CN117924422A - 色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种色氨酸和色氨酸跨链交互β‑发卡抗菌肽及制备方法和应用，属于生物工程领域。抗菌肽WWL的序列如SEQ ID No.1所示。制备方法：以PG为转角单元，通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用，稳定β‑发夹结构，得到抗菌肽模板XWRYRPGRWRYX‑NH₂，X为疏水性氨基酸，Y为色氨酸，当X＝L,Y＝W时，抗菌肽的命名为WWL。本发明的抗菌肽在取代二硫键的前提下，既保持较好的稳定性，又降低抗菌肽的毒性，在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到90％以上。在保持较好的抑菌活性前提下，检测范围内没有发现溶血现象，治疗指数高达95.52。综上所述，抗菌肽WWL具有较高的应用价值。

Description

色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种色氨酸和色氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽及制备方法和应用。

技术背景

近些年来人们对抗生素无节制的滥用导致了很多细菌微生物都产生了耐药性，这使得抗生素的作用效果大大的降低。所以，寻找出一种全新的抗生素替代品已经成为了当前最需要并且也是最急切的问题。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是参与机体免疫防御的第一道屏障，能够帮助机体对抗病原微生物的侵袭。虽然抗菌肽的抗菌机制还有待进一步阐明，但大多数抗菌肽通过直接作用于细菌细胞膜发挥抗菌作用，这与传统抗生素主要作用于细菌细胞的靶点不同。抗菌肽特异的膜裂解机制不易诱发耐药性，因为突变细菌细胞膜结构非常困难，而抗菌肽的多靶点作用是对抗耐药性的另一个重要武器。因此，抗菌肽被认为是最有前途的候选抗生素。

抗菌肽二级结构主要包含α-螺旋肽和β-折叠肽。α-螺旋折叠抗菌肽通常通过阳离子和疏水氨基酸进行修饰，以形成完美的两亲螺旋结构。然而，最近的研究表明，α-螺旋完美的两亲性常常导致杀菌活性和细胞毒性同时增加。β-发卡是最简单的反平行双链肽，由两条平行链和一个β-转角组成。一些研究表明，与具有相等电荷和疏水性的α-螺旋肽相比，β-折叠肽具有更高的选择性。许多天然的β-发卡抗菌肽通过半硫氨酸残基形成二硫键从而稳定其结构，但由于二硫键的固相合成比较复杂、毒性较大而且合成成本较高。因此，在设计抗菌肽时，最大程度地提高抗菌活性的同时使抗菌肽的细胞毒性最小化是当前急需解决的问题，这也成为了目前抗菌肽发展的一大重点。

发明内容

基于以上不足，本发明提供了一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL，解决了现有的抗菌肽毒性大且溶血高的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其C端采用氨基酰胺化，含有PG转角单元。

进一步的，如上所述的抗菌肽WWL的分子式如式(I)所示，

本发明的另一目的是提供如上所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL的制备方法，如下：肽链采用PG转角单元，通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用，并且能够用于稳定β-发夹结构，得到的多肽模板为：XWRYRPGRWRYX-NH₂，X为疏水性氨基酸，Y为色氨酸，当X＝L，Y＝W时，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；采用固相化学合成法合成多肽，经质谱鉴定后，即完成多肽的制备；再经过抑菌活性测定、细胞毒性测定和溶血活性测定，最终命名为抗菌肽WWL。

本发明的另一个目的在于提供如上所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的应用。

进一步的，如上所述的革兰氏阴性菌包括：大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。

进一步的，如上所述的革兰氏阳性菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌。

本发明具有以下优点和有益效果：本方法设计的抗菌肽WWL含有12个氨基酸，序列较短，合成成本较低。对抗菌肽WWL进行抑菌活性检测、毒性检测和溶血活性检测，发现抗菌肽WWL对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等具有较高的抑制作用。本发明通过色氨酸和色氨酸跨链交互作用稳定抗菌肽结构，取代传统二硫键，毒性较小，在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到90％以上。在128uM内没有发现溶血现象，治疗指数可以达到95.52。综上所述，抗菌肽WWL具有较高的应用价值。

