CN117916255A - 用于诊断和治疗炎症性疾病b细胞和t细胞受体链的鉴定 - Google Patents
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Abstract
BCR链或其片段和TCR链或其片段以及它们用于诊断和治疗尚未解决的炎症性疾病、特别是动脉粥样硬化的用途。
Description
本发明涉及可用于诊断和治疗炎症性疾病、特别是动脉粥样硬化的B细胞受体(BCR)链和T细胞受体(TCR)链。
人类免疫***利用不同的防线来实现针对多种疾病的保护。
B细胞，也称为B淋巴细胞，是淋巴细胞亚型的一种白细胞。它们通过分泌抗体在适应性免疫***的体液免疫组成部分中发挥作用，而其他B细胞是先天免疫***的组成部分，也有助于防御任务。此外，B细胞呈递抗原(它们和其他细胞也被归类为专业抗原呈递细胞(APC)并分泌细胞因子。
BCR是B细胞表面的跨膜蛋白。BCR由形成1型跨膜受体蛋白的免疫球蛋白分子组成，通常位于这些淋巴细胞的外表面。通过生化信号传导和从免疫突触物理获取抗原，BCR控制B细胞的激活。B细胞能够通过参与受体聚集、细胞扩散、拉力产生和受体运输的生化模块来收集和捕获抗原，最终导致内吞作用和抗原呈递。
BCR结合部分由膜结合抗体组成，与所有抗体一样，具有独特确定的抗原结合位点。每个B细胞的BCR对于该B细胞来说都是唯一的。抗原的BCR是B细胞激活、存活和发育所需的重要传感器。B细胞在第一次遇到与其受体结合的抗原(其“同源抗原”)时被激活，细胞增殖并分化，产生一群分泌抗体的血浆B细胞或者一群记忆B细胞群，这些记忆B细胞群用于在重复抗原相互作用后产生大量抗体，例如在再次感染病原体(例如病毒)时在疫苗接种中常见的抗体量。这些情况可以长期保护宿主。
过去，鉴定不同的BCR序列及其在免疫***中的后续功能一直很困难，但新技术极大地促进了它们的发现，这使得本发明能够与新策略相结合，以鉴定来自晚期动脉粥样硬化小鼠的BCR和TCR并将这些数据转化至人类患者。
TCR是一种存在于T细胞或T淋巴细胞表面的蛋白质复合物，负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。TCR与抗原肽之间的结合亲和力较低，并且是简并的：即多个TCR识别同一个抗原肽，并且多个抗原肽被同一个TCR识别。
TCR由两条不同的蛋白质链组成(即，它是异源二聚体)。在人类中，95％的T细胞中，TCR由阿尔法(α)链和贝塔(β)链(分别由TRA和TRB编码)组成，而在5％的T细胞中，TCR由伽马和德尔塔组成(γ/δ)链(由TRG和TRD编码)。
T细胞的一个独特特征是它们能够区分来自健康内源细胞的肽和来自体内外来或异常(例如感染或癌变)细胞的肽。
淋巴***是脊椎动物的一个器官***，是造血***的一部分。一项主要功能是免疫防御。淋巴与血浆非常相似，因为它含有废物和细胞碎片，以及细菌和蛋白质。淋巴器官的细胞主要是淋巴细胞。相关淋巴器官由淋巴组织组成，是淋巴细胞产生或活化的场所。有初级淋巴***(骨髓和胸腺)和次级淋巴***(***、脾脏、集合***等)。这些淋巴***在发育过程中出现。
三级淋巴器官(TLO)在组织中出现，以响应成体生物体中未解决的炎症。其中一些疾病与疾病相关和疾病影响的自身免疫有关。因此，TLO在很大程度上是疾病所特有的，在健康个体中并不存在。
动脉三级淋巴器官(ATLO)存在于患病心血管组织的主动脉外膜中。ATLO被集结至T细胞区域和包含位于激活的生发中心的滤泡树突状细胞(FDC)的B细胞滤泡，其中，在被激活的生发中心中，可能会发现自身免疫B2或T细胞。
动脉粥样硬化的动脉内膜和外膜的斑块中都有明显的免疫细胞浸润。在动脉粥样硬化进展过程中，免疫***通过形成ATLO来响应斑块的形成。这可以作为对自身免疫反应可能被集结在ATLO中这一假设的支持。
大多数慢性疾病表现出免疫***自身反应性的一种或多种成分，例如自身反应性抗体和/或自身反应性T细胞。
截至目前，尚不清楚动脉粥样硬化(其在本文中用作炎症性疾病的代表)是否是涉及控制疾病进展的自身免疫B2细胞和/或自身免疫T细胞的真正自身免疫疾病。我们也不知道影响自身免疫淋巴细胞的动脉粥样硬化是在哪里产生的。
动脉粥样硬化导致动脉中形成斑块，是血栓、缺血性心脏病和中风的主要原因之一。然而，关于其他抗原触发因素及其对疾病进展的影响的知识仍然非常有限。
因此，尽管在了解动脉粥样硬化方面取得了进展，但仍然需要新的、更有效的靶向药物来诊断和治疗动脉粥样硬化。寻找可有效用于检测动脉粥样硬化斑块的新型生物标志物，从而构成开发专门用于处理和治疗人类动脉粥样硬化的新临床工具的基础，这一医学需求尚未得到满足。
因此，本发明的一个目的是提供用于诊断和治疗动脉粥样硬化和其他炎症性疾病的新颖的诊断和治疗工具和产品。因此，本发明的一个目的是鉴定单克隆抗体(在BCR中编码)和T细胞，其与动脉壁来源的组织(包括免疫细胞)特异性反应，从而影响TCR中编码的疾病结果。
