CN117844643A - 一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法 - Google Patents
一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法。属于生物技术领域。本发明将流感毒株甲型H1N1系、甲型H3N2系、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的血凝素HA1基因分别与人源IgG1‑Fc基因进行组合,构建成融合基因,再将含有融合基因的小球藻进行高密度发酵、蛋白的提取与纯化,获得融合蛋白。本发明降低了重组流感疫苗的生产成本,提高了外源基因的表达量。将4种流感毒株的HA1基因分别与人源IgG1‑Fc基因整合到小球藻基因组中,证实了串联重组流感血凝素HA1基因可在小球藻中高效表达,证实了融合蛋白具有良好的免疫原性,可激发机体产生高水平的中和抗体,应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体的说是涉及一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法。
背景技术
流行性感冒病毒(简称流感),是一种全球性传染病,人群普遍易感,传播力强。每年会造成300万~500万人感染,29万~65万人死亡。目前,接种流感疫苗仍然是保护机体免受侵害、预防流感以及降低流感并发症的有效的防御机制。目前,国内外流感疫苗生产方式主要源于鸡胚基质,但由于其生产条件的局限性,如缺乏灵活性、依赖鸡胚供应、存在污染风险及鸡胚适应性病毒突变等,越来越多的药企开始着手研究新的流感疫苗的生产方式或表达***,如基于昆虫细胞杆状病毒***生产重组流感亚单位疫苗、mRNA流感疫苗和基于细胞基质(MDCK、Vero)生产流感疫苗等等。任何药物成分的生产方式,尤其是疫苗,都必须对需求的突然增加做出快速的反应。微藻目前被认为是最具潜力、最能实现可持续供给的生物质资源之一。微藻表达***具有较低的制造成本,可以快速调整,同时企业不需要昂贵的发酵设备来生产,也不需要建造扩大生产的重复设施。相对于以上几种表达***而言,微藻生产平台越来越受欢迎,这是因为微藻表达***生产成本较低,易繁殖培养,适宜规模化培养,可扩展性好,同时保持比细胞培养更低的生产成本,避免可能的哺乳动物病原体污染问题,表达的重组蛋白活性高,具有真核***转录后加工以及翻译后加工的功能,能够表达高活性的功能蛋白。
血凝素HA蛋白是流感病毒的关键免疫原,具有凝集红细胞的能力。流感病毒的HA蛋白能够诱导机体产生中和抗体,是疫苗研发的首选靶向蛋白,HA基因由重链HA1和轻链HA2两部分组成,其中HA1有4个抗原决定簇,相较于HA2,HA1结构域具有更高的抗原性和免疫原性。同时位于HA1上的受体结构域是相对保守的结构且可以产生针对流感病毒的特异性中和抗体。
鉴于此,开发一种基于微藻表达***的易于放大生产、成本低的特点,以转基因小球藻为媒介制备重组流感疫苗的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法。
将流感毒株H1N1、H3N2、B Victoria Lineage、B Yamagata Lineage毒株的HA基因中的HA1基因和人源IgG1-Fc基因通过Linker序列串联连接,然后***到小球藻表达载体中,转染小球藻。再将表达融合蛋白的小球藻经三级高密度发酵得到高表达量的融合蛋白,经过蛋白的提取与纯化后,得到高纯度的融合蛋白,可诱导金黄地鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫。
本发明第一个目的是提供一种基于转基因小球藻基质来源生产的重组流感疫苗的重组载体构建方法;第二个目的是提供一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法。
所述重组流感疫苗的制备方法,包括转基因小球藻的构建、重组工程藻种高密度发酵、融合蛋白的制备、产朊假丝酵母菌微囊的制备、重组流感疫苗半成品的制备和重组流感疫苗成品的制备。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明第一个目的是提供一种基于转基因小球藻基质来源生产的重组流感疫苗的重组载体构建方法。
本发明采用Crispr/cas9方法敲除小球藻的fad3基因,将甲型H1N1系、甲型H3N2系、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的4种流感毒株的血凝素HA1基因分别和人源IgG1-Fc基因进行组合,构建成融合基因,然后整合到小球藻基因组fad3敲除点上。
(1)重组载体的构建
融合基因从N端到C段依次包括三种组合方式:其一为:血凝素HA1基因、血凝素HA1基因和人源IgG1-Fc基因;其二为:人源IgG1-Fc基因、血凝素HA1基因和血凝素HA1基因;其三为血凝素HA1基因、人源IgG1-Fc基因和血凝素HA1基因,其中基因之间通过linker序列连接。
A1、融合基因表达盒的构建
流感毒株H1N1(简称H1)、H3N2(简称H3)、B Victoria Lineage(简称BV)和BYamagata Lineage(简称BY);分别将流感毒株H1、流感毒株H3、流感毒株BV和流感毒株BY的四个类型的毒株的HA1血凝素基因分别与人源IgG1-Fc基因(简称Fc基因)进行组合,使其构成融合基因,所述融合基因的上游添加5’端同源臂(Up区域),融合基因的下游添加3’端同源臂(Down区域),以串联的方式连接到pET-28a(+)载体上,重组载体融合基因组合方式见表1。
本发明以小球藻基因组DNA为模版,通过PCR方式扩增同源臂,其中5’端同源臂(Up区域,引物分别为Up-F和Up-R,序列特征为SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.29)和3’端同源臂(Down区域,引物分别为Down-F和Down-R,序列特征为SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.31),引物序列见表2。
重组载体pET-28a(+)-CZ包括三种组合形式:pET-28a(+)-CZ-1、pET-28a(+)-CZ-2和pET-28a(+)-CZ-3。
所述重组载体pET-28a(+)-CZ-1上的目的基因表达框由上游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位点Up区域)、CaMV 35S启动子、HA1-HA1-Fc基因和NOS终止子、下游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位点Down区域)顺序连接到pET-28a(+)载体上,其中目的基因表达盒中血凝素HA1基因与血凝素HA1基因与Fc基因之间均通过linker序列串联组合连接。linker序列为(EAAAK)3;目的基因的表达框5’端连接载体上的Xho1酶切位点,目的基因表达框的3’端连接载体上的EcoR1酶切位点,形成重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H1)-HA1(H1)-Fc、pET-28a(+)-HA1(H3)-HA1(H3)-Fc、pET-28a(+)-HA1(BV)-HA1(BV)-Fc、pET-28a(+)-HA1(BY)-HA1(BY)-Fc。
所述重组载体pET-28a(+)-CZ-2上的目的基因表达框由上游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位点Up区域)、CaMV 35S启动子、Fc-HA1-HA1基因和NOS终止子、下游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位点Down区域)顺序连接到pET-28a(+)载体上,其中目的基因表达盒中Fc基因、血凝素HA1基因和血凝素HA1基因之间均通过linker序列串联组合连接,其中linker序列如SEQ ID NO.32所示;目的基因的表达框5’端连接载体上的Xho1酶切位点,目的基因表达框的3’端连接载体上的EcoR1酶切位点,形成重组表达载体pET-28a(+)-Fc-HA1(H1)-HA1(H1)、pET-28a(+)-Fc-HA1(H3)-HA1(H3)、pET-28a(+)-Fc-HA1(BV)-HA1(BV)、pET-28a(+)-Fc-HA1(BY)-HA1(BY)。
所述重组载体pET-28a(+)-CZ-3上的目的基因表达框由上游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位点Up区域)、CaMV 35S启动子、HA1-Fc-HA1基因和NOS终止子、下游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位点Down区域)顺序连接到pET-28a(+)载体上,其中目的基因表达盒中血凝素HA1基因、Fc基因和血凝素HA1基因之间均通过linker序列串联组合连接,其中linker序列为(EAAAK)3;目的基因的表达框5’端连接载体上的Xho1酶切位点,目的基因表达框的3’端连接载体上的EcoR1酶切位点,形成重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H1)-Fc-HA1(H1)、pET-28a(+)-HA1(H3)-Fc-HA1(H3)、pET-28a(+)-HA1(BV)-Fc-HA1(BV)、pET-28a(+)-HA1(BY)-Fc-HA1(BY)。
A2、sgRNA的设计
选取小球藻基因组fad3基因(GenBank:KX100035.1)进行基因敲除,分别在fad3基因上设计SgRNA,其中SgRNA基因表达框片段结构为:(1)SgRNA-fad3-1(一个敲除位点)、(2)SgRNA-fad3-2(一个敲除位点)、(3)SgRNA-fad3-3(一个敲除位点)、(4)SgRNA-fad3-12(两个敲除位点)、(5)SgRNA-fad3-13(两个敲除位点)、(6)SgRNA-fad3-23(两个敲除位点)、(7)SgRNA-fad3-123(三个敲除位点)。
其中SgRNA-fad3-1基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator结构模式;将待合成的SgRNA-1靶序列核苷酸(序列特征为SgRNA-1-F SEQ IDNo.33;SgRNA-1-R SEQ ID No.34,见表3),进行退火形成双链,合成的双链靶序列;然后再分别与OsU3启动子、gRNA scaffold和Terminator连接。
其中SgRNA-fad3-2基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator结构模式;将待合成的SgRNA-2靶序列核苷酸(序列特征为SgRNA-2-F SEQ IDNo.35;SgRNA-2-R SEQ ID No.36,见表3)进行退火形成双链,合成的双链靶序列;然后再分别与OsU3启动子、gRNA scaffold和Terminator连接。
其中SgRNA-fad3-3基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator结构模式;其中合成的SgRNA-3靶序列核苷酸(序列特征为SgRNA-3-F SEQ IDNo.37;SgRNA-3-R SEQ ID No.38,见表3),进行退火形成双链,合成的双链靶序列;然后再分别与OsU3启动子、gRNA scaffold和Terminator连接。
其中SgRNA-fad3-12基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator结构模式;将SgRNA-fad3-12基因表达框分成两部分(片段A和片段B)构建,其中片段A部分为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator;其中片段B为OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator,片段A和片段B通过golden gate拼接技术连接。
其中SgRNA-fad3-13基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator结构模式;将SgRNA-fad3-13基因表达框分成两部分(片段A和片段C)构建,其中片段A部分为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator;其中片段C为OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator,片段A和片段C通过golden gate拼接技术连接。
其中SgRNA-fad3-23基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator结构模式;将SgRNA-fad3-23基因表达框分成两部分(片段B和片段C)构建,其中片段B部分为OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator;其中片段C为OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator,片段B和片段C通过golden gate拼接技术连接。
其中SgRNA-fad3-123基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator结构模式;将SgRNA-fad3-123基因表达框分成三部分(片段A、片段B和片段C)构建,其中片段A部分为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator;片段B部分为OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator;其中片段C为OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator,其中片段A、片段B和片段C通过golden gate拼接技术连接。
SgRNA靶序列引物退火PCR反应体系:上游引物1~6μL、下游引物1~6μL,引物序列表见表3;PCR反应程序:80~95℃,变性5~10min,然后再25℃退火反应30~90min。
A3、重组载体的构建与验证
用限制性内切酶AflII和BstEII酶切pKSE401载体,使pKSE401载体呈线性化骨架。将pKSE401线性化载体与sgRNA基因表达框片段连接,使重组载体分别形成pKSE401-SgRNA-fad3-1、pKSE401-SgRNA-fad3-2、pKSE401-SgRNA-fad3-3、pKSE401-SgRNA-fad3-12、pKSE401-SgRNA-fad3-13、pKSE401-SgRNA-fad3-23和pKSE401-SgRNA-fad3-123的结构。
连接反应体系为:pKSE401线性化载体0.05~15μg、退火sgRNA基因表达框片段0.02~8μL、T4 DNA Ligase 0.02~2μL、10×T4 DNA Ligase Buffer 0.02~2μL、用双蒸水补足至20~30μL;PCR反应程序:4~25℃反应2~18h。
所述重组载体pKSE401-CZ可形式三种模式:其一,形成重组载体分别含有一个sgRNA表达框的重组载体(pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-1、pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-2、pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-3);其二,形成重组载体分别含有两个sgRNA表达框的重组载体(pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-12、pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-13、pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-23);其三,形成重组载体同时含有三个sgRNA表达框的重组载体(pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-123),其中鉴定引物序列表见表3(序列特征为JD-F SEQ ID NO.39和JD-R SEQ ID NO.40),将构建的重组载体送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
