室温缓慢旋转磁珠1小时。向A和B管中加入50.0μL Binding缓冲液和50.0μLBlocking缓冲液，室温下缓慢旋转1小时。A管噬菌体加入链霉亲和素磁珠溶液，室温缓慢旋转30分钟，磁力架上捕获磁珠，上清转移到一个干净离心管。200.0μLwashing缓冲液(10.0mM Tris-Cl、150.0mM NaCl、10.0mM MgCl2、1.0mM CaCl2，pH 7.4，0.1％Tween-20)洗磁珠2次后，溶液一并转移至含有A管的噬菌体上清的离心管。梯度测定经磁珠捕获的A管的上清液和B管中噬菌体。OaAEP1[C247A]修饰噬菌体的效率计算方法：修饰噬菌体比例(％)＝[(B滴度-A滴度)/B滴度]×100％。噬菌体捕获实验重复3次。滴度测试确定73％的噬菌体颗粒被Biotin-1修饰。
实施例14：
噬菌体单环肽文库构建及功能性单环肽配体筛选
1、构建pCANTAB 5E-GLX12C噬菌粒文库
pCantab 5E噬菌粒和辅助噬菌体(M13KO7)均来自四川阿帕克生物科技有限公司。为了实现大的文库规模，我们采用全质粒PCR的策略构建噬菌体GLX12C多肽文库，其中X是通过NNK编码的随机氨基酸，N为A/T/C/G，K为G/T。具体而言，BsaI酶(来自莫纳公司)被用于文库的噬菌体pIII的N端融合。
我们首先设计引物对pCANTAB 5E质粒图谱中存在的BsaI酶切位点进行点突变(pCANTAB S240密码子TCT突变为TCG)。生物生工定制两个引物如下：
引物9序列(正向)：
5’-GAGCGTGGGTCGCGCGGTATCATTGCAGCAC-3’
引物10序列(反向)：
5’-ACCGCGCGACCCACGCTCACCGGCTC-3’
以pCANTAB 5E质粒为模板，引物9和引物10进行全质粒的PCR反应。利用试剂盒直接回收PCR产物，用DpnI处理模板后转入TG1细胞中，并划板，选取单克隆接种培养，提取质粒寄送测序公司分析，正确的质粒样品被分装后，保存于-20℃。
以点突变的pCANTAB 5E质粒为模板，构建pCANTAB 5E-GLX12C噬菌体文库。从生物生工定制如下两个DNA：
引物A(正向)：
5’-TTGGTCTCGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTG-3’；
引物B(反向)：
5’-TTTGGTCTCAGCACCGCCAGAGCCGCCGCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNCAAACCGGCCATGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGG-3’，文库的模板链，其中N为A/T/C/G，M为C/A。
以pCANTAB 5E(无BsaI酶切位点)质粒为模板，加入引物A和引物B，进行全质粒的PCR反应(30轮)。回收PCR产物，BsaI和DpnI处理PCR产物。回收产物，T4连接酶过夜连接。回收酶连产物，电转化TG1细胞。测定滴度以确定文库的多样性，并随机挑取菌落测序分析文库的质量，滴度测定确定噬菌体文库多样性为1.5×109。收集初代菌体，分装保存在-80℃。
2、OaAEP1[C247A]的反应条件对噬菌体的影响
五等份噬菌体(1012pfu)分别溶解于五种不同的溶液(375ul)。溶液A：中性PBS(商业购买)；溶液B：50.0mM NaOAc，pH 5.0；溶液C：50.0mM NaOAc，pH 5.0，50.0μM含氯乙酰基多肽7(序列为ClAcAsn-Ogly-Leu-His-NH2，ClAcAsn：Asn的α-氨基被氯乙酰基修饰，Ogly：羟基乙酸)；溶液D：50.0mM NaOAc，pH 5.0，5.0μM已激活的OaAEP1[C247A]；溶液E：50.0mMNaOAc，pH 5.0，50.0μM的含氯乙酰基多肽7，5.0μM已激活的OaAEP1[C247A]。噬菌体在4℃下震荡1小时后，稀释涂板检测滴度。如图23所示，滴度测定结果表明OaAEP1[C247A]的反应条件对噬菌体的侵染性影响很小，从而证实本专利提出的方法是一个生物兼容性好的方法。
3、靶蛋白的生物素化
取600.0μg靶蛋白TEAD4(26.53kDa，终浓度为10.0μM)溶于2.0mL PBS(pH 7.4)，然后加入20倍当量的Biotin-PEG-NHS(1000.0g/mol)。室温孵育1小时后，通过ZebaTM脱盐离心板清除未反应的过量Biotin-PEG-NHS。此外，还可以通过以下方法进行靶蛋白的生物素化。200.0μL靶蛋白TEAD4(26.53kDa，母液浓度113.5μM)溶解1.8mLPBS(pH 7.4)，随后加入20倍当量Biotin-PEG-NHS(1000g/mol)。室温孵育1小时后，通过合适大小的超滤浓缩，并通过多次Lysis buffer(20.0mM HEPES,500.0mM NaCl,5％甘油,pH 7.5)置换清除过量的未反应的Biotin-PEG-NHS。