动脉粥样硬化特异性BCR的克隆或疾病特异性T细胞的鉴定可以生成动脉粥样硬化特异性B或T淋巴细胞、鉴定动脉粥样硬化特异性自身抗原以及随后对活体患者出现心脏病、中风或死亡等并发症之前的疾病阶段生成疫苗和抗体治疗以及诊断。
该目的已通过根据权利要求1所述的BCR受体链或其片段和根据权利要求6所述的T细胞受体(TCR)链或其片段来实现。本发明的优选实施例在从属权利要求和下文的详细说明书中阐述。
本发明在第一实施例中提供了包含重链可变区(IgH)和轻链可变区(IgL)的B细胞受体(BCR)链或其片段，其中，所述重链可变区(IgH)包含互补决定区IgHCDR1,IgHCDR2和IgHCDR3，并且其中，所述轻链可变区包含互补决定区IgL CDR1、IgL CDR2和IgL CDR3，其中，根据表1，IgH CDR1包含选自SEQ-ID No.1至58的氨基酸序列，LgH CDR2包含选自SEQ-IDNo.59至117的序列，LgH CDR3包含选自SEQ-ID No.117至174的序列，IGL CDR1包含选自SEQ-ID No.233至290的序列，并且IgL CDR3包含选自SEQ-ID No.291至348的序列。
表1
在另一实施例中，本发明提供根据权利要求1的BCR链或其片段(如表1中所列)，其进一步包含，选自根据表2的SEQ-ID No.175至232的IgL全长序列或者由其衍生的与SEQ-IDNo.175至232的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸序列(命名为BCR1’至BCR58')。
表2
根据另一实施例，根据本发明的BCR链或其片段另外包含，选自根据表3的SEQ-IDNo.349至407的IgL全长序列或由其衍生的与SEQ-ID No.349至407的序列同一性程度在90％至99.7％范围内的IgL全长序列(命名为BCR1”至BCR58”)。
表3
根据本发明的又一实施例，除了根据表1的CDR序列之外，BCR链或其片段还包含：选自根据表2的SEQ-ID No.175至232的IgL全长氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-IDNo.175至232的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸全长序列；以及选自根据表3的SEQ-ID No.349至406的IgL全长氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.349至406的序列同一性程度在90至99.7％的范围内的全长氨基酸序列。
根据本发明的另一实施例，包含表1中定义的CDR序列以及可选地分别根据表2和表3的IgL和/或IgH全长序列的BCR链或其片段，还包含如表4中所定义的互补决定区IgLCDR2中的三个氨基酸的序列(命名为BCR1”’至BCR 58”’)。
表4
在表1至表4中，使用了BCR1至BCR58、BCR1’至BCR58’、BCR1”至BCR58”和BCR1”’至BCR58”’的名称。在这方面，BCR1代表包含表1中给出的BCR1的CDR序列的BCR链或其片段；BCR1’代表BCR1加上表2中给出的BCR1的全长序列或者与表2中列出的SEQ-ID的序列同一性程度在90至99.7％的全长序列；BCR1”代表BCR1加上表3中给出的BCR1”的全长序列或者与表3中列出的SEQ-ID的序列同一性程度在90至99.7％的全长序列；最后，BCR1”’代表BCR1加上表4中给出的BCR1”’的氨基酸序列。BCR2至BCR58、BCR2’至BCR58’、BCR2”至BCR58”和BCR1”’至BCR58”’应作相应解释。
本发明还包括BCR链及其片段，其累积地包含根据表1的CDR序列，根据表2的全长序列或者与表2中列出的SEQ-ID具有90至99.7％的序列同一性程度的全长序列，根据表3的全长序列或者与表3中列出的SEQ-ID具有90至99.7％的序列同一性程度的全长序列，以及根据表4的氨基酸序列。这些可以被命名为BCR1””到BCR58””，其方式与上面对BCR1到BCR1”’的解释类似。
表1和2中定义的BCR链或其片段特别适用于动脉粥样硬化的成像或诊断方法，特别是其中该方法包括通过检测先前施用于患者的BCR链或其片段来使动脉粥样硬化病变可视化。
在本发明的过程中，已经发现动脉粥样硬化是与控制疾病的自身免疫B2细胞的产生相关的疾病。这为动脉粥样硬化的诊断和治疗开辟了新的——实际上是第一次——的可能性。自身免疫B细胞和T细胞过去尚未实现，但通过从晚期动脉粥样硬化小鼠的外膜和ATLO中分离生发中心B细胞或从同一小鼠的动脉粥样硬化斑块中分离T细胞，成功实现了这一目标。
