CN117821282A - 约氏乳杆菌ljsd001及其在延缓衰老中的应用 - Google Patents

约氏乳杆菌ljsd001及其在延缓衰老中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于益生菌领域，公开了一种约氏乳杆菌LJSD001及其在延缓衰老中的应用。所述LJSD001菌是自主分离鉴定并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，LJSD001菌可以延长雌性早衰鼠的寿命，可作为当今有限益生菌延缓衰老的有益补充；LJSD001菌可以减轻肝脏脂质沉积，在肝脏脂质代谢障碍相关疾病中有一定的应用前景；LJSD001菌可以维持衰老过程中的肠道稳态，在肠道稳态失衡的相关疾病中有一定的应用市场；LJSD001菌可以改善年龄相关性的骨质疏松和肌肉衰老，本发明为骨质疏松和肌肉衰老等相关疾病的治疗提供了新线索和新思路；LJSD001菌可以改善神经衰老，本发明为认知减退等相关疾病的治疗提供新的诊疗方向。

Description

约氏乳杆菌LJSD001及其在延缓衰老中的应用
技术领域
本发明属于益生菌领域，具体为约氏乳杆菌LJSD001及其在延缓衰老中的应用，尤其是在制备延缓雌性动物整体衰老以及多脏器衰老产品中的应用。
背景技术
作为宿主微生物群的最大组成部分，胃肠道微生物群包含至少1000种不同微生物物种，总数在1013至1014之间，与人体细胞总数(3～4×1013)相当，被称为人体第二器官。肠道菌群不仅与胃肠道的生理功能密切相关，还参与多种疾病的发生与发展，如胃肠道疾病(炎症性肠病、结直肠癌)、代谢相关性疾病(糖尿病，肥胖、非酒精性脂肪肝)、心血管疾病和衰老相关疾病。
约氏乳杆菌是一种厚壁菌门革兰阳性兼性厌氧菌，是婴儿肠道乳杆菌的优势菌种，也普遍存在于成年人肠道中。既往研究发现，约氏乳杆菌可通过调节皮肤免疫***维持紫外线照射下皮肤的稳态。与此同时，约氏乳杆菌可以通过活化天然巨噬细胞促进抗炎细胞因子IL-10的分泌，从而缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性和慢性结肠炎。然而目前尚未有约氏乳杆菌与寿命或衰老相关生物学表型的研究。
发明内容
第一方面，本发明提供一种约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)LJSD001。约氏乳杆菌(LJSD001菌)为自主分离获得并典藏。
所述LJSD001菌是从粪便中分离出来，种水平通过16S rRNA基因测序鉴定确认，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO.23929，菌株名称：约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)-LJSD001菌。本发明将其首次用于延长雌性早衰小鼠寿命的相关研究，并且初显成效。动物实验表明，LJSD001菌有效延长雌性早衰小鼠的寿命。该菌株取得了以往约氏乳杆菌株预料不到的结果，有望进一步开发成延缓衰老的相关药物。
第二方面，本发明还提供含有约氏乳杆菌LJSD001的菌剂。
所述菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂，可以为药品、保健食品或食品，可以含有对应领域内可接受的载体和/或辅料；其剂型可以为丸剂、片剂、散剂、胶囊、颗粒剂、混悬剂、注射剂、口服液、灌肠剂或管饲制剂。当为液体菌剂，则所述LJSD001菌的浓度优选为109CFU/200μL。
第三方面，本发明还提供上述约氏乳杆菌LJSD001在制备延缓雌性动物衰老的制剂中的应用。
提供上述约氏乳杆菌LJSD001在制备以下任一种用途的制剂中的应用：
降低自然衰老雌性动物虚弱指数；
减轻自然衰老雌性动物肝脏脂质沉积；
改善自然衰老雌性动物肠道稳态；
改善自然衰老雌性动物骨质疏松；
改善自然衰老雌性动物肌肉衰老；
改善自然衰老雌性动物神经衰老。
