CN117867004A - 合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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CN117867004A CN202410048335.4A CN202410048335A CN117867004A CN 117867004 A CN117867004 A CN 117867004A CN 202410048335 A CN202410048335 A CN 202410048335A CN 117867004 A CN117867004 A CN 117867004A
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张磊
陈祥慧
陈瑞兵
杨瑾冬
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Abstract

本发明涉及合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。本发明首次实现利用酿酒酵母合成了复杂苯丙素类化合物抗病毒活性木脂素苷，克服了以阿魏酸为底物合成木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的关键技术难点，通过导入外源途径，匹配最优酶组合提高催化效率，增加拷贝数，增强前体供应，为苯丙素类化合物木脂素苷的生物合成提供参考。本发明利用微生物合成木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷，能高效、稳定生产抗病毒活性木脂素苷，为后续木脂素苷的大规模生物合成提供了强有力的研究和应用基础。

Description

合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于微生物基因工程与代谢工程应用领域，尤其是涉及一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根入药为板蓝根，是当下治疗流感应用最广泛的中药品种之一，具有清热解毒，凉血利咽等功效。临床用于治疗风热感冒，咽喉肿痛，病毒性感染以及传染病流行期间的预防。有研究发现木脂素苷类化合物是板蓝根主要抗病毒活性成分(图1)，包括以落叶松脂素(lariciresinol，Lar)为母核的糖基化产物直铁线莲宁B(clemastanin B,lariciresinol-4,4'-bis-O-β-D-glycopyranoside,LDG)和落叶松脂素-4-O-葡萄糖苷(lariciresinol-4-bis-O-β-D-glycopyranoside,L4G)；及以松脂素(pinoresinol，Pin)为母核的糖基化产物松脂素单糖苷和松脂素双糖苷。
目前，植物提取法是获得木脂素苷的主要方法。前期对赤峰、亳州和阜阳等12个板蓝根主产区的药材进行定量分析，发现L4G及其前体Lar的平均含量仅为47.14μg/g和84.67μg/g，仅占全株的0.047％和0.086％。极低的木脂素苷含量严重限制板蓝根的深度开发和临床应用。利用合成生物学方法构建高效生产抗病毒活性木脂素苷的细胞工厂，实现药效活性成分的稳定供应，是满足临床需求和实现菘蓝(板蓝根基原植物)资源可持续利用的基础。
迄今，能合成抗病毒活性木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的微生物菌株尚无报道。
发明内容
基于目前缺少能合成抗病毒活性木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的微生物菌株的现状，本发明提供一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。
本发明基于模块化的合成生物学策略和多水平代谢工程策略，在酿酒酵母中重构木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的合成途径，首次实现了以环保无污染的方式合成了复杂苯丙素类化合物抗病毒活性木脂素苷。本发明提供的合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌能够发酵生产直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本申请的第一方面，提供一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法，所述合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌能够生产木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷，以酿酒酵母为出发菌株进行基因改造，获得所合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌，所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种：
(1)整合CoAl模块；
(2)整合CoAl模块和Pin模块；
(3)整合CoAl模块、Pin模块和Lar模块；
(4)整合CoAl模块、Pin模块和UGT模块；
(5)整合CoAl模块、Pin模块、Lar模块和UGT模块；
其中，可选地，CoAl模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：酿酒酵母密码子优化过的毛果杨Populus trichocarpa 4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ptr4CL3、Ptr4CL5，酿酒酵母密码子优化过的菘蓝Isatis indigotica 4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ii4CL3，酿酒酵母密码子优化过的拟南芥Arabidopsis thaliana肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因AtCCR1，酿酒酵母密码子优化过的毛果杨P.trichocarpa肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因PtrCCR2，以及酵母内源醇脱氢酶Adh6的编码基因ScADH6；
可选地，Pin模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：酿酒酵母密码子优化过的谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum漆酶的编码基因CgL1，酿酒酵母密码子优化过的栓菌Trametes sp.C30漆酶Lac的编码基因TsLAC3，酿酒酵母密码子优化过的云芝Trametes versicolor漆酶Lac的编码基因TvLAC1和菘蓝I.indigotica指导蛋白Dir的编码基因IiDIR1、IiDIR2；
可选地，Lar模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：酿酒酵母密码子优化过的拟南芥A.thaliana松脂素还原酶Prr的编码基因AtPRR，酿酒酵母密码子优化过的菘蓝I.indigotica松脂素还原酶Plr的编码基因IiPLR1，酿酒酵母密码子优化过的桃儿七Sinopodophyllum hexandrum松脂素还原酶Plr的编码基因ShPLR；
可选地，UGT模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：菘蓝I.indigotica糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b，以及酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1的编码基因ScPGM1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1的编码基因ScUGP1。