ATLO在老年ApoE-/-小鼠和人类患者的动脉外膜和其他动脉的外膜中，在患有动脉粥样硬化的部位形成。ATLO被集结至T细胞区域以及含有激活的生发中心中的滤泡树突状细胞(FDC)的B细胞滤泡。动脉粥样硬化特异性B2细胞和T细胞反应在这些ATLO中集结起来，因此可用于诊断动脉粥样硬化、监测疾病的进程，并可作为新治疗方法的基础。在识别和分离保护或抑制疾病的自身免疫细胞的过程中，特定自身免疫淋巴细胞的这一发现显著缩小了待评估的此类自身免疫淋巴细胞的范围(使用分子生物学工具)。
因此发现，在次级淋巴器官或ATLO的生发中心的B2细胞中，BCR的克隆扩增以抗原依赖性方式发生。克隆扩增(在感染或其他暴露于自身免疫抗原的情况下，淋巴细胞数量(B细胞和T细胞)的强劲和爆发性增加)赋予适应性免疫***非凡的力量和特异性，在某些情况下也会导致疾病，称为自身免疫性疾病。这种特异性是由免疫***通过两种机制实现的：在整个生命过程中产生新的独特的BCR以及通过携带TCR的T细胞进行克隆扩增。
载脂蛋白E缺陷型(ApoE-/-)小鼠是目前用于动脉粥样硬化研究的最流行的小鼠模型，并且也用于本发明的过程中。研究发现，与老年WT(野生型)小鼠相比，ApoE-/-小鼠的ATLO、脾脏和***(LN)显示出显著的BCR克隆扩增。通过测定克隆扩增指数(通常也称为基尼指数)，对来自每个组织的BCR进行克隆扩增，从而对不同组织和个体小鼠的BCR库的克隆性进行定量比较。与WT小鼠相比，ApoE-/-小鼠的脾脏中CD19+B细胞的基尼指数有所增加。与WT小鼠相比，ApoE-/-小鼠的ATLO和SLO中发生了更高的CD19+B细胞克隆扩增。
在BCR组装过程中，BCR通过改变其序列来经历体细胞超突变，以生成专用于生成BCR的疾病的新且独特的BCR序列，并进一步进行序列改变，从而确定自身免疫B细胞在称为亲和力-成熟的附加序列方面的性质。这里报告的BCR序列未知，其中大多数正在发生针对动脉粥样硬化斑块成分的反应，证明其自身免疫性质和动脉粥样硬化的独特性。
因此，本发明过程中的研究结果表明，与给WT小鼠相比，老年ApoE-/-小鼠的SLO和ATLO中的CD19+B细胞的BCR存在更高的多样化、体细胞超突变(SHM)和亲和力成熟以及同种型转换。这里报道的发明涉及疾病特有的序列，并且在健康人类的健康小鼠中没有发现。
这些结果表明，动脉粥样硬化/高脂血症与ApoE-/-小鼠的脾、LN和ATLO中增强的抗原依赖性生发中心反应相关，导致动脉粥样硬化特异性的独特BCR序列。在次级淋巴器官和ATLO中也存在全身性增强的GC反应，表明ATLO是生发中心反应涉及动脉壁特异性抗原依赖性B2激活的部位。
总的来说，这些结果表明，根据本发明的BCR可用于通过疫苗接种策略或抗体治疗方案来监测、诊断和最终治疗性治疗动脉粥样硬化。
在本发明的过程中，发现动脉粥样硬化相关的B2细胞适应性免疫应答被组织在在老年ApoE-/-小鼠的次级淋巴器官和ATLO的生发中心中。次级淋巴器官中的生发中心在正常免疫稳态中组织适应性免疫，而ATLO中的生发中心专门参与针对动脉壁衍生自身抗原的体液免疫反应，这是我们在动脉粥样硬化中分离自身免疫BCR的策略方法的支柱。
使用来自次级淋巴器官或ATLO的生发中心B细胞的配对IgH/IgL序列来克隆和表达单克隆抗体(编码在BCR中)证实了这一点。应用单细胞PCR和Sanger测序获得全长V IgH-lgL IMGT数据库的区域用于识别IgH和IgL链的亚家族。
分选单个ATLO生发中心B细胞(CD19+lgD-PNA+GL7+)，克隆全长Ig重链和轻链并测序，获得ATLOGC衍生抗体，分别获得抗体IgH和IgL部分的BCR序列。权利要求1至2中定义的并且在下文表1至4中被称为BCR1至BCR58、BCR1'至BCR58'、BCR1”至BCR58”和BCR1”’至BCR58”’的BCR链或其片段已被证明是特别合适的用于监测、诊断和治疗动脉粥样硬化，同样显示出与动脉粥样硬化斑块最强的相关性和反应性，动脉粥样硬化斑块是小鼠和男性动脉粥样硬化的标志。
特别是ATLO来源的抗体BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’以剂量依赖性方式识别斑块核自身抗原，并且与老年WT主动脉相比，老年ApoE-/-小鼠的斑块和主动脉中显示出显著更高的信号强度。ATLO衍生的BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’还可识别32周龄小鼠动脉粥样硬化斑块的早期阶段，表明诊断工具和实际上的治疗方法可用于年轻个体，而不仅仅是老年个体。
对于本发明来说重要的是，源自小鼠的自身抗体与人类患病动脉发生反应，这些人类患病动脉包括引起心肌梗塞、中风和其他致命疾病等疾病的斑块。