4、针对固定化TEAD4的单环肽配体筛选
取适量初代甘油菌接种于2×YT液体培养基(含葡萄糖和Amp)。37℃至OD600达0.4。以染复数(MOI)为20(辅助噬菌体的数目为TG1细胞的20倍)加入辅助噬菌体M13KO7。37℃侵染TG1细胞1小时。4℃及4000rpm离心，收集菌体颗粒，去除上层清液。固体颗粒重悬于2×YT培养基(含Amp和Kana，不含葡萄糖)。28℃培养16小时。4℃及8000rpm下离心20分钟，收集含有噬菌体的上清液体，并向其中加入1/5体积预冷的5×PEG8000。冰浴1小时后，在4℃及10000rpm下，离心20分钟，收集噬菌体颗粒，去除清液。重悬噬菌体颗粒于80mL TBS，在4℃及10000rpm下再次离心20分钟，并将清液转移至一个干净的无菌离心瓶，重复PEG8000沉淀噬菌体颗粒步骤。然后，在4℃及10000rpm下，离心噬菌体沉淀溶液20分钟，收集噬菌体颗粒，去除清液，用TBS溶解噬菌体，并用0.45μm的无菌过滤器过滤，在4℃冰箱可保存数天，甘油中于-20℃长期保存。
配置50mM NaOAc的pH4溶液。取125.0μL该溶液，加入3.0μL冷冻保存的OaAEP1[C247A](54μg，终浓度为15μM)，于37℃中静置5小时进行酶激活。5小时后，pH调至5.0，OaAEP1[C247A]浓度为5μM。向该酶的溶液中加入2×1011pfu噬菌体和3.0μL含氯乙酰基的多肽氧酯7(序列为ClAcAsn-Ogly-Leu-His-NH2，ClAcAsn：Asn的α-氨基被氯乙酰基修饰，Ogly：羟基乙酸，终浓度为500.0μM)。于4℃震荡孵育1小时后，PEG沉淀噬菌体。噬菌体颗粒重悬于375.0μL 50.0mM NaOAc(1.0mM TCEP,pH8.0)，37℃及250rpm中孵育30分钟。重复PEG沉淀噬菌体操作一次。噬菌体颗粒沉淀重悬在1.5mLbinding缓冲液，随后加750μLblocking缓冲液，30分钟室温缓慢旋转。
10.0μL预洗的链霉亲和素包裹的磁珠重悬在376.0μL PBS中，加入5.2μL Biotin-TEAD4(低温保存的在裂解buffer中，10μg)。30分钟室温缓慢旋转后，在磁力架上去上清液，1.0mLPBS清洗磁珠3次，并重悬磁珠于300.0μLbinding缓冲液和150.0μLblocking缓冲液中。室温缓慢旋转30分钟后，混合噬菌体液体和磁珠溶液。常温30分钟缓慢旋转孵育后，磁力架上去清液，1.0mLwashing缓冲液洗涤磁珠8次，继续1.0mL binding缓冲液洗涤磁珠2次。磁珠洗涤中，需要换至少3次干净的离心管。向磁珠中加入100.0μL Elution缓冲液(pH2.2)中，常温孵育5分钟后固定于磁力架上，收集上次清液并加入50.0μLNeutralization缓冲液(pH 8.0)。少量的噬菌体用于滴度测定，剩下的噬菌体液体与TG1细胞孵育1小时，离心15分钟，重悬在2×YT培养基中，涂大板，28℃倒置过夜，用2×YT(含Amp)刮下，并按照上述流程进行第二和三噬菌体制备及筛选。
三轮筛选后噬菌体的回收滴度增加111倍，表明噬菌体的富集。随机挑选第三轮筛选后的噬菌体克隆进行测序，确定一条多肽发生了高度富集，其序列为GLQTPLRRRTAQMKCGGSG)。我们化学合成了该序列对应环肽的FITC修饰的单环肽22，如图24所示，其与靶标TEAD4蛋白质的偏振荧光测试确定亲和力为3.9μM。单环配体肽的筛选结果证明了本专利在筛选功能性单环肽方面的实际有效性。
实施例15：
噬菌体双环肽文库构建及功能性双环肽配体筛选
1、构建pCANTAB 5E-GLX6CX6C噬菌粒文库
以pCANTAB 5E质粒(不含BsaI酶切位点)为模板，构建pCANTAB 5E-GLX6CX6C噬菌粒体文库。从生物生工定制如下两个DNA：
引物A(正向)：
5’-TTGGTCTCGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTG-3’；
引物C(反向)：
5’-TTTGGTCTCAGCACCGCCAGAGCCGCCGCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNGCAMNNMNNMNNMNNMNNMNNCAAACCGGCCATGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGG-3’，文库的模板链，其中N为A/T/C/G，M为C/A。
以pCANTAB 5E(无BsaI酶切位点)质粒为模板，加入引物A和引物B，进行全质粒的PCR反应。回收PCR产物，BsaI和DpnI处理PCR产物。回收产物，T4连接酶过夜连接。回收酶连产物，电转化TG1细胞。测定滴度以确定文库的多样性，并随机挑取菌落测序分析文库的质量，滴度测定确定噬菌体文库多样性为1.0×109。收集初代菌体，分装保存在-80℃。