在本发明的一个实施方式中，优选地，Pin模块中效果最优的酶组合为：栓菌漆酶Lac的编码基因为N端截短22个氨基酸的漆酶Lac截短体的编码基因，命名为trTsLAC3；菘蓝指导蛋白Dir1的编码基因为N端截短23个氨基酸的指导蛋白Dir1截短体的编码基因，命名为trIiDIR1；菘蓝指导蛋白Dir2的编码基因为N端截短28个氨基酸的指导蛋白Dir2截短体的编码基因，命名为trIiDIR2。
在本发明的一个实施方式中，优选地，UGT模块中对菘蓝糖基转移酶IiUgt71B2、IiUgt71B5a、IiUgt71B5b采用多拷贝整合，所述多拷贝为1至3个拷贝，优选为3拷贝整合。
在本发明的一个实施方式中，合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法中，所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种：
(a)整合CoAl模块时：增加1个拷贝的毛果杨4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ptr4CL5，毛果杨肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因PtrCCR2，以及酵母内源醇脱氢酶Adh6的编码基因ScADH6；
(b)整合CoAl模块和Pin模块时：(a)的基础上，增加1个拷贝的N端截短22个氨基酸的栓菌漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3，分别和1个拷贝的N端截短23个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir1截短体的编码基因trIiDIR1的组合，及1个拷贝的N端截短28个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir2截短体的编码基因trIiDIR2的组合；
(c)整合CoAl模块、Pin模块和Lar模块时：(b)的基础上，增加1个拷贝的菘蓝松脂素还原酶Plr的编码基因IiPLR1；
(d)整合CoAl模块、Pin模块和UGT模块时：(b)的基础上，分别增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b；为提高松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的产量，在(d)的基础上，分别再增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b；
(e)整合CoAl模块、Pin模块、Lar模块和UGT模块时：(c)的基础上，增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5b；为提高直铁线莲宁B的产量，在(e)的基础上，增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5b，提高了模块的转化率；再增加1个拷贝的酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1的编码基因ScPGM1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1的编码基因ScUGP1组合，增强前体UDP-葡萄糖供应。
可选地，所述木脂素苷合成途径相关基因包括具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的毛果杨4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ptr4CL3，GenBank号为EU603298；具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的毛果杨4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ptr4CL5，GenBank号为EU603299；具有如SEQID NO.3所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的菘蓝4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ii4CL3，GenBank号为KC430623.1；具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的拟南芥肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因AtCCR1，GenBank号为AF320624.1；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的毛果杨肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因PtrCCR2，GenBank号为EU603310；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的酵母内源醇脱氢酶Adh6的编码基因ScADH6，GenBank号为NC_000004.1；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的谷氨酸棒状杆菌漆酶的编码基因CgL1，GenBank号为CP025533.1；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的N端截短22个氨基酸的栓菌漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3，GenBank号为AY397783.1；具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的云芝漆酶Lac的编码基因TvLAC1，GenBank号为AF414109.1；具有如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的N端截短23个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir1截短体的编码基因trIiDIR1；具有如SEQ IDNO.11所示核苷酸序列的N端截短28个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir2截短体的编码基因trIiDIR2；具有如SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的拟南芥松脂素还原酶的编码基因AtPRR，GenBank号为NM_117440.3；具有如SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的菘蓝松脂素还原酶Plr的编码基因IiPLR1，GenBank号为JF264893.1；具有如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的经过酿酒酵母密码子优化的桃儿七松脂素还原酶Plr的编码基因ShPLR，GenBank号为EU240218；具有如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2，GenBank号为MK704396.1；具有如SEQ IDNO.16所示核苷酸序列的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5a，GenBank号为MW051594；具有如SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5b，GenBank号为MW051595；具有如SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1的编码基因ScPGM1，GenBank号为CP046091；具有如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的酵母内源UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1的编码基因ScUGP1，GenBank号为CP046091其中的至少一种。
可选地，所述基因改造方式选自整合以下基因组合中的一种或几种：