本发明第二个目的是提供一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法。
将构建的转基因小球藻经高密度发酵、蛋白的提取与纯化,得到含有流感甲型H1N1系、甲型H3N2系、乙型Yamagata系和乙型Victoria系毒株的HA1基因和人源IgG1-Fc基因的融合蛋白,将融合蛋白与产朊假丝酵母菌微囊佐剂混合得半成品,经检验合格后即得重组流感亚单位疫苗成品。
(2)转基因小球藻的构建
B1、小球藻感受态细胞的制备
1)产酶菌的发酵
从-80℃超低温冰箱中取出工作库的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉),待取出保存的菌种融化后,分别接种至含有复苏培养基的试管斜面进行活化复苏培养。里氏木霉菌种和黑曲霉菌种培养温度22~30℃,培养48~96h;枯草芽孢杆菌的培养温度为30~40℃,培养24~72h。
里氏木霉菌种和黑曲霉菌种复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:0.5~2%胰蛋白胨、1~3%木糖醇、0.2~1%赖氨酸、0.02~0.5%磷酸氢二钾,1.5~2%琼脂,pH6.8~7.2。
枯草芽孢杆菌复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:0.05~3%可溶性淀粉、1~2%花生肽、0.5~2%精氨酸、0.001~0.01%硫酸镁、0.1~1%酪氨酸,1.5~2%琼脂,pH6.8~7.2。
待产酶菌培养结束后用无菌水分别洗下试管斜面的里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的菌体,分别制备成孢子悬液或菌悬液。使里氏木霉菌种和黑曲霉菌种的孢子悬液孢子数控制在5×106~2.5×108个/ml,使枯草芽孢杆菌的菌悬液含菌数量控制在1×108~5×109个/ml。
将里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的孢子悬液或菌悬液按照体积比0.2~3:0.1~4:0.1~3的比例混合制备成混合菌悬液。按照体积比0.1~6%的比例接种至摇瓶培养基,500ml摇瓶摇瓶培养基的装液量为100~300ml,于22~40℃,100~150r/min条件下,培养48~120h。
摇瓶培养基配方,具体为,按质量分数计:1~2%米糠、0.5~5%白糖、1~3%花生肽、0.02~0.5%磷酸氢二钾,pH6.8~7.2。
使用的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉)部分内控指标需满足表4。
2)酶解液的制备
待菌种发酵结束后,将上述混合菌发酵液,于4~25℃,5000~12000r/min,离心20~40min,上清液过0.22~0.45μm的PES滤膜,即得到酶解液。
3)原生质体的制备
从-80℃超低温冰箱中取出5~10ml冻存的小球藻藻种,待藻种融化后,于15~22℃,500~2000r/min,离心5~20min,弃掉上清液,用5~30ml新鲜的藻种复苏培养基进行重悬,再轻轻颠倒混匀5~10次,即得到藻悬液;按体积比吸取1~10%的藻悬液接种至30~300ml新鲜的藻种复苏培养基中,15~25℃培养96~240h时结束培养,并于15~22℃,500~2000r/min,离心5~20min,弃掉上清液,收集藻细胞沉淀物;用新鲜的藻种复苏培养基洗涤沉淀2~5次;将酶解液、新鲜的藻种复苏培养基和小球藻藻细胞沉淀物按照体积比0.5~3:5~20:0.2~1的比例进行涡旋混匀,在28~45℃,90~180r/min下酶解20~100min,酶解结束后于15~22℃,500~10000r/min离心5~20min,将酶解后的沉淀物用无菌水置换洗涤2~6次,将酶解后的藻细胞数控制在5×105~7×109个/ml,将得到的小球藻原生质体分装后于4℃保存备用。
所述藻种复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:1~3%麦芽糖、0.5~5%L-精氨酸、2~7%椰子活性肽、0.5~2%山梨醇、0.03~0.2%磷酸氢二钾、0.01~0.1%磷酸二氢钾,pH 6.8~7.2。
所述椰子活性肽的制备方法:刮下废弃椰壳内的椰肉蛋白,称取5~30g粉碎的椰肉蛋白,与5~20mmol/L的PBST缓冲液(pH5.8~8.0),按照质量体积比3~10:20~100比例混合;然后将上述混合物于4℃,搅拌粉碎10~30min,将椰肉蛋白匀浆调节pH至5.8~7.5,将质量比0.01~5%的复合蛋白酶添加到椰肉蛋白溶液中(E/S,以底物重量计),其中胰蛋白酶和风味蛋白酶按质量比1~5:0.1~3混合,于25~55℃酶解反应0.5~3h,然后将酶解液置于85~95℃,灭酶处理5~20min,再将处理液于4℃,1000~12000r/min,离心5~40min,收集上清液,过5~14Kd的透析袋,用去离子水透析24~60h后,将透析液冷冻干燥,即为椰子活性肽。
B2、小球藻的电转染
取30~100ml培养至小球藻密度(5×105~7×109个/ml)的藻细胞原生质体,于4℃,1000~8000r/min离心5~30min,弃掉上清液,用10~50ml电转缓冲液重悬4~6次,静置10~30min。再于4℃条件下,1000~8000r/min离心5~10min,收集藻体后加入3~5ml电转缓冲液重悬,在100~1000μL藻细胞中加入1~50μg的pET-28a(+)-CZ载体和1~60μg的pKSE401-CZ载体并置于电转杯内,于冰上或25℃静置10~30min。经电转后迅速将藻细胞涂布于SX培养基上,于15~25℃培养静置培养4~14天。从平板上挑取10~30个小球藻藻细胞单克隆于SX培养基平板上三区划线,然后继续培养至形成单克隆藻种,然后将单克隆藻种接种至藻种复苏培养基上,于15~25℃,培养4~14天。
SX培养基配方,具体为,按质量分数计:1~3%乳糖、0.5~5%L-精氨酸、1~3%糖蜜、2~7%L-苯丙氨酸、0.01~0.1%磷酸氢二钾、0.01~0.05%磷酸二氢钾、1.5~2%琼脂粉,25~150μg/ml G418,pH 6.8~7.2。
电转缓冲液配方,具体为,按质量分数计:0.5~1%乳糖、0.02~5%山梨醇、0.01~0.5%氯化镁、0.02~0.1%氯化钙、0.03~1%L-异亮氨酸,pH 6.5~7.5。
电转反应条件为:电压250~500V,电阻10~280Ω,电容20~30μF。
B3、转基因小球藻藻细胞悬液的制备与目的基因的鉴定
(1)转基因小球藻藻细胞悬液的制备
1)先将无菌的96孔板中加入电转染用的藻细胞SX养基;其中96孔板第一列中分别加入50~90μL复苏培养基,剩余各列分别加入10~50μL复苏培养基,然后在96孔板第一列加入5~10μL的藻细胞液,移液器吹吸混匀,并作梯度稀释,将藻细胞液进行梯度倍比稀释。
2)将稀释后的含有单细胞藻种的96孔板盖上盖子后用3M胶带封口,并至于光照培养箱中培养。藻细胞培养参数设定为:温度20~27℃,光照周期6~12L:6~12D,光照强度60~120μmol/(m2·s)。
3)将96孔板中的藻种静置培养5~20天,并定期观察,待培养结束后吸出孔中藻细胞悬液,用于后续藻种扩增培养。
(2)转基因小球藻目的基因的鉴定
吸取藻细胞悬液,提取转基因小球藻基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否存在;以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-1~ZY-12)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性2~5min;98℃变性5~10s,57℃退火10~15s,72℃延伸30~50s,30个循环;72℃终延伸10~15min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用,对鉴定合格的小球藻进行后续活性鉴定试验。
B4、转基因小球藻活性鉴定
1)目的基因传代稳定性验证
随机挑取一组分选符合要求的藻种单细胞悬液,使其于20~27℃悬浮培养至藻细胞密度5×107个/ml,然后进行藻种细胞纯化培养:将藻细胞悬液在筛选培养平板(SX培养基)上稀释涂布,于15~25℃静置培养4~7天,用无菌接种环刮取平板上的单藻细胞团,在250~500ml茄形瓶SX培养基表面上均匀划线培养,于25℃静置培养4~7天;继续进行连续传代培养至第3~6代后,用20~200ml无菌水洗下第3~6代的茄瓶中SX培养基上的藻细胞,提取藻细胞基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否传代稳定。
以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-1~ZY-12)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性2~5min;98℃变性5~10s,57℃退火10~15s,72℃延伸30~50s,30个循环;72℃终延伸10~15min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用,对鉴定合格的小球藻进行后续试验。
2)转基因小球藻中融合蛋白的提取
取50~200ml培养至细胞密度5×105~7×109个/ml的转基因小球藻藻细胞发酵液,将其置于4~25℃条件下,1000~10000r/min离心15~40min,弃上清,即可制备成小球藻藻泥;采用5~20mmol/L的PBST缓冲液(pH5.8~8.0)重悬小球藻藻泥3~4次,得到藻细胞悬液;将藻细胞悬液进行超声破碎,每超声6~8秒,间隔3~5秒,超声破碎处理15~40个循环,然后置于4~25℃条件下,1000~10000r/min离心15~40min,上清液即为融合蛋白样品,制备的融合蛋白需满足表4的样品部分内控指标。
B5、转基因小球藻的保存
将符合要求的转基因小球藻进行高密度发酵,待发酵结束后收集转基因小球藻发酵液,并置于4℃条件下,500~5000r/min离心5~20min,得到小球藻藻泥;用2~5倍体积的无菌水重悬藻泥2~5次,得到藻悬液;并置于4℃条件下,500~5000r/min离心5~20min,再次离心后弃掉上清,用1~3倍体积的保护剂稀释藻细胞沉淀,使藻细胞密度控制为0.5×108~10×109个/ml,置于-80℃超低温冰箱内保存,并建立转基因小球藻主种子库,主种子库转基因小球藻经连续培养传代至第6~15代即为转基因小球藻工作库藻种,其保存方式同主种子库。
保护剂原料组分为:0.2~1%的葡萄糖、1~5%的甘油、0.05~0.5%甘露醇,pH为6.0~7.5。
(3)重组工程藻种高密度发酵
C1、转基因小球藻的复苏
从-80℃超低温冰箱中取出工作库第6~15代转基因小球藻藻种,待藻种解冻后,用接种环蘸取少量的藻种液,在含有复苏培养基的茄形瓶上均匀划线,置于20~27℃,静置培养5~12天。
藻种复苏培养参数设定为:培养温度20~27℃,光照周期6~12L:6~12D,光照强度200~5000lx。
小球藻的复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:1~3%麦芽糖、0.5~5%L-精氨酸、1~3%葡萄糖、2~7%椰子活性肽、0.03~0.2%磷酸氢二钾、0.01~0.1%磷酸二氢钾,pH 6.8~7.2。
C2、转基因小球藻的一级种子培养
将50~150ml的一级种子培养基(不含琼脂)加到茄形瓶中,用细胞刮铲刮下茄形瓶琼脂(1.5~2%)表面的藻种细胞,将转基因小球藻的藻液混匀后,分装至50~150ml离心杯中,15~25℃,500~1500r/min离心5~30min,弃掉上清液,用50~150ml的一级种子培养基(不含琼脂)再次重悬离心杯中的藻泥,将制备成的藻悬液按照体积比0.5~10%的比例接种至500~5000ml细胞培养瓶(含一级种子培养基(不含琼脂))中进行培养,每2~5h摇动1~5次,置于20~27℃培养5~10天时结束,即为一级藻种。
转基因小球藻的一级培养参数设定为:光照周期6~12L:6~12D,光照强度200~6000lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照1~2:0.5~1:1~2。
转基因小球藻的一级种子培养基配方,具体为,按质量分数计:5~30%甘蔗渣酶解物,10~60%蚕豆蛋白生物活性肽,0.03~0.2%磷酸二氢钾,0.01~0.1%磷酸二氢钾,1.5~2%琼脂,pH 6.8~7.2。
甘蔗渣酶解物制备方法:以甘蔗渣为原料,称取50~100g甘蔗渣,将其粉碎后过10~80目筛网,将过筛后的甘蔗渣与无菌水按固液质量体积比0.5~5:10~60置于500~1000ml的蜀牛玻璃瓶内,于4~55℃条件下浸泡5~24h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入100~300ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至5.0~8.5,按质量比0.01~5%的比例将复合粗酶粉(E/S,以底物重量计)加入到甘蔗渣混合液中,于25~60℃,120~180r/min,酶解反应20~300min,待反应结束后抽滤去除甘蔗残渣获得酶解液,将滤液至于80~100℃灭酶处理3~20min,将滤液进行冷冻干燥,即为甘蔗渣酶解物。
复合酶粉的制备:将-80℃超低温冰箱冻存的3株无溶血性的微生物甘油菌种(拟康宁木霉、草酸青霉和哈茨木霉,其中菌种部分内控标准见表4)分别按照0.1~5:0.1~3:5~10的比例混合,并按0.3~30%的体积比接种至250~1000ml的固体产酶培养基中,于25~35℃,静置培养5~10天,待菌种孢子长满固体基质后,于40~75℃下烘干,粉碎至60~300目。
固体产酶培养基的制备:将大麦种子和黄豆种子浸泡水中8~36h,然后将大麦种子和黄豆种子沥干水至无水流出,使大麦种子和黄豆种子的含水量控制在40~75%,然后装入玻璃瓶内,然后于115℃,灭菌30~150min。
蚕豆蛋白生物活性肽的制备:
以蚕豆为原料,称取5~200g蚕豆,将其粉碎后过10~100目筛网,将过筛后的蚕豆渣与无菌水按固液质量体积比0.5~10:10~80置于250~1000ml的蜀牛玻璃瓶内,于4~35℃条件下浸泡1~5h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入80~300ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至7.0,先加入质量比0.1~7%的中性蛋白酶(E/S,以底物重量计)加到蚕豆渣混合液中,于22~55℃,100~220r/min,酶解反应30~180min,反应结束后进行灭酶处理(85~100℃,混合液煮沸2~10min),然后将溶液的pH调节6.0~7.0;再加入质量比0.1~7%的风味蛋白酶(E/S,以底物重量计),于22~55℃,120~220r/min,酶解反应40~200min,反应结束后进行灭酶处理(85~100℃,混合液煮沸2~10min),水解结束后将滤液于200~8000r/min,离心5~15min,取上清液冷冻干燥12~72h,即为蚕豆蛋白生物活性肽。
C3、转基因小球藻的二级发酵培养
将一级藻种按体积0.1~30%的比接种至5~10L二级藻种发酵培养基中,每2~5h摇动1~5次,置于20~27℃培养7~18天时结束,即为二级藻种。
转基因小球藻的二级培养参数设定为:光照周期6~12L:6~12D,光照强度10000~20000lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照1~2:0.5~1:1~2。
转基因小球藻的二级藻种发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:25~40%甘蔗渣酶解物,30~60%蚕豆蛋白生物活性肽,0.1~0.5%磷酸二氢钾,0.2~1%磷酸二氢钾,pH 6.8~7.2。
C4、转基因小球藻的三级发酵培养
采用150L封闭式生物反应器对转基因小球藻进行高密度发酵。封闭式生物反应器参数:罐体装液量控制在45~90L,转基因小球藻的细胞接种密度控制在5×105~7×109个/ml,藻种接种量按罐体装液量10~25%的比例接种至封闭式生物反应器中,采用22~27℃培养96~120h,待培养结束后以2.5~4ml/h/L流速流加罐体装液量体积的0.1~2%的外源营养液,再然后将发酵培养温度调到15~21℃继续培养50~240h。
外源营养液配方,具体为,按质量分数计:0.1~1%糊精、0.5~3%蛋氨酸,pH 5~7.2。
转基因小球藻的三级发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:40~60%甘蔗渣酶解物,55~78%蚕豆蛋白生物活性肽,0.03~0.2%磷酸二氢钾,0.01~2%磷酸二氢钾,pH 6.8~7.2。