附图说明

图1为抗菌肽WWL的高效液相色谱图；

图2为抗菌肽WWL的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗菌肽WWL的设计

由于色氨酸具有疏水性并且是氨基酸中体积最大的，因此色氨酸在蛋白质疏水核心内提供了较大的范德华相互作用。芳香-芳香相互作用是蛋白质稳定的一种众所周知的机制。

本实施例通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用，也可以极大的稳定β-发夹结构，含有PG转角单元，得到抗菌肽模板XWRYRPGRWRYX-NH₂，X为疏水性氨基酸，Y为色氨酸，当X＝L,Y＝W时，得到的序列如表1所示。

表1抗菌肽WWL氨基酸序列

分子式如式(I)所示：

抗菌肽WWL的序列长度为12，含有PG转角单元，含有4个精氨酸，将抗菌肽WWL的C端采用氨基酰胺化以提高一个正电荷，总电荷数为+5。该方法设计的抗菌肽最大程度地提高抗菌活性的同时使抗菌肽的细胞毒性最小化，具有较低的溶血活性。

实施例2

1.多肽通过合成仪器从C端到N端逐一合成。第一步是把Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端的第一个氨基酸)接入Wang树脂，接下来脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；然后将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)，依照这个过程从C端到N端，直至合成结束，获得脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2.在上述得到的多肽树脂中，添加切割剂，在20℃条件下避光反应2h，过滤，使用FA(三氟乙酸)洗涤沉淀，将上述滤液与洗液混合均匀，使用旋转蒸发仪进行浓缩，然后加入10倍体积的预先冷却的无水***，-20℃条件下沉淀3h，析出白色粉末，在2500g离心10min，然后收集沉淀，再用无水***冲洗沉淀，在真空条件下干燥，最终得到多肽。其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3.使用0.2mol/L硫酸钠(使用磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，多肽使用90％的乙腈水溶液进行溶解，过滤，C18反相常压柱，进行梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，然后收集主峰，进行冻干。

4.多肽的鉴定：使用电喷雾质谱法对得到的多肽进行分析，质谱图(见附图1)中得到的分子量与表1中的理论分子量基本一致，且抗菌肽的纯度大于95％(见附图2)。

实施例3

抗菌肽的生物活性测定

1.抑菌活性测定

在37℃，220g摇床条件下，将细菌在阳离子调节的MHB肉汤培养基中培养至对数生长期，并稀释至OD_600nm＝0.4(3×10⁸-9×10⁸CFU mL^-1)。使用前将细菌溶液稀释1000倍。等体积(50μL)的细菌悬液和含有不同浓度两亲物(0.25×10^-6-128×10^-6M)的牛血清白蛋白溶液(BSA，0.2％；乙酸，0.01％)加入圆底透明的聚丙烯96孔板中。含有细菌的MHB培养基用作阳性对照，未接种细菌的MHB用作阴性对照。将96孔板在37℃恒温培养箱孵育18-24h。最低抑菌浓度是用肉眼和酶标仪OD_{492 nm}的光密度下观察不到细菌生长的最小浓度。每项测定在三个独立平行，每个平行两次重复。检测结果见表2。

表2抗菌肽的最小抑菌浓度(uM)

通过表2可以看出抗菌肽WWL对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性。

2.细胞毒性测定：

(1)细胞悬液的准备：将冻存于液氮中的猪小肠上皮细胞IPEC-J2进行复苏，然后转移至5mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃条件下恒温培养。当细胞铺满25cm²培养瓶底约70％时说明细胞进入到快速生长期，进行传代。用无菌PBS润洗细胞两次，加入0.25％胰蛋白酶2mL对细胞进行消化。同时，在消化期间对细胞形态进行观测，当细胞间隙增大并且大部分变圆时，吸走消化液，加入5mL DMEM培养基(含10％小牛血清)，轻轻吹打，混匀，使其形成单细胞悬液。调整细胞浓度，然后将50μL细胞悬液加入到96孔板每行的第1号至11号孔中，终浓度约为2×10⁴细胞/孔，第12号孔加50μL培养基；