(1)Ptr4CL3、AtCCR1、ScADH6组合，Ptr4CL3、PtrCCR2、ScADH6组合，Ptr4CL5、AtCCR1、ScADH6组合，Ptr4CL5、PtrCCR2、ScADH6组合，Ii4CL3、AtCCR1、ScADH6组合，Ii4CL3、PtrCCR2、ScADH6组合；导入位点均为XII1；
(2)CgL1基因，TsLAC3基因，TvLAC1基因，trTsLAC3和trIiDIR1组合，trTsLAC3和trIiDIR2组合；导入位点均为XII3；
(3)AtPRR基因，IiPLR1基因，ShPLR基因，IiUGT71B2基因，IiUGT71B5a基因，IiUGT71B5b基因,IiPLR1和IiUGT71B2组合，IiPLR1和IiUGT71B5a组合，IiPLR1和IiUGT71B5b组合；导入位点均为XI3；
(4)双拷贝的IiUGT71B2基因、IiUGT71B5a基因、IiUGT71B5b基因；导入位点均为II1；
(5)ScPGM1和ScUGP1组合；导入位点为XII5。
可选地，分别将含有PGAL7-Ptr4CL3OPT-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-AtCCR1OPT-THIS5的DNA片段、PGAL7-Ptr4CL3OPT-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-PtrCCR2OPT-THIS5的DNA片段、PGAL7-Ptr4CL5OPT-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-AtCCR1OPT-THIS5的DNA片段、PGAL7-Ptr4CL5OPT-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-PtrCCR2OPT-THIS5的DNA片段、PGAL7-Ii4CL3OPT-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-AtCCR1OPT-THIS5的DNA片段、PGAL7-Ii4CL3OPT-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-PtrCCR2OPT-THIS5的DNA片段整合到出发菌株的XII1位点；
分别将含有TSPG5-PGAL10/1-CgLOPT-TIDP1的DNA片段、TSPG5-PGAL10/1-TsLAC3OPT-TIDP1的DNA片段、TSPG5-PGAL10/1-TvLAC1OPT-TIDP1的DNA片段、TSPG5-trIiDIR1-PGAL10/1-trTsLAC3OPT-TIDP1的DNA片段、TSPG5-trIiDIR2-PGAL10/1-trTsLAC3OPT-TIDP1的DNA片段整合到上一步所需本底菌株的XII3位点；
分别将含有TPRM5-AtPRROPT-PGAL10/1-TLSC2的DNA片段、TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-TLSC2的DNA片段、TPRM5-ShPLROPT-PGAL10/1-TLSC2的DNA片段、TPRM5-IiUGT71B2-PGAL10/1-TLSC2的DNA片段、TPRM5-IiUGT71B5a-PGAL10/1-TLSC2的DNA片段、TPRM5-IiUGT71B5b-PGAL10/1-TLSC2的DNA片段、TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-IiUGT71B2-TLSC2的DNA片段、TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-IiUGT71B5a-TLSC2的DNA片段、TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-IiUGT71B5b-TLSC2的DNA片段整合到上一步所需本底菌株的XI3位点；
分别将含有TPRM9-IiUGT71B2-PGAL10/1-IiUGT71B2-TLSC2的DNA片段、TPRM9-IiUGT71B5a-PGAL10/1-IiUGT71B5a-TLSC2的DNA片段、TPRM9-IiUGT71B5b-PGAL10/1-IiUGT71B5b-TLSC2的DNA片段、整合上一步所需本底菌株的II1位点；
将含有TCPS1-ScUGP1-PGAL10/1-ScPGM1-THIS5的DNA片段整合到上一步所需本底菌株的XII5位点。
在本发明的一个实施方式中，出发菌株选择表达Cas9蛋白且敲除GAL80基因的酿酒酵母(CEN.PK113-11C*)，或经过基因改造后能合成丰富阿魏酸FA前体的酿酒酵母菌株RB218。
其中，表达Cas9蛋白且敲除GAL80基因的酿酒酵母在申请号202111537725.0、公开号CN116333900A的专利申请“一种提高酵母菌株NADPH和FADH2供应的方法、工程菌及其应用”中有公开。酿酒酵母菌株RB218在参考文献Chen,R.et al.(2022)Engineeringcofactor supply and recycling to drive phenolic acid biosynthesis inyeast.NatChem Biol 18,520-529.中有公开。酿酒酵母作为公认的食品安全菌株，具有同植物细胞相似的内质网、液泡、线粒体等细胞器，为模拟植物实现天然产物的异源合成提供了基础；同时具有在简单培养基中易生长，产物易分离纯化等优点，因此本申请利用酿酒酵母作为出发菌株合成植物木脂素苷，具有良好的应用前景。
本申请的第二方面，提供由所述方法得到的合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌，可发酵生产木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷，选自以下任意一种工程菌：
(Ⅰ)通过CoAl模块构建基因工程菌RB57，松柏醇CoAl产量最高；
(Ⅱ)在(Ⅰ)的基因工程菌RB57中通过Pin模块构建，增加1个拷贝的N端截短22个氨基酸的栓菌漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3和N端截短23个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir1截短体的编码基因trIiDIR1的组合，获得基因工程菌RB69B1；增加1个拷贝的N端截短22个氨基酸的栓菌漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3和N端截短28个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir2截短体的编码基因trIiDIR2的组合，获得基因工程菌RB69B2；松脂素Pin产量最高；
(Ⅲ)在(Ⅱ)的基因工程菌RB69B1和RB69B2中通过Lar模块构建，增加1个拷贝的菘蓝松脂素还原酶Plr的编码基因IiPLR1，获得基因工程菌XH2B1和XH2B2；优选地，生产落叶松脂素Lar的工程菌为XH2B2；
(Ⅳ)在(Ⅲ)的基因工程菌XH2B2中通过UGT模块构建，分别增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b，分别获得基因工程菌XH4、XH5、XH6，优选地，生产直铁线莲宁B的工程菌为XH6；
(Ⅴ)在(Ⅳ)的基因工程菌XH6上增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71 B5b，获得基因工程菌XH12；
(Ⅵ)在(Ⅴ)的基因工程菌XH12上增加1个拷贝的酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1的编码基因ScPGM1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1的编码基因ScUGT1组合，获得基因工程菌XH18；
(Ⅶ)在(Ⅱ)的基因工程菌RB69B1和RB69B2中通过UGT模块构建，分别增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b，分别获得基因工程菌XH7B1/2、XH8B1/2、XH9B1/2，优选地，生产松脂素单糖苷的工程菌为XH7B1，生产松脂素双糖苷的工程菌为XH8B1；