(4)融合蛋白的制备
D1、融合蛋白粗提液的制备
将收集的转基因小球藻发酵液置于4~25℃条件下,1000~10000r/min离心15~40min,制备成小球藻藻泥;采用5~20mmol/L的PBST缓冲液(pH5.0~8.0)重悬小球藻藻泥3~4次,得到藻悬液。
将藻悬液用高速匀浆机处理,处理条件:5000~15000r/min匀浆,温度4~15℃,用5~50mmol/L的PBST缓冲液(pH5.0~8.0)将藻细胞稀释至小球藻藻细胞密度9×108~2.5×1010个/ml,间歇匀浆4~6次,每次匀浆5~40min,将匀浆后的藻液,置于4~15℃条件下,300~10000r/min离心5~20min,弃掉沉淀,收集上清,即为融合蛋白粗提液。
D2、融合蛋白的纯化
将制备的融合蛋白粗提液用0.1~1μm的囊氏滤器进行过滤,将样品滤液用10~300Kd的中空纤维柱浓缩3~20倍,用缓冲液(5~50mmol/L PBST,5~10mmol/L精氨酸,pH 5.0~8.0)洗滤2~10次,即为融合蛋白置换液。
采用Rigose MabpureA填料对上述融合蛋白置换液进行第一步纯化。上纯化柱之前,使用0.22μm的PVDF滤膜对样品过滤处理。使用平衡缓冲液(5~50mmol/L PBST,5~10mmol/L精氨酸,pH 5.0~8.0)进行上样品,上样时纯化柱子温度控制在4~15℃,使用洗脱缓冲液(5~10mmol/L柠檬酸钠缓冲液,5~10mmol/L精氨酸,pH 3.0~3.5)进行恒定洗脱,洗脱时纯化柱子的温度控制在16~27℃,收集洗脱的蛋白纯化样,并将洗脱的蛋白纯化样调节至pH 5.0~8.0,即为融合蛋白(初纯液)。
采用Superose 12 Prep Grade填料对上述融合蛋白(初纯液)进行二次纯化,层析柱温度控制在4~15℃,使用平衡缓冲液(5~50mmol/L PBST,120mm NaCl,pH 5.0~8.0)进行纯化,收集的目标蛋白即为融合蛋白(精纯液)。
各纯化步骤样品需满足以下内控指标,如表5所示。
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(5)产朊假丝酵母菌微囊的制备
取10~40ml的产朊假丝酵母菌液(菌体密度控制在1×105~3×107个/ml),于4~15℃条件下2000~10000r/min离心5~30min弃掉上清,再用50~300ml无菌去离子水反复重悬菌体沉淀3~5次。
将离心的沉淀分散到pH 9.0~10的组氨酸和氢氧化钠缓冲溶液中,在4~65℃条件下磁力搅拌0.5~1.5h,4000~10000r/min离心5~20min,弃掉上清,用50~300ml无菌去离子水重悬洗涤5~8次。
用柠檬酸或HCl将溶液调节pH至4.5~5.5,在4~50℃条件下磁力搅拌0.5~1.5h,4000~10000r/min离心5~20min,弃掉上清,用50~300ml无菌去离子水重悬洗涤5~8次。
将沉淀至于10~50ml异丙醇和丙酮混合液中,其中异丙醇和丙酮的体积比为0.01~1:0.01~1,重悬洗涤3~5次,沉淀物真空冷冻干燥36~60小时。
(6)重组流感疫苗半成品的制备
以产朊假丝酵母菌微囊为疫苗佐剂,将产朊假丝酵母菌微囊和融合蛋白(精纯液)按质量体积比0.5~10:10~200混合,于4~15℃条件下,80~150r/min搅拌混合2~5h,然后置于离心机上5000~10000r/min离心10~20min,获得的沉淀物真空冷冻干燥为冻干粉,即为重组流感疫苗半成品。
(7)重组流感疫苗成品的制备
将上述重组流感疫苗半成品、碳酸氢钠(抗酸调节剂)和麦胚凝集素(生物黏附材料)按质量比20~300:0.05~0.2:0.1~0.5混合,压制成微丸;使制备的微丸颗粒每粒控制在0.1g,即为重组流感疫苗成品。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明取得的有益效果为:
1.本发明以小球藻为基质高效串联表达了四种流感毒株(H1N1、H3N2、B VictoriaLineage和B Yamagata Lineage)的血凝素HA1基因和人源IgG1-Fc基因构成的融合蛋白。
2.本发明采用光照自养培养方式进行小球藻藻种扩增,利用外源营养物质为能源物质,通过异养发酵方式高效表达融合蛋白。
3.本发明以串联方式表达含有流感血凝素HA1的重组蛋白,增加了目标蛋白的抗原表位,提高了抗原效价。
4.本发明采用混合菌种组合(里氏木霉、黑曲霉和枯草芽孢杆菌)发酵的方式制备含纤维素、半纤维素和果胶酶的酶液,达到高效制备小球藻原生质体的目的。
5.本发明与直接口服的转基因小球藻相比,纯化的转基因小球藻的抗原含量高,且安全性强。
6.本发明在藻种高密度发酵阶段通过光诱导胁迫提高了转基因小球藻藻细胞光合效率,促进藻细胞生长繁殖。
7.本发明利用转基因小球藻作为生物反应器生产流感疫苗,制备的融合蛋白不需要灭活处理,获得的融合蛋白纯化表达产物的程序和操作相对简单。
8.本发明以废弃椰壳为原料,提取椰子活性肽,实现了废弃物的资源化利用。
9.本发明采用多表位基因的串联方式可有效改善单个基因表位免疫原性弱,易降解的弱点,也能够避免引入表位载体带来的不确定影响。
10.本发明以小球藻作为外源基因转化宿主表达融合蛋白的媒介,小球藻表达***可以对目的蛋白进行高水平的翻译后修饰,而且具有相应的免疫原性。
11.本发明利用Crispr/Cas9技术能够高效便捷地在小球藻藻细胞中实现一个基因多位点同时敲除的策略,提高了基因编辑的效率,大大缩短实验周期,可提高疫苗生产效率。
12.本发明以甘蔗渣为藻种发酵原料之一,实现了废弃物的资源化利用,达到低成本高效生产流感疫苗的目的。
13.本发明在转基因小球藻发酵阶段,采用外源营养物质流加方式补料,既补充了营养物质提高了藻种细胞的蛋白表达量,又降低了发酵代谢产物对藻种细胞生长的抑制作用。
14.本发明使用的转基因小球藻可通过光合作用捕获和固定大气中的二氧化碳,并将其转化为生物能,不仅实现碳中和,还能降低流感疫苗药物的生产成本。
15.本发明使用的微生物菌种(拟康宁木霉、草酸青霉和哈茨木霉)均无拮抗作用,无溶血活性,保证了在流感疫苗在生产环节中产品和生产人员的安全性。
16.本发明以产朊假丝酵母菌为原料,高效制备产朊假丝酵母菌微囊,利用产朊假丝酵母菌微囊的高靶向性将抗原蛋白递送至免疫细胞处,从而提高药物的利用度。
17.本发明基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗产品,其产品以微丸的形式包装,通过口服方式给药,微丸给药后黏附在特定黏膜部位,延长药物与黏膜的接触时间,可促进药物的有效吸收,提高疫苗产品生物利用度。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为从商业渠道购买得到的。
本发明使用的小球藻精华液A30KY(货号:08467),购自福斯特生物科技(泰州)有限公司,现在保存于天津市北辰区高新大道86号 中逸安科生物技术股份有限公司研发中心,编号ZY.604。
本发明使用的载体pET-28a(+)(货号:11905ES03),购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,使用的载体pKSE401(货号:#62202),购自addgene。
本发明使用的微生物菌种:拟康宁木霉bio-088477,购自北京百欧博伟生物技术有限公司;草酸青霉BNCC364478、哈茨木霉BNCC336568、里氏木霉BNCC337997、黑曲霉BNCC186380和产朊假丝酵母BNCC336674,购自北京北纳创联生物技术研究院;枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501,购自北京三药科技开发公司,上述菌种现均保存于天津市北辰区高新大道86号 中逸安科生物技术股份有限公司研发中心。
本发明使用的纯化填料Rigose MabpureA填料,购自嘉兴千纯生物科技有限公司。
本发明使用的纯化填料Superose 12 Prep Grade填料,购自格来赛生命科技(上海)有限公司。
本发明使用的金黄地鼠(LVG Hamster),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
本发明使用的流感毒株:甲型H1N1系(A/West Virginia/30/2022),购自美国疾病控制与预防中心;甲型H3N2系(A/Darwin/11/2021)、乙型Yamagata系(B/Brisbane/9/2014)和乙型Victoria系(B/Singapore/WUH4618/2021),均购自澳大利亚维多利亚传染病参考实验室。
实施例1
一种基于转基因小球藻基质来源生产的重组流感疫苗的制备方法。
所述重组流感亚单位疫苗,包括重组载体的构建、转基因小球藻的构建、重组工程藻种高密度发酵、融合蛋白的制备、产朊假丝酵母菌微囊的制备、重组流感疫苗半成品的制备、重组流感疫苗成品的制备。
(1)重组载体的构建
A1、融合基因表达盒的构建
流感毒株H1N1(简称H1)、H3N2(简称H3)、B Victoria Lineage(简称BV)和BYamagata Lineage(简称BY);分别将流感毒株H1、流感毒株H3、流感毒株BV和流感毒株BY的四个类型的毒株的HA1血凝素基因与人源IgG1-Fc基因(简称Fc基因)进行组合构成融合基因,融合基因的上游添加5’端同源臂(Up区域),融合基因的下游添加3’端同源臂(Down区域),以串联的方式连接到pET-28a(+)载体上,重组载体目的基因组合方式如下:
ZY-1:pET-28a(+)-HA1(H1)-HA1(H1)-Fc;
ZY-2:pET-28a(+)-HA1(H3)-HA1(H3)-Fc;
ZY-3:pET-28a(+)-HA1(BV)-HA1(BV)-Fc;
ZY-4:pET-28a(+)-HA1(BY)-HA1(BY)-Fc。
本发明以小球藻基因组DNA为模版,通过PCR方式扩增同源臂,其中5’端同源臂(Up区域,引物分别为Up-F和Up-R,序列特征为SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.29)和3’端同源臂(Down区域,引物分别为Down-F和Down-R,序列特征为SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.31),引物序列见表2。
所述重组载体pET-28a(+)-CZ-1上的目的基因表达框由上游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位置点Up区域)、CaMV 35S启动子、HA1-HA1-Fc基因和NOS终止子、下游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位置点Down区域)顺序连接到pET-28a(+)载体上,其中目的基因表达盒中血凝素HA1基因与血凝素HA1基因与Fc基因之间均通过linker序列串联组合连接。linker序列为(EAAAK)3;目的基因的表达框5’端连接载体上的Xho1酶切位点,目的基因表达框的3’端连接载体上的EcoR1酶切位点,形成重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H1)-HA1(H1)-Fc、pET-28a(+)-HA1(H3)-HA1(H3)-Fc、pET-28a(+)-HA1(BV)-HA1(BV)-Fc、pET-28a(+)-HA1(BY)-HA1(BY)-Fc,其中鉴定引物序列表见表3。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H1)-HA1(H1)-Fc的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1基因(H1N1)-HA1基因(H1N1)-Fc基因-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(甲型H1N1系毒株)-linker-HA1基因(甲型H1N1系毒株)-linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-NOS终止子-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
Up区域(上游同源臂)的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示。
CaMV 35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。
HA1(H1)-HA1(H1)-Fc融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示。
NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
Down区域(下游同源臂)的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
pET-28a(+)HA1(H1)-HA1(H1)-Fc载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示。
甲型H1N1系毒株的HA1氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示。
人源IgG1-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H3)-HA1(H3)-Fc的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1(H3N2)-HA1(H3N2)-Fc基因-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(甲型H3N2系毒株)-linker-HA1基因(甲型H3N2系毒株)-Linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
HA1(H3)-HA1(H3)-Fc融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示。
甲型H3N2系毒株HA1的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示。
pET-28a(+)HA1(H3)-HA1(H3)-Fc载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(BV)-HA1(BV)-Fc的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1(乙型Victoria)-HA1(乙型Victoria)-Fc基因-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(乙型Victoria系毒株)-Linker-HA1基因(乙型Victoria系毒株)-Linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
HA1(BV)-HA1(BV)-Fc融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示。
乙型Victoria系毒株的HA1氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示。
pET-28a(+)HA1(BV)-HA1(BV)-Fc载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(BY)-HA1(BY)-Fc的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1(乙型Yamagata)-HA1(乙型Yamagata)-Fc基因-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(乙型Yamagata系毒株)-Linker-HA1基因(乙型Yamagata系毒株)-Linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
HA1(BY)-HA1(BY)-Fc融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示。
乙型Yamagata系毒株的HA1氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示。
pET-28a(+)HA1(BY)-HA1(BY)-Fc载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示。
A2、sgRNA的设计
选取小球藻基因组fad3基因进行基因敲除,设计1条SgRNA序列,编号为SgRNA-fad3-1,其sgRNA基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator的结构。将sgRNA-1基因表达框片段退火,形成含有粘性末端的片段;然后将sgRNA基因表达框的5′端添加AflII酶切位点,3′端添加BstEII酶切位点。
具体的:
载体:pKSE401-OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator
5′端添加AflII酶切位点-OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-3′端添加BstEII酶切位点。
OsU3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示。
SgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
gRNA scaffold的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示。
Terminator的核苷酸序列为:TTTTTTT。
SgRNA靶序列引物退火PCR反应体系:上游引物1μL、下游引物1μL,涡旋震荡混匀,引物序列表见表3;PCR反应程序:95℃,变性10min,然后25℃退火反应60min。
A3、重组载体的构建与验证
用限制性内切酶AflII和BstEII酶切pKSE401载体,使pKSE401载体呈线性化骨架。将pKSE401线性化载体与已变性退火的sgRNA基因表达框连接,使重组载体形成pKSE401-SgRNA-fad3-1的结构。
连接反应体系为:pKSE401线性化载体10μg、退火sgRNA基因表达框片段2μL、T4DNALigase 2μL、10×T4 DNA Ligase Buffer 4μL、用双蒸水补足至20μL;PCR反应体系:15℃反应10h。
pKSE401线性化载体和退火sgRNA基因表达框连接完成后即为pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-1。其中鉴定引物序列表见表3(特征序列为JD-F SEQ ID NO.39;JD-R SEQ IDNO.40),将构建的重组载体送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(2)转基因小球藻的构建
B1、小球藻感受态细胞的制备
1)产酶菌的发酵
从-80℃超低温冰箱中取出工作库的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉),待取出保存的菌种融化后,分别接种至含有复苏培养基的试管斜面进行活化复苏培养。里氏木霉菌种和黑曲霉菌种培养温度28℃,培养72h;枯草芽孢杆菌的培养温度为40℃,培养24h。
里氏木霉菌种和黑曲霉菌种复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:1%胰蛋白胨、2%木糖醇、0.2%赖氨酸、0.02%磷酸氢二钾,2%琼脂,pH 7.0。
枯草芽孢杆菌复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:2%可溶性淀粉、1%花生肽、0.5%精氨酸、0.001%硫酸镁、0.1%酪氨酸,2%琼脂,pH 7.0。
待产酶菌培养结束后用无菌水分别洗下试管斜面的里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的菌体,分别制备成孢子悬液或菌悬液。使里氏木霉菌种和黑曲霉菌种的孢子悬液孢子数控制在5×106个/ml,使枯草芽孢杆菌的菌悬液含菌数量控制在1×108个/ml。
将里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的孢子悬液或菌悬液按照体积比1:0.1:2的比例混合制备成混合菌悬液。按照体积比3%的比例接种至摇瓶培养基,摇瓶培养基的装液量为100ml摇瓶培养基(500ml摇瓶),于30℃,150r/min条件下,培养120h。
摇瓶培养基配方,具体为,按质量分数计:2%米糠、0.5%白糖、2%花生肽、0.02%磷酸氢二钾,pH 6.8。
使用的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉)部分内控指标需满足表4。
2)酶解液的制备
待菌种发酵结束后,将上述混合菌发酵液,于4℃,8000r/min,离心20min,上清液过0.22μm的PES滤膜,即得到酶解液。
3)原生质体的制备
从-80℃超低温冰箱中取出10ml冻存的小球藻藻种,待藻种融化后,于15℃,500r/min,离心10min,弃掉上清液,用5ml新鲜的藻种复苏培养基进行重悬,再轻轻颠倒混匀8次,即得到藻悬液;按体积比吸取3%的藻悬液接种至250ml新鲜的藻种复苏培养基中,25℃培养96h时结束培养,并于25℃,500r/min,离心10min,弃掉上清液,收集藻细胞沉淀物;用新鲜的藻种复苏培养基洗涤沉淀3次;将酶解液、新鲜的藻种复苏培养基和小球藻藻细胞沉淀物按照体积比0.5:10:1的比例进行涡旋混匀,在30℃,100r/min下酶解60min,酶解结束后于15℃,500r/min,离心20min,将酶解后的沉淀物用无菌水置换洗涤3次,将酶解后的藻细胞数控制在5×107个/ml,将得到的小球藻原生质体分装后于4℃保存备用。
所述藻种复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:1%麦芽糖、0.5%L-精氨酸、3%椰子活性肽、0.5%山梨醇、0.03%磷酸氢二钾、0.1%磷酸二氢钾,pH 7.0。
所述椰子活性肽的制备方法:刮下废弃椰壳内的椰肉蛋白,称取20g粉碎的椰肉蛋白,与5mmol/L的PBST缓冲液(pH 7.0),按照质量体积比10:100比例混合;然后将上述混合物于4℃,搅拌粉碎30min,将椰肉蛋白匀浆调节pH至7.0,将质量比1%的复合蛋白酶添加到椰肉蛋白溶液中(E/S,以底物重量计),其中胰蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比1:2混合,于40℃酶解反应1h,然后将酶解液置于95℃,灭酶处理5min,再将处理液于4℃,12000r/min,离心5min,收集上清液,过10Kd的透析袋,用去离子水透析48h后,将透析液冷冻干燥,即为椰子活性肽。
B2、小球藻的电转染
取80ml培养至小球藻密度2×108个/ml的藻细胞原生质体,于4℃,1000r/min离心5min,弃掉上清液,用10ml电转缓冲液重悬4次,静置20min。再于4℃条件下,1000r/min离心10min,收集藻体后加入3ml电转缓冲液重悬,在100μL藻细胞中加入5μg的pET-28a(+)-CZ载体(pET-28a(+)-HA1(H1)-HA1(H1)-Fc、pET-28a(+)-HA1(H3)-HA1(H3)-Fc、pET-28a(+)-HA1(BV)-HA1(BV)-Fc和pET-28a(+)-HA1(BY)-HA1(BY)-Fc,按体积比0.5:2:5:1混合)和1μg的pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-1载体并置于电转杯内,于25℃静置10min。经电转后迅速将藻细胞涂布于SX培养基上,于25℃培养静置培养14天。从平板上挑取10个小球藻藻细胞单克隆在SX培养基平板上三区划线,然后继续培养至形成单克隆藻种,然后将单克隆藻种接种至藻种复苏培养基上,于25℃,培养14天。
SX培养基配方,具体为,按质量分数计:2%乳糖、5%L-精氨酸、1%糖蜜、2%L-苯丙氨酸、0.01%磷酸氢二钾、0.03%磷酸二氢钾、2%琼脂粉,25μg/ml G418,pH 6.8。
电转缓冲液配方,具体为,按质量分数计:0.5%乳糖、1%山梨醇、0.01%氯化镁、0.02%氯化钙、1%L-异亮氨酸,pH 7.0。
电转反应条件为:电压250V,电阻20Ω,电容20μF。
B3、转基因小球藻藻细胞悬液的制备与目的基因的鉴定
(1)转基因小球藻藻细胞悬液的制备
1)先将无菌的96孔板中加入电转染用的藻细胞SX养基;其中96孔板第一列中分别加入90μL复苏培养基,剩余各列分别加入50μL复苏培养基,然后在96孔板第一列加入10μL的藻细胞液,移液器吹吸混匀,并作梯度稀释,将藻细胞液进行梯度倍比稀释。
2)将稀释后的含有单细胞藻种的96孔板盖上盖子后用3M胶带封口,并至于光照培养箱中培养。藻细胞培养参数设定为:培养温度25℃,光照周期12L:12D,光照强度120μmol/(m2·s)。
3)将96孔板中的藻种静置培养10天,并定期观察,待培养结束后吸出孔中藻细胞悬液,用于后续藻种扩增培养。
(2)转基因小球藻目的基因的鉴定
吸取藻细胞悬液,提取转基因小球藻基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否存在;以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性2min;98℃变性10s,57℃退火15s,72℃延伸50s,30个循环;72℃终延伸10min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用,对鉴定合格的小球藻进行后续活性鉴定试验。
B4、转基因小球藻活性鉴定
1)目的基因传代稳定性验证
随机挑取一组分选符合要求的藻种单细胞悬液,使其于25℃悬浮培养至藻细胞密度5×107个/ml,然后进行藻种细胞纯化培养:将藻细胞悬液在筛选培养平板(SX培养基)上稀释涂布,并于25℃静置培养7天(即为P1代),用无菌接种环刮取平板上的单藻细胞团,在500ml茄形瓶SX培养基表面上均匀划线培养,于25℃静置培养5天(即为P2代);继续进行连续传代培养至第6代(即为P6代)后,用100ml无菌水洗下第6代的茄瓶中SX培养基上的藻细胞,提取藻细胞基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否传代稳定。
以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性2min;98℃变性10s,57℃退火15s,72℃延伸50s,30个循环;72℃终延伸10min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用。
2)转基因小球藻中融合蛋白的提取
取200ml培养至密度2×108个/ml的转基因小球藻藻细胞发酵液,将其置于4℃条件下,1000r/min离心15min,弃上清,即可制备成小球藻藻泥;采用5mmol/L的PBST缓冲液(pH 7.0)重悬小球藻藻泥3次,得到藻细胞悬液;将藻细胞悬液进行超声破碎,每超声6秒,间隔3秒,超声破碎处理15个循环,然后置于4℃条件下,8000r/min离心20min,上清液即为融合蛋白样品,制备的融合蛋白需满足表4的样品部分内控指标。
B5、转基因小球藻的保存
将符合要求的转基因小球藻进行高密度发酵,待发酵结束后收集转基因小球藻发酵液,并置于4℃条件下,500r/min离心10min,得到小球藻藻泥,用3倍体积的无菌水重悬藻泥3次,得到藻悬液;并置于4℃条件下,500r/min离心5min再次离心后弃掉上清,用2倍体积的保护剂稀释藻细胞沉淀,使藻细胞密度控制为0.5×108个/ml,放置于-80℃超低温冰箱中,并建立转基因小球藻主种子库,主种子库转基因小球藻经连续培养传代至第9代即为转基因小球藻工作库藻种,其保存方式同主种子库。
保护剂原料组分为:0.2%的葡萄糖、1%的甘油、0.5%甘露醇,保护剂溶液pH为7.0。
(3)重组工程藻种高密度发酵
C1、转基因小球藻的复苏
从-80℃超低温冰箱中取出工作库藻种(第9代转基因小球藻),待藻种解冻后,用接种环蘸取少量的藻种液,在含有复苏培养基的茄形瓶上均匀划线,置于25℃,静置培养7天。
藻种复苏培养参数设定为:培养温度25℃,光照周期12L:12D,光照强度2000lx,采用白炽灯光源进行光照培养。
转基因小球藻的复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:1%麦芽糖、0.5%L-精氨酸、1%葡萄糖、7%椰子活性肽、0.03%磷酸氢二钾、0.05%磷酸二氢钾,1.5%琼脂,pH 7.0。
C2、转基因小球藻的一级种子培养
将50ml的一级种子培养基(不含琼脂)加到茄形瓶中,用细胞刮铲刮下茄形瓶琼脂表面的藻种细胞,将转基因小球藻的藻液混匀后,分装至150ml离心杯中,25℃,500r/min离心30min,弃掉上清液,用50ml的一级种子培养基(不含琼脂)再次重悬离心杯中的藻泥,将制备成的藻悬液按照体积比5%的比例接种至2000ml细胞培养瓶(含有一级种子培养基培养(不含琼脂))中进行培养,每2h摇动1次,置于25℃培养7天时结束,即为一级藻种。
转基因小球藻的一级培养参数设定为:光照周期12L:12D,光照强度2000lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照1:1:2。
转基因小球藻的一级种子培养基配方,具体为,按质量分数计:30%甘蔗渣酶解物,60%蚕豆蛋白生物活性肽,0.1%磷酸二氢钾,0.05%磷酸二氢钾,2%琼脂,pH 6.8。
甘蔗渣酶解物制备方法:以甘蔗渣为原料,称取100g甘蔗渣,将其粉碎后过50目筛网,将过筛后的甘蔗渣与无菌水按固液质量体积比5:60置于1000ml的蜀牛玻璃瓶内,于4℃条件下浸泡24h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入300ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至7.0,按质量比5%的比例将复合粗酶粉(E/S,以底物重量计)加入到甘蔗渣混合液中,于25℃,180r/min,酶解反应100min,待反应结束后抽滤去除甘蔗残渣获得酶解液,将滤液至于100℃灭酶处理3min,将滤液进行冷冻干燥,即为甘蔗渣酶解物。
复合酶粉的制备:将-80℃超低温冰箱冻存的3株无溶血性的微生物甘油菌种(拟康宁木霉、草酸青霉和哈茨木霉,其中菌种部分内控标准见表4)甘油菌分别按照5:0.1:5的比例混合,并按0.3%的体积比接种至1000ml的固体产酶培养基中,于35℃,静置培养10天,待菌种孢子长满固体基质后,于40℃下烘干,粉碎至300目。
固体产酶培养基的制备:将大麦种子和黄豆种子浸泡水中8h,然后将大麦种子和黄豆种子沥干水至无水流出,使大麦种子和黄豆种子的含水量控制在40%,然后将装入玻璃瓶内,然后于115℃,灭菌65min。
蚕豆蛋白生物活性肽的制备:
以蚕豆为原料,称取5g蚕豆,将其粉碎后过100目筛网,将过筛后的蚕豆渣与无菌水按固液质量体积比0.5:50置于250ml的蜀牛玻璃瓶内,于4℃条件下浸泡1h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入80ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至7.0,先加入质量体积比0.1%的中性蛋白酶(E/S,以底物重量计)到蚕豆渣混合液中,于35℃,220r/min,酶解反应30min,反应结束后进行灭酶处理(85℃,混合液煮沸10min),然后将溶液的pH调节7.0;再加入质量体积比7%的风味蛋白酶(E/S,以底物重量计),于53℃,220r/min,酶解反应40min,反应结束后进行灭酶处理(85℃,混合液煮沸10min),水解结束后将滤液于8000r/min,离心5min,取上清液冷冻干燥72h,即为蚕豆蛋白生物活性肽。
C3、转基因小球藻的二级发酵培养
将一级藻种按体积比10%的比例接种至10L二级藻种发酵培养基中,每2h摇动2次,置于25℃培养7天时结束,即为二级藻种。
转基因小球藻的二级培养参数设定为:光照周期12L:12D,光照强度20000lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照1:1:2。
转基因小球藻的二级发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:40%甘蔗渣酶解物,30%蚕豆蛋白生物活性肽,0.1%磷酸二氢钾,1%磷酸二氢钾,pH 6.8。
C4、转基因小球藻的三级发酵培养
采用150L封闭式生物反应器对转基因小球藻进行高密度发酵。封闭式生物反应器参数:罐体装液量控制在45L,转基因小球藻的细胞接种密度控制在2×108个/ml,藻种接种量按罐体装液量10%的比例接种至封闭式生物反应器中,采用25℃培养120h,待培养结束后以2.5ml/h/L流速流加罐体装液量体积的2%的外源营养液,再然后将发酵培养温度调到15℃继续培养160h。
外源营养液配方,具体为,按质量分数计:1%糊精、0.5%蛋氨酸,pH 6.0。
转基因小球藻的三级发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:60%甘蔗渣酶解物,55%蚕豆蛋白生物活性肽,0.03%磷酸二氢钾,2%磷酸二氢钾,pH 6.8。
(4)融合蛋白的制备
D1、融合蛋白粗提液的制备
将收集的转基因小球藻发酵液置于4℃条件下,10000r/min离心15min,制备成小球藻藻泥;采用5mmol/L的PBST缓冲液(pH 7.0)重悬小球藻藻泥3次,得到藻悬液。
将藻悬液用高速匀浆机处理,处理条件:15000r/min匀浆,温度4℃,用5mmol/L的PBST缓冲液(pH 7.0)将藻细胞稀释至小球藻藻细胞密度9×108个/ml,间歇匀浆4次,每次匀浆20min,将匀浆后的藻液置于4℃条件下,10000r/min离心20min,弃掉沉淀,收集上清,即为融合蛋白粗提液。
D2、融合蛋白的纯化
将制备的融合蛋白粗提液用0.1μm的囊氏滤器进行过滤,将样品滤液用10Kd的中空纤维柱浓缩3倍,用缓冲液(5mmol/L PBST,5mmol/L精氨酸,pH 7.0)洗滤10次,即为融合蛋白置换液。
采用Rigose MabpureA填料对上述融合蛋白置换液进行第一步纯化。上纯化柱之前,使用0.22μm的PVDF滤膜对样品过滤处理。使用平衡缓冲液(5mmol/L PBST,5mmol/L精氨酸,pH 7.0)进行上样品,上样时柱子温度控制在4℃,使用洗脱缓冲液(5mmol/L柠檬酸钠缓冲液,5mmol/L精氨酸,pH 3.0)进行恒定洗脱,洗脱时柱子的温度控制在27℃,收集洗脱的蛋白纯化样,并将洗脱的蛋白纯化样调节至pH 7.0,即为融合蛋白(初纯液)。
采用Superose 12 Prep Grade填料对上述融合蛋白(初纯液)进行二次纯化,层析柱温度控制在4℃,使用平衡缓冲液(5mmol/L PBST,120mm NaCl,pH 7.0)进行纯化,收集的目标蛋白即为融合蛋白(精纯液)。
各纯化步骤样品检测结果如表6所示。
(5)产朊假丝酵母菌微囊的制备
取40ml的产朊假丝酵母菌液(菌体密度控制在1×105个/ml),于4℃条件下10000r/min离心5min弃掉上清,再用300ml无菌去离子水反复重悬菌体沉淀5次。
将离心的沉淀分散到pH 9.0的组氨酸和氢氧化钠缓冲溶液中,再4℃条件下磁力搅拌1.5h,10000r/min离心5min,弃掉上清,用300ml无菌去离子水重悬洗涤8次。
用柠檬酸将溶液调节pH至4.5,再4℃条件下磁力搅拌1.5h,4000r/min离心20min,弃掉上清,用50ml无菌去离子水重悬洗涤5次。
将沉淀至于用25ml异丙醇和丙酮混合液中,其中异丙醇和丙酮按0.01:1,重悬洗涤3次,沉淀物真空冷冻干燥36h。
(6)重组流感疫苗半成品的制备
以产朊假丝酵母菌微囊为疫苗佐剂,将产朊假丝酵母菌微囊和融合蛋白(精纯液)按质量体积比10:10混合,于4℃条件下,80r/min搅拌混合5h,然后置于离心机上10000r/min离心10min,获得的沉淀物真空冷冻干燥为冻干粉,即为重组流感疫苗半成品。
(7)重组流感疫苗成品的制备
将上述重组流感疫苗半成品、碳酸氢钠(抗酸调节剂)和麦胚凝集素(生物黏附材料)按质量比100:0.1:0.5混合,压制成微丸;使制备的微丸颗粒每粒控制在0.1g,即为重组流感疫苗成品。
实施例2
一种基于转基因小球藻基质来源生产的重组流感疫苗的制备方法。
所述重组流感疫苗,包括重组载体的构建、转基因小球藻的构建、重组工程藻种高密度发酵、融合蛋白的制备、产朊假丝酵母菌微囊的制备、重组流感疫苗半成品的制备、重组流感疫苗成品的制备。
(1)重组载体的构建
A1、融合基因表达盒的构建
流感毒株H1N1(简称H1)、H3N2(简称H3)、B Victoria Lineage(简称BV)和BYamagata Lineage(简称BY);分别将流感毒株H1、流感毒株H3、流感毒株BV和流感毒株BY的四个类型的毒株的HA1血凝素基因与人源IgG1-Fc基因进行组合构成融合基因,融合基因的上游添加5’端同源臂(Up区域),融合基因的下游添加3’端同源臂(Down区域),以串联的方式连接到pET-28a(+)载体上,重组载体目的基因组合方式如下。
ZY-5:pET-28a(+)-Fc-HA1(H1)-HA1(H1);
ZY-6:pET-28a(+)-Fc-HA1(H3)-HA1(H3);
ZY-7:pET-28a(+)-Fc-HA1(BV)-HA1(BV);
ZY-8:pET-28a(+)-Fc-HA1(BY)-HA1(BY)。
本发明以小球藻基因组DNA为模版,通过PCR方式扩增同源臂,其中5’端同源臂(Up区域,引物分别为Up-F和Up-R,序列特征为SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.29)和3’端同源臂(Down区域,引物分别为Down-F和Down-R,序列特征为SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.31),引物序列见表2。
所述重组载体pET-28a(+)-CZ-2上的目的基因表达框由上游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位置点Up区域)、CaMV 35S启动子、Fc-HA1-HA1基因和NOS终止子、下游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位置点Down区域)顺序连接到pET-28a(+)载体上,其中目的基因表达盒中Fc基因、血凝素HA1基因和血凝素HA1基因之间均通过linker序列串联组合连接。linker序列如SEQ ID NO.32所示;目的基因的表达框5’端连接载体上的Xho1酶切位点,目的基因表达框的3’端连接载体上的EcoR1酶切位点,形成重组表达载体pET-28a(+)-Fc-HA1(H1)-HA1(H1)、pET-28a(+)-Fc-HA1(H3)-HA1(H3)、pET-28a(+)-Fc-HA1(BV)-HA1(BV)、pET-28a(+)-Fc-HA1(BY)-HA1(BY),其中鉴定引物序列表见表3。
重组表达载体pET-28a(+)-Fc-HA1(H1)-HA1(H1)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-Fc基因-HA1(H1N1)-HA1(H1N1)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(甲型H1N1系毒株)-linker-HA1基因(甲型H1N1系毒株)-NOS终止子-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
Fc-HA1(H1)-HA1(H1)融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示。
pET-28a(+)-Fc-HA1(H1)-HA1(H1)载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示。
重组表达载体pET-28a(+)-Fc-HA1(H3)-HA1(H3)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-Fc基因-HA1(H3N2)-HA1(H3N2)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(甲型H3N2系毒株)-linker-HA1基因(甲型H3N2系毒株)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
Fc-HA1(H3)-HA1(H3)融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示。
pET-28a(+)-Fc-HA1(H3)-HA1(H3)载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示。
重组表达载体pET-28a(+)-Fc-HA1(BV)-HA1(BV)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-Fc基因-HA1(乙型Victoria)-HA1(乙型Victoria)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(乙型Victoria系毒株)-linker-HA1基因(乙型Victoria系毒株)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
Fc-HA1(BV)-HA1(BV)融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示。
pET-28a(+)-Fc-HA1(BV)-HA1(BV)载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。
重组表达载体pET-28a(+)-Fc-HA1(BY)-HA1(BY)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-Fc基因-HA1(乙型Yamagata)-HA1(乙型Yamagata)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(乙型Yamagata系毒株)-linker-HA1基因(乙型Yamagata系毒株)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
Fc-HA1(BY)-HA1(BY)融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示。
pET-28a(+)-Fc-HA1(BY)-HA1(BY)载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
A2、sgRNA的设计
选取小球藻基因组fad3基因进行基因敲除,设计2条SgRNA序列,编号为SgRNA-fad3-12,其sgRNA基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator的结构。将sgRNA基因表达框的5′端添加AflII酶切位点,3′端添加BstEII酶切位点;然后将sgRNA基因表达框片段退火,形成含有粘性末端的片段。
具体的:
载体:pKSE401-OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator。
5′端添加AflII酶切位点-OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator-3′端添加BstEII酶切位点。
SgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
gRNA scaffold的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示。
Terminator的核苷酸序列为TTTTTTT
SgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SgRNA靶序列引物退火PCR反应体系:上游引物3μL、下游引物3μL,引物序列表见表3;PCR反应程序:80℃,变性10min,然后25℃退火反应90min。
A3、重组载体的构建与验证
用限制性内切酶AflII和BstEII酶切pKSE401载体,使pKSE401载体呈线性化骨架。将pKSE401线性化载体与已变性退火的sgRNA基因表达框片段连接,使重组载体形成pKSE401-SgRNA-fad3-12的结构。
连接反应体系为:pKSE401线性化载体0.05μg、退火sgRNA基因表达框片段8μL、T4DNA Ligase 0.02μL、10×T4 DNA Ligase Buffer 0.02μL、用双蒸水补足至20μL;PCR反应体系:4℃反应18h。
所述重组载体的sgRNA表达框的重组载体(pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-12)。其中鉴定引物序列表见表3(特征序列为JD-F SEQ ID NO.39;JD-R SEQ ID NO.40),将构建的重组载体送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(2)转基因小球藻的构建
B1、小球藻感受态细胞的制备
1)产酶菌的发酵
从-80℃超低温冰箱中取出工作库的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉),待取出保存的菌种融化后,分别接种至不同培养基的试管斜面置于进行活化复苏培养。里氏木霉菌种和黑曲霉菌种培养温度30℃,培养96h;枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃,培养72h。
里氏木霉菌种和黑曲霉菌种复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:0.5%胰蛋白胨、3%木糖醇、1%赖氨酸、0.5%磷酸氢二钾,1.5%琼脂,pH 6.8。
枯草芽孢杆菌复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:3%可溶性淀粉、2%花生肽、2%精氨酸、0.01%硫酸镁、0.5%酪氨酸,1.5%琼脂,pH 7.2。
待产酶菌培养结束后用无菌水分别洗下里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的菌体,分别制备成孢子悬液或菌悬液。使里氏木霉菌种和黑曲霉菌种的孢子悬液孢子数控制在2.5×108个/ml,使枯草芽孢杆菌的菌悬液含菌数量控制在5×109个/ml。
将里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的孢子悬液或菌悬液按照体积比3:4:0.1的比例混合制备成混合菌悬液。按照体积比6%的比例接种至摇瓶培养基,摇瓶培养基的装液量为200ml摇瓶培养基(500ml摇瓶),40℃,100r/min条件下,培养72h。
摇瓶培养基配方,具体为,按质量分数计:1%米糠、5%白糖、3%花生肽、0.5%磷酸氢二钾,pH 7.2。
使用的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉)部分内控指标需满足表4。
2)酶解液的制备
待菌种发酵结束后,将上述混合菌发酵液,于15℃,12000r/min,离心30min,上清液过0.45μm的PES滤膜,即得到酶解液。
3)原生质体的制备
从-80℃超低温冰箱中取出5ml冻存的小球藻藻种,待藻种融化后,于22℃,2000r/min,离心5min,弃掉上清液,用30ml新鲜的藻种复苏培养基进行重悬,再轻轻颠倒混匀5次,即得到藻悬液;按体积比吸取1%的藻悬液接种至200ml新鲜的藻种复苏培养基中,15℃培养240h时结束培养,并于15℃,2000r/min,离心5min,弃掉上清液,收集藻细胞沉淀物;用新鲜的藻种复苏培养基洗涤沉淀2次;将酶解液、新鲜的藻种复苏培养基和小球藻藻细胞沉淀物按照体积比3:5:0.2的比例进行涡旋混匀,在28℃,180r/min下酶解20min,酶解结束后于22℃,10000r/min,离心5min,将酶解后的沉淀物用无菌水置换洗涤6次,将酶解后的藻细胞数控制在5×105,将得到的小球藻原生质体分装后于4℃保存备用。
小球藻的复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:3%麦芽糖、5%L-精氨酸、2%椰子活性肽、2%山梨醇、0.2%磷酸氢二钾、0.01%磷酸二氢钾,pH 6.8。
所述椰子活性肽的制备方法:刮下废弃椰壳内的椰肉蛋白,称取5g粉碎的椰肉蛋白,与20mmol/L的PBST缓冲液(pH 8.0),按照质量体积比3:20比例混合;然后将上述混合物于4℃,搅拌粉碎10min,将椰肉蛋白匀浆调节pH至5.5,将质量比0.01%的复合蛋白酶添加到椰肉蛋白溶液中(E/S,以底物重量计),其中胰蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比5:0.1混合,于25℃酶解反应3h,然后将酶解液置于85℃,灭酶处理20min,再将处理液于4℃,1000/min,离心40min,收集上清液,过5Kd的透析袋,用去离子水透析24h后,将透析液冷冻干燥,即为椰子活性肽。
B2、小球藻的电转染
取30ml培养至小球藻密度5×105个/ml的藻细胞原生质体,于4℃,8000r/min离心30min,弃掉上清液,用50ml电转缓冲液重悬6次,静置10min。再于4℃条件下,5000r/min离心5min,收集藻体后加入5ml电转缓冲液重悬,在1000μL藻细胞中加入50μg的pET-28a(+)-CZ载体(pET-28a(+)-Fc-HA1(H1)-HA1(H1)、pET-28a(+)-Fc-HA1(H3)-HA1(H3)、pET-28a(+)-Fc-HA1(BV)-HA1(BV)、pET-28a(+)-Fc-HA1(BY)-HA1(BY)按体积比1:1:1:1混合)载体和20μg的pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-12载体并置于电转杯内,于25℃静置30min。经电转后迅速将藻细胞涂布于SX培养基上,于15℃培养静置培养7天。从平板上挑取30个小球藻藻细胞单克隆在SX培养基平板上三区划线,然后继续培养至形成单克隆藻种,然后将单克隆藻种接种至藻种复苏培养基上,于15℃,培养7天。
SX培养基配方,具体为,按质量分数计:1%乳糖、0.5%L-精氨酸、3%糖蜜、7%L-苯丙氨酸、0.1%磷酸氢二钾、0.01%磷酸二氢钾、1.5%琼脂粉、75μg/ml G418,pH 7.2。
电转缓冲液配方,具体为,按质量分数计:1%乳糖、5%山梨醇、0.5%氯化镁、0.1%氯化钙、0.03% L-异亮氨酸,pH 6.5。
电转反应条件为:电压320V,电阻10Ω,电容25μF。
B3、转基因小球藻藻细胞悬液的制备与目的基因的鉴定
(1)转基因小球藻藻细胞悬液的制备
1)先将无菌的96孔板中加入电转染用的藻细胞SX养基;其中96孔板第一列中分别加入50μL复苏培养基,剩余各列分别加入25μL复苏培养基,然后在96孔板第一列加入5μL的藻细胞液,移液器吹吸混匀,并作梯度稀释,将藻细胞液进行梯度倍比稀释。
2)将稀释后的含有单细胞藻种的96孔板盖上盖子后用3M胶带封口,并至于光照培养箱中培养。藻细胞培养参数设定为:培养温度20℃,光照周期6L:10D,光照强度100μmol/(m2·s)。
3)将96孔板中的藻种静置培养20天,并定期观察,待培养结束后吸出孔中藻细胞悬液,用于后续藻种扩增培养。
(2)转基因小球藻目的基因的鉴定
吸取藻细胞悬液,提取转基因小球藻基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否存在;以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-5、ZY-6、ZY-7、ZY-8)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性5min;98℃变性10s,57℃退火15s,72℃延伸30s,30个循环;72℃终延伸15min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用,对鉴定合格的小球藻进行后续活性鉴定试验。
B4、转基因小球藻活性鉴定
1)目的基因传代稳定性验证
随机挑取一组分选符合要求的藻种单细胞悬液,使其于20℃悬浮培养至藻细胞密度5×107个/ml,然后进行藻种细胞纯化培养:将藻细胞悬液在筛选培养平板(SX培养基)上稀释涂布,并于15℃静置培养4天(即为P1代),用无菌接种环刮取平板上的单藻细胞团,在250ml茄形瓶SX培养基表面上均匀划线培养,于25℃静置培养7天(即为P2代);继续进行连续传代培养至第4代(即为P4代)后,用20ml无菌水洗下第4代的茄瓶中SX培养基上的藻细胞,提取藻细胞基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否传代稳定。
以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-5、ZY-6、ZY-7、ZY-8)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性5min;98℃变性10s,57℃退火15s,72℃延伸30s,30个循环;72℃终延伸15min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用。
2)转基因小球藻中融合蛋白的提取
取50ml培养至密度7×109个/ml的转基因小球藻藻细胞发酵液,将其置于25℃条件下,10000r/min离心20min,弃上清,即可制备成小球藻藻泥;采用10mmol/L的PBST缓冲液(pH 8.0)重悬小球藻藻泥4次,得到藻细胞悬液;将藻细胞悬液进行超声破碎,每超声8秒,间隔4秒,超声破碎处理40个循环,然后置于25℃条件下,10000r/min离心15min,上清液即为融合蛋白样品,制备的融合蛋白需满足表4的样品部分内控指标。
B5、转基因小球藻的保存
将符合要求的转基因小球藻进行高密度发酵,待发酵结束后收集转基因小球藻发酵液,并置于4℃条件下,5000r/min离心5min,得到小球藻藻泥,用5倍体积的无菌水重悬藻泥5次,得到藻悬液;并置于4℃条件下,5000r/min离心20min再次离心后弃掉上清,用3倍体积的保护剂稀释藻细胞沉淀,使藻细胞密度控制为10×109个/ml,放置于-80℃超低温冰箱中,并建立转基因小球藻主种子库,主种子库转基因小球藻经连续培养传代至第15代即为转基因小球藻工作库藻种,其保存方式同主种子库。
保护剂原料组分为:1%的葡萄糖、5%的甘油、0.05%甘露醇,保护剂溶液pH为6.0。
(3)重组工程藻种高密度发酵
C1、转基因小球藻的复苏
从-80℃超低温冰箱中取出工作库藻种(第15代转基因小球藻),待藻种解冻后,用接种环蘸取少量的藻种液,在含有复苏培养基的方形瓶上均匀划线,置于20℃,静置培养5天。藻种复苏培养参数设定为:培养温度20℃,光照周期6L:12D,光照强度5000 lx,采用白炽灯光源进行光照培养。
转基因小球藻的复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:3%麦芽糖、5%L-精氨酸、3%葡萄糖、2%椰子活性肽、0.2%磷酸氢二钾、0.01%磷酸二氢钾,pH 6.8。
C2、转基因小球藻的一级种子培养
将150ml的种子培养基(不含琼脂)加茄形瓶中,用细胞刮铲刮下茄形瓶琼脂表面的藻种细胞,将转基因小球藻的藻液混匀后,分装至50ml离心杯中,20℃,1500r/min离心5min,弃掉上清液,用150ml的种子培养基再次重悬离心杯中的藻泥,将制备成的藻悬液按照体积比0.5%的比例接种至500ml细胞培养瓶含有一级种子培养基培养(不含琼脂))中进行培养,每5h摇动5次,置于20℃培养10天时结束,即为一级藻种。
转基因小球藻的一级培养参数设定为:光照周期6L:12D,光照强度200lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照2:0.5:1。
转基因小球藻的一级种子培养基配方,具体为,按质量分数计:5%甘蔗渣酶解物,10%蚕豆蛋白生物活性肽,0.2%磷酸二氢钾,0.01%磷酸二氢钾,1.5琼脂,pH 7.2。
甘蔗渣酶解物制备方法:以甘蔗渣为原料,称取50g甘蔗渣,将其粉碎后过80目筛网,将过筛后的甘蔗渣与无菌水按固液比0.5:10置于500ml的蜀牛玻璃瓶内,于25℃条件下浸泡5h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入100ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至8.5,按质量比2%的比例将复合粗酶粉(E/S,以底物重量计)加入到甘蔗渣水解液中,于60℃,120r/min,酶解反应20min,待反应结束后抽滤去除甘蔗残渣获得酶解液,将滤液至于80℃灭酶处理20min,将滤液进行冷冻干燥,即为甘蔗渣酶解物。
复合酶粉的制备:将-80℃超低温冰箱冻存的3株无溶血性的微生物甘油菌种(拟康宁木霉、草酸青霉和哈茨木霉,其中菌种部分内控标准见表4)分别按照0.1:3:10的比例,并按10%的体积比接种至500ml的固体产酶培养基中,于25℃,静置培养5天,待菌种孢子长满固体基质后,于55℃下烘干,粉碎至60目。
固体产酶培养基的制备:将大麦种子和黄豆种子浸泡水中36h,然后将大麦种子和黄豆种子沥干水至无水流出,使大麦种子和黄豆种子的含水量控制在75%,然后将装入玻璃瓶内,然后于115℃,灭菌30min。
蚕豆蛋白生物活性肽的制备:
以蚕豆为原料,称取200g蚕豆,将其粉碎后过60目筛网,将过筛后的蚕豆渣与无菌水按固液质量体积比10:80置于1000ml的蜀牛玻璃瓶内,于15℃条件下浸泡2h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入300ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至7.0,先按质量体积比2%的比例将中性蛋白酶(E/S,以底物重量计)到蚕豆渣混合液中,22℃,150r/min,酶解反应180min,反应结束后进行灭酶处理(100℃,混合液煮沸2min),然后将溶液的pH调节6.5,再加入质量比0.3%的风味蛋白酶(E/S,以底物重量计),于40℃,120r/min,酶解反应200min,反应结束后进行灭酶处理(90℃,混合液煮沸5min),水解结束后将滤液200r/min,离心15min,取上清液冷冻干燥12h,即为蚕豆蛋白生物活性肽。
C3、转基因小球藻的二级发酵培养
将一级藻种按体积比0.1%的比例接种至5L二级藻种发酵培养基中,每5h摇动1次,置于20℃培养18天时结束,即为二级藻种。
转基因小球藻的二级培养参数设定为:光照周期6L:12D,光照强度10000lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照2:0.5:1。
转基因小球藻的二级发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:25%甘蔗渣酶解物,40%蚕豆蛋白生物活性肽,0.5%磷酸二氢钾,0.2%磷酸二氢钾,pH 7.2。
C4、转基因小球藻的三级发酵培养
采用150L封闭式生物反应器对转基因小球藻进行高密度发酵。封闭式生物反应器参数:罐体装液量控制在90L,转基因小球藻的细胞接种密度控制在5×105个/ml,藻种接种量按罐体装液量25%的比例接种至封闭式生物反应器中,采用22℃培养96h,待培养结束后以4ml/h/L流速流加罐体装液量体积的0.1%的外源营养液,再然后将发酵培养温度调到15℃继续培养240h。
外源营养液配方,具体为,按质量分数计:0.1%糊精、3%蛋氨酸,pH 7.2。
转基因小球藻的三级发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:40%甘蔗渣酶解物,78%蚕豆蛋白生物活性肽,0.2%磷酸二氢钾,0.01%磷酸二氢钾,pH 7.2。
4)融合蛋白的制备
D1、融合蛋白粗提液的制备
将收集的转基因小球藻发酵液置于25℃条件下,1000r/min离心40min,制备成小球藻藻泥;采用20mmol/L的PBST缓冲液(pH 5.0)重悬小球藻藻泥4次,得到藻悬液。
将藻悬液用高速匀浆机处理,处理条件:5000r/min匀浆,温度15℃,用20mmol/L的PBST缓冲液(pH5.0)将藻细胞稀释至小球藻藻细胞密度2.5×1010个/ml,间歇匀浆6次,每次匀浆40min,将匀浆后的藻液,置于15℃条件下,300r/min离心15min,弃掉沉淀,收集上清,即为融合蛋白粗提液。
D2、融合蛋白的纯化
将制备的融合蛋白粗提液用1μm的囊氏滤器进行过滤,将样品滤液用30Kd的中空纤维柱浓缩20倍,用缓冲液(20mmol/L PBST,10mmol/L精氨酸,pH 5.0)洗滤5次,即为融合蛋白置换液。
采用Rigose MabpureA填料对上述融合蛋白置换液进行第一步纯化。上纯化柱之前,使用0.22μm的PVDF滤膜对样品过滤处理。使用平衡缓冲液(20mmol/L PBST,10mmol/L精氨酸,pH 5.0)进行上样品,上样时柱子温度控制在15℃,使用洗脱缓冲液(10mmol/L柠檬酸钠缓冲液,10mmol/L精氨酸,pH 3.5)进行恒定洗脱,洗脱时柱子的温度控制在16℃,收集洗脱的蛋白纯化样,并将洗脱的蛋白纯化样调节至pH 8.0,即为融合蛋白(初纯液)。
采用Superose 12 Prep Grade填料对上述融合蛋白(初纯液)进行二次纯化,层析柱温度控制在15℃,使用平衡缓冲液(20mmol/L PBST,120mm NaCl,pH 8.0)进行纯化,收集的目标蛋白即为融合蛋白(精纯液)。
各纯化步骤样品检测结果如表7所示。
(5)产朊假丝酵母菌微囊的制备
取20ml的产朊假丝酵母菌液(细胞密度控制在3×107个/ml),于15℃条件下8000r/min离心10min弃掉上清,再用100ml无菌去离子水反复重悬菌体沉淀3次。
将离心的沉淀分散到pH 9.5的组氨酸和氢氧化钠缓冲溶液中,再65℃条件下磁力搅拌0.5h,6000r/min离心20min,弃掉上清,用100ml无菌去离子水重悬洗涤5次。
用HCl将溶液调节pH至5.0,再50℃条件下磁力搅拌0.5h,6000r/min离心10min,弃掉上清,用300ml无菌去离子水重悬洗涤8次。
将沉淀至于用50ml异丙醇和丙酮混合液中,其中异丙醇和丙酮按0.05:0.01,重悬洗涤4次,沉淀物真空冷冻干燥48h。
(6)重组流感疫苗半成品的制备
以产朊假丝酵母菌微囊为疫苗佐剂,将产朊假丝酵母菌微囊和融合蛋白(精纯液)按质量体积比5:200混合,于15℃条件下,100r/min搅拌混合3h,然后置于离心机上5000r/min离心20min,获得的沉淀物真空冷冻干燥为冻干粉,即为重组流感疫苗半成品。
(7)重组流感疫苗成品的制备
将上述重组流感疫苗半成品、碳酸氢钠(抗酸调节剂)和麦胚凝集素(生物黏附材料)按质量比300:0.05:0.1混合,压制成微丸;使制备的微丸颗粒每粒控制在0.1g,即为重组流感疫苗成品。
实施例3
一种基于转基因小球藻基质来源生产的重组流感疫苗的制备方法。
所述重组流感疫苗,包括重组载体的构建、转基因小球藻的构建、重组工程藻种高密度发酵、融合蛋白的制备、产朊假丝酵母菌微囊的制备、重组流感疫苗半成品的制备、重组流感疫苗成品的制备。
(1)重组载体的构建
A1、融合基因表达盒的构建
流感毒株H1N1(简称H1)、H3N2(简称H3)、B Victoria Lineage(简称BV)和BYamagata Lineage(简称BY);分别将流感毒株H1、流感毒株H3、流感毒株BV和流感毒株BY的四个类型的毒株的HA1血凝素基因与人源IgG1-Fc基因进行组合构成融合基因,以串联的方式连接到pET-28a(+)载体上,重组载体目的基因组合方式如下:
ZY-9:pET-28a(+)-HA1(H1)-Fc-HA1(H1);
ZY-10:pET-28a(+)-HA1(H3)-Fc-HA1(H3);
ZY-11:pET-28a(+)-HA1(BV)-Fc-HA1(BV);
ZY-12:pET-28a(+)-HA1(BY)-Fc-HA1(BY)。
本发明以小球藻基因组DNA为模版,通过PCR方式扩增同源臂,其中5’端同源臂(Up区域,引物分别为Up-F和Up-R,序列特征为SEQ ID NO.28,SEQ ID NO.29)和3’端同源臂(Down区域,引物分别为Down-F和Down-R,序列特征为SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.31),引物序列见表2。
所述重组载体pET-28a(+)-CZ-3上的目的基因表达框由上游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位置点Up区域)、CaMV 35S启动子、HA1-Fc-HA1和NOS终止子、下游同源臂(来源于小球藻fad3敲除位置点Down区域)顺序连接到pET-28a(+)载体上,其中目的基因表达盒中血凝素HA1基因、Fc基因和血凝素HA1基因之间均通过linker序列串联组合连接,其中linker序列为(EAAAK)3;目的基因的表达框5’端连接载体上的Xho1酶切位点,目的基因表达框的3’端连接载体上的EcoR1酶切位点,形成重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H1)-Fc-HA1(H1)、pET-28a(+)-HA1(H3)-Fc-HA1(H3)、pET-28a(+)-HA1(BV)-Fc-HA1(BV)、pET-28a(+)-HA1(BY)-Fc-HA1(BY),其中鉴定引物序列表见表3。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H1)-Fc-HA1(H1)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1(H1N1)-Fc基因-HA1(H1N1)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(甲型H1N1系毒株)-linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(甲型H1N1系毒株)-NOS终止子-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
HA1(H1)-Fc-HA1(H1)融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。
pET-28a(+)-HA1(H1)-Fc-HA1(H1)载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(H3)-Fc-HA1(H3)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1(H3N2)-Fc基因-HA1(H3N2)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(甲型H3N2系毒株)-linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(甲型H3N2系毒株)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
HA1(H3)-Fc-HA1(H3)融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示。
pET-28a(+)-HA1(H3)-Fc-HA1(H3)的载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ IDNO.70所示。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(BV)-Fc-HA1(BV)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1(乙型Victoria)-Fc基因-HA1(乙型Victoria)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(乙型Victoria系毒株)-linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(乙型Victoria系毒株)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
HA1(BV)-Fc-HA1(BV) 融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示。
pET-28a(+)-HA1(BV)-Fc-HA1(BV)载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示。
重组表达载体pET-28a(+)-HA1(BY)-Fc-HA1(BY)的具体构建方式如下:
表达宿主:小球藻ZY.604。
载体:pET-28a(+)-Up区域(上游同源臂)-CaMV 35S启动子-HA1(乙型Yamagata)-Fc基因-HA1(乙型Yamagata)-NOS终止子-Down区域(下游同源臂)。
重组表达载体基因表达盒连接方式:5’端连接载体上的Xho1酶切位点-Up区域-CaMV 35S启动子-HA1基因(乙型Yamagata系毒株)-linker-Fc基因(人源IgG1-Fc基因)-linker-HA1基因(乙型Yamagata系毒株)-Down区域-3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
HA1(BY)-Fc-HA1(BY)融合基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示。
pET-28a(+)-HA1(BY)-Fc-HA1(BY)载体的基因表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示。
A2、sgRNA的设计
选取小球藻基因组fad3基因进行基因敲除,设计3条SgRNA序列,编号为SgRNA-fad3-123,其sgRNA基因表达框为OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator的结构。将sgRNA基因表达框的5′端添加AflII酶切位点,3′端添加BstEII酶切位点;然后将sgRNA基因表达框片段退火,形成含有粘性末端的片段。
具体的:
载体:pKSE401-OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator。
5′端添加AflII酶切位点-OsU3启动子-SgRNA-1-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-2-gRNA scaffold-Terminator-OsU3启动子-SgRNA-3-gRNA scaffold-Terminator-3′端添加BstEII酶切位点。
SgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
gRNA scaffold的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示。
Terminator的核苷酸序列为:TTTTTTT
SgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SgRNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SgRNA靶序列引物退火PCR反应体系:上游引物6μL、下游引物6μL,引物序列表见表3;PCR反应程序:95℃,变性5min,然后25℃退火反应30min。
A3、重组载体的构建与验证
用限制性内切酶AflII和BstEII酶切pKSE401载体,使pKSE401载体呈线性化骨架。将pKSE401线性化载体与已变性退火的sgRNA基因表达框片段连接,使重组载体形成pKSE401-SgRNA-fad3-123的结构。
连接反应体系为:pKSE401线性化载体10μg、退火sgRNA基因表达框片段4μL、T4连接酶1μL、10×Buffer 2μL、用双蒸水补足至25μL;PCR反应体系:15℃反应2h。
pKSE401线性化载体和退火sgRNA基因表达框连接完成后即为重组载体pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-123。其中鉴定引物序列表见表3(特征序列为JD-F SEQ ID NO.39;JD-RSEQ ID NO.40),将构建的重组载体送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(2)转基因小球藻的构建
B1、小球藻感受态细胞的制备
1)产酶菌的发酵
从-80℃超低温冰箱中取出工作库的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉),待取出保存的菌种融化后,分别接种至不同培养基的试管斜面置于进行活化复苏培养。里氏木霉菌种和黑曲霉菌种培养温度22℃,培养48h;枯草芽孢杆菌的培养温度为30℃,培养48h。
里氏木霉菌种和黑曲霉菌种复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:2%胰蛋白胨、1%木糖醇、0.5%赖氨酸、0.1%磷酸氢二钾,2%琼脂,pH 7.2。
枯草芽孢杆菌复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:0.05%可溶性淀粉、1.5%花生肽、1%精氨酸、0.005%硫酸镁、1%酪氨酸,2%琼脂,pH 6.8。
待产酶菌培养结束后用无菌水分别洗下里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的菌体,分别制备成孢子悬液或菌悬液。使里氏木霉菌种和黑曲霉菌种的孢子悬液孢子数控制在1×107个/ml,使枯草芽孢杆菌的菌悬液含菌数量控制在3×108个/ml。
将里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的孢子悬液或菌悬液按照体积比0.2:2:3的比例混合制备成混合菌悬液。按照体积比0.1%的比例接种至摇瓶培养基,摇瓶培养基的装液量为300ml摇瓶培养基(500ml摇瓶),22℃,100r/min条件下,培养48h。
摇瓶培养基配方,具体为,按质量分数计:1.5%米糠、3%白糖、1%花生肽、0.3%磷酸氢二钾,pH 7.0。
使用的产酶甘油菌种(里氏木霉、枯草芽孢杆菌和黑曲霉)部分内控指标需满足表4。
2)酶解液的制备
待菌种发酵结束后,将上述混合菌发酵液,于25℃,5000r/min,离心40min,上清液过0.22μm的PES滤膜,即得到酶解液。
3)原生质体的制备
从-80℃超低温冰箱中取出10ml冻存的小球藻藻种,待藻种融化后,于20℃,1000r/min,离心20min,弃掉上清液,用15ml新鲜的藻种复苏培养基进行重悬,再轻轻颠倒混匀10次,即得到藻悬液;按体积比吸取10%的藻悬液接种至30ml新鲜的藻种复苏培养基中,20℃培养120h时结束培养,并于22℃,1000r/min,离心20min,弃掉上清液,收集藻细胞沉淀物;用新鲜的藻种复苏培养基洗涤沉淀5次;将酶解液、新鲜的藻种复苏培养基和小球藻藻细胞沉淀物按照体积比2:20:0.5的比例进行涡旋混匀,在45℃,90r/min下酶解100min,酶解结束后于20℃,6000r/min,离心10min,将酶解后的沉淀物用无菌水置换洗涤2次,将酶解后的藻细胞数控制在7×109个/ml,将得到的小球藻原生质体分装后于4℃保存备用。
小球藻的复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:2%麦芽糖、3%L-精氨酸、7%椰子活性肽、1%山梨醇、0.1%磷酸氢二钾、0.05%磷酸二氢钾,pH 7.2。
所述椰子活性肽的制备方法:刮下废弃椰壳内的椰肉蛋白,称取30g粉碎的椰肉蛋白,与10mmol/L的PBST缓冲液(pH5.0),按照质量体积比5:60比例混合;然后将上述混合物于4℃,搅拌粉碎20min,将椰肉蛋白匀浆调节pH至7.5,将质量比5%的复合蛋白酶添加到椰肉蛋白溶液中(E/S,以底物重量计),其中胰蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比3:3混合,于55℃酶解反应0.5h,然后将酶解液置于80℃,灭酶处理10min,再将处理液于4℃,5000r/min,离心20min,收集上清液,过14Kd的透析袋,用去离子水透析60h后,将透析液冷冻干燥,即为椰子活性肽。
B2、小球藻的电转染
取30ml培养至小球藻密度7×109个/ml的藻细胞原生质体,于4℃,3000r/min离心10min,弃掉上清液,用30ml电转缓冲液重悬5次,静置30min。再于4℃条件下,8000r/min离心8min,收集藻体后加入3ml电转缓冲液悬浮,在500μL藻细胞中加入10μg的pET-28a(+)-CZ载体(pET-28a(+)-HA1(H1)-Fc-HA1(H1)、pET-28a(+)-HA1(H3)-Fc-HA1(H3)、pET-28a(+)-HA1(BV)-Fc-HA1(BV)和pET-28a(+)-HA1(BY)-Fc-HA1(BY)按体积比3:4:2:5混合)和60μg的pKSE401-CZ-SgRNA-fad3-123载体并置于电转杯内,于冰上静置15min。经电击后迅速将藻细胞涂布于SX培养基上,于20℃培养静置培养4天。从平板上挑取20个小球藻藻细胞单克隆在复苏SX培养基平板上三区划线,然后继续培养至形成单克隆藻种,然后将单克隆藻种接种至SX培养基上,于20℃,培养4天。
SX培养基配方,具体为,按质量分数计:3%乳糖、1%L-精氨酸、2%糖蜜、5% L-苯丙氨酸、0.05%磷酸氢二钾、0.05%磷酸二氢钾、2%琼脂粉,150μg/ml G418,pH 7.0。
电转缓冲液配方,具体为,按质量分数计:0.8%乳糖、0.02%山梨醇、0.1%氯化镁、0.05%氯化钙、0.5%L-异亮氨酸,pH 7.5。
电转反应条件为:电压500V,电阻280Ω,电容30μF。
B3、转基因小球藻藻细胞悬液的制备与目的基因的鉴定
(1)转基因小球藻藻细胞悬液的制备
1)先将无菌的96孔板中加入电转染用的藻细胞SX养基;其中96孔板第一列中分别加入60μL复苏培养基,剩余各列分别加入10μL复苏培养基,然后在96孔板第一列加入8μL的藻细胞液,移液器吹吸混匀,并作梯度稀释,将藻细胞液进行梯度倍比稀释。
2)将稀释后的含有单细胞藻种的96孔板盖上盖子后用3M胶带封口,并至于光照培养箱中培养。藻细胞培养参数设定为:培养温度20℃,光照周期10L:6D,光照强度60μmol/(m2·s)。
3)将96孔板中的藻种静置培养5天,并定期观察,待培养结束后吸出孔中藻细胞悬液,用于后续藻种扩增培养。
(2)转基因小球藻目的基因的鉴定
吸取藻细胞悬液,提取转基因小球藻基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否存在;以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性3min;98℃变性5s,57℃退火10s,72℃延伸40s,30个循环;72℃终延伸12min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用,对鉴定合格的小球藻进行后续活性鉴定试验。
B4、转基因小球藻活性鉴定
1)目的基因传代稳定性验证
随机挑取一组分选符合要求的藻种单细胞悬液,使其于27℃悬浮培养至藻细胞密度5×107个/ml,然后进行藻种细胞纯化培养:将藻细胞悬液在筛选培养平板(SX培养基)上稀释涂布,并于20℃静置培养5天(即为P1代),用无菌接种环刮取平板上的单藻细胞团,在300ml茄形瓶SX培养基表面上均匀划线培养,于25℃静置培养4天(即为P2代);继续进行连续传代培养至第3代(即为P3代)后,用200ml无菌水洗下第3代的茄瓶中SX培养基上的藻细胞,提取藻细胞基因组DNA,通过PCR方式验证转基因小球藻基因组目的基因是否传代稳定。
以转基因小球藻基因组DNA为模板,目的基因(ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12)上下游引物序列见表2。PCR反应程序:98℃预变性3min;98℃变性5s,57℃退火10s,72℃延伸40s,30个循环;72℃终延伸12min,程序结束后将PCR管置于4℃冰箱待用,对鉴定合格的小球藻进行后续试验。
2)转基因小球藻中融合蛋白的提取
取100ml培养至密度5×105个/ml的转基因小球藻藻细胞发酵液,将其置于20℃条件下,5000r/min离心40min,弃上清,即可制备成小球藻藻泥;采用20mmol/L的PBST缓冲液(pH 5.8)重悬小球藻藻泥3次,得到藻细胞悬液;将藻细胞悬液进行超声破碎,每超声7秒,间隔5秒,超声破碎处理20个循环,然后置于20℃条件下,1000r/min离心40min,上清液即为融合蛋白样品,制备的融合蛋白需满足表4的样品部分内控指标。
B5、转基因小球藻的保存
将符合要求的转基因小球藻进行高密度发酵,待发酵结束后收集转基因小球藻发酵液,并置于4℃条件下,1000r/min离心20min,得到小球藻藻泥,用2倍体积的无菌水重悬藻泥2次,得到藻悬液;并置于4℃条件下,1000r/min离心10min再次离心后弃掉上清,用1倍体积的保护剂稀释藻细胞沉淀,使藻细胞密度控制为2×108个/ml,放置于-80℃超低温冰箱中,并建立转基因小球藻主种子库,主种子库转基因小球藻经连续培养传代至第6代即为转基因小球藻工作库藻种,其保存方式同主种子库。
保护剂原料组分为:0.5%的葡萄糖、2%的甘油、0.3%甘露醇,保护剂溶液pH为7.5。
(3)重组工程藻种高密度发酵
C1、转基因小球藻的复苏
从-80℃超低温冰箱中取出工作库藻种(第6代转基因小球藻),待藻种解冻后,用接种环蘸取少量的藻种液,在含有复苏培养基的方形瓶上均匀划线,置于20℃,静置培养12天。藻种复苏培养参数设定为:培养温度27℃,光照周期12L:6D,光照强度200lx,采用白炽灯光源进行光照培养。
转基因小球藻的复苏培养基配方,具体为,按质量分数计:2%麦芽糖、1% L-精氨酸、2%葡萄糖、5%椰子活性肽、0.1%磷酸氢二钾、0.1%磷酸二氢钾,pH 7.2。
C2、转基因小球藻的一级种子培养
将100ml的种子培养基(不含琼脂)加到茄形瓶中,用细胞刮铲刮下茄形瓶琼脂表面的藻种细胞,将转基因小球藻的藻液混匀后,分装至100ml离心杯中,15~25℃,1000r/min离心20min,弃掉上清液,用100ml的种子培养基再次重悬离心杯中的藻泥,将制备成的藻悬液按照体积比10%的比例接种至5000ml细胞培养瓶(含有一级种子培养基培养(不含琼脂))中进行培养,每2h摇动5次,置于27℃培养5天时结束,即为一级藻种。
转基因小球藻的一级培养参数设定为:光照周期12L:6D,光照强度6000lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照1:1:1。