2、针对固定化TEAD4的双环肽配体筛选
取适量初代甘油菌接种于2×YT液体培养基(含葡萄糖和Amp)。37℃至OD600达0.4。以染复数(MOI)为20(辅助噬菌体的数目为TG1细胞的20倍)加入辅助噬菌体M13KO7。37℃侵染TG1细胞1小时。4℃及10000rpm离心，收集菌体颗粒，去除上层清液。固体颗粒重悬于2×YT培养基(含Amp和Kana，不含葡萄糖)。28℃培养16小时。4℃及8000rpm下离心20分钟，收集含有噬菌体的上清液体，并向其中加入1/5体积预冷的5×PEG8000。冰浴1小时后，在4℃及10000rpm下，离心20分钟，收集噬菌体颗粒，去除清液。重悬噬菌体颗粒于80mL TBS，在4℃及10000rpm下再次离心20分钟，并将清液转移至一个干净的无菌离心瓶，重复PEG8000沉淀噬菌体颗粒步骤。然后，在4℃及10000rpm下，离心噬菌体沉淀溶液20分钟，收集噬菌体颗粒，去除清液，用TBS溶解噬菌体，并用0.45μm的无菌过滤器过滤，在4℃冰箱可保存数天，甘油中于-20℃长期保存。
配置50mM NaOAc的pH4溶液。取125.0μL该溶液，加入3.0μL冷冻保存的OaAEP1[C247A](54μg，终浓度为15μM)，于37℃中静置5小时进行酶激活。5小时后，pH调至5.0，OaAEP1[C247A]浓度为5μM。向该酶的溶液中加入2×1011pfu噬菌体和3.0μL含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽氧酯9(序列为AcNH-CabLys-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，CabLys：Lys的侧链被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰，Ogly：羟基乙酸结构，终浓度为500.0μM)。于4℃震荡孵育1小时后，PEG沉淀噬菌体。噬菌体颗粒重悬于375.0μL 50.0mMNaOAc(1.0mM TCEP,pH8.0)，37℃及250rpm中孵育30分钟。重复PEG沉淀噬菌体操作一次。噬菌体颗粒沉淀重悬在1.5mLbinding缓冲液，随后加750μLblocking缓冲液，30分钟室温缓慢旋转。
10.0μL预洗的链霉亲和素包裹的磁珠重悬在376.0μL PBS中，加入5.2μL Biotin-TEAD4(低温保存的在裂解buffer中，10μg)。30分钟室温缓慢旋转后，在磁力架上去上清液，1.0mLPBS清洗磁珠3次，并重悬磁珠于300.0μLbinding缓冲液和150.0μLblocking缓冲液中。室温缓慢旋转30分钟后，混合噬菌体液体和磁珠溶液。常温30分钟缓慢旋转孵育后，磁力架上去清液，1.0mLwashing缓冲液洗涤磁珠8次，继续1.0mL binding缓冲液洗涤磁珠2次。磁珠洗涤中，需要换至少3次干净的离心管。向磁珠中加入100.0μL Elution缓冲液(pH2.2)中，常温孵育5分钟后固定于磁力架上，收集上次清液并加入50.0μLNeutralization缓冲液(pH 8.0)。少量的噬菌体用于滴度测定，剩下的噬菌体液体与TG1细胞孵育1小时，离心15分钟，重悬在2×YT培养基中，涂大板，28℃倒置过夜，用2×YT(含Amp)刮下，并按照上述流程进行第二和三噬菌体制备及筛选。
三轮筛选后的噬菌体的回收滴度增加1333倍，表明发生了富集。任意挑选单克隆序发现一个高度富集的多肽序列：GLQMDPWQCEFWDSVCGGSG。如图25所示，合成了该序列对应的荧光素修饰双环肽23，通过与靶标TEAD4的偏振荧光测试结合力为205.9nM。
按照相似的流程，使用含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽氧酯10(序列为CabGly-Asn-Ogly-Leu-His-NH2，CabGly：Gly的α-氨基被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰，Ogly：羟基乙酸结构)对噬菌体文库进行酶学修饰，并以固定化的TEAD4为靶标进行筛选。随机测序，发现两个高度富集多肽序列：GLQMDPWQCEFWDSVCGGSG和GLKLDPWECDFWRSLCGGSG。如图26-27所示，合成荧光素修饰的双环肽24和双环肽25，与靶标TEAD4的偏振荧光测试亲和力分别为305.9nM和139.5nM。双环肽筛选的结果证明了本专利在筛选功能性双环肽方面的实际有效性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法包括以下步骤：