(Ⅷ)在(Ⅶ)的基因工程菌XH7B1上增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2，获得基因工程菌XH13；在基因工程菌XH8B1上增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5a，获得基因工程菌XH14。
本申请的第三方面，提供上述所述的方法得到的合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌在合成木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷中的应用。
本申请的第四方面，提供一种木脂素苷的制备方法，发酵培养所述合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌，并提取获得木脂素苷；
其中，培养发酵通过所有模块基因改造方式所述基因工程菌时，增加前体阿魏酸：将工程菌接种于含葡萄糖且添加阿魏酸的培养基A中，发酵得到所述木脂素苷；
可选地，所述葡萄糖在所述培养基A中的含量为10～20g/L，阿魏酸在所述培养基A中的含量为50～300mg/L。
可选地，所述发酵工程菌条件包括：
温度为28～30℃；
转数为220～280rpm；
时间为72～96小时；
装液量15～20/100mL。
本发明分别构建了一株发酵生产木脂素苷直铁线莲宁B及一株发酵生产松脂素单糖苷和一株发酵生产松脂素双糖苷的酵母工程菌。以酿酒酵母作为出发菌株，通过导入外源途径，正交筛选最优酶组合提高催化效率，减轻菌体代谢负担，增加拷贝数，增强前体供应等方法，从而显著提升木脂素苷的产量。首先，根据已有的文献确认了木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的合成途径，对已报道的途径和改造步骤进行总结对比，设计最适的构建路径。考虑到合成途径涉及的植物酶底物杂泛性极强(图1)，不利于整体构建。因此以相对稳定的中间产物作为关键节点，进行分模块(CoAl模块、Pin模块、Lar模块、UGT模块)构建。主要通过以下手段实现：1.以表达Cas9蛋白且敲除GAL80基因的酿酒酵母(CEN.PK113-11C*)为出发菌株，通过导入外源途径，比较关键酶4-香豆酸辅酶A连接酶4cl、肉桂酰辅酶A还原酶Ccr和醇脱氢酶Adh6的不同正交组合催化活性，筛选最优的松柏醇(CoAl)合成途径，完成CoAl模块构建；2.进一步地，比较不同来源的关键酶漆酶Lac和指导蛋白Dir组合，引入最佳来源的松脂素(Pin)合成途径，再通过代谢工程的方法去除信号肽强化松脂素合成的代谢流，完成Pin模块构建；3.通过比较不同来源的关键酶松脂素还原酶Plr，筛选最佳来源的中间体落叶松脂素(Lar)合成途径，完成Lar模块构建；4.比较来源于菘蓝Isatis indigotica的不同糖基转移酶Ugt，筛选最优的木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷合成酶，完成UGT模块构建；5.进一步地，通过增加木脂素苷合成途径中糖基转移酶Ugt的拷贝数，以及过表达酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1，增强前体UDP-葡萄糖供应，提高了模块的转化率，使得木脂素苷的产量得到了显著提升，是迄今首次报道用微生物法生产木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷。
本发明以酿酒酵母CEN.PK113-11C*为出发菌株，筛选不同来源的4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl及肉桂酰辅酶A还原酶Ccr，并利用正交组合的方式对不同4Cl、Ccr和酵母内源醇脱氢酶Adh6进行催化效果比较，并通过筛选不同来源的漆酶Lac、截断Lac和指导蛋白Dir的N端信号肽实现共定位、筛选不同来源的松脂素还原酶Plr、多拷贝糖基转移酶Ugt以及过表达酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1，最终构建得到用于高效生产木脂素苷(包括直铁线莲宁B、松脂素双糖苷、松脂素单糖苷)的酿酒酵母工程菌株，实现了木脂素苷在微生物生产中从无到有的突破，且在最小培养基中直铁线莲宁B的产量可达到133.8μg/L，松脂素双糖苷、松脂素单糖苷的产量分别可达到459.2μg/L和543.6μg/L。本发明均采用整合基因组的方式来构建细胞工厂生产木脂素苷，既规避了利用质粒表达稳定性不高的问题，又具有生产成本低、工业化应用前景广的优点。根据本发明提供的合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用，不仅实现了利用酿酒酵母生产木脂素苷零的突破，且利用共定位、关键酶多拷贝、增加前体供应等策略提高了木脂素苷的生产效率，为后续木脂素苷的产业化打下夯实的基础。
本发明利用微生物合成木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷，与传统植物提取和化学合成相比，不受地理气候等条件限制，环境友好无污染，同时满足国家绿色生物制造的战略需求。本发明构建的酵母工程菌能高效、稳定生产抗病毒活性木脂素苷，为后续木脂素苷的大规模生物合成提供了强有力的研究和应用基础。
附图说明
图1示出了抗病毒活性木脂素苷的生物合成途径示意图。
图2示出了CoAl模块的产量优化图。
图3示出了CoAl模块和Pin模块整合的产量优化图。
图4示出了共定位代谢工程优化对松脂素产量的变化图。
图5示出了CoAl模块、Pin模块和Lar模块整合的产量优化图。
图6示出了CoAl模块、Pin模块和UGT模块整合的产量优化图。
图7示出了CoAl模块、Pin模块、Lar模块和UGT模块整合的产量优化图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
本申请以下实施例的出发菌株为表达Cas9蛋白且敲除GAL80基因的酿酒酵母CEN.PK113-11C*，具体是将CEN.PK113-11C菌株中敲除GAL80基因所得。
其中，CEN.PK113-11C是Euroscarf(Oberursel,Germany)公司的(MATa MAL2-8cSUC2 his3Δ1ura3-52)；而将CEN.PK113-11C菌株中敲除GAL80基因的方法在申请号202111537725.0、公开号CN116333900A的专利申请“一种提高酵母菌株NADPH和FADH2供应的方法、工程菌及其应用”中有公开。
实施例1：酿酒酵母高效整合位点
(1)搭载基因编辑CRISPR/Cas9***的sgRNA表达载体构建
前期自主构建了整合CAS9基因且敲除GAL80基因的重组酿酒酵母CEN.PK113-11C*(基因型MATa,SUC2,MAL2-8c,his3Δ,ura3Δ,gal80Δ,XI5::(PTEF1-CAS9-TCYC1)),其能实现在启动子PGAL7和PGAL10/1后表达的途径基因在限糖条件下高效表达，并以此为宿主菌株进行合成抗病毒活性木脂素苷酵母菌株的构建。
将酿酒酵母基因组无意义片段或拟敲除的基因片段作为基因组重组位点，构建了一系列sgRNA表达载体，结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，利用酵母自身同源重组的特性，把sgRNA表达载体及携带目标位点up同源臂-目标表达盒-dw同源臂的供体DNA片段高效整合至酵母基因组中。
本发明中使用的所有sgRNA表达载体除20bp靶向序列不同以外，其余部分完全相同。简单来说，首先使用引物6005(GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG)从pgRNA-GAL80质粒中扩增载体骨架S1；接着，分别扩增sgRNA-1和sgRNA-2，其中sgRNA-1使用引物p1(GCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCA GTGTTATC)和pX1(AAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATC(M20)GTTTTAGAGCTAGAAATAG，其中M20为可替换20bp靶向序列)，sgRNA-2使用引物p2(GATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGC)和pX2(AAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATC(N20)GTTTTAGAGCTAGAAATAG，其中N(N20)为可替换的另外20bp靶向序列)；最后，sgRNA片段和载体骨架片段使用GibsonAssembly的方法进行克隆连接，获得的重组载体测序完全正确后进行应用。pX1和pX2中M20和N20的替换序列及替换后对应的序列名称详见表1，本发明中涉及的sgRNA表达载体包括pgRNA-XII1(靶向位点XII1)，pgRNA-XII3(靶向位点XII3)，pgRNA-XI3(靶向位点XI3)，pgRNA-II1(靶向位点II1)，pgRNA-XII5(靶向位点XII5)。对于供体DNA，分别扩增pgRNA载体靶向位点的上下游各约500bp序列作为同源臂，之后通过融合PCR的方式将目标表达盒在同源臂间进行组装，获得完整的供体DNA片段，与对应位点的pgRNA载体同时转化酵母，用于基因编辑和菌株改造。
表1整合位点
实施例2：产抗病毒活性木脂素苷的菌株构建及优化
利用基因编辑工具和代谢工程手段，在酿酒酵母中实现了木脂素苷的合成(图1)。合成途径中涉及的植物或微生物来源的酶，大部分可以通过美国国家生物信息中心NCBI(https//www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到对应的氨基酸序列或基因序列，其余为本实验室从植物cDNA中克隆并表征后获得。以阿魏酸为前体，松柏醇CoAl、松脂素Pin和落叶松脂素Lar为中间产物，将木脂素苷的合成途径分成CoAl、Pin、Lar和UGT四个模块，进行分步构建与优化。以葡萄糖为碳源，结合代谢工程的手段，有效的提升了木脂素苷的产量。
(1)CoAl模块的构建及优化
CoAl模块包含阿魏酸到松柏醇的生物合成途径。利用出发菌株CEN.PK113-11C*，使用化学转化法将约500ng的pgRNA-XII1分别和约500ng的XII1up-PGAL7-Ii4CL3opt-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-AtCCR1opt-THIS5-XII1dw表达Ii4CL3、AtCCR1和ScADH6、约500ng的XII1up-PGAL7-Ii4CL3opt-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-PtrCCR2opt-THIS5-XII1dw表达Ii4CL3、PtrCCR2和ScADH6、约500ng的XII1up-PGAL7-Ptr4CL3opt-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-AtCCR1opt-THIS5-XII1dw表达Ptr4CL3、AtCCR1和ScADH6、约500ng的XII1up-PGAL7-Ptr4CL3opt-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-PtrCCR2opt-THIS5-XII1dw表达Ptr4CL3、PtrCCR2和ScADH6、约500ng的XII1up-PGAL7-Ptr4CL5opt-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-AtCCR1opt-THIS5-XII1dw表达Ptr4CL5、AtCCR1和ScADH6、约500ng的XII1up-PGAL7-Ptr4CL5opt-TENO2-TCPS1-ScADH6-PGAL10/1-PtrCCR2opt-THIS5-XII1dw表达Ptr4CL5、PtrCCR2和ScADH6进行转化后，在加有组氨酸的SD平板上于30℃倒置培养3天；转化子经加有组氨酸的液体SD培养基培养后，通过PCR验证正确，涂布于同时含有组氨酸、尿嘧啶和5-氟乳清酸的固体培养基进行质粒丢失，质粒丢失的菌株再次PCR验证正确后保存备用，分别获得产松柏醇的工程酵母菌株RB52-57。下文中的其它基因组编辑工作均遵循相似流程。
进一步地，在以20g/L葡萄糖为碳源的基础盐培养基中，接种RB52-57酵母菌株，进行发酵，初始接种OD600为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，30℃，220rpm，发酵24h时添加100mg/L阿魏酸前体，总发酵时间为72～96h。
进一步地，对发酵产物进行提取和检测。结果证明酵母菌株RB52-57均可产生松柏醇，菌株RB57产量最高，为29.37mg/L(图2)。
以上技术方案的具体步骤是：取500μL发酵样品，再加入500μL无水乙醇后充分涡旋混匀10min；13000g离心5min，取500μL上清过0.22μm尼龙微孔滤膜后获得松柏醇样品。检测使用岛津LC-2030，色谱柱为3×100mm 2.7um Poroshell120EC-C18(Agilent)，流速为0.8mL/min，流动相A为H2O+0.05％HCOOH，流动相B为ACN+0.05％HCOOH，紫外检测器检测波长为280nm和330nm。具体流动相梯度为95％-A(0min)，90％-A(3min)，88％-A(4-5min)，85％-A(6-7min)，40％-A(10min)，95％-A(12-14min)。
(2)Pin模块的构建及优化
a.Pin模块的构建
在高产松柏醇菌株RB57基础上构建松脂素合成途径。分别转化pgRNA-XII3和XII3up-TSPG5-PGAL10/1-trCgLOPT-TIDP1-XII3dw、pgRNA-XII3和XII3up-TSPG5-PGAL10/1-trTsLAC3OPT-TIDP1-XII3dw、pgRNA-XII3和XII3up-TSPG5-PGAL10/1-trTvLAC1OPT-TIDP1-XII3dw于菌株RB57中，筛选酿酒酵母中可用于生产松脂素的关键酶，分别获得菌株RB68tr、RB69tr和RB70tr。
进一步地，在以20g/L葡萄糖为碳源的基础盐培养基中，接种RBRB68tr-RB70tr酵母菌株，进行发酵，初始接种OD600为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，30℃，220rpm，发酵24h时添加100mg/L阿魏酸前体，总发酵时间为72～96h。
进一步地，使用上述(1)的方法对发酵产物进行提取和检测。结果证明只有酵母菌株RB69tr均可产生松脂素，产量为13.03mg/L(图3)。
b.Pin模块的优化
在产松脂素菌株RB69tr基础上优化松脂素合成途径。分别转化pgRNA-XII3和XII3up-TSPG5-IiDIR1-PGAL10/1-trTsLAC3OPT-TIDP1-XII3dw、pgRNA-XII3和XII3up-TSPG5-IiDIR2-PGAL10/1-trTsLAC3OPT-TIDP1-XII3dw、pgRNA-XII3和XII3up-TSPG5-trIiDIR1-PGAL10/1-trTsLAC3OPT-TIDP1-XII3dw、pgRNA-XII3和XII3up-TSPG5-trIiDIR2-PGAL10/1-trTsLAC3OPT-TIDP1-XII3dw于菌株RB69tr中，探索去除信号肽后关键酶共定位对生产松脂素的影响，分别获得菌株RB69A1/A2和RB69B1/B2。
进一步地，在以20g/L葡萄糖为碳源的基础盐培养基中，接种RB69A1/A2和RB69B1/B2酵母菌株，进行发酵，初始接种OD600为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，30℃，220rpm，发酵24h时添加100mg/L阿魏酸前体，总发酵时间为72～96h。
进一步地，使用上述(1)的方法对发酵产物进行提取和检测。结果证明去除信号肽共定位的策略能显著增加松脂素的积累量，携带指导蛋白截短体trIiDir1/2的酵母菌株RB69B1/B2松脂素的产量最高，为19.08mg/L和18.42mg/L，对比菌株RB69tr分别提高46％和41％(图4)。
(3)Lar模块的构建
在高产松脂素菌株RB69B1/B2基础上构建落叶松脂素合成途径。分别转化pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-AtPRROPT-PGAL10/1-TLSC2-XI3dw、pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-TLSC2-XI3dw、pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-ShIiPLR1OPT-PGAL10/1-TLSC2-XI3dw于菌株RB69B1/B2中，筛选酿酒酵母中可用于生产落叶松脂素的关键酶，分别获得菌株XH1B1/B2、XH2B1/B2和XH3B1/B2。
进一步地，在以20g/L葡萄糖为碳源的基础盐培养基中，接种XH1B1/B2-XH3B1/B2酵母菌株，进行发酵，初始接种OD600为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，30℃，220rpm，发酵24h时添加100mg/L阿魏酸前体，总发酵时间为72～96h。
进一步地，对发酵产物进行提取和检测。结果证明酵母菌株XH1B1/B2-XH3B1/B2均可产生落叶松脂素，携带IiPlr1蛋白的菌株XH2B1/B2落叶松脂素产量最高，为1.03mg/L和1.51mg/L(图5)。
以上技术方案的具体步骤是：取500μL发酵样品，再加入500μL无水乙醇后充分涡旋混匀10min；13000g离心5min，取500μL上清过0.22μm尼龙微孔滤膜后获得落叶松脂素样品。检测使用Agilent 1200-6410LC-MS，色谱柱为3×100mm2.7um Poroshell 120EC-C18(Agilent)，流速为0.3mL/min，流动相A为H2O+0.05％HCOOH，流动相B为ACN+0.05％ HCOOH。具体流动相梯度为95％-A(0min)，80％-A(2min)，78％-A(6min)，75％-A(12min)，5％-A(23min)，后延伸5min。木脂素苷途径各成分质谱检测条件如表2。
表2负离子模式下木脂素苷途径各成分质谱检测条件
(4)UGT模块的构建及优化
a.产松脂素单糖苷和双糖苷模块的构建和优化
在高产松脂素菌株RB69B1基础上构建松脂素糖苷合成途径。分别转化pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-PGAL10/1-IiUGT71B2-TLSC2-XI3dw、pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-PGAL10/1-IiUGT71B5a-TLSC2-XI3dw、pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-PGAL10/1-IiUGT71B5b-TLSC2-XI3dw于菌株RB69B1中，筛选酿酒酵母中可用于生产松脂素糖苷的关键酶，分别获得菌株XH7B1、XH8B1和XH9B1。
进一步地，在以20g/L葡萄糖为碳源的基础盐培养基中，接种XH7B1-XH9B1酵母菌株，进行发酵，初始接种OD600为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，30℃，220rpm，发酵24h时添加100mg/L阿魏酸前体，总发酵时间为72～96h。
进一步地，使用上述(3)的方法对发酵产物进行提取和检测。结果证明携带IiUgt71b2蛋白的酵母菌株XH7B1松脂素单糖苷的产量最高，为507.9μg/L；携带IiUgt71b5a蛋白的酵母菌株XH8B1松脂素双糖苷的产量最高，为390.0μg/L(图6)。
进一步地，在菌株XH7B1和XH8B1基础上优化松脂素糖苷合成途径。分别转化pgRNA-II1和II1up-TPRM9-IiUGT71B2-PGAL10/1-IiUGT71B2-TLSC2-II1dw、pgRNA-II1和II1up-TPRM9-IiUGT71B2-PGAL10/1-IiUGT71B5a-TLSC2-II1dw于菌株XH7B1和XH8B1中，通过增加糖基转移酶Ugt的拷贝数，分别获得菌株XH13和XH14。
进一步地，使用上述(3)的方法发酵菌株XH13和XH14，且对发酵产物进行提取和检测。结果证明增加拷贝数的策略能显著增加松脂素糖苷的积累量，3拷贝IiUGT71B2的酵母菌株XH13松脂素单糖苷的产量可达到543.6μg/L，对比菌株XH7B1提高了7％；3拷贝IiUGT71B5a的酵母菌株XH14松脂素双糖苷的产量可达到459.2μg/L，对比菌株XH8B1显著提高了18％(图6)。
b.产直铁线莲宁B模块的构建和优化
在高产松脂素菌株RB69B2基础上构建直铁线莲宁B合成途径。分别转化pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-IiUGT71B2-TLSC2-XI3dw、pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-IiUGT71B5a-TLSC2-XI3dw、pgRNA-XI3和XI3up-TPRM5-IiPLR1OPT-PGAL10/1-IiUGT71B5b-TLSC2-XI3dw于菌株RB69B2中，筛选酿酒酵母中可用于生产直铁线莲宁B的关键酶，分别获得菌株XH4、XH5和XH6。
进一步地，在以20g/L葡萄糖为碳源的基础盐培养基中，接种XH4-XH6酵母菌株，进行发酵，初始接种OD600为0.1，发酵条件：装液量20/100mL，30℃，220rpm，发酵24h时添加100mg/L阿魏酸前体，总发酵时间为72～96h。
进一步地，使用上述(3)的方法对发酵产物进行提取和检测。结果证明携带IiUgt71b5b蛋白的酵母菌株XH6直铁线莲宁B的产量最高，为2.6μg/L(图7)。
进一步地，在菌株XH6基础上优化直铁线莲宁B合成途径。同时转化pgRNA-II1和II1up-TPRM9-IiUGT71B2-PGAL10/1-IiUGT71B5a-TLSC2-II1dw于菌株XH6中，通过增加糖基转移酶Ugt的拷贝数，获得菌株XH12。
进一步地，使用上述(3)的方法发酵菌株XH12，且对发酵产物进行提取和检测。结果证明增加拷贝数的策略能显著增加直铁线莲宁B的积累量，3拷贝IiUGT71B5b的酵母菌株XH12的直铁线莲宁B产量可达到61.8μg/L，对比菌株XH6显著提高了22.7倍(图7)。
进一步地，在菌株XH12基础上增加糖苷合成前体UDP-葡萄糖供应，优化直铁线莲宁B合成。同时转化pgRNA-XII5和XII5up-TCPS1-ScUGP1-PGAL10/1-ScPGM1-THIS5-XII5dw于菌株XH12中，经过表达ScPGM1和ScUGP1，获得菌株XH18。
进一步地，使用上述(3)的方法发酵菌株XH18，且对发酵产物进行提取和检测。结果证明增加糖苷合成前体UDP-葡萄糖供应的策略能显著增加直铁线莲宁B的积累量，酵母菌株XH18直铁线莲宁B的产量可达到133.8μg/L，对比菌株XH12显著提高了1.3倍(图7)。
实施例3：重组酿酒酵母发酵合成木脂素苷涉及的培养基、实验流程及基因信息
(1)培养基
YPD培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉；
SD培养基：20g/L葡萄糖，6.7g/L YNB，需要时添加必需的氨基酸成分(如组氨酸、尿嘧啶)；
发酵培养基(基础成分培养基)：(NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO4 14.4g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，加入约900mL ddH2O，调节pH为5.6，定容至950mL，115℃灭菌20min。灭菌后，补加1mL维生素溶液和2mL微量金属溶液，根据需要添加组氨酸和尿嘧啶(40mg/L)。向发酵培养基中添加葡萄糖到20g/L，用于酿酒酵母工程菌发酵。
微量金属溶液配置方法(1L溶液)：
编号 试剂 重量[g]
1 FeSO4·7H2O 3.0
2 ZnSO4·7H2O 4.5
3 CaCl2·2H2O 4.5
4 MnCl2·4H2O 1.03
5 CoCl2·6H2O 0.3
6 CuSO4·5H2O 0.3
7 Na2MoO4·2H2O 0.4
8 H3BO3 1.0
9 KI 0.1
10 Na2EDTA·2H20 19.0
维生素溶液配置方法(1L溶液)：
编号 名称 重量[g]
1 D-生物素 0.05
2 D-泛酸钙 1.0
3 硫胺 1.0
4 吡哆醇 1.0
5 烟酸 1.0
6 对氨基苯甲酸 0.2
7 肌醇 25.0
(2)实验流程及条件
将XH12，XH13和XH14菌株活化后，分别挑取单克隆菌落于3/15mL YPD培养基中，30℃，220rpm震荡培养16h；接种，将种子液用发酵培养基清洗2次，按初始OD600＝0.1接种于发酵培养基，装液量为20mL/100mL锥形瓶，30℃，220rpm条件下进行发酵72～96h。定点取样或者终点取样，用于生物量(以600nm处的吸光值表示)和木脂素苷产量分析。
(3)DNA操作及使用的基因
所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母CEN.PK113-11C基因组DNA或用质粒作为模板进行PCR扩增。对于经密码子优化的异源基因，使用合成片段(从SangonBiotech获得)或用质粒进行PCR扩增。对于未经密码子优化的异源基因，使用本实验室从植物cDNA中克隆并表征后获得的质粒进行PCR扩增。所有使用的基因都列在表3中。
表3基因名称及序列编号
注：ScOPT表明将基因按照酿酒酵母偏好性进行密码子优化，不含ScOPT表示未经酿酒酵母密码子优化。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌能够生产木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷；
以酿酒酵母为出发菌株进行基因改造，获得所合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌，所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种：
(1)整合CoAl模块；
(2)整合CoAl模块和Pin模块；
(3)整合CoAl模块、Pin模块和Lar模块；
(4)整合CoAl模块、Pin模块和UGT模块；
(5)整合CoAl模块、Pin模块、Lar模块和UGT模块；
其中，CoAl模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：酿酒酵母密码子优化过的毛果杨Populus trichocarpa 4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ptr4CL3、Ptr4CL5，酿酒酵母密码子优化过的菘蓝Isatis indigotica 4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ii4CL3，酿酒酵母密码子优化过的拟南芥Arabidopsis thaliana肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因AtCCR1，酿酒酵母密码子优化过的毛果杨P.trichocarpa肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因PtrCCR2，以及酵母内源醇脱氢酶Adh6的编码基因ScADH6；
Pin模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：酿酒酵母密码子优化过的谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum漆酶的编码基因CgL1，酿酒酵母密码子优化过的栓菌Trametes sp.C30漆酶Lac的编码基因TsLAC3，酿酒酵母密码子优化过的云芝Trametes versicolor漆酶Lac的编码基因TvLAC1和菘蓝I.indigotica指导蛋白Dir的编码基因IiDIR1、IiDIR2；
Lar模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：酿酒酵母密码子优化过的拟南芥A.thaliana松脂素还原酶Prr的编码基因AtPRR，酿酒酵母密码子优化过的菘蓝I.indigotica松脂素还原酶Plr的编码基因IiPLR1，酿酒酵母密码子优化过的桃儿七Sinopodophyllum hexandrum松脂素还原酶Plr的编码基因ShPLR；
UGT模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合：菘蓝I.indigotica糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b，以及酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1的编码基因ScPGM1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1的编码基因ScUGP1；
其中，酿酒酵母密码子优化过的Ptr4CL3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，酿酒酵母密码子优化过的Ptr4CL5核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，酿酒酵母密码子优化过的Ii4CL3核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，酿酒酵母密码子优化过的AtCCR1核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，酿酒酵母密码子优化过的PtrCCR2核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，ScADH6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，酿酒酵母密码子优化过的CgL1核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，酿酒酵母密码子优化过的trTsLAC3核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，酿酒酵母密码子优化过的TvLAC1核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，trIiDIR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，trIiDIR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，酿酒酵母密码子优化过的AtPRR核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，酿酒酵母密码子优化过的IiPLR1核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，酿酒酵母密码子优化过的ShPLR核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，IiUGT71B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，IiUGT71B5a的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，IiUGT71B5b的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，ScPGM1的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，ScUGP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
2.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，Pin模块的酶选自以下的组合：栓菌漆酶Lac的编码基因为N端截短22个氨基酸的漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3；菘蓝指导蛋白Dir1的编码基因为N端截短23个氨基酸的指导蛋白Dir1截短体的编码基因trIiDIR1；菘蓝指导蛋白Dir2的编码基因为N端截短28个氨基酸的指导蛋白Dir2截短体的编码基因trIiDIR2。
3.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，UGT模块中对菘蓝糖基转移酶IiUgt71B2、IiUgt71B5a、IiUgt71B5b采用3拷贝整合。
4.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种：
(a)整合CoAl模块时：增加1个拷贝的毛果杨4-香豆酸辅酶A连接酶4Cl的编码基因Ptr4CL5、毛果杨肉桂酰辅酶A还原酶Ccr的编码基因PtrCCR2，以及酵母内源醇脱氢酶Adh6的编码基因ScADH6；
(b)整合CoAl模块和Pin模块时：(a)的基础上，增加1个拷贝的N端截短22个氨基酸的栓菌漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3，分别和1个拷贝的N端截短23个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir1截短体的编码基因trIiDIR1的组合，及1个拷贝的N端截短28个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir2截短体的编码基因trIiDIR2的组合；
(c)整合CoAl模块、Pin模块和Lar模块时：(b)的基础上，增加1个拷贝的菘蓝松脂素还原酶Plr的编码基因IiPLR1；
(d)整合CoAl模块、Pin模块和UGT模块时：(b)的基础上，分别增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b；为提高松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的产量，在(d)的基础上，分别再增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b；
(e)整合CoAl模块、Pin模块、Lar模块和UGT模块时：(c)的基础上，增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5b；为提高直铁线莲宁B的产量，在(e)的基础上，增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5b，提高了模块的转化率；再增加1个拷贝的酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1的编码基因ScPGM1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1的编码基因ScUGP1组合，增强前体UDP-葡萄糖供应。
5.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述基因改造方式选自整合以下基因组合中的一种或几种：
(1)Ptr4CL3、AtCCR1、ScADH6组合，Ptr4CL3、PtrCCR2、ScADH6组合，Ptr4CL5、AtCCR1、ScADH6组合，Ptr4CL5、PtrCCR2、ScADH6组合，Ii4CL3、AtCCR1、ScADH6组合，Ii4CL3、PtrCCR2、ScADH6组合；导入位点均为XII1；
(2)CgL1基因，TsLAC3基因，TvLAC1基因，trTsLAC3和trIiDIR1组合，trTsLAC3和trIiDIR2组合；导入位点均为XII3；
(3)AtPRR基因，IiPLR1基因，ShPLR基因，IiUGT71B2基因，IiUGT71B5a基因，IiUGT71B5b基因，IiPLR1和IiUGT71B2组合，IiPLR1和IiUGT71B5a组合，IiPLR1和IiUGT71B5b组合；导入位点均为XI3；
(4)双拷贝的IiUGT71B2基因、IiUGT71B5a基因、IiUGT71B5b基因；导入位点均为II1；
(5)ScPGM1和ScUGP1组合；导入位点为XII5。
6.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，出发菌株选择表达Cas9蛋白且敲除GAL80基因的酿酒酵母，或经过基因改造后能合成丰富阿魏酸(FA)前体的酿酒酵母菌株。
7.一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌，采用权利要求1-6所述的构建方法得到，其特征在于，
选自以下任意一种工程菌：
(Ⅰ)通过CoAl模块构建基因工程菌RB57，松柏醇CoAl产量最高；
(Ⅱ)在(Ⅰ)的基因工程菌RB57中通过Pin模块构建，增加1个拷贝的N端截短22个氨基酸的栓菌漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3和N端截短23个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir1截短体的编码基因trIiDIR1的组合，获得基因工程菌RB69B1；增加1个拷贝的N端截短22个氨基酸的栓菌漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3和N端截短28个氨基酸的菘蓝指导蛋白Dir2截短体的编码基因trIiDIR2的组合，获得基因工程菌RB69B2；松脂素Pin产量最高；
(Ⅲ)在(Ⅱ)的基因工程菌RB69B1和RB69B2中通过Lar模块构建，增加1个拷贝的菘蓝松脂素还原酶Plr的编码基因IiPLR1，获得基因工程菌XH2B1和XH2B2；优选地，生产落叶松脂素Lar的工程菌为XH2B2；
(Ⅳ)在(Ⅲ)的基因工程菌XH2B2中通过UGT模块构建，分别增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b，分别获得基因工程菌XH4、XH5、XH6，优选地，生产直铁线莲宁B的工程菌为XH6；
(Ⅴ)在(Ⅳ)的基因工程菌XH6上增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71 B5b，获得基因工程菌XH12；
(Ⅵ)在(Ⅴ)的基因工程菌XH12上增加1个拷贝的酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶Pgm1的编码基因ScPGM1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶Ugp1的编码基因ScUGT1组合，获得基因工程菌XH18；
(Ⅶ)在(Ⅱ)的基因工程菌RB69B1和RB69B2中通过UGT模块构建，分别增加1个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2、IiUGT71B5a、IiUGT71B5b，分别获得基因工程菌XH7B1/2、XH8B1/2、XH9B1/2，优选地，生产松脂素单糖苷的工程菌为XH7B1，生产松脂素双糖苷的工程菌为XH8B1；
(Ⅷ)在(Ⅶ)的基因工程菌XH7B1上增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B2，获得基因工程菌XH13；在基因工程菌XH8B1上增加2个拷贝的菘蓝糖基转移酶Ugt的编码基因IiUGT71B5a，获得基因工程菌XH14。
8.权利要求1～6任一项所述方法得到的工程菌、权利要求7所述的工程菌在合成木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷中的应用。
9.一种木脂素苷的制备方法，其特征在于，发酵培养权利要求1～6任一项所述方法得到的工程菌、权利要求7所述的工程菌，并提取获得的木脂素苷；
培养发酵所述工程菌时，增加前体阿魏酸：将工程菌接种于含葡萄糖且添加阿魏酸的培养基A中，发酵得到所述木脂素苷，所述木脂素苷包括直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷。
10.根据权利要求9所述的一种木脂素苷的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖在所述培养基A中的含量为10～20g/L，阿魏酸在所述培养基A中的含量为50～300mg/L；
所述发酵工程菌条件包括：
温度为28～30℃；
转数为220～280rpm；
时间为72～96小时；
装液量15～20/100mL。
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