ATLO衍生抗体BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’用于寻找动脉粥样硬化相关自身抗原，这些抗体被发现能够识别组蛋白。当使用BCR56、BCR56'、BCR56”和BCR56”’抗体作为诱饵从老年ApoE-/-小鼠患病主动脉裂解物上清液中捕获BCR56、BCR56'、BCR56”和BCR56”’抗原时，提供了证据证明BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’识别出分子大小为10-15kD的主要条带。
从免疫荧光染色、Western Blot和质谱的综合数据可以得出结论：BCR56、BCR56'、BCR56”和BCR56”’抗原位于细胞核中，分子量为10-15kD，代表组蛋白。BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’与组蛋白的结合通过使用小牛胸腺组蛋白混合物以及牛组蛋白混合物进行的各种研究进行了评估。此外，还发现(BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’)抗体以剂量依赖性方式与人重组组蛋白混合物结合。数据表明组蛋白H2B是ATLO GC衍生抗体(BCR56、BCR56'、BCR56”和BCR56”’)的同源抗原。
使用抗小鼠IgG二抗，使用全小鼠重组抗体(BCR56”’)来区分人体组织切片中的人内源性免疫球蛋白。这些实验的数据表明，BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’抗原存在于人颈动脉斑块切片中。小鼠和人的动脉粥样硬化斑块中似乎存在相同的抗原。这些抗原可能在患病的动脉壁微环境中释放，从而触发老年ApoE-/-小鼠ATLO生发中心的自身免疫B2反应。使用人组蛋白混合物(H2A、H2B、H3.1、H3.2、H3.3和H4)作为抗原来筛选衰老过程中WT和ApoE-/-小鼠的血清。获得的结果显示，与WT小鼠相比，成年和老年ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化小鼠的血清中AHA滴度明显更高。8周龄ApoE-/-小鼠不会出现动脉粥样硬化，8周WT和ApoE-/-小鼠之间的这些滴度没有显著差异，这支持使用这些抗体作为疾病早期的诊断标记物。这些数据表明，血清AHA滴度代表ApoE-/-小鼠中动脉粥样硬化的诊断标志物。数据还表明，BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’自身抗原存在于人类动脉粥样硬化斑块中。
这一数据促使一项研究探讨在老年ApoE-/-小鼠中观察到的现象是否适用于患有心血管疾病的患者。年龄和性别匹配的无症状(无神经***症状)患者(n＝31)和有症状(有神经***症状)颈动脉粥样硬化患者(n＝34)的血清抗组蛋白抗体(AHA)滴度。与无症状患者相比，有症状患者的AHA滴度显著升高。本实验中，4份健康对照血清由同事志愿者捐赠。这一意想不到的结果表明，组蛋白(包括BCR56抗原)可能会引发人类心血管疾病患者的自身免疫反应。因此，抗组蛋白抗体诊断(包括BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’)代表了诊断动脉粥样硬化的血清生物标志物。
因此，总体数据提供了作为原理证明的证据，即本文提供的BCR序列及其片段是自身免疫BCR的丰富来源，并且在老年ApoE-/-小鼠中观察到的数据可以转化至患有动脉粥样硬化的患者并可以用作诊断工具，并可能在疾病发展早期预测疾病进展并指导治疗。
上文描述的本发明的实施例涉及与动脉粥样硬化病变特异性结合的BCR链或其片段。根据本发明的BCR链或其片段显示针对动脉粥样硬化斑块的反应性。
本发明还涵盖编码任何上述BCR链或其片段的多核苷酸、包含此类多核苷酸的表达载体以及包含所述多核苷酸或所述表达载体的重组宿主细胞。
本发明的另一实施例涉及用于开发T细胞介导的动脉粥样硬化治疗的TCR链或其片段。
构建从3只老年(78周龄)C57BL/6野生型(WT)和ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块、ATLO和主动脉引流肾***(rLN)收集的T细胞。根据T细胞谱系标记表达来定义11T细胞亚群，即CD4作为辅助T细胞的标记；CD8a用于细胞毒性T细胞；Foxp3用于调节性T(Treg)细胞；CCR7作为趋化因子受体，SELL(CD62L)作为细胞表面选择标记，两者都参与募集T细胞和归巢至***。CD44是T细胞激活的标志物，SELL、CD44和CCR7的组合用于区分初始、中枢记忆和效应记忆T细胞；自然杀伤T细胞的杀伤细胞凝集素样受体B亚家族成员1C(Klrblc或NK1.1)；γδT细胞的TCR伽玛恒定区1(Tcrg-c1)和TCRδ恒定区(Trdc)；lcos、Cxcr5、Sh2d1a的共同表达用于滤泡辅助T(Tfh)细胞。11T细胞亚群命名如下：簇0，CD4效应调节性T细胞(eTreg，CD4+Foxp3+CD44+Sell-Ccr7low)；簇1,CD4 Tern(CD4效应记忆T细胞，CD4+Foxp3-CD44+Sell-Ccr7low)；簇2，CD8 Tern(CD8a+CD44+Sell-Ccr7low)；簇3，CD8初始T细胞(CD8a+CD44-Sell+Ccr7high)；簇4，CD8 Tern(CD8中央记忆T细胞，CD8a+CD44+Sell+Ccr7int)；簇5，CD8 Tcm/NKT(CD8a+CD44+Sell+Ccr7intKlrb1c+)；簇6，CD4初始T细胞(CD4+CD44-Sell+Ccr7high)；簇7，CD4中央Treg细胞(cTreg，CD4+Foxp3+Ccr7low)；簇8，gd T细胞(CD4-CD8a-Tcrgc1+Trdc+)；簇9，滤泡T辅助细胞(Tfh细胞，lcos+Cxcr5+Shad1a+)，簇10，双阴性T细胞(DN T细胞，CD3e+CD4-CD8a-)。
根据转录组进行通路富集分析，以验证每个簇的生物学功能，即簇9(滤泡辅助细胞；Tfh细胞)的高表达基因集中在B细胞激活基因、增殖、稳态和生发中心形成方面；簇8(γδT细胞)的基因表达集中在Th17细胞分化中。比较不同组织微环境中每个T细胞亚群的细胞比例。从老年WT和ApoE-/-小鼠获得的LN在大多数T细胞亚群百分比方面表现出的相似性与我们之前使用不同方法的报告一致。此外，在ATLO和动脉粥样硬化斑块中观察到较高百分比的CD8 Tem和γδT细胞。
据报道，双阴性(DN)T细胞可抑制多种免疫相关疾病的炎症反应。在斑块中观察到少量DNT细胞，其百分比比LN和ATLO中的百分比高10倍。基因集富集分析(GSEA)表明，补体激活和胆固醇稳态途径显著地集中在DN T细胞中，而炎症反应和同种异体移植排斥基因集呈负相关。这些数据表明DN T细胞在动脉粥样硬化斑块中发挥免疫抑制作用。值得注意的是，与LN和ATLO相比，斑块中效应Treg细胞和中央Treg细胞的百分比较低，这反过来可能导致动脉粥样硬化中观察到的促动脉粥样硬化免疫反应与抗动脉粥样硬化免疫反应的不平衡。所有这些数据不仅提供了对动脉粥样硬化发病机制的深入了解，而且还提供了具有自身免疫T细胞性质的独特TOR序列，可用作动脉粥样硬化患者的治疗和诊断方案。
单个T细胞携带独特的抗原特异性、配对的TCRα/β链，可以在t-SNE投影中检测T细胞扩增及其转录组。我们将一种T细胞克隆型定义为携带相同配对的TCRα/βCDR3区域的T细胞(n>2)。从总共3310个T细胞中获得2798个TCRα链或TCRβ链序列(占总T细胞的84.5％)和2092个配对的TCRα/β(占总T细胞的63.2％)。这些数据表明，这是一种以单细胞分辨率获得配对TCRα/β的高通量和高产率方法。此外，这种方法使我们能够在单细胞分辨率下将转录组与配对的TCRα/β序列结合起来，这使我们能够比较不同组织微环境中扩增T细胞与非扩增T细胞之间的转录表达。在WTLN中，TCR扩增为4.72％，ApoE-/-LN中TCR扩增为8.17％，在ATLO中TCR扩增为8.77％，而动脉粥样硬化斑块中的TCR扩增为20.71％。Shannon多样性指数用于确定TCR多样性，其与克隆性呈负相关。我们的数据显示，与LN和ATLO相比，动脉粥样硬化斑块显示出较少的TCR多样性，这与动脉粥样硬化斑块中扩增的T细胞百分比较高一致。在下一步中，确定哪些T细胞亚群被扩增，t-SNE图谱用于将转录本与每个细胞的TCR序列组合起来。11个T细胞亚群根据T细胞功能分为4个主要簇，其中簇I：CD4记忆、效应和调节T细胞；簇II：CD8记忆和效应T细胞；III簇：初始T细胞，IV簇：γδ-T细胞。扩增的T细胞仅限于记忆和效应CD4和CD8 T细胞(簇I和II)。在所有组织微环境中观察到初始T细胞(簇III)中缺乏扩增的T细胞，证实了数据集的高质量。与WT LN(8.1％)、ApoE-/-LN(5.6％)和ATLO(5.0％)相比，检测到斑块中扩增的CD4记忆/效应/调节T细胞百分比(15.0％)更高。此外，数据表明，与WT小鼠(WT LNs，5.9％)相比，ApoE-/-小鼠(ApoE-/-LNs 16.2％、ATLOs 17.9％、斑块38.1％)中扩增的CD8记忆/效应T细胞的百分比更高。总而言之，数据显示斑块中扩增的CD4记忆/效应/调节T细胞的百分比与WT LN相比高2倍，与ApoE-/-LN和ATLO相比高3倍。此外，斑块中扩增的CD8记忆/效应/调节T细胞的百分比与WTLN相比高6.5倍，与ApoE-/-LN和ATLO相比高2倍。
因此，本发明提供了动脉粥样硬化中克隆独特扩增的T细胞库，包括它们以前未知的配对TCR序列。配对TCR序列是鉴定开发T细胞介导的动脉粥样硬化治疗候选药物的丰富来源。
T细胞受体(TCR)链或其部分代表本发明的另一实施例，其包含β链部分(TRBV)和α链部分(TRAV)，其中，所述β链部分(TRBV)包含互补决定区TRBV CDR1、TRBV CDR2和TRBVCDR3，并且其中，所述α链部分TRAV包含互补决定区TRAV CDR1、TRAV CDR2和TRAV CDR3，其中，根据表5，TRBV CDR1包含选自SEQ-ID No.407至477的氨基酸序列，TRBV CDR2包含选自SEQ-ID No.478至548的序列，TRBV CDR3包含选自SEQ-ID No.549至619的序列，TRAV CDRl包含选自SEQ-ID No.691至761的序列，TRAV CDR2包含选自SEQ-ID No.762至832的序列，并且TRAV CDR3包含选自SEQ-ID No.No.833至903的序列。
表5
/>
/>
表5中定义的TCR链或其片段代表本发明的另一实施例，其进一步包含选自根据表6的SEQ-ID No.678至748的全长TRBV氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.678至748的β链部分的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸序列。
表6
/>
/>
根据又一实施例，本发明提供了TCR链或其片段，除了表5中定义的CDR序列之外，还可选地包含：SEQ-ID No.620至690所示的全长TRBV氨基酸序列，或者包含与SEQ-IDNo.620至690的序列同一性为90％至99.7％的序列；以及选自根据表7的SEQ-ID No.904至974的全长TRAV氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.904至974的α链部分的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸序列(指定为TCR1”至TCR71”)。
表7
/>
在表5至7中，使用了名称TCR1至TCR71、TCR1’至TCR58’以及TCR1”至BCR58”。在这点上，TCR1代表包含表5中给出的TCR1的CDR序列的TCR链或其片段，TCR1’代表TCR1加上表6中给出的TCR1’的全长序列或者与表6中列出的SEQ-ID具有90％至99.7％的序列同一性程度的全长序列，并且BCR1”代表BCR1加上表7中给出的BCR1”的全长序列或者与表7中列出的SEQ-ID具有90％至99.7％的序列同一性程度的全长序列。TCR2至TCR71、TCR2’至TCR71’和TCR2”至TCR71”应作相应解释。
本发明还包括TCR链及其片段，其累积地包含根据表5的CDR序列，根据表6的全长序列或者与表6中列出的SEQ具有90至99.7％序列同一性程度的全长序列，根据表7的全长序列或者与表7中列出的SEQ-ID具有90至99.7％序列同一性程度的全长序列。这些可以以与上面解释的类似的方式命名为TCR1’”至TCR71’”。
表5至表7中定义的TCR链或其片段特别适用于动脉粥样硬化的成像或诊断方法，特别是其中该方法包括通过检测先前施用于患者的TCR链或其片段来使动脉粥样硬化病变可视化。
在一实施例中，本发明提供了如表5中定义的命名为TCR1至TCR71的TCR链或片段，在优选的实施例中，其还包含如表6中所定义的全长序列，并且其被命名为TCR1’至TCR71’，并且在另一实施例中还包含表7中定义的适合于诊断或治疗未解决的炎症性疾病的全长序列。这尤其包括TCR链或其片段，其包含：与SEQ-IDNo.620至690的β链部分的序列同一性程度在90至99.7％、优选92至99.7％、特别优选95至99.7％范围内的氨基酸序列，以及与SEQ-ID No.904至974的α链部分的序列同一性程度在90至99.7％、优选92至99.7％、特别优选95至99.7％范围内的氨基酸序列。
从3310个TCR序列中，分别命名为TCR1至TCR71，TCR1'至TCR71'和TCR1”至TCR71”的TCR是克隆扩增的TCR，并且TCR1至TCR71、TCR1'至TCR71’和TCR1”至TCR71”在患病小鼠中存在，但野生型小鼠中没有，这揭示了它们在动脉粥样硬化中的独特性质。
在本发明的过程中，已经发现了患病小鼠中与动脉粥样硬化相关的一系列单克隆抗体和TCR序列。
使用单克隆抗体，有证据表明，在小鼠身上进行的观察可以转化为患有心血管疾病的人类患者。单克隆抗体和TCR可以用作细胞库，分别从中获得动脉粥样硬化的诊断工具。单克隆抗体和TCR还提供了一个可用于开发动脉粥样硬化治疗方法的库。此外，它们的同源自身抗原可用于开发动脉粥样硬化的疫苗接种治疗方法。
研究发现，组蛋白2B抗原和针对组蛋白2B的单克隆抗体与小鼠模型和心血管疾病患者的动脉粥样硬化有关。这一概念验证证据表明，ATLO衍生的单克隆抗体及其同源抗原形成了一个序列库，可开发为血清生物标志物，以诊断并可能预测动脉粥样硬化。
还发现一些ATLO衍生的单克隆抗体可以识别动脉粥样硬化斑块成分。这些数据为动脉粥样硬化提供了成像工具。他们还提供了一系列序列来开发治疗方案，以减轻动脉粥样硬化斑块。
所发现的单克隆抗体(编码在其BCR中)提供了将药物递送至动脉粥样硬化斑块环境的工具，因此可用于治疗动脉粥样硬化。
组蛋白2B被鉴定为至少一种ATLO来源的抗体(BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’)的同源抗原。因此，组蛋白2B和其他ATLO来源的抗体的同源抗原可用于设计新的动脉粥样硬化疫苗接种策略。每种自身抗原都提供了强大的工具来为人类接种疫苗，以预防和或治疗患有晚期疾病的患者，从而提供直到今天才可用的因果治疗选择，因为动脉粥样硬化仍然是一种基本上无法治疗的无法解决的动脉炎症性疾病。
本发明定义了动脉粥样硬化斑块和ATLO中克隆扩增的T细胞，并鉴定了它们的TCR序列。这些克隆扩增的TCR可用于设计新型T细胞诊断工具和T细胞免疫疗法。
本文报道的转录组分析表明，动脉粥样硬化小鼠的耐受性发生了崩溃，这为开发治疗方法以恢复动脉粥样硬化患者的耐受性提供了工具，正如目前在癌症免疫疗法中使用的那样。
数据显示，老年ApoE-/-小鼠的次级淋巴器官和ATLO中组织了与动脉粥样硬化相关的B2自身免疫反应。使用单细胞序列，比较了次级淋巴器官和ATLO之间的B细胞反应，并提供了ATLO是功能活跃的淋巴器官的证据，可以组织动脉粥样硬化相关的B2自身免疫反应。使用单细胞克隆和重组抗体生产技术，观察到几种ATLO生发中心来源的抗体可识别动脉粥样硬化斑块成分。这些数据表明ATLO组织动脉粥样硬化相关的自身免疫B2反应。使用ATLO生发中心来源的BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’抗体组蛋白2B(H2B)蛋白被鉴定为BCR56、BCR56’、BCR56”和BCR56”’抗体的同源抗原。重要的是，在小鼠动脉粥样硬化的早期阶段以及人类动脉粥样硬化斑块中也观察到了相同的H2B蛋白。我们在患病小鼠中鉴定了一系列单克隆抗体和TCR序列。这些单克隆抗体和TCR及其同源抗原可用作动脉粥样硬化的新型诊断工具和治疗方法。
根据本发明的BCR链或其片段和TCR链或其片段可以有利地用于患者体内动脉粥样硬化病变的方法中，优选用于动脉粥样硬化的体内诊断方法中。在一个优选的实施例中，这种方法包括通过检测先前施用于患者的BCR链或其片段或TCR链或其片段来使动脉粥样硬化病变可视化。
本发明还包括药物组合物，其包含任何BCR链或其片段或TCR链或其片段以及药学上可接受的赋形剂和载体。
在另一实施例中，本发明涉及治疗动脉粥样硬化的方法，其包括施用治疗有效剂量的根据本发明的任何BCR链或其片段或TCR链或其片段。
用于本发明目的的治疗有效剂量旨在表示当施用于患者时在患有动脉粥样硬化的受试者中产生积极治疗反应的量。
最后，本发明还涵盖用于诊断动脉粥样硬化的试剂盒，其包含1)根据本发明的任何BCR链或其片段或TCR链或其片段，以及2)用于对根据本发明的任何BCR链或其片段或TCR链或其片段进行检测或可视化的试剂或工具。
根据本发明的BCR链或其片段或TCR链或其片段可以例如是：用放射性示踪剂或造影剂标记，然后可以通过核成像或磁共振成像实现可视化。
Claims (14)
1.B细胞受体(BCR)链或其片段，其包含重链可变区(IgH)和轻链可变区(IgL)，其中，所述重链可变区(IgH)包含互补决定区IgH CDR1、IgH CDR2和IgH CDR3，并且其中，所述轻链可变区包含互补决定区IgL CDR1和IgL CDR3，其中，根据表1，IgH CDR1包含选自SEQ-IDNo.1至58的氨基酸序列，IgH CDR2包含选自SEQ-ID No.59至117的序列，IgH CDR3包含选自SEQ-ID No.117至174的序列，IgL CDR1包含选自SEQ-ID No.233至290的序列，并且IgLCDR3包含选自SEQ-ID No.291至348的序列：
表1
2.根据权利要求1所述的BCR链或其片段，其包含，选自根据表2的SEQ-ID No.175至232的IgL全长氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.175至232的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸全长序列：
表2
3.根据权利要求1或2所述的BCR链或其片段，其包含，选自根据表3的SEQ-ID No.349至406的IgL全长氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.349至406的序列同一性程度在90％至99.7％范围内的IgL全长氨基酸序列：
表3
4.根据权利要求1至3所述的BCR链或其片段，其包含：
选自根据表2的SEQ-ID No.175至232的IgL全长氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-IDNo.175至232的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸全长序列；以及
选自根据表3的SEQ-ID No.349至406的IgL全长氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-IDNo.349至406的序列同一性程度在90至99.7％的范围内的全长氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4所述的BCR链或其片段，其中，所述轻链可变区(IgL)包含如表4中所定义的互补决定区IgL CDR2中的三个氨基酸的序列：
表4
6.根据权利要求1至4中任一项所述的BCR链或其片段，其用于动脉粥样硬化的诊断和/或治疗。
7.根据权利要求1至6所述的BCR链BCR56、BCR56’、BCR56”或BCR56”’用于治疗动脉粥样硬化的用途。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的BCR链或其片段，其用于对动脉粥样硬化进行成像或诊断的方法中，其中，所述方法包括通过检测先前施用于患者的BCR链或其片段来使动脉粥样硬化病变可视化。
9.T细胞受体(TCR)链或其部分，其包含β链部分(TRBV)和α链部分(TRAV)，其中，所述β链部分(TRBV)包含互补决定区TRBV CDR1、TRBV CDR2和TRBV CDR3，并且其中，所述α链部分TRAV包含互补决定区TRAV CDR1、TRAV CDR2和TRAV CDR3，其中，根据表5，TRBV CDR1包含选自SEQ-ID No.407至477的氨基酸序列，TRBV CDR2包含选自SEQ-ID No.478至548的序列，TRBV CDR3包含选自SEQ-ID No.549至619的序列，TRAV CDRl包含选自SEQ-ID No.691至761的序列，TRAV CDR2包含选自SEQ-ID No.762至832的序列，并且TRAV CDR3包含选自SEQ-IDNo.No.833至903的序列：表5
/>
10.根据权利要求8所述的TCR链或其片段，其包含选自根据表6的SEQ-ID No.620至690的全长TRBV氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.620至690的β链部分的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸序列：
表6
/>
/>
11.根据权利要求8或9中任一项所述的TCR链或其片段，其包含选自根据表7的SEQ-IDNo.904至974的全长TRAV氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.904至974的α链部分的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸序列，
表7
/>
/>
12.根据权利要求8至9中任一项所述的TCR链或其片段，其包含：选自SEQ-ID No.620至690的全长TRBV氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.620至690的β链部分的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸序列，以及选自SEQ-ID No.904至974的全长TRAV氨基酸序列或者由其衍生的与SEQ-ID No.904至974的α链部分的序列同一性程度在90至99.7％范围内的氨基酸序列。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的TCR链或其片段，其用于诊断和/或治疗动脉粥样硬化。
14.根据权利要求9至12中任一项所述的TCR链或其片段，其用于动脉粥样硬化的成像或诊断的方法中，其中，所述方法包括通过检测先前施用于患者的TCR链或其片段来使动脉粥样硬化病变可视化。
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