CN111518168B - 一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽及其制备方法和应用，抗菌肽WRW，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过截取肉食杆菌素的羧基末端的17个氨基酸，获得的一条肽WGW，将肽WGW中的中性甘氨酸、带负电的谷氨酸及极性不带电的谷氨酰胺和天冬酰胺替换成带正电荷的精氨酸；然后将肽链中的丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸替换成亮氨酸，得到肽WRW；本抗菌肽具有高效的抑菌作用，而且具有很低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在128μmol/L浓度下造成4.07％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血以及小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到89.57％，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。

Description

一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素一直是人类治疗因病原微生物感染引起的疾病的有力武器，但是随着传统抗生素的大量使用，致病菌的耐药性逐渐增强，抗生素时代正逐渐走到尽头。目前最好的抗生素也逐渐失去效果，所以寻找新的抗菌药物已成为备受关注的焦点。尤其是近来关于超级细菌的报道，更为人们敲响了警钟。寻找一种新型绿色的饲料添加剂以替代抗生素，已经成为一个紧迫的任务。
抗菌肽种类繁多，在自然界中分布极为广泛，但是真正应用到医药及畜牧领域的例子却很少，限制抗菌肽应用的因素很多，其中对于某些抗菌肽来说抗菌活性低是限制其应用的主要影响因素。因此，在保证对正常细胞不产生毒性的前提下，寻找一种有效的提高抗菌肽抗菌活性的方法势在必行。杂合设计是一种很好的策略用来优化这些抗菌肽分子。这种方法能够很好的保留所需片段的生物学活性，而不被某一种参数的改变而影响。肉食杆菌素Carnobacteriocin X，其抗菌活性MIC值偏低，对菌体的抑制效果差，不利于作为抗菌药物使用。
发明内容
本发明的目的在于公开一种衍生自肉食杆菌素Carnobacteriocin X的抗菌肽及其制备方法。使其具备高活性，低毒性的优点。
本发明的目的是这样实现的：一种衍生自肉食杆菌素WRW，其序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下特征：如上所述的一种衍生自肉食杆菌素WRW的制备方法，其方法特点在于：通过截取肉食杆菌素Carnobacteriocin X的羧基末端的17个氨基酸，得到含有1个正电荷，疏水值为-0.43的多肽WGW，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；将多肽WGW中的中性甘氨酸、带负电的谷氨酸及极性不带电的谷氨酰胺和天冬酰胺替换成带正电荷的精氨酸；再将肽链中的丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸替换成亮氨酸，得到多肽WRW，其序列如SEQ IDNo.1所示，其正电荷含量为6个，疏水值提高到0.65。
本发明还公开该衍生自肉食杆菌素WRW在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
本发明的有益效果及优点：本发明的方法通过截取或替代的方法简化肉食杆菌素，保留其活性中心，在不降低抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性。对该抗菌肽RLL进行抗菌和溶血活性检测，发现不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等六种菌种有高效的抑制作用，而且具有很低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在128μmol/L浓度下造成4.07％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血以及小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到89.57％，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。
附图说明
图1为本发明的抗菌肽WRW的高效液相色谱图。
图2为本发明的抗菌肽WRW的高效液相质谱图。
图3为本发明抗菌肽WRW和蜂毒素ME的溶血活性图。
图4为发明抗菌肽WRW和蜂毒素ME对小鼠巨噬细胞的细胞毒性影响图。
具体实施方式
下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明:
实施例1
抗菌肽的设计
肉食杆菌素Carnobacteriocin X的氨基酸序列为：
WGWKEVVQNGQTIFSAGQKLGNMVGKIVPLPFG；
通过截取肉食杆菌Carnobacteriocin X的羧基末端的17个氨基酸，得到含有1个正电荷，疏水值为-0.43的多肽。
获得的一条多肽WGW，其氨基酸序列为：
WGWKEVVQNGQTIFSAG-NH2；
将多肽WGW中的中性甘氨酸、带负电的谷氨酸及极性不带电的谷氨酰胺和天冬酰胺替换成带正电荷的精氨酸。
再将肽链中的丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸替换成亮氨酸，得到多肽WRW，其氨基酸序列为：WRWKRLLRRGRLIFLAG-NH2；
其正电荷含量为6个，疏水值提高到0.65。
通过改造获得的多肽WRW均具有较高的细胞选择性。WRW的N端乙酰化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。抗菌肽WRW的序列如表1所示。
表1 衍生肽的氨基酸序列
Figure BDA0002430563320000021
Figure BDA0002430563320000031
实施例2
固相化学合成法合成WRW抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3：
抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(OD492nm)处测定光吸收值，,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2 抗菌肽的抑菌活性
Figure BDA0002430563320000041
通过表2可以看出，WRW对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较高的抑菌活性。
表3 短肽的MHC(μM)、GM(μM)和SI值
Figure BDA0002430563320000042
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图3。通过图3可以看出，WRW在检测范围内未表现出溶血活性，在128μmol/L浓度下造成4.07％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，于对照组蜂毒素呈显著性差异。
真核细胞毒性的测定：采用MTT，并通过小鼠巨噬细胞RAW264.7进行细胞毒性检测。
(1)培养基的制备及细胞的培养：将DMEM(培养基)与胎牛血清9:1混合配置完全培养基，并复苏液氮中的小鼠巨噬细胞RAW264.7，以细胞长满瓶底80％-90％为宜。
(2)待用细胞的试验处理：无菌PBS清洗并重悬细胞3次，并用0.25％胰蛋白酶液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入终浓度约为2×104的50μL细胞悬液。
(3)抗菌肽处理：另附96孔板第一孔内加10μL抗菌肽并倍比稀释后，取出50μL肽液加入原96孔板1-10孔，11孔加50μL完全培养基，12孔加100μL完全培养基。恒温培养4h；
(4)毒性检测：取50μL 5mg/mL MTT溶液加入96孔板，再培养3-4h后，加150μL DMSO(二甲基亚砜)，酶标仪OD570nm测定吸光度。吸光度值越高，证明毒性越弱，反之亦然。检测结果见图4。通过图4可以看出，WRW在检测范围内未表现出对小鼠巨噬细胞的毒性，在128μmol/L浓度下小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到89.57％，于对照组蜂毒素呈显著性差异。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽及其制备方法和应用
<140> 2020102346014
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ac-Trp Arg Trp Lys Arg Leu Leu Arg Arg Gly Arg Leu Ile Phe Leu Ala
1 5 10 15
Gly-NH2
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Gly Trp Lys Glu Val Val Gln Asn Gly Gln Thr Ile Phe Ser Ala
1 5 10 15
Gly

Claims (3)

1.一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽WRW，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽WRW的制备方法，其特征在于：通过截取肉食杆菌素Carnobacteriocin X的羧基末端的17个氨基酸，得到含有1个正电荷，疏水值为-0.43的多肽WGW，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；将多肽WGW中的中性甘氨酸、带负电的谷氨酸及极性不带电的谷氨酰胺和天冬酰胺替换成带正电荷的精氨酸；再将肽链中的丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸替换成亮氨酸，得到多肽WRW，其序列如SEQ ID No.1所示，其正电荷含量为6个，疏水值提高到0.65。
3.根据权利要求1所述的一种衍生自肉食杆菌素的抗菌肽WRW在制备治疗葡萄球菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
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