S1、制备含有低反应性基团的天冬酰胺内肽酶识别的多肽类化合物，且该化合物具有以下结构通式：
其中，Xa为亲电体基团、含亲电体基团的由天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种，其中亲电体基团包括氯乙酰基、3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基；Xb为氧(氧酯键)、氮氢(酰胺键)、硫(硫酯键)中的任意一种，Xc为氢或甲基，Xd为氨基、羟基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽序列中的任意一种；
S2、利用以上多肽类化合物在活化状态的天冬酰胺内肽酶存在条件下与N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板在缓冲盐溶液A中发生酶连反应，产生连接中间体；
S3、利用S2中的连接中间体在缓冲盐溶液B中发生分子内大环化反应，产生环肽分子；
S4、选取S2中N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板，通过基因编码融合表达在噬菌体pIII蛋白质的N末端，再经过S2和S3步骤操作来构建噬菌体展示的环肽库，并针对靶标蛋白筛选大环肽配体。
2.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中的多肽模板为以下两种：
模板a：G-Z-(X)m-C；模板b：G-Z-(X)m-C-(X)n-C
其中，模板a用于构建单环肽，模板b用于构建双环肽，G代表甘氨酸，Z代表L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸中的任意一种，X代表任意一种天然L-氨基酸，C代表L-半胱氨酸且位置可以根据要求改变，m和n代表3～20之间的氨基酸数目。
3.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述的天冬酰胺内肽酶是其野生型或者突变体，包括OaAEP1、OaAEP1[C247A]、Butelase 1。
4.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中多肽类化合物的浓度范围为0.1μM～10.0mM，活化状态的天冬酰胺内肽酶的浓度范围为0.01μM～10.0mM。
5.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中活化状态的天冬酰胺内肽酶为未活化的天冬酰胺内肽酶在pH为3.0～5.0的弱酸性缓冲溶液中进行预先活化，所述弱酸性缓冲溶液包括乙酸钠、乙酸、乙酸铵缓冲液中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中酶连反应的时间为15分钟～6小时，反应温度为0～45℃，且缓冲盐溶液A的pH在4.5～9.0，缓冲盐溶液A包括乙酸钠、乙酸和乙酸铵缓冲液中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述S3中分子内大环化反应时间为15分钟～6小时，反应温度为0～45℃，缓冲盐溶液B的pH为6.6～9.0，且缓冲盐溶液B包括NaOAc、HEPES、Tris和PBS中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述S4中噬菌体包括由pCANTAB 5E噬菌粒和辅助噬菌体M13KO7组成的噬菌体***或M13KE噬菌体***。
9.根据权利要求1所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法，其特征在于，所述S4中靶标蛋白筛选大环肽配体的步骤包括：
S4-1、利用所述的天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化方法构建噬菌体展示的单环肽或双环肽文库；
S4-2、靶标蛋白被固定在磁珠或孔板上，所述S4-1中噬菌体展示的单环肽或双环肽文库与固定化靶标蛋白共孵育，经过2～4轮生物淘选，对淘选后的噬菌体颗粒进行测序；
S4-3、根据测序结果合成富集的目标环肽，并评价与靶标蛋白的结合力和生物活性。
10.根据权利要求1-9所述的一种天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化的应用，其特征在于，所述天冬酰胺内肽酶介导的多肽环化应用于基因编码环肽文库的构建，包括对噬菌体展示的多肽文库进行多肽连接和环化，构建噬菌体展示的单环肽和双环肽库，针对靶标蛋白筛选环肽配体用于药物、检测试剂盒或其它生物医学和生物材料的开发。
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