转基因小球藻的一级种子培养基配方,具体为,按质量分数计:20%甘蔗渣酶解物,30%蚕豆蛋白生物活性肽,0.03%磷酸二氢钾,0.1%磷酸二氢钾,1.5%琼脂,pH 7.0。
甘蔗渣酶解物制备方法:以甘蔗渣为原料,称取80g甘蔗渣,将其粉碎后过10目筛网,将过筛后的甘蔗渣与无菌水按固液比2:40置于800ml的蜀牛玻璃瓶内,于55℃条件下浸泡5h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入100ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至5.0,按质量比0.01%的比例将复合粗酶粉(E/S,以底物重量计)加入到甘蔗渣水解液中,于30℃,150r/min,酶解反应300min,待反应结束后抽滤去除甘蔗残渣获得酶解液,将滤液至于90℃灭酶处理10min,将滤液进行冷冻干燥,即为甘蔗渣酶解物。
复合酶粉的制备:将-80℃超低温冰箱冻存的3株无溶血性的微生物甘油菌种(拟康宁木霉、草酸青霉和哈茨木霉,其中菌种部分内控标准见表4)分别按照2:2:6的比例混合,并按30%的比例接种至250ml的固体产酶培养基中,于30℃,静置培养7天,待菌种孢子长满固体基质后,于75℃下烘干,粉碎至200目。
固体产酶培养基的制备:将大麦种子和黄豆种子浸泡水中24h,然后将大麦种子和黄豆种子沥干水至无水流出,使大麦种子和黄豆种子的含水量控制在52%,然后将装入玻璃瓶内,然后于115℃,灭菌150min。
蚕豆蛋白生物活性肽的制备:
以蚕豆为原料,称取80g蚕豆,将其粉碎后过10目筛网,将过筛后的蚕豆渣与无菌水按固液质量体积比5:10置于500ml的蜀牛玻璃瓶内,于35℃条件下浸泡5h,浸泡结束后滤掉浸泡液,加入100ml的无菌水混匀,将溶液的pH调节至7.0,先按质量体积比7%的比例将中性蛋白酶(E/S,以底物重量计)到蚕豆渣混合液中,55℃,100r/min,酶解反应60min,反应结束后进行灭酶处理(90℃,混合液煮沸5min),然后将溶液的pH调节6.0,再加入质量比5%的风味蛋白酶(E/S,以底物重量计),于25℃,180r/min,酶解反应100min,反应结束后进行灭酶处理(85℃,混合液煮沸2min),水解结束后将滤液于3000r/min,离心10min,取上清液冷冻干燥48h,即为蚕豆蛋白生物活性肽。
C3、转基因小球藻的二级发酵培养
将一级藻种按体积比30%的比例接种至8L二级藻种发酵培养基中,每3h摇动5次,置于27℃培养10天时结束,即为二级藻种。
转基因小球藻的二级培养参数设定为:光照周期12L:6D,光照强度15000lx,采用复合光源进行光照培养,复合光源:白炽灯、LED蓝光和LED红光光照强度按照2:1:1。
转基因小球藻的二级发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:30%甘蔗渣酶解物,60%蚕豆蛋白生物活性肽,0.3%磷酸二氢钾,0.5%磷酸二氢钾,pH 7.0。
C4、转基因小球藻的三级发酵培养
采用150L封闭式生物反应器对转基因小球藻进行高密度发酵。封闭式生物反应器参数:罐体装液量控制在60L,转基因小球藻的细胞接种密度控制在7×109个/ml,藻种接种量按罐体装液量20%的比例接种至封闭式生物反应器中,采用27℃培养100h,待培养结束后以3ml/h/L流速流加罐体装液量体积的1%的外源营养液,再然后将发酵培养温度调到21℃继续培养50h。
外源营养液配方,具体为,按质量分数计:0.5%糊精、2%蛋氨酸,pH 7.0。
转基因小球藻的三级发酵培养基配方,具体为,按质量分数计:50%甘蔗渣酶解物,60%蚕豆蛋白生物活性肽,0.1%磷酸二氢钾,1%磷酸二氢钾,pH 7.0。
(4)融合蛋白的制备
D1、融合蛋白粗提液的制备
将收集的转基因小球藻发酵液置于20℃条件下,5000r/min离心20min,制备成小球藻藻泥;采用10mmol/L的PBST缓冲液(pH 8.0)重悬小球藻藻泥3次,得到藻悬液。
将藻悬液用高速匀浆机处理,处理条件:10000r/min匀浆,温度4℃,用50mmol/L的PBST缓冲液(pH 8.0)将藻细胞稀释至小球藻藻细胞密度6×109个/ml,间歇匀浆5次,每次匀浆5min,将匀浆后的藻液,置于4℃条件下,5000r/min离心5min,弃掉沉淀,收集上清,即为融合蛋白粗提液。
D2、融合蛋白的纯化
将制备的融合蛋白粗提液用0.22μm的囊氏滤器进行过滤,将样品滤液用100Kd的中空纤维柱浓缩10倍,用缓冲液(50mmol/L PBST,5mmol/L精氨酸,pH 8.0)洗滤2次,即为融合蛋白置换液。
采用Rigose MabpureA填料对上述融合蛋白置换液进行第一步纯化。上纯化柱之前,使用0.22μm的PVDF滤膜对样品过滤处理。使用平衡缓冲液(50mmol/L PBST,5mmol/L精氨酸,pH 8.0)进行上样品,上样时柱子温度控制在4℃,使用洗脱缓冲液(10mmol/L柠檬酸钠缓冲液,5mmol/L精氨酸,pH 3.0)进行恒定洗脱,洗脱时柱子的温度控制在20℃,收集洗脱的蛋白纯化样,并将洗脱的蛋白纯化样调节至pH 5.0,即为融合蛋白(初纯液)。
采用Superose 12 Prep Grade填料对上述融合蛋白(初纯液)进行二次纯化,层析柱温度控制在10℃,使用平衡缓冲液(50mmol/L PBST,120mm NaCl,pH 5.0)进行纯化,收集的目标蛋白即为融合蛋白(精纯液)。
各纯化步骤样品检测结果如表8所示。
(5)产朊假丝酵母菌微囊的制备
取10ml的产朊假丝酵母菌液(菌体密度为2×106个/ml),于10℃条件下2000r/min离心30min弃掉上清,再用50ml无菌去离子水反复重悬菌体沉淀4次。
将离心的沉淀分散到pH 10的组氨酸和氢氧化钠缓冲溶液中,再20℃条件下磁力搅拌0.5h,4000r/min离心10min,弃掉上清,用50ml无菌去离子水重悬洗涤5次。
用HCl将溶液调节pH至5.5,再15℃条件下磁力搅拌0.5h,10000r/min离心5min,弃掉上清,用150ml无菌去离子水重悬洗涤6次。
将沉淀至于用10ml异丙醇和丙酮混合液中,其中异丙醇和丙酮按1:0.07,重悬洗涤5次,沉淀物真空冷冻干燥60h。
(6)重组流感疫苗半成品的制备
以产朊假丝酵母菌微囊为疫苗佐剂,将产朊假丝酵母菌微囊和融合蛋白(精纯液)按质量体积比0.5:50混合,于10℃条件下,150r/min搅拌混合2h,然后置于离心机上8000r/min离心20min,获得的沉淀物真空冷冻干燥为冻干粉,即为重组流感疫苗半成品。
(7)重组流感疫苗成品的制备
将上述重组流感疫苗半成品、碳酸氢钠(抗酸调节剂)和麦胚凝集素(生物黏附材料)按质量比20:0.2:0.3混合,压制成微丸;使制备的微丸颗粒每粒控制在0.1g,即为重组流感疫苗成品。
实施例4 藻种特性对比
实验组1为实施例1制备的转基因小球藻;
实验组2为实施例2制备的转基因小球藻;
实验组3为实施例3制备的转基因小球藻;
实验组4采用反复冻融法制备藻种原生质体,其余操作同实施例2;
实验组5工作种子库的藻细胞使用第16代的转基因工程藻种,其余操作同实施例2;
实验组6工作种子库的藻细胞使用第20代的转基因工程藻种,其余操作同实施例2;
实验组7工作种子库的藻细胞使用第40代的转基因工程藻种,其余操作同实施例2;
对照组1未进行小球藻基因的敲除和***,属于原始小球藻藻细胞。
考察藻种的形态特征、藻细胞生物量、蛋白产量、-80℃冻存两年后藻种存活率和目的基因传代稳定性,结果如表9所示。
结果表明,实验组1至实验组7的转基因小球藻均未发生死亡,且经鉴定均能够表达融合蛋白;实验组1至实验组7均为转基因工程藻种,工作种子库藻细胞在不同代次之间藻种形态特征均未发生明显变化,藻种在光学显微镜下观察均呈圆形或近圆形,无鞭毛,在培养基上培养96h后,藻种形态呈深绿色,均与对照组1的藻细胞形态和生长特征一致,均符合小球藻的藻种生长特性;上述8组实验中,藻细胞生物量、蛋白产量和-80℃冻存两年后藻种存活率指标中,以实验组2效果最佳,其他组藻细胞由高到低依次为实验组2>对照组1>实验组5>实验组3>实验组6>实验组7>实验组1>实验组4;其中实验4藻种的藻细胞生物量、蛋白产量和-80℃冻存两年后藻种存活率最差,说明酶法制备藻种原生质体优于反复冻融法,更适宜制备转基因工程藻种;在目的基因稳定性试验考察中发现,除了对照组未鉴定出目的基因外,实验组7发生目的基因缺失外,其余实验组1~6中小球藻的主种子库和工作种子库的藻细胞目的基因在转基因藻种中能够保证稳定存在,且未发生突变,说明工作种子库传至20代的藻细胞构建的转基因工程藻种具有良好的遗传稳定性,有望应用于小球藻基质大流行流感疫苗的生产。
实施例5 重组流感疫苗免疫效果评价
本发明选取SPF级的健康金黄地鼠(LVG Hamster),4周龄,雌雄各半。
实验共设8组,每组120只,每组6个重复,具体实验组别设置如下:
组别1:(实验组1)本发明实施例2制备的转基因小球藻藻种(每次灌胃0.1g处理,3次/日),未攻毒;
组别2:(实验组2)本发明实施例2制备的转基因小球藻藻种(每次灌胃0.1g处理,3次/日),攻毒;
组别3:(实验组3)本发明实施例2方法制备的低剂量组(每次灌胃0.1g处理,1次/日)重组流感疫苗,攻毒;
组别4:(实验组4)本发明实施例2方法制备的中剂量组(每次灌胃0.1g处理,2次/日)重组流感疫苗,攻毒;
组别5:(实验组5)本发明实施例2方法制备的高剂量组(每次灌胃0.1g处理,3次/日)重组流感疫苗,攻毒;
组别6:(对照组1)注射市售四价流感亚单位疫苗,攻毒;
组别7:(对照组2)小球藻藻种(编号:ZY.604)(灌胃0.1g处理),攻毒;
组别8:(对照组3)正常饲养金黄地鼠灌胃0.1g无菌饲料处理,3次/日,未攻毒。
实验地点:在中逸安科生物技术股份有限公司SPF级动物房饲养。
免疫方式:采用灌胃方式通过口腔灌胃金黄地鼠给药,分别于第1、3、7天给药,免疫周期为7天。
免疫后攻毒计划:于免疫第8天进行攻毒实验,所述供试毒株分别为:甲型H1N1系(A/West Virginia/30/2022)、甲型H3N2系(A/Darwin/11/2021)、乙型Yamagata系(B/Brisbane/9/2014)、乙型Victoria系(B/Singapore/WUH4618/2021),攻毒组合形式为:甲型H1N1系、甲型H3N2系、乙型Yamagata系和乙型Victoria系按1:1:1:1组合,其中流感病毒均以1.5×107TCID50,攻毒体积为300μL/只的剂量对金黄地鼠的颈部皮下进行攻毒。考察免疫后第21天的金黄地鼠的体重(若小鼠体重减轻≥25%,则为不符合要求项)、存活率、抗体效价情况,每天观察金黄地鼠健康状态,监测金黄地鼠整个培养过程是否存在异常毒性或过敏反应,并记录金黄地鼠体重及存活情况。产品应用效果研究结果见表10。
结果表明,灌胃无菌饲料的雌雄金黄地鼠(组别8)均存活,无异常毒性或过敏反应发生,且雌雄金黄地鼠均无抗体产生;灌胃小球藻藻种(编号:ZY.604)(组别7)雌雄金黄地鼠攻毒后均无存活,攻毒前无异常毒性或过敏反应发生,且无抗体生产;与组别7相比,灌胃转基因小球藻藻种(灌胃0.1g处理,3次/日,未攻毒)(组别1)的雌雄金黄地鼠均存活,无异常毒性或过敏反应发生,有抗体生产且抗体效价均为1:30,说明原始小球藻不含有抗原蛋白,在雌雄金黄地鼠体内未不会产生抗体,转基因小球藻含有抗原蛋白,能够产生特异性抗体,且具有一定的免疫原性,同时说明服用转基因小球藻是安全的;与组别6(注射市售四价流感亚单位疫苗,攻毒)相比,组别3、组别4和组别5的雌雄金黄地鼠体重、存活率和抗体效价均高于组别6,且以组别4的免疫效果最佳;组别2和组别5相比,组别5为灌胃转基因小球藻(纯化后制备的重组流感疫苗,含有产朊假丝酵母菌微囊为疫苗佐剂)对雌雄金黄地鼠的免疫保护效果好于组别2(灌胃转基因小球藻(未纯化,且不含有产朊假丝酵母菌微囊为疫苗佐剂))。综上所述,本次免疫保护效果由高到低依次为:组别4(实验组4,中剂量组)>组别3(实验组3,低剂量组)>组别5(实验组5,高剂量组)>组别6(对照组,注射市售四价流感亚单位疫苗)>组别2(口服转基因小球藻藻种,攻毒处理。结果显示,服用本发明制备的中剂量规格重组流感疫苗能够明显降低流感病毒的感染,表明基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗具有良好的免疫效果,本研究将为重组流感口服疫苗的产业化应用提供重要技术支撑。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种基于转基因小球藻制备的重组流感疫苗的制备方法,其特征在于,采用Crispr/cas9方法敲除小球藻的fad3基因,将流感甲型H1N1系、甲型H3N2系、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的4种毒株的血凝素HA1基因分别与人源IgG1-Fc基因一起整合到小球藻基因组fad3敲除位置点上,得到转基因小球藻;
之后将构建的转基因小球藻进行高密度发酵、蛋白的提取与纯化,得到含有流感甲型H1N1系、甲型H3N2系、乙型Yamagata系和乙型Victoria系毒株的融合蛋白,然后再与产朊假丝酵母菌微囊佐剂混合后即为重组流感疫苗。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)重组载体的构建
A1、融合基因表达盒的构建
分别将流感毒株H1、流感毒株H3、流感毒株BV和流感毒株BY的HA1血凝素基因与人源IgG1-Fc基因进行组合,构建成融合基因,融合基因的上游添加5’端同源臂,融合基因的下游添加3’端同源臂,以串联的方式连接到pET-28a(+)载体上;
A2、sgRNA的设计
选取小球藻基因组fad3基因进行基因敲除,在fad3基因上设计sgRNA,sgRNA基因表达框结构片段由OsU3启动子、sgRNA、gRNA scaffold和Terminator连接而成;
A3、重组载体的构建
酶切pKSE401载体呈线性化骨架,将pKSE401线性化载体与已变性退火的sgRNA基因表达框连接,形成重组载体;
(2)转基因小球藻的构建
将步骤A1构建的重组载体与步骤A3构建的重组载体经电转染至小球藻中,经基因鉴定构建转基因小球藻;
(3)重组工程藻种高密度发酵
(4)融合蛋白的制备
(5)产朊假丝酵母菌微囊的制备
(6)重组流感疫苗半成品的制备
(7)重组流感疫苗成品的制备。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A1中,融合基因的组合方式为HA1-HA1-Fc、Fc-HA1-HA1或HA1-Fc-HA1。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A1中,融合基因由血凝素HA1基因、血凝素HA1基因、Fc基因之间通过linker序列串联而成;
融合基因5’端连接载体上的Xho1酶切位点,融合基因3’端连接载体上的EcoR1酶切位点。
5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A2中,sgRNA为sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3中的一种或多种;
sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
sgRNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)包括:转基因小球藻的复苏、转基因小球藻的一级种子培养、转基因小球藻的二级发酵培养、转基因小球藻的三级发酵培养。
7.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)包括融合蛋白粗提液的制备和融合蛋白的纯化。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述融合蛋白的纯化依次使用RigoseMabpureA填料和Superose 12 Prep Grade填料进行纯化。
9.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(6)的具体操作为:以产朊假丝酵母菌微囊为疫苗佐剂,将产朊假丝酵母菌微囊和融合蛋白混合,于4~15℃条件下,80~150r/min搅拌混合2~5h,然后置于离心机上5000~10000r/min离心10~20min,获得的沉淀物真空冷冻干燥为冻干粉,即为重组流感疫苗半成品。
10.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(7)的具体操作为:将重组流感疫苗半成品、碳酸氢钠和麦胚凝集素按质量比20~300:0.05~0.2:0.1~0.5混合,压制成微丸;使制备的微丸颗粒每粒控制在0.1g,即为重组流感疫苗成品。
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