(2)抗菌肽处理：吸取用培养基倍比稀释的抗菌肽50μL加入到96孔板的第1号至10号孔中，在37℃条件下，培养16-18h。第12号孔仅含培养基为阴性对照，第11号孔含有细胞但无抗菌肽为阳性对照，第1至10号孔为测定孔；

(3)结果判断：培养结束后，吸取5mg/mL的MTT 50μL加入到96孔板的每个孔中，37℃下培养4h。然后再加入150μL的DMSO，振荡10min以溶解晶体。用酶标仪测定OD₄₉₂吸光度。

(4)每个试验重复3次以上，根据下面公式来计算细胞存活率：

细胞存活率(100％)＝(OD_测定值/OD_阳性对照)×100％

在所有检测浓度下猪小肠上皮细胞生存率均达到90％以上。结果见表3。

表3抗菌肽细胞毒性的测定

通过表3可以看出，抗菌肽WWL对猪小肠上皮细胞毒性较小，在检测范围内细胞存活率均达到90％以上。

3.溶血活性测定

(1)采集健康的人血液1mL，保存于肝素钠抗凝管；

(2)在3000g条件下低温离心5-10min，弃除上清，收集红细胞；

(3)用PBS溶液将已收集到的红细胞冲洗3遍，然后再用10倍体积的PBS溶液使红细胞重悬；

(4)在96孔板中的每行第1号孔中都加入80μL PBS溶液，其余孔中加入50μL PBS溶液。将20μL抗菌肽储备液(2.56mM)加入到第1号孔内，充分混匀，然后吸取50μL加入到第2号孔内，充分混匀，依次类推，直到第10号孔，混匀后吸取50μL，弃去；

(5)在96孔板的第1至11号孔中加50μL红细胞悬液，第12号孔加入50μL 0.2％Triton X-100，混匀。这样第11号孔作为阴性对照，而第12号孔为阳性对照；

(6)放入培养箱中37℃孵育1h，然后在3000g条件下离心5-10min；

(7)吸取上清，转入到新的96孔板中，在OD₅₇₀条件下用酶标仪测定吸光度值；

(8)溶血活性依据下面公式进行计算：

溶血率(％)＝[(样品OD₅₇₀-阴性对照OD₅₇₀)/(阳性对照OD₅₇₀-阴性对照OD₅₇₀)]×100％

最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的浓度。结果见表4。

表4抗菌肽溶血活性的测定

通过表4表明抗菌肽WWL在检测范围内并未发现溶血活性。使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值算为治疗指数，治疗指数为95.52。

Claims (6)

1.一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其C端采用氨基酰胺化，含有PG转角单元。

2.根据权利要求1所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL，其特征在于：其分子式如式(I)所示，

3.根据权利要求1或2所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL的制备方法，其特征在于，方法如下：肽链采用PG转角单元，通过色氨酸和色氨酸形成的对跨链之间的相互作用，并且能够用于稳定β-发夹结构，得到的多肽模板为：

XWRYRPGRWRYX-NH₂，当X＝L，Y＝W时，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；采用固相化学合成法合成多肽，经质谱鉴定后，即完成多肽的制备；再经过抑菌活性测定、细胞毒性测定和溶血活性测定，最终命名为抗菌肽WWL。

4.根据权利要求1或2所述的一种色氨酸和色氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WWL在制备治疗由革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的革兰氏阴性菌包括：大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。

6.根据权利要求4所述的应用，所述的革兰氏阳性菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌。