CN117870554A - 用于确定样品高度信息的方法以及扫描显微镜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定样品的高度信息的方法，以及一种扫描显微镜。所述方法包括以下步骤：生成照明点；使用所述照明点照射所述样品；捕获所述样品上的所述照明点的反射图像；评估所述图像的横向分布；根据所述横向分布确定所述高度信息；其中，所述照明点具有三维照明图案和/或探测光路中的图像具有三维探测图案。所述扫描显微镜的特征在于照明装置(07)和/或探测器装置包括用于生成三维图案的构件，所述三维图案具有在沿所述光学轴不对称的所述横向强度分布的变化；且所述评估装置配置成根据所述探测器信号确定高度信息。

Description

用于确定样品高度信息的方法以及扫描显微镜
(201710131546.4的分案)
技术领域
本发明涉及用于确定样品形貌信息或高度信息的方法以及一种扫描显微镜。
为了表征技术表面且尤其是为了推导粗糙测量值以及形貌，共聚焦显微镜是当前使用的标准方法。该方法在例如M.Rohlres、J.Seewig,L著作且由标准出版社有限公司(BeuthVerlag GmbH)2009年于柏林出版的“表面的光学测量技术”中有所描述。在许多共聚焦***中，样品的扫描在此是在三个空间方向上进行的，也就是说，首先涉及的是点扫描***，其中光束在x/y方向上被引导(扫描)至样品上。为了推导出高度信息，还要求样品相对于探测器单元(在z方向上)移动。通过根据z位置的强度最大值，可推导出高度信息且因此推导出各x、y位置的形貌。在此情况下，通常使用例如“重心”方法(Tiziani et al.,Opt.Eng.39,32(2000))。该***的一个示范例是卡尔蔡司显微镜有限公司的LSM700。
该方法的一个不足主要是，对3D形貌记录的额外z扫描需要很长时间。此外，其精确性(高度测量的精度)极大程度地取决于样品表面相对于探测器单元的定位精度且因此总是具有局限性，或高度精确性要求高度精确且昂贵的致动元件，例如，在压电的基础上。
发明内容
本发明的目的是简化使用扫描显微镜时对样品形貌的确定，或使得可不使用独立的z扫描即可对样品进行形貌确定。部分目的可认为是提高记录速度和/或分辨率。
该目的通过本发明方法以及本发明的显微镜实现。
本发明用于确定样品高度信息的方法，包括以下步骤：生成照明点；使用所述照明点照射所述样品；捕获所述照明点在所述样品上的反射图像；评估所述图像的横向分布；根据所述横向分布确定所述高度信息；其中，所述照明点具有三维照明图案以及/或者探测光路中的所述图像具有三维探测图案。
本发明的扫描显微镜包括：照明装置，其用于用照明点照射样；扫描装置，其用于在所述样品上扫描所述照明点；探测器装置，其用于由所述样品反射的所述照明点的空间分辨探测；评估装置，其用于评估所述探测器装置的信号；其中，所述照明装置和/或探测器装置包括用于生成三维图案的器件，所述三维图案具有沿光学轴不对称的横向强度分布中的变化；且所述评估装置配置成根据所述探测器装置的信号确定高度信息。
本发明有利的结构变形在优选实施方式以及以下说明书中予以说明。
本发明的基本构思在于在扫描显微镜中，在照明和/或探测侧，使用和评价类似于点扩散函数的三维照明图案和/或探测图案。
在一优选实施例中，照明图案和/或探测图案具有作为z的函数(沿光学轴的z方向)的大的清楚的强度横向变化。在此情况下，作为z的函数的清楚的强度横向变化应理解为每个z位置中的照明图案和/或探测图案允许与该z位置明确对齐。在此情况下，光学轴沿与放置样品的样品平面正交的平面平行延伸。
在根据本发明的方法中，生成三维照明图案和/或三维探测图案。样品优选地用照明点以光栅型方式进行扫描，且在此过程中照明图案被投射至样品上且/或在探测光路中照明点的图像具有探测图案。
由于照明图案的横向变化中的z信息的编码的结果，可通过例如位置敏感探测器直接读取每个光栅位置的z信息。此外，总强度信息可以已知的方式用于横向或x/y或2D图像生成。
有利地，相比于共聚焦显微镜而言，首先不要求z扫描(速度更快)且其次实现了更高的形貌分辨率。
在一有利的实施例中，照明图案和/或探测图案具有沿光学轴(z方向)不对称的横向强度分布的变化。在此情况下，光学轴沿与放置样品的样品平面正交的平面平行延伸。
由于探测图案的横向变化中的z信息的编码的结果，可通过例如位置敏感探测器直接读取每个光栅位置的z信息。此外，总强度信息可以已知的方式用于横向或x/y或2D图像生成。
通过在照明点的一半瞳中引入线性相位分布，可实现尤其简单的照明图案。这可通过例如覆盖一半瞳的一个玻璃楔或者分别覆盖一半瞳的两个相向的楔来实现。
为了生成相应的三维探测图案，玻璃楔应设置在探测光路中。
在其他实施例中，可通过例如激光生成具有旋转强度分布的照明图案和/或探测图案。生成旋转强度分布使得有必要在照明和/或探测光路中具有相应的相位元件。
通过使用包括2个点(Helix,PRILM)的照明图案，2个点的(相反方向的)信号可被平均以提高信号的质量。但是，如果每个点独立评估，横向分辨率则因此提高。在此情况下，z信息也可通过所述点的位置取得。与此同时，独立评估也因此使得可加快图像记录的速度，因为实际上2个点被同时用于成像。
有利地，本发明相比于共聚焦显微镜，首先不要求z扫描(速度更快)且其次可实现较高的形貌分辨率。
探测图案能以与所述的照明图案相同的方式实施。尤其是，其还可使用相同的方式实现。这也适用于探测光组件的旋转强度分布，其中后者仅间接生成，在例如激光在样品上的反射的意义上。
根据本发明的扫描显微镜首先，以已知的方式，具有照明装置，用于通过照明点照明和/或激发样品。其进一步包括将照明点扫描到样品上的扫描装置、用于探测从样品上反射和/或发射的照明点的探测器装置以及用于评估探测器装置的信号的评估装置。
根据本发明，照明装置和/或探测器装置包括至少一种用于通过沿光学轴不对称的横向强度分布中的变化来生成三维图案的器件。评估装置配置成从探测信号中确定高度信息。这可使用已知的方式进行，因为照明图案和/或探测图案的强度分布是已知的。
当将激光用作光源时，根据待检测的样品的光学属性不同可产生干涉效应，该干涉效应使得分析探测信号变得更困难。这一点可通过使用适当的光源(例如超发光源)或影响激光的相干性来避免。
原则上，该***也可以非退扫描的方式设计，因为z分辨率不需要针孔。但是，这样将需要使用相机(像素阵列)作为探测器，因为反射点将不再静止。将需要为每个相机图像评估反射PSF。
该方法和/扫描显微镜也可以实现为用于更快捕捉大样品区的多点***。为此，多个照明点中的每一个可在专用的位置敏感探测器上成像(快)或所有的照明点均在一个相机上成像且每个照明点被分配一个专用的ROI(兴趣区)，然后在其中评估反射的照明图案。
通过将z信息转换成横向强度分布，与纯粹的散焦信息相比可获得更高的可评估信息内容这一事实，可更具体地显示本发明的优点。
在横向强度变化中的z信息编码允许使用分段探测器(PSD，即位置敏感探测器)。形貌显微镜(反射)通常是不限光子的；在此情况下，通过分段探测器可实现非常高的灵敏性。
原则上可以不必有针孔，因为离焦光组件的区分也缘于PSF的横向形式或差分信号。但是，额外的针孔可能有利于更好的信噪比。
对于本发明而言，有利地是每像素z扫描不再是必要的，因为z信息直接呈现在PSD信号中。
在生成高度地图(不同像素的相对高度信息)时，可发生两种情况：
a)在不发生高度差大于景深的平面样品的情况下，本发明不需要z扫描，因为高度信息可直接一次性确定。
b)在具有大于景深的明显的高度变化的样品的情况下，z扫描被认为仍然是必要的。但是，在此可使用较在先技术大得多的z步长，因此也获得了轮流时间增益。
此外，有利地，不需要计算操作；数据记录仅由扫描方法限定。尤其是由于材料显微镜中存在足够的信号光，可使用共振扫描仪和/或多点扫描，因此可实现巨大的速度增益。
通过将相位元件引入到照明光路中且张开探测侧的共聚焦针孔(其中相应的探测器应被使用)，本发明可在例如常用的共聚焦显微镜中实现。替代性地或在此之外，相位元件可被引入到探测光路中。
附图说明
以下将参照附图对本发明和优选实施例进行更详细的说明。
附图如下：
图1显示各种点扩散函数；
图2显示多个z位置的照明图案或探测图案；
图3显示由样品反射的照明图案的评估或探测图案的评估的一个优选实施例；
图4显示探测信号评估的电路图；
图5显示探测器装置的强度信号作为样品形貌(z)的函数；
图6显示第一优选实施例中带开放控制回路的激光扫描显微镜的基本示意图；
图7显示第二优选实施例中带闭环控制回路的激光扫描显微镜的基本示意图。
具体实施方式
图1显示多个点扩散函数(PSF)，例如在激光扫描显微镜的检测中发生或被评估的点扩散函数。
附图底部显示标准点扩散函数，例如作为在针孔处的衍射结果产生的点扩散函数。图中显示横向分辨率作为z位置的函数。
图中顶部显示所谓的双螺旋点扩展函数(DH-PSF)，例如在Pavani等著的OpticsExpress 16,26(2008)中描述的用于在超分辨率显微镜(PALM)中的3D数据生成的双螺旋点扩展函数。在横向(X-Y)和轴向(Z)上非对称的点扩散函数优选地被用作照明图案。其也可用作探测图案。
图2显示激光扫描显微镜中使用玻璃楔覆盖一半瞳时所生成的不同的照明图案和探测图案。类似的探测点扩散函数描述在Baddeley等著的Nano Res.4,589(2011)中。
根据本发明，上述以及类似的点扩散函数可在照明和探测中产生且可用作照明图案或探测图案，其中通过在适当的情况下使用激光源，有必要考虑在点光源意义上的相干性。
图3和4描述使用照明图案或探测图案的测量和评估原则。
图3显示500nm和750nm代表的两个不同z位置处的图案01。探测器示意地描绘于图案中。探测器为位置敏感探测器(PSD)，且在所示的示范例中为四象限光电二极管02。可以看出，在不同z位置各象限的强度具有不同的值。
图4显示一示例性评估电路，其形成每种情况下两个象限中的差分信号。在当前具有沿相反的方向行进的两个对称点的图案中，在本发明的一实施例中象限{A和B}以及{C和D}的差分信号将是相同的且可平均化以增加灵敏度。
标准化的差分信号形成如下：
所有象限的汇总信息将对应于扫描点的强度信号且用于以已知的方式确定总体图像。
作为替代且根据点图案，四个象限中的两个的和就足够了，也就是说，两个点中仅有一个被使用；因此提高了横向分辨率。
图5显示根据上述计算评估的图案的信号线形。
最大值04和最小值06之间的中间区03显示出具有非常高信号质量的严格单一的特性，而且其在宽的范围内为线性的。在该区03中，z信息可因此直接从探测器差分信号中清楚地获得。非线性特性(例如当使用不同类型的照明图案时)也可以本领域技术人员所熟知的相应测量和校准曲线来绘图。
图6显示第一优选实施例中具有开放控制回路(开放回路)的激光扫描显微镜。
激光扫描显微镜首先以已知的方式构建。激光器07提供照明光路08中的照明光线，该照明光线通过扫描器09被逐点扫描至样品平面11上。
由定位在样品平面11中样品所反射或发出的光通过物镜13和分束器14沿观察光路12馈送至探测器16。探测器16为位置敏感探测器(PSD)。
相位元件17被设置在两个光路的至少一个中，即在照明光路、在探测光路中或在两个光路中，以生成清楚的强度分布，其是作为z的函数的极大的变量，横切地且与光轴平行。相位元件17可以是例如简单的玻璃楔(如Baddeley等著的Nano Res.4,589(2011)中所述)，或者是复相位掩膜(如Grover等著的Biomedical Optics Express 2,3012(2011)中所述)。相位元件17在激发和/或探测时位于***共轭瞳中或附近。相位元件18在图中以虚线表示；相位元件18可用作相位元件17的替代，或者除相位元件17之外的附加相位元件。
替代性地，相位元件17、18也可以是空间光调制器(SLM)。如果后者作用于传输(如，液晶SLM)，结构上没有变化；如果涉及反射SLM(如，微镜阵列、变形镜)，光束应相应地折叠。
可使用相机或探测器阵列代替探测器16。像素的数量可以小(也即快)；其足够将反射照明图案成像。因此，整个照明图案的图像信息可随后被分析。
DE 10 2013 019 347 A1中所述的探测器阵列尤其适合用于此目的。在此情况下，例如可采用存储***PSF。
也可相对于测量头移动样品，以替代扫描动作。
图7显示原则上与图6中所述的相同结构的***，但是体现为闭环控制回路(闭环回路)。相同的附图标记具有与上述相同的含义。
该***还包括用于在z方向上调整样品平面的压电致动器19、和控制器20。
控制器20接收例如以上述方式确定的探测器16的差分信号，作为控制变量r。为了保持该控制变量在设定点值w(例如“0”)，控制器20将控制信号s应用到压电致动器19。该信号与z(形貌)直接成比例且被评估单元21测得并评估。在此情况下，评估单元21可具有用于数据处理的专用信号处理器。此外，误差信号f(控制变量偏差)可被探测并记录，该近似值的误差信号(例如使用PI控制器)与形貌的改变成比例(偏差)。
本实施例的优点在于高灵敏度(也就是形貌分辨率)，其缘于零交点处(图5)信号的高梯度还在于z方向上的高操作范围。后者不再由照明图案的景深(例如，在100x 0.9NA的情况下约1-1.5μm)来提供，而是由压电致动器19的运动范围(可能是10–100μm)来提供。由于闭环控制回路以及压电致动器19的致动时间，这种模式本质上慢于图6中所描述的实施例。
理想的是处在操作模式“开放回路”(快速，有限的z)和“闭环回路”(慢，较大的z操作范围，灵敏)之间的需求控制切换。
在该实施例中，也有由虚线表示的一个相位元件18；其可用作相位元件17的替代或附加。
附图标记列表：
01 照明图案
02 四象限光电二极管
03 中间区
04 最大值
05–
06 最小值
07 激光器
08 照明光路
09 扫描器
10–
11 样品平面
12 观察光路
13 物镜
14 分束器
15–
16 探测器
17 相位元件
18 相位元件
19 压电致动器
20 控制器
21 评估单元

Claims (16)

1.一种用于确定样品高度信息的方法，包括以下步骤：
-生成照明点；
-使用所述照明点照射所述样品；
-利用象限光电二极管作为位置敏感探测器(16)捕获所述照明点在所述样品上的反射图像，其中，所述照明点具有三维照明图案以及/或者探测光路中的图像具有三维探测图案，且
所述照明图案以及/或者探测图案具有沿光学轴不对称的横向强度分布的变化，并由此具有作为沿光学轴的z方向的函数的清楚的横向强度变化；
-校准沿所述光学轴所述象限光电二极管的各象限的变化强度的所述函数；
-评估所述图像的横向分布；
-登记每个象限的强度，其中，由于作为沿所述光学轴的z方向的函数的所述清楚的横向强度变化，所述象限光电二极管的各象限的强度在不同z位置具有不同的值，其中沿所述光学轴的每个位置(z位置)中的所述照明图案以及/或者探测图案允许与对各横向扫描位置的该z位置明确对齐；
-形成每种情况下两个象限中的差分信号，以及
-通过将获得的差分信号与沿光轴的强度的所述函数进行比较，直接获得z位置的信息，从而根据所述横向分布确定所述高度信息。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于所述照明图案具有由一个或两个点构成的三维照明图案。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，提供在“闭环回路”操作模式与根据权利要求1的“开环回路”操作模式之间的需求控制切换，而“闭环回路”操作模式进一步允许通过压电致动器(19)和控制器(20)调整包含所述样品的样品平面，其中所述控制器(20)接收所述差分信号作为受控变量并且所述控制器(20)向所述压电致动器(19)施加控制信号，以便将所述受控变量保持在设定点。
4.如权利要求1-3任一项中所述的方法，特征在于所述光学轴平行于与放置所述样品的样品平面正交的平面延伸。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，特征在于相位分布被用于生成所述照明图案和/或探测图案。
6.如权利要求5中所述的方法，特征在于所述相位分布为线性的。
7.如权利要求1-6中任一所述的方法，特征在于所述图像的强度信息被进一步确定。
8.如权利要求1-7中任一所述的方法，特征在于所述照明图案通过使用有旋转强度分布的激光束来生成。
9.如权利要求1-7中任一所述的方法，特征在于将多个照明点同时扫描在所述样品平面上。
10.一种扫描显微镜，包括：
-照明装置(07)，其用于用照明点照射样品；
-扫描装置(09)，其用于在所述样品上扫描所述照明点；
-作为探测器装置(16)的象限光电二极管，其用于由所述样品反射的所述照明点的空间分辨探测；
-评估装置，其用于评估所述探测器装置(16)的信号；
特征在于：
-所述照明装置(07)和/或探测器装置包括用于生成三维图案的器件，所述三维图案具有沿光学轴不对称的横向强度分布的变化；且
-所述评估装置配置成按照权利要求1的方法根据所述探测器装置的信号确定高度信息。
11.如权利要求10中所述的扫描显微镜，特征在于所述用于生成所述三维图案的器件是相位元件(17)。
12.如权利要求11中所述的扫描显微镜，特征在于所述相位元件(17)包括玻璃楔，所述玻璃楔设置在所述扫描显微镜的瞳平面中，且覆盖所述照明点和/或图像的至少一部分。
13.如权利要求12中所述的扫描显微镜，特征在于所述玻璃楔为第一玻璃楔且所述相位元件(17)包括第二玻璃楔，其中所述第一玻璃楔和所述第二玻璃楔呈相反的方向设置且各自覆盖所述照明图案的一半。
14.如权利要求10中所述的扫描显微镜，特征在于所述用于生成照明图案的器件是有旋转强度分布的激光束。
15.如权利要求10中所述的扫描显微镜，包括压电致动器(19)和控制器(20)，用于调节包含所述样品的样品平面，其中所述控制器(20)接收作为受控变量的所述差分信号，所述控制器(20)向所述压电致动器(19)施加控制信号，以将所述受控变量保持在设定点。
16.权利要求10-15中任一项所述的扫描显微镜在材料显微镜领域中的使用。
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