CN117836408A - 用于机电转染的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于机电细胞转染的方法、装置、***和套件。装置包括第一电极、第二电极和在它们之间的有源区，其中施加于所述第一电极和所述第二电极的电势差在所述有源区中产生足以对所述有源区中流动的至少一个细胞亚群进行转染的电场。
Description
联邦政府资助研究的声明
本发明根据国家科学基金会颁发的SBIR第I阶段授权号1747096和SBIR第II阶段授权号1853194在政府的支持下进行。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
免疫疗法目前处于基础科学研究和药物驱动的临床应用的前沿。这种趋势部分是由于靶基因修饰的最新进展以及CRISPR/Cas复合物编辑在治疗开发中的广泛使用。为了鉴定具有治疗意义的遗传修饰，研究组织通常不得不筛选成千上万的遗传变异，这些遗传变异可以包括内源基因的修饰或经工程化的基因的***。这种药物发现过程是很费力的，通常需要在实验室内进行大量的体力劳动，由于缺乏适当的高通量技术因此给整个行业造成了瓶颈。
生物技术和制药研究与开发活动已转变为使流程的几乎所有步骤都自动化。工作流程包括由复杂的实验室管理软件提供支持以实现高通量发现的液体处理机器人。然而，转染步骤的局限在于低通量、效率低下的技术以及无法自动化的使用者密集型***。用于转染的自动化平台不仅具有大幅降低过程成本的潜力，而且还增加了细胞活力和成功工程化的细胞的数量，同时还减少了发现时间，这在竞争性免疫疗法领域是至关重要的。
通过电穿孔转染的独特优势是RNA递送。现有的递送DNA的病毒技术似乎可与电穿孔转染相提并论，但是缺乏GMP质量的非逆转录病毒RNA病毒。所以，为了达到将mRNA递送至细胞中的目的，具有电穿孔平台的公司一直是合作和收购的目标。
目前的高通量基因转移方法通常需要使用病毒递送(例如慢病毒载体)，其中病毒颗粒感染细胞并且转导所关注的遗传修饰。虽然病毒学方法可以应用于高通量自动化***，但是生产中存在局限性，这种局限性延长了研究工作的时间线：病毒载体必须克隆，转染至病毒产生系中，然后病毒颗粒必须纯化。这个过程可能要耗费研究组织数月的时间，从而显著地影响了平台开发的时间线，同时增加了药物发现的成本。另外，使用病毒转导进行基因转移并不适合所有细胞类型的遗传修饰，因为某些细胞(诸如特异性免疫细胞亚群)对病毒感染具有耐受性。因此，在生物技术行业内，对于不依赖于病毒递送机制的用于基因转移的高通量自动化***的需求仍未得到满足。
发明内容
我们通过本文所述的工作证明，采用机电转染的非病毒方法(包括使用电场和高流体流速)是用于开发和制造离体细胞疗法的可扩展策略。与基于纯电场或基于纯机械的穿孔方法不同，机电转染的组合效应使得以高效率和低毒性递送遗传物质。本发明首次表明机电转染可成功用于人原代T细胞。利用可商购获得的液体处理***，观察到对扩增的T细胞的递送的快速优化，效率大于90％且活力大于80％。在多种使用情况下评估优化的机电转染参数的确认，所述情况包括递送至幼稚T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、递送多种有效负载以及在50倍放大演示中。此外，转录组和本体分析显示，通过机电转染的高效率、高活力递送导致基因失调最小(与基线相比仅2％的变化)。本发明证明，非病毒机电转染是用于细胞和基因治疗工程和开发的有效且可扩展的方法。
因此，在一个方面，本发明提供一种使用本发明的装置或***中的任一者来将组合物(例如，通过机电转染)引入到悬浮于流动液体中的多个哺乳动物细胞中的方法。特别地，本发明的方法包括提供装置，所述装置包括具有第一入口和第一出口的进入区；第一电极和第二电极；以及包括第二入口和第二出口的有源区。所述方法还包括选择电场(E)、平均流速(u)、有源区中的水力直径(d)、液体电导率(σ)、液体动态粘度(μ)和液体密度(ρ)的组合，以给出值在1×108与1×1010之间的无量纲参数Π5；其中无量纲参数Π5由表示。所述方法还包括使多个细胞和组合物穿过有源区，同时提供所选择的(E)、(u)、(d)、(σ)、(μ)和(ρ)的组合，从而将组合物引入到多个哺乳动物细胞中。
在一些实施方案中，将组合物以以下通量引入到多个细胞中：每个有源区至少1×105个细胞/分钟，例如105个细胞/分钟至1012个细胞/分钟，例如105个细胞/分钟至106个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟至5×106个细胞/分钟、106个细胞/分钟至107个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟至5×107个细胞/分钟、107个细胞/分钟至108个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟至5×108个细胞/分钟、108个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟至5×109个细胞/分钟、109个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟至5×1010个细胞/分钟或1010个细胞/分钟至1011个细胞/分钟，例如每个有源区约103个细胞/分钟、5×103个细胞/分钟、104个细胞/分钟、5×104个细胞/分钟、105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟、106个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟、107个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟、108个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟、109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟、1010个细胞/分钟、5×1010个细胞/分钟或1011个细胞/分钟。
在一些实施方案中，进入区和有源区被构造为提供增加的平均流速，例如相对于进入区中的平均流速。
在另一方面，本发明提供了一种将组合物引入到悬浮于流动液体中的多个细胞中的方法。所述方法包括提供装置，所述装置包括具有第一入口和第一出口的进入区、第一电极和第二电极以及包括第二入口和第二出口的有源区。所述方法还包括使多个细胞和组合物穿过有源区，同时提供来自第一电极和第二电极的电能，并同时提供至少部分地来自平均流速的机械能，其中机械能和电能一起使得将组合物引入到多个细胞中，其效率、产率和/或活力至少等于单独的电穿孔或机械穿孔，且比电穿孔或机械穿孔需要更少的电能或机械能来实现所述效率、产率和/或活力。
在一些实施方案中，将组合物以以下通量引入：每个有源区至少1×105个细胞/分钟/，例如105个细胞/分钟至106个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟至5×106个细胞/分钟、106个细胞/分钟至107个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟至5×107个细胞/分钟、107个细胞/分钟至108个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟至5×108个细胞/分钟、108个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟至5×109个细胞/分钟、109个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟至5×1010个细胞/分钟或1010个细胞/分钟至1011个细胞/分钟，例如每个有源区约103个细胞/分钟、5×103个细胞/分钟、104个细胞/分钟、5×104个细胞/分钟、105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟、106个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟、107个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟、108个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟、109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟、1010个细胞/分钟、5×1010个细胞/分钟、1011个细胞/分钟、5×1011个细胞/分钟或1012个细胞/分钟。
在一些实施方案中，由电场提供的电能与由有源区中的压降和流速的乘积提供给流动液体的机械能的比率在103∶1和106∶1之间，例如103∶1和105∶1之间、104∶1和106∶1之间、103∶1和104∶1之间或105∶1和106∶1之间(例如约103∶1、104∶1、105∶1或106∶1)。在一些实施方案中，进入区和有源区被构造为提供增加的平均流速。
本发明的另一方面提供了一种将组合物引入到悬浮于流动液体中的多个细胞中的方法。所述方法包括提供装置，所述装置包括具有第一入口和第一出口的进入区、第一电极和第二电极以及包括第二入口和第二出口并具有水力直径(d)的有源区。所述方法还包括提供多个细胞的测试部分和测试组合物，它们一起具有液体电导率(σ)、液体动态粘度(μ)和液体密度(ρ)，以及细胞与组合物的比率，并使测试部分和测试组合物以平均流速(u)穿过有源区，同时施加电场(E)，其中(u)、(E)、(σ)、(μ)和(ρ)中的至少一个为改变的。所述方法还包括确定无量纲参数Π5的范围，其包括最大产率、效率和/或细胞活力，用于将测试组合物引入到多个细胞的测试部分中，其中然后使多个细胞和组合物以对应于Π5值的(u)、(E)、(σ)、(μ)和(ρ)的组合穿过有源区，所述值包括最大产率、效率或细胞活力中的至少一种，从而将组合物引入到多个细胞中。
在一些实施方案中，重复范围确定，其中多个细胞的测试部分和测试组合物具有第二细胞与组合物比率，和/或其中有源区具有第二水力直径(d)。
在一些实施方案中，所述方法包括在Π5范围确定步骤期间，在保持电场(E)恒定的同时改变平均速度(μ)，或者在保持平均流速(u)恒定的同时改变电场(E)。
在一些实施方案中，将组合物以以下通量引入：每个有源区至少1×105个细胞/分钟，例如每个有源区105个细胞/分钟至1012个细胞/分钟，例如每个有源区105个细胞/分钟至106个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟至5×106个细胞/分钟、106个细胞/分钟至107个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟至5×107个细胞/分钟、107个细胞/分钟至108个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟至5×108个细胞/分钟、108个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟至5×109个细胞/分钟、109个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟至5×1010个细胞/分钟或1010个细胞/分钟至1011个细胞/分钟，例如每个有源区约105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟、106个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟、107个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟、108个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟、109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟、1010个细胞/分钟、5×1010个细胞/分钟、1011个细胞/分钟、5×1011个细胞/分钟或1012个细胞/分钟。
在一些实施方案中，进入区和有源区被构造为提供增加的平均流速(u)。
在另一方面，本发明提供了一种将组合物引入到多个人免疫细胞中的方法，所述免疫细胞分离自从正常患者或供体血液中收集的悬浮液并悬浮于流动液体中。所述方法包括提供装置，所述装置包括含有第一入口和第一出口的进入区、第一电极和第二电极以及含有第二入口和第二出口的有源区。所述方法还包括选择电场(E)、平均流速(u)、有源区中的水力直径(d)、液体电导率(σ)、液体动态粘度(μ)(例如，通过旋转粘度测定法测量)和液体密度(ρ)的组合，以给出值在1×108与1×1010之间的无量纲参数Π5；其中无量纲参数Π5由表示。所述方法还包括使多个细胞和组合物穿过有源区，同时提供所选择的(E)、(u)、(d)、(σ)、(μ)和(ρ)的组合，从而将组合物引入到多个人免疫细胞中，以产生治疗剂量的转染细胞。
在一些实施方案中，使用白细胞分离术制备悬浮液。在一些实施方案中，将组合物以以下通量引入到多个细胞中：每个有源区至少1×105个细胞/分钟，例如每个有源区105个细胞/分钟至1012个细胞/分钟，例如每个有源区105个细胞/分钟至106个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟至5×106个细胞/分钟、106个细胞/分钟至107个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟至5×107个细胞/分钟、107个细胞/分钟至108个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟至5×108个细胞/分钟、108个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟至5×109个细胞/分钟、109个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟至5×1010个细胞/分钟或1010个细胞/分钟至1011个细胞/分钟，例如每个有源区约105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟、106个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟、107个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟、108个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟、109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟、1010个细胞/分钟、5×1010个细胞/分钟、1011个细胞/分钟、5×1011个细胞/分钟或1012个细胞/分钟。在一些实施方案中，进入区和有源区被构造为提供增加的平均流速，例如相对于通过进入区的流速。在一些实施方案中，将组合物引入到多个哺乳动物细胞中，而不改变所需的细胞表面标志物。细胞表面标志物包括但不限于CD3、CD4、CD8、CD19、CD45RA、CD45RO、CD28、CD44、CD69、CD80、CD86、CD206、IL-2受体、CTLA4、OX40、PD-1、TIM3、CD56、TNFa、IFNg、LAG3、TCRα/β、CD64、SIRP α/β(CD172a/b)、巢蛋白、CD325(N-钙粘蛋白)、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CDl97(CCR7)、CD27、CD11b、CCR7(CD197)、CD16、CD56、TIGIT、TRA-1-60、同源域蛋白(Nanog)、TCRγ/δ、OCT4、T-bet、GATA-3、FoxP3、IL-17、B220、CD25、IgM、PD-L1、IL-23、IL-12、CD11c和F4/80。
在任一前述方面的一些实施方案中，有源区包括大于100μm(例如100μm至10mm、150μm至15mm、200μm至10mm、250μm至5mm、500μm至10mm、1mm至10mm、1mm至50mm、5mm至25mm或20mm至50mm，例如约0.5mm、1.0mm、1.5mm、2mm、5mm、10mm、15mm、25mm或50mm)的最小水力直径。在任一前述方面的一些实施方案中，有源区包括大于多个细胞中的平均细胞直径的最小水力直径，例如平均细胞直径的至少1.1倍，例如平均细胞直径的1和10倍之间(例如，1-2倍、2-3倍、3-4倍、4-5倍、5-6倍、6-7倍、7-8倍、8-9倍或1-10倍)，或例如平均细胞直径的10和100倍之间(例如10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或10-100倍)，或例如平均细胞直径的100和1,000倍之间(例如100-200倍、200-300倍、300-400倍、400-500倍、500-600倍、600-700倍、700-800倍、800-900倍或100-1,000倍)，或例如平均细胞直径的1,000和10,000倍之间(例如1,000-2,000倍、2,000-3,000倍、3,000-4,000倍、4,000-5,000倍、5,000-6,000倍、6,000-7,000倍、7,000-8,000倍、8,000-9,000倍或1,000-10,000倍)，或例如大于平均细胞直径的10,000倍，例如平均细胞直径的12,000倍、15,000倍、18,000倍或20,000倍。
在任一前述方面的一些实施方案中，有源区具有基本上均一的横截面面积。
在任一前述方面的一些实施方案中，通过有源区的流速在0.001mL/min和1,000mL/min之间(例如0.001mL/min和0.05mL/min之间、0.001mL/min和0.1mL/min之间、0.001mL/min和1mL/min之间、0.05mL/min和0.5mL/min之间、0.05mL/min和5mL/min之间、0.1mL/min和1mL/min之间、0.5mL/min和2mL/min之间、1mL/min和5mL/min之间、1mL/min和10mL/min之间、1mL/min和100mL/min之间、5mL/min和25mL/min之间、5mL/min和150mL/min之间、10mL/min和100mL/min之间、15mL/min和150mL/min之间、25mL/min和100mL/min之间、25mL/min和200mL/min之间、50mL/min和150mL/min之间、50mL/min和250mL/min之间、75mL/min和200mL/min之间、75mL/min和350mL/min之间、100mL/min和250mL/min之间、100mL/min和400mL/min之间、150mL/min和450mL/min之间、200mL/min和500mL/min之间、250mL/min和700mL/min之间、300mL/min和1,000mL/min之间、400mL/min和750mL/min之间、500mL/min和1,000mL/min之间或750mL/min和1,000mL/min之间，例如约0.001mL/min、0.01mL/min、0.05mL/min、0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、5mL/min、10mL/min、15mL/min、20mL/min、30mL/min、40mL/min、50mL/min、60mL/min、70mL/min、80mL/min、90mL/min、100mL/min、150mL/min、200mL/min、250mL/min、300mL/min、350mL/min、400mL/min、450mL/min、500mL/min、600mL/min、700mL/min、800mL/min、900mL/min或1,000mL/min)。
在任一前述方面的一些实施方案中，有源区中流动液体的雷诺数(ρud/μ)(基于有源区的水力直径(d))为10和3000之间(例如，10和2000之间、100和1600之间、100和1800之间或183和1530之间)。
在一些实施方案中，悬浮液中的流动液体流过有源区的平均流速为1×10-2m/s和10m/s之间，例如0.01和1m/s之间(例如0.01和0.05m/s之间、0.05和0.1m/s之间、0.1和0.5m/s之间、0.5和1m/s之间、1.5和2m/s之间、1和2m/s之间、2和3m/s之间、3和4m/s之间、4和5m/s之间、5和6m/s之间、6和7m/s之间、7和8m/s之间、8和9m/s之间或9和10m/s之间)，例如0.1和5m/s之间、0.4和1.4m/s之间、0.65和1.3m/s之间或0.26和2.08m/s之间，例如约0.1m/s、0.2m/s、0.3m/s、0.4m/s、0.5m/s、0.6m/s、0.7m/s、0.8m/s、0.9m/s、1.0m/s、1.1m/s、1.2m/s、1.3m/s、1.4m/s、1.5m/s、2m/s、3m/s、4m/s、5m/s、6m/s、7m/s、8m/s、9m/s或10m/s。
在一些实施方案中，悬浮液中的流动液体在穿过有源区时的峰值压力在1×10-3Pa和9.5×104Pa之间(例如0.1Pa和10,000Pa之间、1Pa和5,000Pa之间、100Pa和3000Pa之间或136Pa和1600Pa之间)。
在任一前述方面的一些实施方案中，悬浮于液体中的多个细胞中的任何细胞在有源区中的停留时间为0.1ms和50ms之间(例如0.1和0.5ms之间、0.5ms和5ms之间、1ms和10ms之间、1ms和15ms之间、5ms和15ms之间、10ms和20ms之间、15ms和25ms之间、20ms和30ms之间、25ms和35ms之间、30ms和40ms之间、35ms和45ms之间或40ms和50ms之间，例如约0.5ms、0.6ms、0.7ms、0.8ms、0.9ms、1ms、1.5ms、2ms、2.5ms、3ms、3.5ms、4ms、4.5ms、5ms、5.5ms、6ms、6.5ms、7ms、7.5ms、8ms、8.5ms、9ms、9.5ms、10ms、10.5ms、11ms、11.5ms、12ms、12.5ms、13ms、13.5ms、14ms、14.5ms、15ms、20ms、25ms、30ms、35ms、40ms、45ms或50ms)。在一些实施方案中，停留时间为5-20ms(例如，6-18ms、8-15ms或10-14ms)。
在任一前述方面的一些实施方案中，电场由电压脉冲产生，其中所述电压脉冲以特定的施加电压使第一电极通电，同时第二电极以特定施加的电压通电，从而在第一电极和第二电极之间施加电势差，其中所述电压脉冲各自具有的幅度在-3kV和3kV之间(例如，在-3kV和1kV之间、在-3kV和-1.5kV之间、在-2kV和2kV之间、在-1.5kV和1.5kV之间、在-1.5kV和2.5kV之间、在-1kV和1kV之间、在-1kV和2kV之间、在-0.5kV和0.5kV之间、在-0.5kV和1.5kV之间、在-0.5kV和3kV之间、在-0.01kV和2kV之间、在0kV和1kV之间、在0kV和2kV之间、在0kV和3kV之间、在0.01kV和0.1kV之间、在0.01kV和1kV之间、在0.02kV和0.2kV之间、在0.03kV和0.3kV之间、在0.04kV和0.4kV之间、在0.05kV和0.5kV之间、在0.05kV和1.5kV之间、在v.06kV和0.6kV之间、在0.07kV和0.7kV之间、在0.08kV和0.8kV之间、在0.09kV和0.9kV之间、在0.1kV和0.7kV之间、在0.1kV和1kV之间、在0.1kV和2kV之间、在0.1kV和3kV之间、在0.15kV和1.5kV之间、在0.2和0.6kV之间、在0.2kV和2kV之间、在0.25kV和2.5kV之间、在0.3kV和3kV之间、在0.5kV和1kV之间、在0.5kV和3kV之间、在0.6kV和1.5kV之间、在0.7kV和1.8kV之间、在0.8kV和2kV之间、在0.9kV和3kV之间、在1kV和2kV之间、在1.5kV和2.5kV之间、或在2kV和3kV之间，例如，约-3kV、-2.5kV、-2kV、-1.5kV、-1kV、-0.5kV、-0.01kV、0kV、0.01kV、0.02kV、0.03kV、0.04kV、0.05kV、0.06kV、0.07kV、0.08kV、0.09kV、0.1kV、0.2kV、0.3kV、0.4kV、0.5kV、0.6kV、0.7kV、0.8kV、0.9kV、1kV、1.1kV、1.2kV、1.3kV、1.4kV、1.5kV、1.6kV、1.7kV、1.8kV、1.9kV、2kV、2.1kV、2.2kV、2.3kV、2.4kV、2.5kV、2.6kV、2.7kV、2.8kV、2.9kV或3kV)。在一些实施方案中，第一电极以特定的施加电压通电，同时第二电极保持接地(例如，0kV)，从而在第一电极和第二电极之间施加电势差。在一些实施方案中，电压脉冲具有的持续时间在0.01ms和1,000ms之间(例如，在0.01ms和0.1ms之间、在0.01ms和1ms之间、在0.01ms和10ms之间、在0.05ms和0.5ms之间、在0.05ms和1ms之间、在0.1ms和1ms之间、在0.1ms和5ms之间、在0.1ms和500ms之间、在0.5ms和2ms之间、在1ms和5ms之间、在1ms和10ms之间、在1ms和25ms之间、在1ms和100ms之间、在1ms和1,000ms之间、在5ms和25ms之间、在5ms和150ms之间、在10ms和100ms之间、在15ms和150ms之间、在25ms和100ms之间、在25ms和200ms之间、在50ms和150ms之间、在50ms和250ms之间、在75ms和200ms之间、在75ms和350ms之间、在100ms和250ms之间、在100ms和400ms之间、在150ms和450ms之间、在200ms和500ms之间、在250ms和700ms之间、在300ms和1,000ms之间、在400ms和750ms之间、在500ms和1,000ms、或在750ms和1,000ms之间，例如，约0.01ms、0.05ms、0.1ms、0.5ms、1ms、5ms、10ms、15ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、150ms、200ms、250ms、300ms、350ms、400ms、450ms、500ms、600ms、700ms、800ms、900ms或1,000ms)。在一些实施方案中，电压脉冲具有至少1000ms的持续时间。在一些实施方案中，电压脉冲以在1Hz和50,000Hz之间的频率施加于第一电极和第二电极(例如，在1Hz和10Hz之间、在1Hz和100Hz之间、在1Hz和1,000Hz之间、在5Hz和20Hz之间、在5Hz和2,000Hz之间、在10Hz和50Hz之间、在10Hz和100Hz之间、在10Hz和1,000Hz之间、在10Hz和10,000Hz之间、在20Hz和50Hz之间、在20Hz和100Hz之间、在20Hz和2.000Hz之间、在20Hz和20,000Hz之间、在50Hz和500Hz之间、在50Hz和1,000Hz之间、在50Hz和50,000Hz之间、在100Hz和200Hz之间、在100Hz和500Hz之间、在100Hz和1,000Hz之间、在100Hz和10,000Hz之间、在100Hz和50,000Hz之间、在200Hz和400Hz之间、在200Hz和750Hz之间、在200Hz和2.000Hz之间、在500Hz和1.000Hz之间、在750Hz和1.500Hz之间、在750Hz和10,000Hz之间、在1,000Hz和2,000Hz之间、在1,000Hz和5,000Hz之间、在1,000Hz和10,000Hz之间、在1,000Hz和50,000Hz之间、在5,000Hz和10,000Hz之间、在5,000Hz和20,000Hz之间、在5,000Hz和50,000Hz之间、在10,000Hz和15,000Hz之间、在10,000Hz和25,000Hz之间、在10,000Hz和50,000Hz之间、在20,000Hz和30,000Hz之间、或在20,000和50,000Hz之间，例如，约1Hz、5Hz、10Hz、20Hz、50Hz、75Hz、100Hz、150Hz、200Hz、300Hz、400Hz、500Hz、600Hz、700Hz、800Hz、900Hz、1,000Hz、2,000Hz、5,000Hz、10,000Hz、15,000Hz、20,000Hz、30,000Hz、40,000Hz或50,000Hz)。
在一些实施方案中，电压脉冲的波形选自由以下各项组成的组：DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形以及它们的任何叠加或组合。在一些实施方案中，由电压脉冲产生的电场具有100V/cm和50,000V/cm之间的幅度(例如100V/cm和500V/cm之间、100V/cm和1,000V/cm之间、100V/cm和2,000V/cm之间、100V/cm和5,000V/cm之间、250V/cm和2000V/cm之间、500V/cm和2500V/cm之间、500V/cm和5,000V/cm之间、500V/cm和1,500V/cm之间、300V/cm和500V/cm之间、1000V/cm和2,000V/cm之间，例如约100V/cm、150V/cm、200V/cm、250V/cm、300V/cm、350V/cm、400V/cm、450V/cm、500V/cm、550V/cm、600V/cm、650V/cm、700V/cm、750V/cm、800V/cm、900V/cm、1,000V/cm或2,000V/cm)。
在一些实施方案中，电压脉冲的占空比为1％和100％之间(例如1％和10％之间、1％和97％之间、2.5％和20％之间、5％和25％之间、5％和40％之间、10％和25％之间、10％和50％之间、10％和95％之间、15％和60％之间、15％和85％之间、20％和40％之间、30％和50％之间、40％和60％之间、40％和75％之间、50％和85％之间、50％和100％之间、75％和100％之间或90％和100％之间，例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。
在一些实施方案中，液体具有的电导率在0.001mS/cm和500mS/cm之间(例如，在0.001mS/cm和0.05mS/cm之间、在0.001mS/cm和0.1mS/cm之间、在0.001mS/cm和1mS/cm之间、在0.05mS/cm和0.5mS/cm之间、在0.05mS/cm和5mS/cm之间、在0.1mS/cm和1mS/cm之间、在0.1mS/cm和100mS/cm之间、在0.5mS/cm和2mS/cm之间、在1mS/cm和5mS/cm之间、在1mS/cm和10mS/cm之间、在1mS/cm和100mS/cm之间、在1mS/cm和500mS/cm之间、在5mS/cm和25mS/cm之间、在5mS/cm和150mS/cm之间、在10mS/cm和100mS/cm之间、在10mS/cm和250mS/cm之间、在15mS/cm和150mS/cm之间、在25mS/cm和100mS/cm之间、在25mS/cm和200mS/cm之间、在50mS/cm和150mS/cm之间、在50mS/cm和250mS/cm之间、在50mS/cm和500mS/cm之间、在75mS/cm和200mS/cm之间、在75mS/cm和350mS/cm之间、在100mS/cm和250mS/cm之间、在100mS/cm和400mS/cm之间、在100mS/cm和500mS/cm之间、在150mS/cm和450mS/cm之间、在200mS/cm和500mS/cm之间、在300mS/cm和500mS/cm之间，例如约0.001mS/cm、0.01mS/cm、0.05mS/cm、0.1mS/cm、0.5mS/cm、1mS/cm、5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、30mS/cm、40mS/cm、50mS/cm、60mS/cm、70mS/cm、80mS/cm、90mS/cm、100mS/cm、150mS/cm、200mS/cm、250mS/cm、300mS/cm、350mS/cm、400mS/cm、450mS/cm或500mS/cm)。
在一些实施方案中，悬浮于液体中的多个细胞的温度为0℃和50℃之间(0℃和5℃之间、2℃和15℃之间、3℃和30℃之间、4℃和10℃之间、4℃和25℃之间、5℃和30℃之间、7℃和35℃之间、10℃和25℃之间、10℃和40℃之间、15℃和50℃之间、20℃和40℃之间、25℃和50℃之间或35℃和45℃之间，例如约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃)。
在一些实施方案中，所述方法还包括在转染后将悬浮于液体中的多个细胞储存于回收缓冲液中。在一些实施方案中，细胞在引入组合物后具有0.1％至99.9％之间的活力(例如0.1％和5％之间、1％和10％之间、2.5％和20％之间、5％和40％之间、10％和30％之间、10％和60％之间、10％和90％之间、25％和40％之间、25％和85％之间、30％和50％之间、30％和80％之间、40％和65％之间、50％和75％之间、50％和99.9％之间、60％和80％之间、75％和99.9％之间或85％和99.9％之间，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％)。
在一些实施方案中，组合物以0.1％和99.9％之间(例如，0.1％和5％之间、1％和10％之间、2.5％和20％之间、5％和40％之间、10％和30％之间、10％和60％之间、10％和90％之间、25％和40％之间、25％和85％之间、30％和50％之间、30％和80％之间、40％和65％之间、50％和75％之间、50％和99.9％之间、60％和80％之间、75％和99.9％之间或85％和99.9％之间，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％)的效率引入到多个细胞中。
在一些实施方案中，所述方法产生0.1％和100％之间(例如，0.1％和5％之间、1％和10％之间、2.5％和20％之间、5％和40％之间、10％和30％之间、10％和60％之间、10％和90％之间、25％和40％之间、25％和85％之间、30％和50％之间、30％和80％之间、40％和65％之间、50％和75％之间、50％和100％之间、60％和80％之间、75％和100％之间、85％和100％之间，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的细胞回收率。在一些实施方案中，所述方法在转染后24小时产生0.1％和500％之间(例如，0.1％和5％之间、1％和10％之间、2.5％和20％之间、5％和40％之间、10％和30％之间、10％和60％之间、10％和90％之间、25％和40％之间、25％和85％之间、30％和50％之间、30％和80％之间、40％和65％之间、50％和75％之间、50％和100％之间、60％和80％之间、60％和150％之间、75％和100％之间、75％和200％之间、85％和150％之间、90％和250％之间、100％和200％之间、100％和400％之间、150％和300％之间、200％和500％之间或300％和500％之间，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、150％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％或500％)的活工程化细胞产率(例如，回收产率)。
在一些实施方案中，所述方法在转染后立即产生0.1％和100％之间(例如，0.1％和5％之间、1％和10％之间、2.5％和20％之间、5％和40％之间、10％和30％之间、10％和60％之间、10％和90％之间、25％和40％之间、25％和85％之间、30％和50％之间、30％和80％之间、40％和65％之间、50％和75％之间、50％和100％之间、60％和80％之间、60％和90％之间、75％和100％之间或85％和100％之间，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100)的活工程化细胞产率(例如，回收产率)。
在一些实施方案中，递送至多个细胞(例如，机电递送至多个细胞)的组合物包含至少一种选自由以下各项组成的组的化合物：治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的分子、不带电的分子、经工程化的核酸酶、DNA、RNA、CRISPR-Cas复合物、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(mn)、大范围TAL、酶、转座子、肽、蛋白质、病毒、聚合物、核糖核蛋白(RNP)和多糖。在一些实施方案中，组合物在液体中的浓度为0.0001μM和20μM之间(例如0.0001μM至0.001μM、0.001μM至0.01μM、0.001μM至5μM、0.005μM至0.1μM、0.01μM至0.1μM、0.01μM至1μM、0.1μM至1μM、0.1μM至5μM、1μM至10μM、1μM至15μM或1μM至20μM，例如约0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM)。在一些实施方案中，组合物在液体中的浓度为0.0001μg/mL和1,000μg/mL之间(例如0.0001μg/mL至0.001μg/mL、0.001μg/mL至0.01μg/mL、0.001μg/mL至5μg/mL、0.005μg/mL至0.1μg/mL、0.01μg/mL至0.1μg/mL、0.01μg/mL至1μg/mL、0.1μg/mL至1μg/mL、0.1μg/mL至5μg/mL、1μg/mL至10vg/mL、1μg/mL至50μg/mL、1μg/mL至100μg/mL、2.5μg/mL至15μg/mL、5μg/mL至25μg/mL、5μg/mL至50μg/mL、5μg/mL至500μg/mL、7.5μg/mL至75μg/mL、10μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至1,000μg/mL、25μg/mL至50μg/mL、25μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至500μg/mL、50μg/mL至100μg/mL、50μg/mL至250μg/mL、50μg/mL至750μg/mL、100μg/mL至300μg/mL、100μg/mL至1,000μg/mL、200μg/mL至400μg/mL、250μg/mL至500μg/mL、350μg/mL至500μg/mL、400μg/mL至1,000μg/mL、500μg/mL至750μg/mL、650μg/mL至1,000μg/mL或800μg/mL至1,000μg/mL，例如约0.0001μg/mL、0.0005μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.03μg/mL、0.04μg/mL、0.05μg/mL、0.06μg/mL、0.07μg/mL、0.08μg/mL、0.09μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL、4.5μg/mL、5μg/mL、5.5μg/mL、6μg/mL、6.5μg/mL、7μg/mL、7.5μg/mL、8μg/mL、8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、500μg/mL、550μg/mL、600μg/mL、650μg/mL、700μg/mL、750μg/mL、800μg/mL、850μg/mL、900μg/mL、950μg/mL或1,000μg/mL)。
在任一前述方面的一些实施方案中，悬浮于液体中的多个细胞包括真核细胞(例如，动物细胞，例如，人细胞)、原核细胞(例如，细菌细胞)、植物细胞和/或合成细胞。细胞可以是原代细胞(例如，原代人细胞)、来自细胞系(例如，人细胞系)的细胞、悬浮液中的细胞、贴壁细胞、干细胞、血细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC))和/或免疫细胞(例如，白细胞(例如，先天免疫细胞或适应性免疫细胞))。在一些实施方案中，细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞或抗原呈递细胞)是未刺激的细胞、刺激的细胞或活化的细胞。在一些实施方案中，细胞是适应性免疫细胞和/或先天免疫细胞。在一些实施方案中，多个细胞包括抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、人胚肾(HEK-293)细胞、中国仓鼠卵巢(例如，CHO-K1)细胞、胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。在一些实施方案中，细胞可以是原代人T细胞、原代人巨噬细胞、原代人单核细胞、原代人NK细胞或原代人诱导性多能干细胞(iPSC)。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，所述方法还包括在穿孔后将悬浮于液体中的多个细胞储存于回收缓冲液中。
在任一前述方面的一些实施方案中，本发明提供了一种套件，其包括本文所述的任何装置或***；以及例如多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每一个包括：壳体，所述壳体被构造为包裹至少一个装置的第一电极、第二电极和有源区；第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至第一电极；以及第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至第二电极。在一些实施方案中，所述多个外部结构整合至所述多个装置。在一些实施方案中，所述多个外部结构可释放地连接至所述多个装置。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为降低所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置(Peltierdevice)。
在任一前述方面的一些实施方案中，本发明提供了一种用于将组合物引入到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，其中所述套件包括本文所述的多个装置和被构造为包裹所述多个装置的多个外部结构，其中所述多个外部结构中的每一个包括：壳体，所述壳体被构造为包裹至少一个装置的第一电极、第二电极和有源区；第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至第一电极；以及第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至第二电极。在一些实施方案中，所述多个外部结构整合至所述多个装置。在一些实施方案中，所述多个外部结构可释放地连接至所述多个装置。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为降低所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
在任一前述方面的一些实施方案中，本发明提供了一种用于将组合物机电递送到悬浮于液体中的多个细胞中的套件，所述套件包括：多个装置，所述多个装置中的每一个包括前述实施方案的装置；以及多个外部结构，所述外部结构被构造为包裹所述多个装置，其中所述多个外部结构中的每一个包括：壳体，所述壳体被构造为包裹至少一个装置的第一电极、第二电极和有源区；第一电输入，所述第一电输入可操作地耦合至第一电极；以及第二电输入，所述第二电输入可操作地耦合至第二电极。在一些实施方案中，所述多个外部结构整合至所述多个装置。在一些实施方案中，所述多个外部结构可释放地连接至所述多个装置。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为增加所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是加热元件，所述加热元件选自由以下各项组成的组：加热块、液体流、电池供电的加热器和薄膜加热器。在一些实施方案中，所述壳体还包括热控制器，所述热控制器被构造为降低所述至少一个装置的温度，其中所述热控制器是冷却元件，所述冷却元件选自由以下各项组成的组：液体流、蒸发冷却器和帕尔贴装置。
在任一前述方法的一些实施方案中，所述套件还包括一个或多个与所述装置的区流体连接的储集器，例如第一储集器和第二储集器，所述区是例如进入区、有源区或回收区。例如，第一储集器可以与进入区流体连接，并且第二储集器可以与回收区流体连接，例如作为回收缓冲液的来源。
在任一前述方面的一些实施方案中，有源区的横截面选自由以下组成的组：圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
在一些情况下，进入区的水力直径或回收区的水力直径在有源区的水力直径的0.01％至100,000％之间。例如，进入区的水力直径或回收区的水力直径可以是有源区的水力直径的0.01％至1000％，例如有源区的水力直径的0.01％至1％、0.1％至10％、5％至25％、10％至50％、10％至1000％、25％至75％、25％至750％或50％至1000％。或者，进入区的水力直径或回收区的水力直径可以是有源区的水力直径的100％至100,000％，例如100％至1000％、500％至5,000％、1,000％至10,000％、5,000％至25,000％、10,000％至50,000％、25,000％至75,000％或50,000％至100,000％。
在任一前述方面的一些实施方案中，有源区的水力直径在0.01mm和50mm之间。在一些实施方案中，有源区的长度在0.01mm和50mm之间。在特定实施方案中，有源区的长度在0.01mm和25mm之间。在一些实施方案中，第一电极或第二电极中任一者的水力直径在0.1mm至500mm之间。在特定实施方案中，进入区、回收区或有源区中的任一者都不会减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一者的横截面尺寸，例如，细胞可以通过装置而不变形。
在另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的第一电极、第二电极和有源区。在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在任一前述方面的一些实施方案中，有源区的横截面选自由以下组成的组：圆柱体、椭圆形、多边形、星形、平行四边形、梯形和不规则形状。
在任一前述方面的一些实施方案中，进入区的水力直径或回收区的水力直径在有源区的水力直径的0.01％至100,000％之间。例如，进入区的水力直径或回收区的水力直径可以是有源区的水力直径的0.01％至1000％，例如有源区的水力直径的0.01％至1％、0.1％至10％、5％至25％、10％至50％、10％至1000％、25％至75％、25％至750％或50％至100％。或者，进入区的水力直径或回收区的水力直径可以是有源区的水力直径的100％至100,000％，例如100％至1000％、500％至5,000％、1,000％至10,000％、5,000％至25,000％、10,000％至50,000％、25,000％至75,000％或50,000％至100,000％。
在任一前述方面的一些实施方案中，有源区的水力直径在0.01mm和50mm之间。在一些实施方案中，有源区的长度在0.005mm和50mm之间。在特定实施方案中，有源区的长度在0.005mm和25mm之间。在一些实施方案中，第一电极或第二电极中任一者的水力直径在0.1mm至500mm之间。在特定实施方案中，进入区、回收区或有源区中的任一者都不会减小悬浮于流体中的所述多个细胞中的任一者的横截面尺寸，例如，细胞可以通过装置而不变形。
在任一前述方面的一些实施方案中，第一电极和/或第二电极是多孔的或导电流体(例如，液体)。
在另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的第一电极、第二电极和有源区。在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在任一前述方面的一些实施方案中，本发明提供了一种用于通过机电转染将组合物引入到悬浮于流动流体中的多个细胞中的***，所述***包括本文所述的任何装置和电势源，其中所述装置的第一电极和第二电极可释放地连接到电势源。在所述***中，悬浮于流体中的多个细胞在进入有源区后被穿孔。
在另外的实施方案中，所述装置包括具有壳体的外部结构，所述壳体被构造为包裹所述装置的第一电极、第二电极和有源区。在一些实施方案中，所述外部结构包括可操作地耦合至第一电极的第一电输入和可操作地耦合至第二电极的第二电输入。在一些实施方案中，所述第一电输入或所述第二电输入与所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。
在一些实施方案中，所述外部结构整合至所述装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述装置。
在一些实施方案中，前述方面中的任一者的装置、***或方法中的任一者诱导可逆孔形成。在特定实施方案中，机电转染基本上是非热可逆的机电转染。
在一些实施方案中，所述装置和所述电势源之间的可释放连接选自由以下各项组成的组：钳子、夹子、弹簧、护套、钢丝刷、机械连接、感应连接或它们的组合。在特定实施方案中，所述装置和所述电势源之间的可释放连接是弹簧。
在一些实施方案中，所述***还包括一个或多个与装置的区(例如，进入区或回收区)流体连接的储集器，例如第一储集器和第二储集器。例如，第一储集器可以与进入区流体连接，并且第二储集器可以与回收区流体连接。
在另外的实施方案中，所述***包括与进入区流体连接的流体递送源，其中所述流体递送源被构造为将悬浮于流体中的多个细胞通过进入区递送至回收区。在一些实施方案中，来自流体递送源的递送速率在0.001mL/min至1,000mL/min之间，例如25mL/min。在某些实施方案中，悬浮于流体中的多个细胞中的任一个的停留时间在0.5ms至50ms之间。在一些实施方案中，流体的电导率在0.001mS/cm至500mS/cm之间，例如1-20mS/cm。
在另外的实施方案中，所述***包括控制器，所述控制器可操作地耦合至电势源，以将电压脉冲递送至第一电极和第二电极，以在第一电极和第二电极之间产生电势差。在一些实施方案中，电压脉冲具有的幅度为高达3kV，例如0.01kV至3kV，例如0.2-0.6kV。在一些情况下，机电转染的占空比在0.001％至100％之间，例如10-95％。在一些实施方案中，电压脉冲具有的持续时间在0.01ms至1,000ms之间，例如1-10ms。在某些实施方案中，电压脉冲以在1Hz至50,000Hz之间(例如，100-500Hz)的频率施加于第一电极和第二电极。电压脉冲的波形可以是DC波形、方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形、任意波形或者它们的任何叠加或组合。在特定实施方案中，由电压脉冲产生的电场具有1V/cm至50,000V/cm之间，例如100-1,000V/cm，例如400-1,000V/cm之间的幅度。在另外的实施方案中，所述***包括壳体(例如，壳体结构)，所述壳体被构造为容纳本文所述的机电转染装置。在另外的实例中，所述壳体(例如，壳体结构)包括热控制器，所述热控制器被构造为增加或降低所述壳体或它们的***的任何部件的温度。在一些实施方案中，热控制器是加热元件，例如加热块、液体流、电池供电的加热器或薄膜加热器。在其他实施方案中，热控制器是冷却元件，例如液体流、蒸发冷却器、或热电装置(例如帕尔贴装置)。
在另外的实施方案中，所述***包括多个机电转染装置，例如串联或并联。在特定实施方案中，所述***包括用于多个机电转染装置的多个外部结构。
在另外的实施方案中，所述方法包括评估悬浮于流体中的多个细胞的一部分的健康状况。在某些实施方案中，所述评估包括测量悬浮于流体中的多个细胞的一部分的活力。在一些实施方案中，所述评估包括测量悬浮于流体中的多个细胞的一部分的转染效率。在一些实施方案中，所述评估包括测量悬浮于流体中的多个细胞的一部分的细胞回收率。在某些实施方案中，所述评估包括细胞表面标志物表达的流式细胞术分析。
在一些实施方案中，所述方法诱导可逆的机电转染。在特定实施方案中，机电转染基本上是非热可逆的机电转染。
在一些实施方案中，通过施加正压(例如泵，例如注射泵、蠕动泵或压力源)来使悬浮于流体中的细胞与组合物穿过装置的有源区中的电场。
在某些实施方案中，样品中的多个细胞中的细胞可以是哺乳动物细胞、真核生物细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、合成细胞、原代细胞、细胞系、悬浮细胞、贴壁细胞、未刺激的细胞、刺激的细胞、活化的细胞、免疫细胞、干细胞、血细胞、红细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、抗原呈递细胞(APC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞或外周血单核细胞(PBMC)、人胚肾细胞(例如HEK-293细胞)或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括Jurkat细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人T细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括THP-1细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人巨噬细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人单核细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括自然杀伤(NK)细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括中国仓鼠卵巢细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括人胚肾细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括B细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人T细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人单核细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人巨噬细胞。在特定实施方案中，所述多个细胞包括胚胎干细胞(ESC)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。在特定实施方案中，所述多个细胞包括原代人诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种选自由以下各项组成的组的化合物：治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的治疗剂、纳米颗粒、带电的分子(例如，溶液中的离子)、不带电的分子、核酸(例如，DNA或RNA)、CRISPR-Cas复合物、蛋白质、聚合物、核糖核蛋白(RNP)、经工程化的核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(MN)、大范围TAL、酶、肽、转座子或多糖(例如，葡聚糖，例如，硫酸葡聚糖)。可以在悬浮液中递送至细胞的组合物包括核酸(例如，寡核苷酸、mRNA或DNA)、抗体(或抗体片段，例如双特异性片段、三特异性片段、Fab、F(ab′)2、或单链可变片段(scFv))、氨基酸、多肽(例如，肽或蛋白质)、细胞、细菌、基因治疗剂、基因组工程化的治疗剂、表观基因组工程化的治疗剂、碳水化合物、化学药物、造影剂、磁性颗粒、聚合物珠粒、金属纳米颗粒、金属微粒、量子点、抗氧化剂、抗生素剂、激素、核蛋白、多糖、糖蛋白、脂蛋白、类固醇、镇痛药、局部麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂、化学治疗剂、外泌体、外膜囊泡、疫苗、病毒、噬菌体、佐剂、维生素、矿物质、细胞器以及它们的组合。在某些实施方案中，所述组合物是核酸(例如，寡核苷酸、mRNA或DNA)。在某些实施方案中，所述组合物是抗体。在某些实施方案中，所述组合物是多肽(例如，肽或蛋白质)。
在一些实施方案中，组合物在液体中的浓度为0.0001μM和20μM之间(例如0.0001μM至0.001μM、0.001μM至0.01μM、0.001μM至5μM、0.005μM至0.1μM、0.01μM至0.1μM、0.01μM至1μM、0.1μM至1μM、0.1μM至5μM、1μM至10μM、1μM至15μM或1μM至20μM，例如约0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μvM、19μM或20μM)。
在某些实施方案中，组合物在流体中的浓度为0.0001μg/mL和1,000μg/mL之间(例如0.0001μg/mL至0.001μg/mL、0.001μg/mL至0.01μg/mL、0.001μg/mL至5μg/mL、0.005μg/mL至0.1μg/mL、0.01μg/mL至0.1μg/mL、0.01μg/mL至1μg/mL、0.1μg/mL至1μg/mL、0.1μg/mL至5μg/mL、1μg/mL至10μg/mL、1μg/mL至50μg/mL、1μg/mL至100μg/mL、2.5μg/mL至15μg/mL、5μg/mL至25μg/mL、5μg/mL至50μg/mL、5μg/mL至500μg/mL、7.5μg/mL至75μg/mL、10μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至1,000μg/mL、25μg/mL至50μg/mL、25μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至500μg/mL、50μg/mL至100μg/mL、50μg/mL至250μg/mL、50μg/mL至750μg/mL、100μg/mL至300μg/mL、100μg/mL至1,000μg/mL、200μg/mL至400μg/mL、250μvg/mL至500μg/mL、350μg/mL至500μg/mL、400μg/mL至1,000μg/mL、500μg/mL至750μg/mL、650μg/mL至1,000μg/mL或800μg/mL至1,000μg/mL，例如约0.0001μg/mL、0.0005μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.03μg/mL、0.04μg/mL、0.05μg/mL、0.06μg/m[、0.07μg/mL、0.08μg/mL、0.09μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL、4.5μg/mL、5μg/mL、5.5μg/mL、6μg/mL、6.5μg/mL、7μg/mL、7.5μg/mL、8μg/mL、8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、500μg/mL、550μg/mL、600μg/mL、650μg/mC、700μg/mL、750μg/mL、800μg/mL、850μg/mL、900μg/mL、950μg/mL或1,000μg/mL)。
在另外的实施方案中，所述方法包括壳体结构，所述壳体结构被构造为容纳本文所述的机电装置。在另外的实例中，所述壳体结构包括热控制器，所述热控制器被构造为增加或降低所述壳体或它们的***的任何部件的温度。在一些实施方案中，所述热控制器是加热元件，例如加热块、液体流、电池供电的加热器或薄膜加热器。在其他实施方案中，所述热控制器是冷却元件，例如液体流、蒸发冷却器、或热电装置(例如帕尔贴装置)。在某些实施方案中，悬浮于流体中的多个细胞的温度在0℃和50℃之间。
在另外的实施方案中，所述装置包括多个机电转染装置，例如串联或并联。在特定实施方案中，所述装置包括用于所述多个装置的多个外部结构。
在一些实施方案中，所述方法还包括在转染后将悬浮于流体中的多个细胞储存于回收缓冲液中。在某些实施方案中，在引入组合物后，经转染的细胞具有的活力在0.1％和99.9％之间，例如75％和95％。在其他实施方案中，组合物至细胞的引入效率在0.1％和99.9％之间，例如在25％和95％之间。在某些实施方案中，细胞回收率在0.1％和100％之间。在特定实施方案中，细胞回收率在0.1％和500％之间。
在另一方面，本发明提供一种用于通过机电转染将组合物引入到悬浮于流体中的多个细胞中的套件，所述套件包括如本文所述的多个装置、如本文所述的多个外部结构和转染缓冲液。
在另一方面，本发明提供一种用于将组合物机电转染到悬浮于流体中的多个细胞中的套件，所述套件包括如本文所述的多个装置、如本文所述的多个外部结构和转染缓冲液。
在任一前述方面的一些实施方案中，所述外部结构整合至所述多个细胞装置。在某些实施方案中，所述外部结构可释放地连接至所述多个装置。
定义
在将值描述为范围的情况下，应当理解，这种公开包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及落入该范围内的具体数值，而与是否明确指出具体数值或具体子范围无关。
如本文所用，术语“约”是指所列举的值的±10％。
如本文所用，术语“平均流速”是指流动液体(例如，在通道或管腔中)的速度，由液体(例如，来自流体递送源，例如泵)的体积流速(Q，单位m3/s)除以例如液体流动的通道或管腔的横截面面积(A，单位m2)的商确定，因此平均流速(u)的单位为m/s。
如本文所用，术语“多个”是指多于一个。
如本文所用，术语“电导率(conductivity)”是指电导率(electricalconductiVity)，即带电颗粒(例如离子)移动通过介质的能力，例如流动液体中的盐离子，例如缓冲离子。
如本文所用，术语“基本上均一的”是指+/-5％的差异。
如本文所用，术语“最小水力直径”是指等于四倍横截面面积除以横截面(例如管腔(例如有源区或进入区的管腔))的润湿周长(例如内周长)的最小商的长度。
除非另外指明，否则术语“横截面面积”是指横向横截面的面积(例如，沿着垂直于纵轴或流动方向的平面)。
如本文所用，术语“流体连接”是指至少两个装置元件(例如机电装置、储集器等)之间的直接连接，所述直接连接允许流体在此类装置元件之间移动而不通过中间元件。
如本文所用，术语“流体连通”是指至少两个装置元件(例如有源区、储集器等)之间的间接连接，所述间接连接允许流体在此类装置元件之间移动，例如通过中间元件(例如，通过中间管道、中间通道等)。
如本文所用，术语“管腔”是指允许流体通过的本发明装置的一部分(例如，有源区或进入区)的内腔。
如本文所用，术语“进入区”包括本发明装置的一部分，在有源区中进行机电转染之前，流体和悬浮于流体中的多个细胞可以通过所述部分。进入区可还包括与本发明装置的有源区流体连通的附加储集器。当将电势差施加于本发明的装置的第一电极和第二电极时，可以在本发明的装置的进入区内产生的电场不足以使细胞穿孔发生。
如本文所用，术语“回收区”包括本发明装置的一部分，流体和悬浮于流体中的多个细胞可在有源区中机电转染后穿过或驻留在该部分。回收区可包括有源区装置下游(例如，紧接下游，例如接近第二出口)的一部分(例如，管腔、管、通道、储集器等)。回收区可以还包括与有源区流体连通的附加储集器。
如本文所用，术语“有源区”是指装置的一部分，其设置在第一电极和第二电极之间，并与进入区流体连通并位于其下游(例如，第一出口的下游)。电场被递送到有源区中的流体。
如本文所用，术语“转染”是指可以利用除病毒递送方法之外的手段(诸如生物、化学、电、机械或物理方法)将有效负载引入细胞中的过程。
如本文所用，术语“电穿孔”是指利用施加的电场在细胞膜中产生小孔的过程，有效负载可以通过所述小孔被引入细胞中(例如，作为转染方法)。
如本文所用，术语‘机电转染”是指一种转染过程，通过所述过程，可利用施加的电场和机械穿孔机制的组合将有效负载引入到细胞中。这种递送方法具有减少和/或稳定有源区中的细胞的总电场暴露的潜力，从而提高细胞活力和/或转染效率，或者它们二者。本发明的装置被构造为通过机电转染而不是通过单独的电穿孔来转染细胞。本发明的方法允许为给定的细胞类型确定电能(例如电场强度)和机械能(例如流速)的最佳组合。
如本文所用，术语“治疗剂量”是指当向患者施用以用于治疗某种状态、病症或病状时，足以实现这种治疗的转染细胞的量。治疗剂量施用可以是单独施用、与其他药剂组合施用、作为一系列施用的一部分施用或其组合。治疗可产生治疗益处，例如有益的免疫反应、减轻或消除疾病状态、减少例如癌细胞或癌症生物标志物、减缓或阻止癌细胞复制速率等。治疗剂量可以通过例如监测患者状况(例如通过临床评估)、临床疾病进展、疾病或器官功能生物标志物的数量、例如白细胞或红细胞的数量等来确定。治疗剂量可以是本文所述的任何数量或浓度的细胞。
附图说明
图1示出了本发明装置的示意图。将细胞和有效负载悬浮于储集器中的专用缓冲液中。当细胞和有效负载流过机电转染区时，它们暴露于电能和连续的流体流，以诱导瞬时细胞膜破裂并同时将遗传有效负载递送到细胞中。然后将转染的细胞直接分配到生长培养基中用于细胞回收。
图2A-图2D示出了与机电转染相关且与结果数据有关的参数。使用本发明的装置、***和方法用GFP报告基因mRNA转染扩增的人T细胞。在24小时，评估培养物的细胞活力(7AAD阴性)、转染效率和百分比产率(从1e6个输入细胞观察到的活GFP+细胞)。根据本发明的方法，通过相对于机电转染特异性参数π4(图2A和图2B)和π5(图2C和图2D)绘制百分比活力、效率和产率，将GFP报告基因mRNA递送至扩增的T细胞中的转染作用机制在此得以显现。所有分析均使用Thermo Fisher AttuneTM NxT流式细胞仪完成；n＝89描绘为单独的数据点。
图3A-图3F示出了使用根据本发明方法的机电装置与两种基于电穿孔的商业转染***(NeonTM和4D NucleofectorTM)进行转染的比较数据。使用机电转染***或可商购获得的基于电穿孔的转染***(NeonTM和4D NucleofectorTM)处理扩增的人T细胞，而没有有效负载。在此示出了处理后6或24小时的代表性数据。在图3A-图3C中，火山图示出显著失调的基因(p＜0.05)，在6小时的表达变化大于1倍。图3D是在6小时表现出基线表达对比失调表达的基因的图形表示。图3E是在6和24小时选择的上调基因和下调基因的热图。图3F是着重于T细胞功能的基因本体论的热图。
图4A-图4B示出了使用根据本发明方法的机电转染***对不同供体对比对照的结果。用GFP报告基因mRNA转染来自三个独特供体的扩增的人T细胞。在24小时评估培养物的细胞活力(7AAD阴性)(图4A)和转染效率(图4B)。条形图是具有以下转染样品大小的平均值±SD：供体#1n＝3，供体#2n＝22，供体#3n＝3。
图5A-图5F示出了使用机电转染***和本发明的方法转染幼稚T细胞的结果。用GFP报告基因mRNA转染幼稚T细胞。评估培养物的扩增能力(图5A)和细胞活力(图5B)(台盼蓝排除)，测量至转染后6天。图5C示出了针对谱系标志物CD45RA和CD45RO的表达而染色的幼稚T细胞对比对照的比较。图5D-图5F示出了在转染后24小时测量的来自0.5M细胞输入的细胞活力(7AAD阴性)(图5D)、转染效率(图5E)和活GFP+细胞计数(产率)(图5F)。条形图代表n＝2的转染平均值±SD。
图6A-图6B展示了本发明的方法和如本文所述的机电转染如何能够从小规模研究转染直接转化为大规模细胞制造转染。图6A是示出可以如何将机电流动池用于小规模装置(例如，与液体处理机整合成96孔形式)、机电转染(例如，设置用于分批转染的装置阵列)和大规模机电装置或***(例如，封闭的机电转染***)，从而允许从一个规模直接转换到另一个规模的示意图。使用小体积机电装置阵列平台(小规模10-100μL转染)和大体积流动机电转染***(大规模＞5mL转染)，用GFP mRNA报告基因有效负载转染扩增的人T细胞。在24小时评估细胞的细胞活力(7AAD阴性)(图6B)和转染效率(图6B)。条形图是平均值±SD，小体积n＝6，大体积n＝2。
图7A-图7B示出了用于确定总细胞计数和活力的门控策略。在图7A中，总细胞在前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)点状图中预门控。该门捕获宽形态的细胞，用于总细胞群的精确分析。在图7B中，然后通过从总细胞门中选通7-AAD细胞来确定活力。基于未处理的细胞确定效率门，以消除任何背景荧光(未示出)。
图8A-图8B是场强对比流速的热图，活力(图8A)和效率(图8B)是在z轴上。使用大体积转染***用GFP报告基因mRNA转染扩增的人T细胞。在24小时评估培养物的细胞活力(图8A)(7AAD阴性)和转染效率(图8B)。所有分析均使用Thermo Fisher AttuneTM NxT流式细胞仪完成；n＝96描绘为单个数据点。
图9A-图9C是扩增的人T细胞的火山图，所述细胞来自使用机电(图9A)或可商购获得的基于电穿孔的转染***(NeonTM(图9B)和4D NucleofectorTM(图9C))处理的无有效负载的两个独特供体中的第二个。火山图示出了显著失调的基因(p＜0.05)，在处理后6小时表达变化大于1倍。
图10A-图10B是示出使用机电转染***或可商购获得的基于电穿孔的转染***(NeonTM和4D NucleofectorTM)用GFP报告基因mRNA转染的扩增的人T细胞在24小时的细胞活力(7AAD阴性)(图10A)和转染效率(图10B)的条形图。条形图为平均值±SD n＝7。
图11A-图11C示出了使用本发明的***来递送多个有效负载。用GFP报告基因mRNA和mCherry报告基因mRNA转染扩增的人T细胞，所述***包括本发明的装置阵列。在并联(图11B)或串联(间隔48小时)(图11C)递送后24小时，评估培养物的细胞活力(7AAD阴性)(图11A)和转染效率(图11B和图11C)。
具体实施方式
本发明提供了用于转染细胞(例如哺乳动物细胞，例如原代T细胞)的方法，与传统的基于比色皿的电穿孔方法或可商购的电穿孔仪器相比，所述方法以相同或更大的体积、相同或更高的转染效率、相同或更高的通量、相同或更高的回收率、相同或更高的产率以及相同或更高的细胞活力进行机电转染。具体而言，提供了能够以流通方式、连续方式或使用本发明的多个机电转染装置进行机电转染以提高通量和细胞数量的***和方法。更具体地说，本发明的方法允许所施加的电能低于基于电穿孔的技术，从而使对转染细胞的损伤最小化。
非病毒细胞转染代表了自体和异体细胞疗法的有希望的发展。尽管将细胞疗法与病毒载体生产挑战分开具有优势，但在临床应用中，非病毒转染仍落后于病毒方法。最广为人知的非病毒转染形式之一是电穿孔，其中对静止的细胞悬浮液施加高能电场。通过经典电穿孔进行成功转染依赖于每个细胞经历的电场强度。然而，长时间的电场强度过大会导致不可逆的细胞膜破裂，从而导致细胞死亡。
为了提高电场辅助转染的产率，必须使施加到细胞上的电能最小化。本发明的方法通过向施加于细胞的总能量中添加机械成分来减少使细胞膜通透所需的电能。这种机械能可以经由例如流体流动来递送，从而通过诱导膜破裂以将例如DNA、RNA或CRISPR-RNP递送到细胞核中来降低有效递送遗传有效负载所需的高能电场。
机电细胞转染包括使用与机械应力结合的电场，例如与中等流体流速相关的机械应力，来渗透细胞并递送外源物质。该技术不同于电穿孔，在电穿孔中，仅利用电场来渗透细胞，通常没有流动或以低流体流速，从而导致应力最小。在机电细胞转染的情况下，孔形成是由电场和机械能输入的组合效应介导的，机械能输入的形式是细胞上的剪切力和法向应力。预期机电细胞转染将取决于以下参数：施加的电压的均方根，VRMMS；介质电导率(即电导率)，s；平均流体速度，u；电极之间的距离，l；流体动态粘度(例如，通过旋转粘度测定法测量)，μ；通道直径，d；细胞直径，D；以及流体密度，r。应用白金汉Pi定理(Buckingham Pitheorem)进行量纲分析，获得了一组四个无量纲参数。前两个参数和/>是由细胞直径缩放的无量纲长度。第三个无量纲组是经典雷诺数/>它是流体流动中惯性效应与粘性效应的比率。机电转染在大约102的中等Re下发生，因此属于层流状态。第四个无量纲组/>表示施加在细胞悬浮液上的电功率与机械功率之比。动态粘度(μ)可通过例如旋转粘度计测定，例如，如Pries等人，″Blood viscosity in tube flow：dependence on diameter and hematocrit.″American Joumal of Physiology-Heartand Circulatory Physiology 263.6(1992)：H1770-H1778中所述。
预期该过程的关键物理将由这四个无量纲组及其组合决定。Re和Π4的存在和重要性使这种转染机制区别于电穿孔和基于纯机械的转染方法。在电穿孔中，电场和脉冲条件控制转染效率，并且所述过程通常发生在具有静止流体的静态室中。最近的努力包括基于流动的电穿孔，其中细胞悬浮液在转染过程期间以有限的速度移动。然而，在这些***中，流动用于将细胞递送至转染区，而不是像机电转染的情况一样影响转染本身。基于机械的转染方法，特别是采用较高流速的那些方法，肯定依赖于Re，但是由于没有施加电场，因此不需要这里描述的π4。因此，尽管与电穿孔有一些表面相似性，但机电转染是一种独特且新颖的向细胞递送外源物质的技术。
本发明提出了一种新的转染技术，即利用电能和连续流动的机电转染，其表现出优于电穿孔和其他病毒和非病毒转染方法的若干个优点。量纲分析揭示了通过平衡流体流动和电场的影响来优化机电转染，从而将该技术与以前使用电场的方法区分开来。给出的物理模型阐明了驱动该技术效果的关键参数，主要通过将之前的无量纲参数组合成第五无量纲组来定义，所述第五无量纲组含有电场平方与通道速度的比率。优化向感兴趣细胞的有效负载递送效率，同时保持活力(例如，优化工程化细胞产率)，是转染解决方案的目标，并且本发明提供了用于快速优化有效机电转染的关键参数的有效方法。
本文描述的转录组分析结果显示，高递送效率可以与显著的基因失调脱离。根据本发明的机电转染在处理后6小时显示出相对于基线的低于5％偏移，而两种可商购获得的基于电穿孔的转染装置在总基因失调方面显示出相对于基线的高于5％偏移。在由非病毒处理诱导的失调中，仅13％可归因于机电装置中的分子功能改变，而基于电穿孔的装置诱导了19-24％归因于分子功能的失调。当用基于电穿孔的装置处理后6小时发现T细胞耗竭标志物(CTLA4和TIGIT)上调，但根据本发明的方法用机电装置处理后发现其处于基线水平时，强调这种功能失调。在24小时对转染效率的分析显示，在机电处理后观察到的基因失调减少导致递送效率指标与来自Thermo Fisher(NeonTM)的可商购获得的基于电穿孔的装置没有显著差异，例如分别为89.2％和89.4％。本发明提供了大于75％的转染后活力，并且在多种使用情况下观察到大于80％的递送效率。这些发现也在多个PBMC供体中得到证实，在递送效率方面没有显著差异，在所有三个供体之间观察到的效率(GFP+活细胞)的范围为84.0％至93.7％。此外，观察到的高转染效率没有导致细胞状态的改变，如本研究中通过维持谱系特异性幼稚细胞标志物表达(CD45RA+/CD45RO-)所指示的。这些发现表明，在机电转染后24小时，在幼稚CD4+T细胞中可以保持高活力和高递送效率，均高于95％，同时保持幼稚标志物表达，即100％CD45RA+/CD45RO-。此外，与小规模结果相比，50倍放大转染的结果导致活力和递送效率的变化≤2.5％。这些数据共同表明，使用非病毒机电转染方法进行的细胞工程化不同于经典电穿孔，并且代表了现有转染方法的有意义的替代方法。机电转染可与高通量自动化一起用于发现或工艺开发，同时也易于扩大制造规模。这种向外扩展和向上扩展，同时保持细胞健康和高细胞产率的能力，使得机电转染成为细胞疗法开发和制造的有吸引力的新解决方案。
装置
通常，本发明的装置被构造为可以与现有的液体处理装置、泵或流体运输设备(诸如常规移液器吸头机器人或大规模液体处理***)对接的流通装置，以提供悬浮于流体中的细胞的连续转染。本发明的装置被构造用于通过与基于电穿孔的转染***中的递送机制不同的机电转染机制而在有源区内进行细胞转染。本发明的装置通常具有两个不同的区域：具有第一入口和第一出口的进入区以及具有第二入口和第二出口的有源区。第一电极和第二电极被设置成在有源区中产生电场。图1示出了本发明的装置的实施方案的实例。当将电势差施加于第一电极和第二电极时，在两个电极之间的空间(例如，有源区)中产生局部电场，并且对暴露于电场的细胞进行穿孔。本发明的单个装置可以包括两个电极，如图1所示；或者，本发明的单个装置可以包括三个或更多个电极，这些电极限定多个有源区，从而允许对悬浮于流体中的细胞进行多次转染。本发明的装置可以包括在第一电极和第二电极之间的多个有源区，以允许细胞在单个装置或多个装置中流动时经过不同的电场，例如，由多个有源区中的每一个的不同几何形状产生的电场。
在一些情况下，第一电极和第二电极可以是导电线、中空圆柱体、导电薄膜、金属泡沫、网状电极、液体可扩散膜、导电液体或它们的任何组合，可以包括在装置中。电极可以平行于装置的流体流的轴对齐，或者可以垂直于装置的流体流的轴对齐。例如，第一电极和第二电极可以是平行于装置内的流体流的轴布置的中空圆柱体电极，诸如图1的装置所示，以使得流体流过电极。在一个替代性实例中，第一电极和/或第二电极可以由具有与装置的流体流的轴对齐的孔的多孔导体(例如，金属网)制成。在一个替代性实例中，第一电极和/或第二电极可以是导电流体，例如液体。在一些情况下，第一电极和第二电极可以被构造为围绕有源区的由固体导体(例如，导线)制成的螺旋，例如双螺旋。在这种构造中，有源区的水力直径保持基本上均一，但是第一电极和第二电极沿着有源区的长度改变位置。第一电极和第二电极与有源区流体连通，但是电势差施加于电极时产生的电场随着悬浮于流体中的细胞行进通过本发明的装置而旋转。在某些实施方案中，第一电极和第二电极被包埋于本发明的装置中，并且具有设置在有源区的流体连接之处或附近的有源区域，以使得携带悬浮液中的细胞的流体接触电极的一部分，并且在有源区中产生电场。
当被构造为中空圆柱形电极时，电极的直径可以为约0.1mm至5mm，例如约0.1mm至1mm、0.5mm至1.5mm、1mm至2mm、1.5mm至2.5mm、2mm至3mm、2.5mm至3.5mm、3mm至4mm、3.5mm至4.5mm或4mm至5mm，例如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm或5mm。示例性电极外径为1.3mm，对应于16号电极。
有源区可以流体地和/或电气地连接本发明装置的第一电极和第二电极，并且当电极通电时，在它们之间产生局部电场。有源区可以流体连接至有源区下游的回收区。有源区的横截面形状可以是允许细胞通过有源区和有源区内的电场的任何合适的形状。横截面形状可以是例如圆形、椭圆形或多边形，例如正方形、矩形、三角形、n边形(例如，具有4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个边的规则或不规则多边形)、星形、平行四边形、梯形或不规则形状(例如，椭圆形或曲线形)。在一些情况下，有源区是沿其长度具有基本上均一的横截面尺寸的通道，例如，有源区可以具有圆形横截面，其中从与进入区的流体连接到有源区的出口(例如第二出口)或回收区的流体连接的直径是常数。在这种构型中，产生的电场更均匀，从而允许产生更可预测的悬浮于流体中的细胞的电场暴露。或者，有源区的水力直径可以沿其长度而变化。例如，有源区的水力直径可以沿着其长度增加或减小，或者可以沿着其长度具有多于一个尺寸变化，例如水力直径，例如直径可以增加或减小至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或者至多约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在这种构型中，有源区可以具有截短的锥形横截面，其直径从顶部开孔至底部开孔而增大或从顶部开孔至底部开孔而减小。在一些情况下，本发明的装置可以包括多个串联流体连接的有源区，每个有源区具有均一的或不均一的横截面，并且每个有源区都可以具有不同的横截面形状。作为非限制性实例，本发明的装置可以包括多个串联连接的有源区，所述多个有源区中的每一个具有不同水力直径的圆柱体横截面，例如，每个有源区具有不同的直径。
在一些实施方案中，有源区的水力直径可以为0.005mm至50mm，例如0.005mm至0.05mm、0.01mm至0.1mm、0.05mm至0.5mm、0.1mm至1mm、0.5mm至1mm、0.5mm至2mm、0.7mm至1.5mm、1mm至5mm、3mm至7mm、5mm至10mm、7mm至12mm、10mm至15mm、13mm至18mm、15mm至20mm、22mm至30mm 25mm至35mm、30mm至40mm、35mm至45mm或40mm至50mm，例如约0.005mm、0.006mm、0.007mm、0.008mm、0.009mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm、31mm、32mm、33mm、34mm、35mm、36mm、37mm、38mm、39mm、40mm、41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、48mm、49mm或50mm。通常，有源区的直径大小使得其不具有接触细胞以使细胞膜与通道壁变形的收缩，例如细胞的穿孔不是由细胞挤压引起的机械变形诱导的，例如细胞可以自由穿过有源区。
在一些情况下，有源区的长度可以为0.005mm至50mm，例如0.005mm至0.05mm、0.01mm至0.1mm、0.05mm至0.5mm、0.1mm至1mm、0.5mm至2mm、1mm至5mm、3mm至7mm、4mm至8mm、5mm至10mm、7mm至12mm、10mm至15mm、13mm至18mm、15mm至20mm、22mm至30mm、25mm至35mm、30mm至40mm、35mm至45mm或40mm至50mm，例如约0.005mm、0.006mm、0.007mm、0.008mm、0.009mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm、31mm、32mm、33mm、34mm、35mm、36mm、37mm、38mm、39mm、40mm、41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、48mm、49mm或50mm。
进入区和/或回收区的水力直径可以独立地基本上与有源区的水力直径相同。或者，进入区和/或回收区可以独立地小于或大于有源区的水力直径。例如，当进入区和/或回收区的水力直径独立地被构造为小于有源区的水力直径时，进入区和/或回收区的水力直径可以是有源区的水力直径的0.01％至100％、0.01％至1％、0.1％至10％、1％至5％、1％至10％、5％至25％、5％至10％、10％至25％、10％至50％、25％至75％或50％至100％，例如约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
或者，当进入区和/或回收区的水力直径独立地被构造为大于有源区的水力直径时，进入区和/或回收区的水力直径可以是有源区的水力直径的100％至100,000％，例如100％至1000％、100％至250％、100％至500％、250％至750％、500％至1,000％、500％至5,000％、1,000％至10,000％、5,000％至25,000％、10,000％至50,000％、25,000％至75,000％或50,000％至100,000％，例如约100％、150％、175％、200％、225％、250％、300％、250％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1,000％、2,000％、3,000％、4,000％、5,000％、6,000％、7,000％、8,000％、9,000％、10,000％、15,000％、20,000％、25,000％、30,000％、35,000％、40,000％、45,000％、50,000％、55,000％、60,000％、65,000％、70,000％、75,000％、80,000％、85,000％、90,000％、95,000％或100,000％。
本发明的装置可以另外包括一个或多个用于流体试剂(例如，缓冲溶液)或样品(例如，细胞的悬浮液和待引入细胞的组合物)的储集器。例如，本发明的装置可以包括用于使悬浮于流体中的细胞流入进入区和有源区的储集器和/或用于容纳已被转染的细胞的储集器。类似地，可以存在用于使液体在装置的附加部件(诸如与第一电极或第二电极相交的附加入口、)中流动的储集器。单个储集器可以另外连接至本发明的多个装置，例如，在相同的液体被引入两个或更多个本发明的单独装置(被构造为并联地或串联地对细胞进行转染)的情况下。或者，本发明的装置可以被构造为与液体源配合，所述液体源可以是外部储集器(诸如，小瓶、管或囊袋)。类似地，装置可以被构造为与容纳储集器的单独的部件配合。储集器可以具有任何适当的尺寸，例如，以容纳10mL至5000mL，例如，10mL至3000mL、25mL至100mL、100mL至1000mL、40mL至300mL、1mL至100mL、10mL至500mL、250mL至750mL、250mL至1000mL、或1000mL至5000mL。当存在多个储集器时，每个储集器可以具有相同的或不同的尺寸。
除上文讨论的部件之外，本发明的装置可以包括附加部件。例如，本发明的装置的第一电极和第二电极可以包括一个或多个附加流体入口，以允许将非样品流体(例如，缓冲溶液)引入装置的适当区中。例如，本发明装置的回收区可包括附加入口和出口，以循环回收缓冲液，从而有助于在转染过程后为细胞提供生长环境。
***和套件
本发明的一个或多个机电转染装置可以与各种外部部件(例如，电源、泵、储集器(例如，袋)、控制器、试剂、液体和/或样品)以***的形式组合。在一些实施方案中，本发明的***包括本发明的多个装置和电势源，所述电势源可释放地连接至本发明的一个或多个装置的第一电极和第二电极。在这种构型中，本发明的一个或多个装置被连接至电势源，并且第一电极通电且第二电极保持接地。这在有源区中产生局部电场，从而对通过一个或多个装置的细胞进行转染。并入本发明装置的机电***可以诱导通过本发明装置和***的细胞的可逆穿孔。例如，本发明的装置和***可以诱导基本上非热可逆的穿孔。
在一些情况下，与第一电极和第二电极的可释放连接可以包括可以在电势源与第一电极和第二电极之间维持一致的电接触点的任何实际机电连接。示例性电连接包括但不限于钳子、夹子(例如，鳄鱼夹)、弹簧(例如，片弹簧)、外部护套或套筒、钢丝刷、柔性导体、弹簧针、机械连接、感应连接或它们的组合。其他类型的电连接是本领域已知的。本发明的装置可以被安装到导电网中的开口中，以使得装置的第一电极和第二电极可以接触导电网。具体而言，导电网包括弹簧加载的电极，例如连接至弹簧的电极，以使得当将本发明的装置安装到导电网的开口中时，弹簧加载的电极移位和压缩弹簧(它还提供对本发明的装置的第一电极和第二电极的恢复力)，从而确保本发明的装置和电势源之间的电接触。
电势源被构造为将施加的电压递送至一个或多个电极，以便在电极之间提供电势差，从而在有源区中建立均匀的电场。在一些情况下，诸如在双电极电路中，施加的电压被递送至第一电极，并且第二电极保持接地。不希望受任何特定理论的束缚，以特定的大小、特定的频率、特定的脉冲形状、特定的持续时间、特定的施加脉冲数和特定的占空比将施加的电压递送至电极。这些参数与有源区的几何形状有关，它们将在有源区内递送特定的电场，悬浮于流体中的细胞将经历所述电场。可以针对特定的细胞系和/或递送至特定细胞系的组合物优化本文所述的电参数。将电势施加于本发明的一个或多个的装置的电极可以通过可操作地耦合至电势源的控制器(例如，编程的计算机)来启动和/或控制。
本发明的装置的几何形状(例如，有源区的横截面的形状和尺寸)以及本文所述的电势参数，控制有源区内的所得的电场的形状和强度。通常，含有具有均一的横截面的有源区的装置将展示出沿着其长度均匀的电场。为了调节有源区中的所得的电场，有源区可以包括沿着其长度的多个不同的水力直径和/或不同的横截面形状。作为非限制性实例，本发明的装置可以包括多个串联连接的有源区，所述多个有源区中的每一个具有不同水力直径的圆形横截面，例如，每个有源区具有不同的直径。在这种构型中，有源区的不同直径的圆形横截面各自作为独立的有源区，并且在相同的施加电压(例如，恒定的DC电压)下，每个有源区在每次尺寸变化时都将诱导不同的电场。
在一些情况下，本发明的装置可以包括多个串联流体连接的有源区，每个有源区具有均一的或不均一的横截面，并且每个有源区都可以具有不同的横截面形状。或者，本发明的***可以包括处于并联构型的本发明的多个装置，其中每个装置彼此独立地工作以增加机电转染的总通量。
在一些情况下，所施加电压的幅度为-3kV至3kV，例如-3kV至-0.1kV、-2kV至-0.1kV、-1kV至-0.1kV、-0.1kV至-0.01kV、0.01kV至3kV，例如0.01kV至0.1kV、0.02kV至0.2kV、0.03kV至0.3kV、0.04kV至0.4kV、0.05kV至0.5kV、0.06kV至0.6kV、0.07kV至0.7kV、0.08kV至0.8kV、0.09kV至0.9kV、0.1kV至1kV、0.1kV至2.0kV、0.1kV至3kV、0.15kV至1.5kV、0.2kV至2kV、0.25kV至2.5kV或0.3kV至3kV，例如0.01至1kV、0.1kV至0.7kV或0.2至0.6kV，例如约0.01kV、0.02kV、0.03kV、0.04kV、0.05kV、0.06kV、0.07kV、0.08kV、0.09kV、0.1kV、0.2kV、0.3kV、0.4kV、0.5kV、0.6kV、0.7kV、0.8kV、0.9kV、1kV、1.1kV、1.2kV、1.3kV、1.4kV、1.5kV、1.6kV、1.7kV、1.8kV、1.9kV、2kV、2.1kV、2.2kV、2.3kV、2.4kV、2.5kV、2.6kV、2.7kV、2.8kV、2.9kV或3kV。
在一些情况下，所施加电压的频率为1Hz至50,000Hz，例如1Hz至1,000Hz、1Hz至500Hz、100Hz至500Hz、100Hz至5,000Hz、500Hz至10,000Hz、1000Hz至25,000Hz或5,000Hz至50,000Hz，例如10Hz至1000Hz、10Hz至500Hz、500Hz至750Hz或100Hz至500Hz，例如约1Hz、2Hz、3Hz、4Hz、5Hz、6Hz、7Hz、8Hz、9Hz、10Hz、20Hz、30Hz、40Hz、50Hz、60Hz、70Hz、80Hz、90Hz、100Hz、110Hz、120Hz、130Hz、140Hz、150Hz、160Hz、170Hz、180Hz、190Hz、200Hz、210Hz、220Hz、230Hz、240Hz、250Hz、260Hz、270Hz、270Hz、280Hz、290Hz、300Hz、310Hz、320Hz、330Hz、340Hz、350Hz、360Hz、370Hz、380Hz、390Hz、400Hz、410Hz、420Hz、430Hz、440Hz、450Hz、460Hz、470Hz、480Hz、490Hz、500Hz、510Hz、520Hz、530Hz、540Hz、550Hz、600Hz、700Hz、800Hz、900Hz、1,000Hz、2,000Hz、3,000Hz、4,000Hz、5,000Hz、6,000Hz、7,000Hz、8,000Hz、9,000Hz、10,000Hz、15,000Hz、20,000Hz、25,000Hz、30,000Hz、35,000Hz、40,000Hz、45,000Hz或50,000Hz。
在一些实施方案中，施加的脉冲的形状(例如波形)可以是方波波形、脉冲波形、双极波形、正弦波形、斜坡波形、不对称双极波形或任意波形。其他电压波形是本领域已知的。所选的波形可以以任何实际电压模式施加，包括但不限于高压-低压、低压-高压、直流(DC)、交流(AC)、单极、仅正(+)极性、仅负(-)极性、(+)/(-)极性、(-)/(+)极性或者它们的任何叠加或组合。技术人员可以理解，这些脉冲参数将取决于细胞系，被递送至细胞的组合物的任何电学特征。
施加的电压脉冲可以递送到有源区的持续时间为0.01ms至1,000ms，例如0.01ms至1ms、0.1ms至10ms、0.1ms至15ms、1ms至10ms、1ms至50ms、10ms至100ms、25ms至200ms、50ms至400ms、100ms至600ms、300ms至800ms或500ms至1,000ms，例如约0.01ms至100ms、0.1ms至50ms、或1ms至10ms，例如0.01ms、0.02ms、0.03ms、0.04ms、0.05ms、0.06ms、0.07ms、0.08ms、0.09ms、0.1ms、0.2ms、0.3ms、0.4ms、0.5ms、0.6ms、0.7ms、0.8ms、0.9ms、1ms、2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms、8ms、9ms、10ms、11ms、12ms、13ms、14ms、15ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、150ms、200ms、250ms、300ms、350ms、400ms、450ms、500ms、550ms、600ms、650ms，700ms、750ms、800ms、850ms、900ms、950ms或1,000ms。
在一些情况下，递送的所施加电压脉冲的数量可以为1或更多，例如2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10或更多、或100或更多，例如1-4、2-5、3-6、4-7、5-8、6-9、7-10、8-11、7-12或9-13，例如0.01至1,000，例如1至10、1至50、5至10、5至15、10至100、25至200、50至400、100至600、300至800或500至1,000，例如1至100、1至50或1至10，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000或大于1000。
在-些情况下，递送的所施加电压脉冲的数量可以是1或更多。例如，在一些情况下，递送的所施加电压脉冲的数量为1,000至1,000,000，例如1,000至10,000(例如，1,000至2,000、2,000至3,000、3,000至4,000、4,000至5,000、5,000至6,000、6,000至7,000、7,000至8,000、8,000至9,000或9,000至10,000，例如1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000)、10,000至100,000(例如，10,000至20,000、20,000至30,000、30,000至40,000、40,000至50,000、50,000至60,000、60,000至70,000、70,000至80,000、80,000至90,000或90,000至100,000，例如10,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、75,000、80,000、90,000或100,000)或100,000至1,000,000(例如，100,000至200,000、200,000至300,000、300,000至400,000、400,000至500,000、500,000至600,000、600,000至700,000、700,000至800,000、800,000至900,000或900,000至1,000,000，例如约100,000、200,000、250,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、750,000、800,000、900,000或1,000,000)。
在一些情况下，施加电压的脉冲可以1％至100％的占空比递送，例如1％至10％、2.5％至20％、5％至40％、10％至60％、30％至80％或50％至100％，例如0.01％至100％、0.1％至99％、1％至97％或10％至95％，例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
当电极连接到电势源并通电时，本发明的装置在有源区中产生局部电场，所述电场与机械能(例如，来自流动)组合转染通过的细胞。在一些情况下，在有源区中产生的电场的幅度为2V/cm至50,000V/cm，例如2V/cm至1,000V/cm、100V/cm至1,000V/cm、100V/cm至5,000V/cm、400V/cm至2,000V/cm、400至1000V/cm、500V/cm至10,000V/cm、1000V/cm至25,000V/cm或5,000V/cm至50,000V/cm，例如2V/cm至20,000V/cm、5V/cm至10,000V/cm或100V/cm至1,000V/cm，例如约2V/cm、3V/cm、4V/cm、5V/cm、6V/cm、7V/cm、8V/cm、9V/cm、10V/cm、20V/cm、30V/cm、40V/cm、50V/cm、60V/cm、70V/cm、80V/cm、90V/cm、100V/cm、200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm、900V/cm、1,000V/cm、2,000V/cm、3,000V/cm、4,000V/cm、5,000V/cm、6,000V/cm、7,000V/cm、8,000V/cm、9,000V/cm、10,000V/cm、15,000V/cm、20,000V/cm、25,000V/cm、30,000V/cm、35,000V/cm、40,000V/cm、45,000V/cm或50,000V/cm。
本发明的***通常包括流体递送源，所述流体递送源被构造为将悬浮于流体中的多个细胞通过进入区递送到有源区(例如，通过第一电极)，并从有源区出来(例如，通过第二电极)，例如递送到回收区。流体递送源通常包括泵，包括但不限于高压源、注射泵、微型泵或蠕动泵。或者，流体可以通过工作流体相对于待递送的流体的储集器的位移来递送，或通过空气置换来递送。其他流体递送源是本领域已知的。在一些情况下，流体递送源被构造为通过正压的施加来使悬浮于流体中的细胞流动。不希望受任何特定理论的束缚，悬浮液中的细胞流过本发明的装置的流速以及本发明的装置的有源区的特定几何形状将确定细胞在有源区中的电场中的停留时间。
在一些情况下，从流体递送源递送的流体的体积流速为每个有源区0.001mL/min至1,000mL/min的体积流速，例如每个有源区0.001mL/min至0.1mL/min、0.01mL/min至1mL/min、0.1mL/min至10mL/min、1mL/min至50mL/min、10mL/min至100mL/min、25mL/min至200mL/min、50mL/min至400mL/min、100mL/min至600mL/min、300mL/min至800mL/min或500mL/min至1,000mL/min，例如约0.001mL/min、0.002mL/min、0.003mL/min、0.004mL/min、0.005mL/min、0.006mL/min、0.007mL/min、0.008mL/min、0.009mL/min、0.01mL/min、0.02mL/min、0.03mL/min、0.04mL/min、0.05mL/min、0.06mL/min、0.07mL/min、0.08mL/min、0.09mL/min、0.1mL/min、0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min、5mL/min、6mL/min、7mL/min、8mL/min、9mL/min、10mL/min、15mL/min、20mL/min、25mL/min、30mL/min、35mL/min、40mL/min、45mL/min、50mL/min、55mL/min、60mL/min、65mL/min、70mL/min、75mL/min、80mL/min、85mL/min、90mL/min、95mL/min、100mL/min、150mL/min、200mL/min、250mL/min、300mL/min、350mL/min、400mL/min、450mL/min、500mL/min、550mL/min、600mL/min、650mL/min、700mL/min、750mL/min、800mL/min、850mL/min、900mL/min、950mL/min或1,000mL/min。在特定的实施方案中，流速为每个有源区10mL/min至100mL/min，例如每个有源区约10mL/min、20mL/min、30mL/min、40mL/min、50mL/min、60mL/min、70mL/min、80mL/min、90mL/min或100mL/min。
在一些情况下，液体穿过有源区时的雷诺数在10和3,000之间(，例如，10至100、25至200、50至400、100至600mL/min、300mL/min至800mL/min、500至1,000、800至1,500、1,200至2,000、1,800至2,500或2,400至3000，例如约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、15U、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000、1,500、2,000、2,050或3,000)。
在一些情况下，液体穿过有源区时的峰值压力在1×10-3Pa和9.5×104Pa之间，例如0.001至9,500之间(例如0.001Pa至0.1Pa、0.01Pa至1Pa、0.1Pa至10Pa、1Pa至50Pa、10Pa至100Pa、25Pa至200Pa、50Pa至400Pa、100Pa至600Pa、300Pa至800Pa或500Pa至1,000Pa、1,000Pa至6,000Pa、3,000Pa至8,000Pa、5,000Pa至9,000Pa或7,500Pa至9,500Pa，例如约0.001Pa、0.002Pa、0.003Pa、0.004Pa、0.005Pa、0.006Pa、0.007Pa、0.008Pa、0.009Pa、0.01Pa、0.02Pa、0.03Pa、0.04Pa、0.05Pa、0.06Pa、0.07Pa、0.08Pa、0.09Pa、0.1Pa、0.2Pa、0.3Pa、0.4Pa、0.5Pa、0.6Pa、0.7Pa、0.8Pa、0.9Pa、1Pa、2Pa、3Pa、4Pa、5Pa、6Pa、7Pa、8Pa、9Pa、10Pa、15Pa、20Pa、25Pa、30Pa、35Pa、40Pa、45Pa、50Pa、55Pa、60Pa、65Pa、70Pa、75Pa、80Pa、85Pa、90Pa、95Pa、100Pa、150Pa、200Pa、250Pa、300Pa、350Pa、400Pa、450Pa、500Pa、550Pa、600Pa、650Pa、700Pa、750Pa、800Pa、850Pa、900Pa、950Pa、1,000Pa、1,100Pa、1,500Pa、2,000Pa、2,500Pa、3,000Pa、3,500Pa、4,000Pa、4,500Pa、5,000Pa、5,500Pa、6,000Pa、6,500Pa、7,000Pa、7,500Pa、8,000Pa、8,500Pa、9,000Pa或9,500Pa，或例如约3,300Pa(例如2,500至4,000Pa，例如2,500Pa至3,000Pa、2,800至3,300Pa、3,100Pa至3,400Pa)，例如约2,800Pa、2,900Pa、3,000Pa、3,100Pa、3,200Pa、3,300Pa、3,400Pa或3,500Pa。在一些情况下，液体穿过有源区时的平均流速在1×10-2m/s和10m/s之间，例如0.01和1m/s之间(例如0.01和0.05m/s之间、0.05和0.1m/s之间、0.1和0.5m/s之间、0.5和1m/s之间、1.5和2m/s之间、1和2m/s之间、2和3m/s之间、3和4m/s之间、4和5m/s之间、5和6m/s之间、6和7m/s之间、7和8m/s之间、8和9m/s之间或9和10m/s之间)，例如0.1和5m/s之间、0.4和1.4m/s之间、0.65和1.3m/s之间或0.26和2.08m/s之间，例如约0.1m/s、0.2m/s、0.3m/s、0.4m/s、0.5m/s、0.6m/s、0.7m/s、0.8m/s、0.9m/s、1.0m/s、1.1m/s、1.2m/s、1.3m/s、1.4m/s、1.5m/s、2m/s、3m/s、4m/s、5m/s、6m/s、7m/s、8m/s、9m/s或10m/s。
细胞在本发明装置的有源区中的停留时间可以是0.5ms至50ms，例如0.5ms至5ms、1ms至10ms、5ms至15ms、10ms至20ms、15ms至25ms、20ms至30ms、25ms至35ms、30ms至40ms、35ms至45ms或40ms至50ms，例如约0.5ms、0.6ms、0.7ms、0.8ms、0.9ms、1ms、1.5ms、2ms、2.5ms、3ms、3.5ms、4ms、4.5ms、5ms、5.5ms、6ms、6.5ms、7ms、7.5ms、8ms、8.5ms、9ms、9.5ms、10ms、10.5ms、11ms、11.5ms、12ms、12.5ms、13ms、13.5ms、14ms、14.5ms、15ms、20ms、25ms、30ms、35ms、40ms、45ms或50ms。在一些实施方案中，停留时间为5-20ms(例如，6-18ms、8-15ms或5-14ms)。
本发明的***通常具有的特征在于容纳和支撑本发明的一个或多个装置和任何必要的电连接(例如，电极连接)的壳体。壳体可以被构造为保持和使本发明的单个装置通电，或者，壳体可以被构造为保持和使本发明的多个装置同时通电。壳体可以包括热控制器，所述热控制器能够在转染期间调节本发明的装置的温度或者热调节***的部件(例如流体，例如含有细胞的缓冲液或悬浮液)。热控制器可以被构造为加热本发明的装置或它们的***的部件，冷却本发明的装置或它们的***的部件，或者进行两种操作。当合适的热控制器被构造为加热本发明的装置或它们的***的部件时，合适的热控制器包括但不限于加热块或罩、液体加热器(例如，浸没式或循环式流体浴、电池供电的加热器)或电阻加热器(例如，薄膜加热器，例如，加热带)。当合适的热控制器被构造为冷却本发明的装置或它们的***的部件时，合适的热控制器包括但不限于液体冷却器(例如，浸没式或循环式流体浴、蒸发冷却器)或热电冷却器(例如，帕尔贴冷却器)。例如，当通过液体冷却实施时，本发明的装置或被构造为保持本发明的装置的壳体可以直接接触循环冷却流体的管道，或者围绕包括循环冷却流体的管道的冷却护套。其他加热和冷却元件是本领域已知的。
在一些实施方案中，壳体(例如，盒)被构造用于与自动化封闭***一起使用和/或***到自动化封闭***中，所述自动化封闭***用于在临床或医院环境中将细胞疗法递送给患者。
在一些实施方案中，壳体(例如，盒)还包括用于在样本的机电转染期间、之前和之后进行细胞悬浮液和/或缓冲液储存的冷却/加热区域/壳体。在一些实施方案中，***(例如，装置和壳体)是外部供电的。
在一些实施方案中，本发明的装置包括触摸屏使用者接口或其他替代性使用者接口，所述使用者接口允许使用者能够选择参数，诸如流速、波形、施加的电势、要转染的体积、时间延迟、冷却特征部、加热特征部、转染状态、进度，以及用于优化机电转染或机电方案的其他参数。在一些实施方案中，使用者接口还包含预先设定的参数选择，允许使用者能够在特定参数和条件下操作***，这些参数和条件此前已由使用者验证或由制造商推荐。在一些实施方案中，使用者接口可以连接至程序，以允许***的自动运行和/或运行算法，以针对已知细胞类型的给定样品和有效负载组合优化转染。在一些实施方案中，如果使用者选择此功能，则优化算法具有独立或自主调整机电参数的能力。在一些实施方案中，优化算法允许连续调整在机电转染过程中使用的参数，所述参数可以取决于细胞类型、细胞悬浮液的电导率、细胞悬浮液的体积、动态粘度、一个或多个转染盒的寿命、悬浮液的物理状态或一个或多个转染装置的状态。
在一些实施方案中，优化算法具有根据已知的输入细胞类型参数来执行预测分析以及相应地调整机电参数的能力。待测量的输入参数包括但不限于悬浮液电导率、悬浮液温度、悬浮液动态粘度、细胞形态、细胞尺寸和细胞阻抗。在一些实施方案中，优化算法根据本发明的装置中的任一者内的电信号来调整机电参数。在一些实施方案中，优化算法根据本发明的装置中的任一者内的检测流参数来调整机电参数。在一些实施方案中，优化算法根据独特的无量纲输入参数来调整转染参数。在一些实施方案中，优化算法具有根据独特的多变量参数组合来调整机电转染参数的能力，所述参数预测高活力结果、高效率结果或匹配的活力和效率结果。
本发明的***可以包括一个或多个外部结构，所述外部结构被构造为覆盖本发明的一个或多个装置的电极，例如减少最终使用者暴露于带电的电连接的机会。典型地，机电***将包括一个覆盖其电极和有源区的外部结构。外部结构可以是非导电材料，例如非导电聚合物，所述非导电材料包括用于机电接合装置的部分(例如，电极或有源区)的结构特征部。外部结构可以在结构内包括一个或多个凹部、切口或类似的开口以容纳装置。外部结构可以被构造为可以从装置移除的部件。例如，外部结构可以包括通过铰链(例如，活动铰链)连接的两个单独的部件，以便可以将外部结构折叠在本发明的装置上。或者，外部结构可以是一个或多个单独的件，所述件可以使用合适的配合特征部连接在一起以形成单一结构。在这些实施方案中，可以使用任何合适的紧固件(例如，按扣、闩锁、按钮或夹子)将外部结构固定至本发明的装置上，这些紧固件可以整合进外部结构中或在外部连接至外部结构。其他合适的紧固件类型是本领域已知的。在一些实施方案中，外部结构包括一个或多个对齐特征部(例如销、凹痕、凹槽或凸片)以确保外部结构的一个或多个件的正确对齐。在一些情况下，外部结构被构造为永久连接至本发明的装置。
在一些实施方案中，壳体(例如，盒，例如，外部结构)包封一个或多个前述发明或者一个或多个用于连续流机电转染的装置。在一些实施方案中，壳体(例如，盒)被构造为允许与自动化封闭***一起使用和/或***到自动化封闭***中，所述自动化封闭***将细胞疗法递送给患者。在一些实施方案中，壳体还包括用于在样本的机电转染期间、之前和之后进行细胞悬浮液和/或缓冲液储存的冷却/加热区域/壳体。在一些实施方案中，***(例如，一个或多个装置和壳体)是外部供电的。
在一些实施方案中，***还包括优化算法，如果所述使用者选择此功能，则优化算法具有独立或自主调整机电参数的能力。这些优化算法允许连续调整在转染过程中使用的参数，所述参数可以取决于细胞类型、电导率、悬浮液的体积、动态粘度、机电盒的寿命、悬浮液的物理状态或机电装置的状态。
在本文所述的外部结构的实施方案中的任一者中，外部结构提供外部电势源和本发明的装置的电极之间的电连接。例如，外部结构可以包括用于电连接的一个或多个电输入(例如，铲形、香蕉形插头或卡口，例如，BNC连接器、)，所述电输入有助于内部结构内的电势源和本发明的装置的电极之间的电连接。
本发明的装置和外部结构可以在套件中与附加外部部件(诸如试剂，例如，缓冲液，例如，转染或回收缓冲液)和/或样品组合。在一些情况下，转染缓冲液包括适于细胞机电转染的组合物。在一些情况下，转染缓冲液包含浓度为0.1至200mM(例如，0.1至1.0mM、1.0mM至10mM、或10mM至100mM)的合适浓度的一种或多种盐(例如，氯化钾、氯化钠、磷酸钾、磷酸二氢钾)或糖(例如，葡萄糖或肌醇)，或它们的任何组合。
缓冲液和培养基
本发明的装置和***可以与转染缓冲液或含有支持转染的添加剂的细胞培养物生长培养基一起使用。可以添加某些添加剂来控制所用的转染缓冲液和/或细胞培养物生长培养基的电导率，这些添加剂包括KCl、MgCl2、NaCl、葡萄糖、Na2HPO4、NaH2PO4、Ca(NO3)2、甘露糖醇、琥珀酸、右旋糖、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、海藻糖、CaCl2、二甲基亚砜(DMSO)、K2HPO4、KH2PO4、乙烯-双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)、KOH、NaOH、K2SO4、Na2SO4、组氨酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、ATP-二钠盐和NaHCO3。可以添加某些添加剂来控制所用的转染缓冲液和/或细胞培养物生长培养基的动态粘度，这些添加剂包括Ficoll、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、甲基纤维素(MethoCel)、胶原蛋白I和基质胶。
方法
本发明的特征在于使用本文所述的机电转染装置将组合物(例如遗传有效负载)引入到悬浮于流体中的多个细胞的至少一部分中的方法。本文所述的方法可以用于大大增加组合物至细胞类型的递送的通量，这通常被认为是基因工程研究领域和基因修饰的细胞疗法的治疗领域中的瓶颈。具体而言，与典型的转染方法(例如，慢病毒转染)或商购获得的细胞转染仪器(例如，基于电穿孔的仪器)相比，本文所述的方法在通过施用于多种细胞类型的转染后具有显著增加的回收细胞数、转染效率和细胞活力。
通过使含有悬浮细胞以及含有待引入细胞的组合物的流体通过如本文所述的本发明的装置(例如，机电转染装置)，可以将组合物引入到悬浮于流体中的多个细胞的至少一部分中。通过施加正压，例如从连接至流体源的泵(例如，蠕动泵、数字移液器或自动化液体处理源)施加正压，可以使悬浮于流体中的组合物和细胞通过本发明的装置递送。悬浮于流体中的组合物和细胞从进入区流到有源区，例如被设置成穿过由两个电极产生的电场。当悬浮于流体中的组合物和细胞流过有源区时，对第一电极和第二电极施加电势差，从而产生电场并因此将细胞暴露于电场，所述电场为有源区中的细胞提供电能。将流体中的细胞同时暴露于来自流动的机械能。将细胞暴露于所产生的电场和流动的机械能的组合，增强了多个细胞的暂时渗透性，从而将组合物引入到多个细胞的至少一部分中。在特定实施方案中，选择电场和流动，使得无量纲参数具有1×108和1×1010之间的值。
在一些情况下，由电场提供给流动液体的电能与由有源区中的压降提供的机械能的比率在103∶1至106∶1之间，例如103∶1和105∶1之间、104∶1和106∶1之间、103∶1和104∶1之间或105∶1和106∶1之间(例如约103∶1、104∶1、105∶1或106∶1)。
在一些情况下，本发明的方法包括根据本文所述的任何方法，首先使多个细胞的测试部分(例如，来自多个细胞的测试部分)和测试组合物穿过有源区。一个或多个测试部分可用于确定П5的最佳范围，例如，找到对应于最大细胞活力、转染效率和/或工程化细胞产率的П5的范围。当施加电场(E)，改变(u)、(E)、液体电导率(σ)、液体动态粘度(μ)和液体密度(ρ)中的-个或多个时，测试部分(例如，具有特定细胞与组合物比率的部分)可以以平均流速(u)穿过有源区，以找到对应于最大细胞活力、转染效率和/或工程化细胞产率的Π5的范围。这可以重复几次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)，其中细胞与组合物的比率相同和/或不同。替代地或另外地，测试可以在具有不同水力直径的有源区中重复进行。在确定Π5的一个或多个合适范围后，多个细胞可以在(u)、(E)、(σ)、(μ)和(ρ)的组合的情况下穿过有源区(具有合适的水力直径)，以将组合物引入到多个细胞中。变量(u)、(E)、(σ)、(μ)和(ρ)中的任何一个或任何组合可以变化。
在特定情况下，当用电极施加恒定电场(E)时，测试部分以变化的平均流速(u)穿过有源区，或者当电场变化时(例如，通过改变电极之间的电压)，平均流速可以是在恒定速度下。这些步骤中的一个或两个可以重复一次或多次，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。
在所述方法的一些情况下，在离开本发明的装置的有源区时，与细胞健康相关的细胞表型标志物、或某些表面标志物的表达、或某些细胞特性(例如治疗功能所需的特性)，相对于细胞表型标志物的基线测量或细胞健康、功能等的其它测量，可能不会改变。在特定情况下，多个细胞在离开有源区后，与细胞健康或所需功能(例如表达)相关的某些表型标志物没有可测量的变化。例如，建立细胞表型的基线或对照测量值可以是未使用本发明的装置转染的细胞上的细胞表面标志物的表达的测量值。在已使用本发明的装置转染的细胞上，相同的细胞标志物的表达的相应的相同测量值可以用于评估细胞表型的变化。经由细胞表面标志物表达的流式细胞术分析来评估细胞表型，以确保在机电转染后细胞表型的变化最小或保持不变。待评估的细胞表面标志物的实例包括但不限于CD3、CD4、CD8、CD19、CD45RA、CD45RO、CD28、CD44、CD69、CD80、CD86、CD206、IL-2受体、CTLA4、OX40、PD-1和TIM3、CD56、TNFa、IFNg、LAG3、TCRα/β、CD64、SIRPα/β(CD172a/b)、巢蛋白、CD325(N-钙粘蛋白)、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD197(CCR7)、CD27、CD11b、CCR7(CD197)、CD16、CD56、TIGIT、TRA-1-60、同源域蛋白、TCRγ/δ、OCT4、T-bet、GATA-3、FoxP3、IL-17、B220、CD25、IgM、PD-L1、IL-23、IL-12、CD11c和F4/80。评估细胞形态(例如，使用明视野或荧光显微镜)以确认机电转染后没有表型变化。
在一些情况下，在将组合物引入所述多个细胞的至少一部分后，所述多个细胞储存于回收缓冲液中。回收缓冲液被构造为促进在所述多个细胞中形成的孔的最终封闭。回收缓冲液通常包括细胞培养基，所述细胞培养基可以包含用于细胞营养和生长的其他成分，例如，血清、矿物质等。技术人员可以理解，回收缓冲液的选择将取决于进行机电转染的细胞类型。
细胞通量，即每个有源区每分钟处理的细胞数，例如每分钟转染的细胞数的范围通常为103个细胞/分钟至1011个细胞/分钟、例如103个细胞/分钟至104个细胞/分钟、5×103个细胞/分钟至5×104个细胞/分钟、105个细胞/分钟至105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟至5×106个细胞/分钟、106个细胞/分钟至107个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟至5×107个细胞/分钟、107个细胞/分钟至108个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟至5×108个细胞/分钟、108个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟至5×109个细胞/分钟、109个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟至5×1010个细胞/分钟或1010个细胞/分钟至1011个细胞/分钟，例如约103个细胞/分钟、5×103个细胞/分钟、104个细胞/分钟、5×104个细胞/分钟、105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟、106个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟、107个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟、108个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟、109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟、1010个细胞/分钟、5×1010个细胞/分钟或1011个细胞/分钟。在所述方法的一些情况下，将组合物以以下通量引入到多个细胞中：每个有源区至少1×105个细胞/分钟，例如105个细胞/分钟至105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟至5×106个细胞/分钟、106个细胞/分钟至107个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟至5×107个细胞/分钟、107个细胞/分钟至108个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟至5×108个细胞/分钟、108个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟至5×109个细胞/分钟、109个细胞/分钟至109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟至5×1010个细胞/分钟、1010个细胞/分钟至1011个细胞/分钟或1011个细胞/分钟至1012个细胞/分钟，例如约103个细胞/分钟、5×103个细胞/分钟、104个细胞/分钟、5×104个细胞/分钟、105个细胞/分钟、5×105个细胞/分钟、106个细胞/分钟、5×106个细胞/分钟、107个细胞/分钟、5×107个细胞/分钟、108个细胞/分钟、5×108个细胞/分钟、109个细胞/分钟、5×109个细胞/分钟、1010个细胞/分钟、5×1010个细胞/分钟、1011个细胞/分钟或1012个细胞/分钟。
在本文所述的方法的一些实施方案中，具有悬浮细胞的流体体积(例如，置换体积)和待引入到流过本发明装置的有源区的细胞中的组合物可以是每个有源区0.001mL至2000mL、0.001mL至1000mL，例如0.001mL至1000mL，例如0.001mL至0.1mL、0.01mL至1mL、0.01mL至750mL、0.01mL至1500mL、0.1mL至5mL、0.1mL至500mL、0.1mL至2000mL、1mL至10mL、1mL至1000mL、2mL至2000mL、2.5mL至20mL、5mL至40mL、10mL至60mL、10mL至1000mL、20mL至2000mL、30mL至80mL、50mL至200mL、100mL至500mL或250mL至750mL、500mL至1000mL、500mL至2000mL、750mL至1500mL或1000mL至2000mL，例如0.01mL至100mL、0.1mL至99mL、1mL至97mL或10mL至95mL，例如0.0025mL至10mL、o.01mL至1mL或0.025mL至0.1mL，例如约0.001mL、0.0025mL、0.005mL、0.0075mL、0.01mL、0.025mL、0.05mL、0.075mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL、550mL、600mL、650mL、700mL、750mL、800mL、850mL、900mL、950mL、1000mL、1050mL、1100mL、1150mL、1200mL、1250mL、1300mL、1350mL、1400mL、1450mL、1500mL、1550mL、1600mL、1650mL、1700mL、1750mL、1800mL、1850mL、1900mL、1950mL或2000mL。
在一些实施方案中，流过本发明的装置的有源区的流体体积(例如，置换体积)、置换速率或其他受控参数可以影响或可以不影响多个细胞的转染效率。在一些实施方案中，本发明的装置被构造为与自动化流体处理平台一起使用，所述自动化流体处理平台可以每次反应处理大约10-200μL体积的多个细胞。在一些实施方案中，本发明的装置是***的一部分，所述***可以每次反应处理高达几升的体积。在一些实施方案中，自动化流体处理平台被构造用于与一个或多个流体递送源(例如泵，例如注射泵、微泵或蠕动泵)一起使用，所述流体递送源递送流过本发明的装置的有源区的流体体积。在一些实施方案中，流过本发明的装置的有源区的流体体积可以通过使工作流体相对于待递送的流体的储集器而置换或通过空气置换来递送。在一些实施方案中，流体递送源被构造为通过正压的施加来使悬浮于流体中的细胞流动。
在某些方面，细胞所悬浮的流体的电导率可以影响悬浮液中细胞的机电转染。具有悬浮细胞的流体的电导率可以为0.001mS至500mS，例如0.001mS至0.1mS、0.01mS至1mS、0.1mS至10mS、1mS至50mS、10mS至100mS、25mS至200mS、50mS至400mS或100mS至500mS，例如0.01mS至100mS、0.1mS至50mS或1至20mS，例如约0.001mS、0.002mS、0.003mS、0.004mS、0.005mS、0.006mS、0.007mS、0.008mS、0.009mS、0.01mS、0.02mS、0.03mS、0.04mS、0.05mS、0.06mS、0.07mS、0.08mS，0.09mS、0.1mS、0.2mS、0.3mS、0.4mS、0.5mS、0.6mS、0.7mS、0.8mS、0.9mS、1mS、2mS、3mS、4mS、5mS、6mS、7mS、8mS、9mS、10mS、15mS、20mS、25mS、30mS、35mS、40mS、45mS、50mS、55mS、60mS、65mS、70mS、75mS、80mS、85mS、90mS、95mS、100mS、150mS、200mS、250mS、300mS、350mS、400mS、450mS或500mS。
本发明的方法可以将组合物递送至许多细胞类型，包括但不限于哺乳动物细胞、真核生物细胞、原核生物细胞、合成细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、原代细胞、细胞系、悬浮细胞、贴壁细胞、未刺激的细胞、刺激的细胞或活化的细胞、免疫细胞、实体瘤细胞、干细胞(例如，原代人诱导性多能干细胞(例如，iPSC)、胚胎干细胞(例如，ESC)、间充质干细胞(例如，MSC)或造血干细胞(例如，HSC))、血细胞(例如，红细胞)、T细胞(例如，原代人T细胞)、B细胞、抗原呈递细胞(APC)、自然杀伤(NK)细胞(例如，原代人NK细胞)、单核细胞(例如，原代人单核细胞)、巨噬细胞(例如，原代人巨噬细胞)和外周血单核细胞(PBMC)、中性粒细胞、树突细胞、人胚肾(例如HEK-293)细胞或中国仓鼠卵巢(例如，CHO-K1)细胞。可以转染的典型细胞数可以是每个有源区104个细胞至1012个细胞(例如104个细胞至105个细胞、104个细胞至106个细胞、104个细胞至107个细胞、5×104个细胞至5×105个细胞、105个细胞至106个细胞、105个细胞至107个细胞、2.5×105个细胞至106个细胞、5×105个细胞至5×106个细胞、106个细胞至107个细胞、106个细胞至108个细胞、106个细胞至1012个细胞、5×106个细胞至5×107个细胞、107个细胞至108个细胞、107个细胞至109个细胞、107个细胞至1012个细胞、5×107个细胞至5×108个细胞、108个细胞至109个细胞、108个细胞至1010个细胞、108个细胞至1012个细胞、5×108个细胞至5×109个细胞、109个细胞至1010个细胞、109个细胞至1011个细胞、1010个细胞至1011个细胞、1010个细胞至1012个细胞或1011个细胞至1012个细胞，例如约104个细胞、2.5×104个细胞、5×104个细胞、105个细胞、2.5×105个细胞、5×105个细胞、106个细胞、2.5×106个细胞、5×106个细胞、107个细胞、2.5×107个细胞、5×107个细胞、108个细胞、2.5×108个细胞、5×108个细胞、109个细胞、2.5×109个细胞、5×109个细胞、1010个细胞、5×1010个细胞、1011个细胞或1012个细胞)。
本文所述的本发明的方法可以将多种组合物递送至悬浮于流体中的细胞。可以递送至细胞的组合物包括但不限于治疗剂、维生素、纳米颗粒、带电的分子(例如，溶液中的离子)、不带电的分子、核酸(例如，DNA或RNA)、CRISPR-Cas复合物、蛋白质、聚合物、核糖核蛋白(RNP)、经工程化的核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、归巢核酸酶、大范围核酸酶(MN)、大范围TAL、酶、肽、转座子或多糖(例如，葡聚糖，例如，硫酸葡聚糖)。可以在悬浮液中递送至细胞的示例性组合物包含核酸、寡核苷酸、抗体(或抗体片段，例如双特异性片段、三特异性片段、Fab、F(ab′)2、或单链可变片段(scFv))、氨基酸、肽、蛋白质、基因治疗剂、基因组工程化的治疗剂、表观基因组工程化的治疗剂、碳水化合物、化学药物、造影剂、磁性颗粒、聚合物珠粒、金属纳米颗粒、金属微粒、量子点、抗氧化剂、抗生素剂、激素、核蛋白、多糖、糖蛋白、脂蛋白、类固醇、抗炎剂、抗微生物剂、化学治疗剂、外泌体、外膜囊泡、疫苗、病毒、噬菌体、佐剂、矿物质以及它们的组合。待递送的组合物可以包含单一化合物，诸如本文所述的化合物。或者，待递送的组合物可以包含多个靶向不同基因的化合物或组分。
流体中组合物的典型浓度可以为0.0001μg/mL至1000μg/mL(例如，0.0001μg/mL至0.001μg/mL、0.001μg/mL至0.01μg/mL、0.001μg/mL至5μg/mL、0.005μg/mL至0.1μg/mL、0.01μg/mL至0.1μg/mL、0.01μg/mL至1μg/mL、0.1μg/mL至1μg/mL、0.1μg/mL至5μg/mL、1μg/mL至10μg/mL、1μg/mL至50μg/mL、1μg/mL至100μg/mL、2.5μg/mL至15μg/mL、5μg/mL至25μg/mL、5μg/mL至50μg/mL、5μg/mL至500μg/mL、7.5μg/mL至75μg/mL、10μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至1,000μg/mL、25μg/mL至50μg/mL、25μg/mL至250μg/mL、25μg/mL至500μg/mL、50μg/mL至100μg/mL、50μg/mL至250μg/mL、50μg/mL至750μg/mL、100μg/mL至300μg/mL、100μg/mL至1,000μg/mL、200μg/mL至400μg/mL、250μg/mL至500μg/mL、350μg/mL至500μg/mL、400μg/mL至1,000μg/mL、500μg/mL至750μg/mL、650μg/mL至1,000μg/mL或800μg/mL至1,000μg/mL，例如约0.0001μg/mL、0.0005μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.03μg/mL、0.04μg/mL、0.05μg/mL、0.06μg/mL、0.07μg/mL、0.08μg/mL、0.09μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL、4.5μg/mL、5μg/mL、5.5μg/EL、6μg/mL、6.5μg/mL、7μg/mL、7.5μg/mL、8μg/mL、8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、500μg/mL、550μg/mL、600μg/mL、650μg/mL、700μg/mL、750μg/mL、800μg/mL、850μg/mL、900μg/mL、950μg/mL或1,000μg/mL)。
流体中组合物的典型浓度可以在0.0001μM和20μM之间(例如，0.0001μM至0.001μM、0.001μM至0.01μM、0.001μM至5μM、0.005μM至0.1μM、0.01μM至0.1μM、0.01μM至1μM、0.1μM至1μM、0.1μM至5μM、1μM至10μM、1μM至15μM或1μM至20μM，例如约0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM)。
在一些情况下，使用热控制器来控制含有悬浮细胞和组合物的流体的温度，所述热控制器被纳入支撑本发明的一个或多个装置的壳体中。控制流体的温度以减少来源于有源区中产生的电场的焦耳热的影响，因为太高的温度可以损害机电转染后的细胞活力。流体的温度可以为0℃至40℃，例如0℃至10℃、1℃至5℃、2℃至15℃、3℃至20℃、4℃至25℃、5℃至30℃、7℃至35℃、9℃至40℃、10℃至38℃、15℃至40℃、20℃至40℃、25℃至40℃或35℃至40℃，例如约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃ 31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
使用本发明的方法转染的细胞比使用典型转染方法，例如慢病毒转染或可商购获得的细胞转染仪器更有效地转染，并具有更高的活力。例如，对于本文所述的方法，转染效率，即将组合物成功递送至细胞的效率可以为0.1％至99.9％，例如0.1％至5％、1％至10％、2.5％至20％、5％至40％、10％至60％、30％至80％或50％至99.9％，例如10％至90％、25％至85％，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％。
在使用本文所述的本发明的方法引入组合物后，悬浮于流体中的细胞的细胞活力，即机电转染过程后健康细胞的数量或百分比，可以为0.1％至99.9％，例如0.1％至5％、1％至10％、2.5％至20％、5％至40％、10％至60％、30％至80％或50％至99.9％，例如10％至90％、25％至85％，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％。
回收产率，即在机电转染后收集的活工程化细胞的百分比可以为转染后24h时0.1％至500％，例如0.1％至5％、1％至10％、2.5％至20％、5％至40％、10％至60％、30％至80％、50％至99.9％、75％至150％、100％至200％、150％至250％、200％至300％、250％至350％、300％至400％、350％至450％或400％至500％，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99.9％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％或500％。
在一些实施方案中，所述方法产生的细胞回收产率，即在机电转染后收集的活工程化细胞的百分比为0.1％和100％之间(例如，0.1％和5％之间、1％和10％之间、2.5％和20％之间、5％和40％之间、10％和30％之间、10％和60％之间、10％和90％之间、25％和40％之间、25％和85％之间、30％和50％之间、30％和80％之间、40％和65％之间、50％和75％之间、50％和100％之间、60％和80％之间、75％和100％之间、85％和100％之间，例如约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。
技术人员将理解，最佳条件可以根据细胞类型或其他因素而变化。对于每种新细胞类型，可以根据需要调整以下参数：波形、电场、脉冲持续时间、缓冲液暴露时间、缓冲液温度和处理后的条件。
实施例
实施例1-机电转染的应用
本文展示了用自动化液体处理器实施的机电转染。在该实施例中，流动池被设计成与液体处理***整合，以便能够将电能和机械能递送至细胞悬浮液(图1)。这些流动池包括设计有储集器的移液管尖端，能够拾取并分配悬浮于流体缓冲材料中的细胞和有效负载。当悬浮于流体缓冲液中的细胞和有效负载以限定的流速穿过流动池时，通过与横跨流动池区域放置的电极接触来将精确的电场递送穿过流动池。将这些细胞分配到含有生长培养基的96孔板中，并培养24小时。然后进行生物分析，以通过流式细胞仪确定输出度量(门控实施例可在图7中找到)。
机电转染的有效使用需要确定靶细胞和有效负载组合的最佳条件和参数。这些条件和参数包括流速和电场特性。为了确定用于应用机电转染将基于mRNA的有效负载递送到原代T细胞中的最佳条件，在全自动化平台上进行基于板的基质实验，所述平台包括与商业液体处理***(PerkinElmerG3***，Waltham，MA)整合的机电装置阵列。利用这种技术，可以以分批方式递送多达96种独立编程的机电转染参数组合。在这组实验中，解冻后24小时，将报告基因mRNA有效负载递送至第九天扩增的人T细胞。使用可溶性抗CD3和抗CD28抗体扩增原代人T细胞，并将其重悬于转染缓冲液中。处理后立即回收样品用于培养和下游分析。通过流式细胞术(Thermo Fisher AttuneTM NxT)测量细胞活力、活细胞计数和转染效率；使用GFP(绿色荧光蛋白)mRNA测量对扩增的T细胞的递送效率(图8)。这组实验产生了多种条件(总共11种)，其中转染的细胞表现出高活力(大于70％的活细胞)和高转染效率(大于90％的GFP+)。/>
预期最相关的细胞转染参数诸如活力、转染效率和细胞产率取决于以上定义的无量纲参数，包括П1、П2、Re、П4及其组合(图2)。第五个无量纲组是所有四个参数的组合，它似乎控制与细胞转染相关的主要物理学。将这个无量纲组表示为对于给定的细胞类型，在特定转染介质中，括号外的所有项都可以被认为是常数。因此，预期细胞转染通常会随着所施加的电场E(例如，电能)和通道中的平均速度u(例如，机械能)而发生最显著变化。如以下实施例所示，发现细胞活力、转染效率和细胞产率似乎都强烈依赖于П5。该数据证明，对于固定的通道几何形状、培养基和细胞类型，П5的值是决定细胞转染结果的主要因素之一。该因素结合了机械能和电能输入的效果，进一步表明机电转染在物理上不同于细胞转染的纯电方法或纯机械方法。
实施例2-转录谱
为了进一步评估使用机电转染将遗传有效负载递送到T细胞中的效果，进行转录组分析以评估处理后发生的转录变化(图3A-图3F)。此外，包括可商购获得的基于非病毒电穿孔的***，用于比较度量：来自Thermo Fisher的NeonTM转染***(称为‘NeonTM’)和来自Lonza的4D NucleofectorTM(称为v4D NucleofectorTM’)。使用含有5M细胞的100μL反应和装置特定的专有程序和缓冲液来评估每个***。材料部分提供了每个装置的程序信息。对于每个装置，在没有有效负载存在的情况下处理细胞，并将其与没有经历任何处理的供体对照进行比较。对于该分析，在每台装置上重复处理来自两个供体的细胞。在细胞处理后6小时，大于1倍的显著(p＜0.05)基因失调在图3A-图3C的火山图中示出为红色(上调基因)或绿色(下调基因)(来自第二供体的重复数据示出在图9中)。机电***在6小时表现出接近基线的基因表达谱，所有基因中仅2％被机电转染过程异常调节(图3D)。NeonTM静态转染***在6小时表现出低失调谱，所有基因中仅6％被该基于电穿孔的过程异常调节(图3D)。4DNucleofectorTM在6小时表现出显著失调，所有基因中的47％被该基于电穿孔的转染过程异常调节(图3D)。
细胞产物的功能能力可直接影响细胞驱动所需免疫反应的有效性。例如，已表明编辑的细胞分化和耗竭可能与T细胞疗法的有限效率有关。为了更好地理解细胞处理对T细胞功能的影响，在6小时和24小时的时间点评估通常与T细胞功能相关的基因的上调(图3E)。我们包括了促炎细胞因子(IFNγ和IL-2)和活化受体(CD69和CD27)，选择它们来评估细胞的过程驱动活化。此外，选择耗竭受体(CTLA4和TIGIT)作为对处理的细胞下游细胞功能的过程影响的指标。在机电处理的细胞中没有观察到促炎细胞因子、活化受体或耗竭标志物的上调(图3E)。相反，电穿孔诱导这些基因的上调；在处理的细胞中，NeonTM转染***上调CTLA4，并且4D NucleofectorTM上调促炎细胞因子、活化受体和耗竭标志物(图3E)。
为了进一步探索对整体细胞健康和功能的影响，使用通过进化关系的蛋白质分析(PANTHER)分类***评估了着重于分子功能、生物过程和蛋白质类别的基因本体论。在6小时的时间点，机电转染显示6％的总失调与蛋白质类别相关，13％归因于分子功能，并且18％的总失调与生物过程相关(图3F)。对于NeonTM电穿孔***，10％的总失调与蛋白质类别相关，19％归因于分子功能，并且36％的总失调与生物过程相关(图3F)。用4DNucleofectorTM转染导致13％的总失调与蛋白质类别相关，24％归因于分子功能，并且52％的总失调与生物过程相关(图3F)。
为了将转录组数据与处理后活力和递送效率相关联，使用用于机电***、NeonTM和4D NucleofectorTM平台的相同程序和条件，用报告基因mRNA有效负载转染来自相同供体的细胞(图11A-图11C)。机电***与NeonTM***类似，表现出约80％的高转染细胞活力，而4DNucleofectorTM***表现出约45％的低转染细胞活力(图11A)。关于递送，机电***和NeonTM***均实现了约90％的高递送效率，而4D NucleofectorTM***导致约50％的中等递送效率。(图11B)。结合转录组分析，很明显非病毒递送效率与处理后的细胞产物不良健康无关。此外，就包括基因失调、活力、效率和细胞健康输出在内的所有指标而言，机电转染优于现有的基于电穿孔的转染装置。
实施例3-将多种mRNA递送至原代人T细胞
进行实验来评估机电转染方法将多个有效负载并联(即，通过单一处理共递送)和串联(即，交错处理，间隔48小时)递送到单个细胞中的能力。在同一天用含有两种mRNA的细胞混合物进行并联条件，所述mRNA包括GFP报告基因mRNA和mCherry报告基因mRNA，而串联处理间隔两天进行，在每个时间点用含有单一mRNA的细胞混合物进行，首先用GFP报告基因mRNA，然后在48小时后用mCherrymRNA进行。mRNA表达荧光报告基因以追踪单细胞水平下的递送效率(图11A-图11C)。对于两种方法，用机电转染处理后24小时原代T细胞的活力为约80％(图11A)，表明并联和串联转染对细胞健康无害，从而允许重复交错转染而没有利用机电技术的细胞活力的显著损失。然而，两种方法观察到不同的表达谱(图11B)。并联方法向单个细胞的双重递送效率为94.2％；而当进行串联转染时，递送效率为82.3％(图11C)。对于mRNA并联共递送，观察到清晰的1∶1表达，仅非常少的细胞(1％)表达单一荧光报告基因(图11B)。相比之下，对于串联转染，3.3％的群体为GFP单一阳性，并且11.3％的群体为mCherry单一阳性(图11C)。
实施例4-多个T细胞供体
供体异质性是所有细胞治疗制造和开发管道中的常数，因此跨多个供体评估输出指标至关重要。对于临床制造，包括来自不同供体的T细胞在内的来源材料可能需要重新表征和可比性测试。因此，证明在上述优化努力过程中获得的结果转化为来源于多种起始材料的T细胞对于细胞疗法开发是至关重要的(图4A-图4B)。将来自三个不同健康PBMC供体的细胞(人口统计可在下表1中找到)分离，扩增，然后用机电转染用GFP mRNA转染。本研究中的所有供体都符合材料和方法部分中概述的起始表型和活力标准。该实验证明了多供体细胞材料的一致结果，与无转染对照相比，其活力变化小于10％(图4A)。此外，对于所有三个供体，GFP mRNA递送的效率具有低可变性(并且超过84％)(图4B)。
表1-使用机电技术，用GFP报告基因mRNA转染来自三个独特供体的扩增的人T细胞。该人口统计表比较了三个独特的供体。
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实施例5-将mRNA递送至幼稚人T细胞
尽管未活化的幼稚T细胞由于转染前的制备和处理相对简单而在细胞工程化中受到关注，但由于与遗传信息递送相关的历史挑战以及在没有首先活化T细胞的情况下不能进行逆转录病毒转导，这种细胞类型在细胞和基因治疗领域中代表性不足。为了评估用这种传统上难以转染的细胞状态进行机电转染的性能，用编码GFP的mRNA转染分离的幼稚T细胞(CD3+/CD4+/CD45RA+/CD45RO-)(图5A-图5F)。然后用可溶性抗CD3/抗CD28活化试剂扩增幼稚T细胞，并在转染后监测6天。这些细胞在转染后的生长率在活化后长达六天相当于未处理的对照细胞(图5A)，没有显著的活力损失(图5B)。此外，对细胞的幼稚T细胞标志物CD45RA和CD45RO进行染色(图5B)，表明转染细胞的表型没有变化，并且细胞保持其幼稚CD45RA+/CD45RO-状态。转染的幼稚T细胞的活力相当于未处理的细胞，分别为95.4％和98.3％(图5D)。观察到递送效率为96.7％(图5E)，对应于高的总产率(图5F)。
实施例6-制造体积放大
已普遍接受的是，由于电极和比色皿的几何形状不断变化，标准电穿孔在从研究到制造体积的放大过程中需要额外优化。为了解决这个问题，基于电穿孔的转染领域已出现了许多变通方法，包括应用微流体、基于批量的自动化和纳米结构。迄今为止，这些解决方案还不能满足不断发展的细胞和基因治疗工业中的高通量开发和大批量制造的需求。机电转染技术已被构造到大体积制造平台中(例如，被构造为连续再供应新细胞悬浮液的机电***和装置)，其利用了先前针对小体积***描述的相同流动池(图6A-图6B)。由于其连续流动性质，在大体积平台中的机电转染随时间成比例。因此，处理更大体积只需要成比例地操作更长时间。大体积机电转染解决方案能够在大约2-3分钟内处理多达100mL的流体，将细胞样品从输入袋转移到输出袋。通过蠕动泵(L/S)控制流体流量。将在本发明的小规模***上优化期间鉴定的相同参数直接应用于较大体积***，因为机电***利用完全相同的转染机制和组件，而与规模无关(图6A)。为了证明5mL运行(相对于上述数据放大50倍)，用1mg mRNA以10x6/mL的密度转染50M原代人T细胞(图6B)。结果显示，在机电转染后24小时，细胞活力没有显著损失，通过小平台和大平台进行转染的活力分别为73.5％和71.0％(图6B)。机电转染后24小时观察到的递送效率也相似，通过小平台和大平台进行转染的效率分别为94.3％和92.2％(图6B)。因此，机电转染可以容易地扩大临床相关处理体积。
实施例7-方法和材料
以下方法和材料用于收集实施例1-6中讨论的数据。
T细胞培养和扩增
人外周血细胞(PBMC)购自STEMCELL TechnologiesTM(#70025)。将100M PBMC在100mL来自Lonza的X-VIVOTM 10培养基(#04-380Q)中解冻，其中含有来自R&D SystemsTM的重组人IL-2蛋白(#202-IL)。解冻培养24小时后，根据制造商的方案，用来自STEMCELLTechnologiesTM的ImmunoCultTM人CD3/CD28 T细胞活化剂试剂(#10971)活化PBMC 3天。在第4天，将细胞沉淀(500x g，5分钟)并转移至来自Wilson Wolf的(#80500)，其中含有500mL新鲜的X-VIVOTM 10培养基和重组人IL-2。然后在/>培养物中每3天添加新鲜的重组人IL-2，总共12天。然后用来自Bulldog Bio的BambankerTM细胞冷冻培养基(#BB01)将细胞冷冻成等份试样以供将来使用。使扩增后解冻的T细胞等分试样以1e6/mL的密度在来自Thermo Fisher的RPMI 1640培养基(#11875119)中生长，所述培养基含有来自的10％胎牛血清(FBS)(#F-4135)、来自/>的青霉素-链霉素溶液(#30-002-CI)和重组IL-2。幼稚人T细胞(CD3+/CD4+/CD45RA+)也来源于STEMCELLTechnologiesTM(#70029)，并如上所述在具有10％FBS和IL-2的RPMI中培养。在标准细胞培养箱中，将细胞在37℃下用5％CO2培养。在细胞培养过程期间，使用CountessTMII(ThermoFisher)监控细胞活力和大小。
机电转染
用来自Biotechnologies的商业来源的编码GFP(#L7601)或mCherry(#L7203)的mRNA进行转染。计数T细胞，沉淀(500x g，5分钟)，并以10-50×106/mL的密度重悬于与本发明相容的转染缓冲液中。以固定的最大10％体积添加有效负载，并通过移液混合细胞：有效负载溶液。
在具有8-尖端VarispanTM头的PerkinElmerG3BioTx Pro Plus工作站上用小体积机电装置阵列对细胞进行处理。将细胞溶液转移到96孔板中的4℃冷却混合板上，并通过微流体通道上方的机电装置的尖端吸出。然后通过相同尖端以恒定流速分配溶液，同时通过电递送歧管向这些尖端施加特定电场。将细胞直接递送到细胞培养基中，用于在96深孔板中回收。
通过一个原型用较大体积的机电转染***处理细胞，在所述原型中流体流过放置在通过管道连接的输入袋和输出袋之间的机电转染装置，其中使用来自Cole-Palmer的L/S蠕动泵和/>BPT管道(L/S13：#06508-13)控制流体转移。将细胞：有效负载溶液转移到输入容器中，然后在施加特定电场的同时以恒定流速泵送通过通道。然后将细胞立即转移到细胞培养基中，用于在输出容器中回收。
两个平台的回收溶液的最终密度为1×106/mL，所述回收溶液含有10％转染缓冲液和90％细胞培养基。在标准细胞培养箱中，将细胞在37℃下用5％CO2培养。
NeonTM转染
根据制造商的说明书，使用Thermo Fisher NeonTM转染***。简言之，将5M第9天扩增的T细胞重悬于T缓冲液中，并装载到100μL NeonTM移液管吸头中。运行方案来自NeonTM T细胞微孔化方案(2100V 1脉冲20ms)。然后将处理的细胞转移到组织培养容器中。
4D NucleofectorTM转染
根据制造商的说明书，使用Lonza4D NucleofectorTM***。简言之，将5M第9天扩增的T细胞重悬于新鲜制备的人T细胞核转染溶液中，并装载到100μL Lonza认证的比色皿中。对于未刺激的人T细胞(EO115)，运行的方案来自AmaxaTM 4D NucleofectorTM方案。然后将处理的细胞转移到组织培养容器中。
流式细胞术分析
使用Thermo Fisher AttuneTM Nxt流式细胞仪评估活力和效率指标。将200μL培养的细胞沉淀(500x g，5分钟)并重悬于来自Fisher Scientific的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(#14190250)中，所述缓冲液具有来自eBiosciencesTM的7-AAD活力溶液(#00-6993-50)。然后，使用AttuneTM Nxt自动进样器在体积读数上分析细胞。在前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)点状图中对总细胞进行门控。然后对活细胞(7-AAD-)进行门控，以通过荧光报告基因的表达来确定递送效率。根据基于细胞培养物的总体积(7.5X/1mL)的应用稀释因子计算总细胞数和产率。用来自的APC/Cy7小鼠抗人CD45RA(#304128)和BV510小鼠抗人CD45RO(#304232)抗体进行幼稚T细胞标志物染色。
转录组分析
在处理后6小时和24小时从细胞培养物中收集全细胞沉淀，并储存在-80℃下。所有RNA提取、cDNA合成、下一代测序和相对于对照归一化的初步原始数据均由完成。然后在内部对归一化数据进行分析(Excel-Microsoft)并绘图(GraphPad-Prism 8)。将通过进化关系的蛋白质分析(PANTHER)分类***用于基因本体分析。
其他实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入，就如每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文的程度一样。如果此定义与本文引用的任何参考文献之间存在冲突，则以本文提供的定义为准。
虽然已经结合本公开的具体实施方案描述了本公开，但应理解，本发明能够进一步修改，并且本申请旨在覆盖本公开的任何变化、使用或改编，所述变化、使用或改编通常遵循本公开的原理，并且包括在本公开所属领域内的已知或常规实践中的对本公开的所述偏离，并且可应用于上文所示的基本特征，并且在权利要求的范围内。
其他实施方案在权利要求内。
Claims (18)
1.一种将组合物引入到悬浮于流动液体中的多个哺乳动物细胞中的方法，所述方法包括：
(a)提供装置，所述装置包括：
i)包括第一入口和第一出口的进入区；
ii)第一电极和第二电极；和
iii)包括第二入口和第二出口的有源区；和
(b)选择电场(E)、平均流速(u)、所述有源区中的水力直径(d)、液体电导率(σ)、液体动态粘度(μ)和液体密度(ρ)的组合，以给出值在1×108和1×1010之间的无量纲参数Π5；其中所述无量纲参数Π5由下式表示：
以及
(c)使所述多个细胞和所述组合物穿过所述有源区，同时提供所选择的(E)、(u)、(d)、(σ)、(μ)和(ρ)的组合，从而将所述组合物引入到所述多个哺乳动物细胞中。
2.如1所述的方法，其中所述组合物以每个有源区至少1×105个细胞/分钟的通量引入到所述多个细胞中。
3.如1所述的方法，其中所述进入区和所述有源区被构造为提供增加的平均流速。
4.如1所述的方法，其中所述组合物被引入到所述多个哺乳动物细胞中，而不改变所需的细胞表面标志物。
5.一种将组合物引入到悬浮于流动液体中的多个细胞中的方法，所述方法包括：
(a)提供装置，所述装置包括：
i)包括第一入口和第一出口的进入区；
ii)第一电极和第二电极；和
iii)包括第二入口和第二出口的有源区，和
(b)使所述多个细胞和所述组合物穿过所述有源区，同时提供来自所述第一电极和所述第二电极的电能，并提供至少部分地来自平均流速的机械能；其中所述机械能和所述电能一起使得将所述组合物引入到所述多个细胞中，其效率、活力和/或产率至少等于单独的电穿孔或机械穿孔，且比电穿孔或机械穿孔需要更少的电能或机械能来实现所述效率、活力和/或产率。
6.如5所述的方法，其中所述组合物以每个有源区至少1×105个细胞/分钟的通量引入到所述多个细胞中。
7.如5或6所述的方法，其中由电场提供给所述流动液体的所述电能与由所述有源区中的压降提供的所述机械能的比率在103∶1和106∶1之间。
8.如5所述的方法，其中所述进入区和所述有源区被构造为提供增加的平均流速。
9.一种将组合物引入到悬浮于流动液体中的多个细胞中的方法，所述方法包括：
(a)提供装置，所述装置包括：
i)包括第一入口和第一出口的进入区；和
ii)第一电极和第二电极；
iii)包括第二入口和第二出口并具有水力直径(d)的有源区；和
(b)提供所述多个细胞的测试部分和测试组合物，它们一起具有液体电导率(σ)、液体动态粘度(μ)和液体密度(ρ)，以及细胞与组合物的比率，并使所述测试部分和所述测试组合物以平均流速(u)穿过所述有源区，同时施加电场(E)，其中(u)、(E)、(σ)、(μ)和(ρ)中的至少一个为改变的；
(c)确定无量纲参数Π5的范围，其包括最大细胞活力、转染效率和/或工程化细胞产率，用于将所述测试组合物引入到所述多个细胞的所述测试部分中，其中
和
(d)使所述多个细胞和所述组合物以对应于Π5值的(u)、(E)、(σ)、(μ)和(ρ)的组合穿过所述有源区，所述值包括最大细胞活力、转染效率或工程化细胞产率中的至少一种，从而将所述组合物引入到所述多个细胞中。
10.如9所述的方法，其还包括重复步骤(b)，其中所述细胞测试部分和所述测试组合物具有第二细胞与组合物比率和/或所述有源区具有第二水力直径(d)。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述电场(E)保持恒定，同时改变所述平均速度(u)；或者所述平均流速(u)保持恒定，同时改变所述电场(E)。
12.如9-11中任一项所述的方法，其中所述组合物以每个有源区至少1×105个细胞/秒的通量引入到所述多个细胞中。
13.如9所述的方法，其中所述进入区和所述有源区被构造为提供增加的平均流速(u)。
14.一种将组合物引入到多个人免疫细胞中的方法，所述免疫细胞来自从正常患者或供体血液中收集的悬浮液并悬浮于流动液体中，所述方法包括：
(a)提供装置，所述装置包括：
i)包括第一入口和第一出口的进入区；
ii)第一电极和第二电极；和
iii)包括第二入口和第二出口的有源区；和
(b)选择电场(E)、平均流速(u)、所述有源区中的水力直径(d)、液体电导率(σ)、液体动态粘度(μ)和液体密度(ρ)的组合，以给出值在1×108和1×1010之间的无量纲参数Π5；其中所述无量纲参数Π5由下式表示：
以及
(c)使所述多个细胞和所述组合物穿过所述有源区，同时提供所选择的(E)、(u)、(d)、(σ)、(μ)和(ρ)的组合，从而将所述组合物引入到所述多个人免疫细胞中以产生治疗剂量的转染细胞。
15.如14所述的方法，其中所述悬浮液使用白细胞分离术制备。
16.如14所述的方法，其中所述组合物以每个有源区至少1×105个细胞/分钟的通量引入到所述多个细胞中。
17.如14所述的方法，其中所述进入区和所述有源区被构造为提供增加的平均流速。
18.如14所述的方法，其中所述组合物被引入到所述多个哺乳动物细胞中，而不改变所需的细胞特征。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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