本发明至少具有如下优点及有益效果：
(1)、LJSD001菌可以延长雌性早衰动物的寿命，目前尚无相关文献和专利报道，可作为当今有限益生菌治疗手段的有益补充；
(2)、LJSD001菌可以降低自然衰老雌性动物的虚弱指数，在延缓衰老中有一定的应用市场。
(3)、LJSD001菌可以减轻自然衰老雌性动物的肝脏脂质沉积，在肝脏脂质代谢障碍相关疾病中有一定的应用前景；
(4)、LJSD001菌可以维持自然衰老雌性动物的肠道稳态，在肠道稳态失衡相关疾病中有一定的应用市场。
(5)、LJSD001菌可以改善自然衰老雌性动物的骨质疏松，为年龄相关性骨质疏松的治疗提供新线索和新思路。
(6)、LJSD001菌可以改善自然衰老雌性动物的肌肉衰老，为老年相关的肌少症提供新的治疗方案。
(7)、LJSD001菌可以改善自然衰老雌性动物的神经衰老，为治疗年龄相关的认知减退提供新思路。
附图说明
图1a、图1b为实施例1中LJSD001菌的全基因组测序图。图中，A为LJSD001菌的Circos基因组圈图分析；B为LJSD001菌亚种比较基因组物种进化树分析；C为LJSD001菌亚种泛基因组Venn图分析。
图2为实施例2中LJSD001菌在延长雌性早衰小鼠寿命中的作用。图中，A为PBS组达50％死亡率时，PBS组及LJSD001菌干预雄性早衰鼠的大体观；B为PBS组达50％死亡率时，PBS组及LJSD001菌干预雌性早衰鼠的大体观；C为PBS和LJSD001菌分别干预雄性和雌性早衰鼠的体重变化；D为不区分性别时，PBS和LJSD001菌分别干预早衰鼠的生存曲线情况；E为单独分析雄性早衰小鼠，PBS和LJSD001菌干预后的生存曲线情况；F为单独分析雌性早衰小鼠，PBS和LJSD001菌干预后的生存曲线差异情况。
图3为实施例3中LJSD001菌在改善自然衰老雌性小鼠的虚弱指数中的作用。图中，A为19个月时，雌性自然衰老小鼠(Aged)及LJSD001菌干预雌性自然衰老小鼠(Aged+L.j)的大体观；B为干预10个月后两组自然衰老雌性小鼠的全身衰老指数评分。
图4为实施例4中LJSD001菌在改善自然衰老雌性小鼠肝脏脂质沉积中的作用。图中，A为油红染色显示PBS和LJSD001菌分别处理的自然衰老雌性小鼠(分别对应图中Aged、Aged+L.j)以及年轻对照雌性小鼠(对应图中Young组)的肝脏脂质沉积情况。B为甘油三脂试剂盒检测PBS和LJSD001菌分别处理的自然衰老雌性小鼠以及年轻对照雌性小鼠甘油三脂含量的情况。
图5为实施例5中LJSD001菌在改善自然衰老雌性小鼠肠道稳态中的作用。图中，A为分别用PBS和LJSD001菌干预自然衰老雌性小鼠，年轻雌性小鼠作为对照，三组小鼠肠道免疫组化(HE)图，SA-β-gal染色以及PAS染色情况；B为三组小鼠肠道衰老指标P21、P53的蛋白图；C为表示三组小鼠肠道通透性的荧光标记的葡聚糖(FITC-dextran)实验；D为三组小鼠肠道粘液层厚度图；E为三组小鼠肠道屏障蛋白的电镜图；F为三组小鼠肠道屏障蛋白mRNA水平的变化；G为通过流式细胞术检测三组小鼠肠道免疫细胞CD8T细胞的衰老情况；H为通过流式细胞术检测三组小鼠肠道免疫细胞CD4T细胞的衰老情况。
图6为实施例6中LJSD001菌在改善自然衰老雌性小鼠的骨质疏松中的作用。图中，A为PBS和LJSD001菌分别处理的自然衰老雌性小鼠(分别对应图中Aged、Aged+L.j)以及年轻对照雌性小鼠(对应图中Young组)三组小鼠股骨样本微型CT进行扫描后3D重建代表图；B为三组小鼠骨体积分数：骨体积/总体积(BV/TV)比较；C为三组小鼠骨小梁数(Tb.N)比较。
图7为实施例7中LJSD001菌在改善自然衰老雌性小鼠肌肉衰老中的作用。图中，A为PBS和LJSD001菌分别处理的自然衰老雌性小鼠(分别对应图中Aged、Aged+L.j)以及年轻对照雌性小鼠(对应图中Young组)，三组小鼠肌力情况；B为PBS和LJSD001菌分别处理的自然衰老雌性小鼠(分别对应图中Aged、Aged+L.j)以及年轻对照雌性小鼠(对应图中Young组)，三组小鼠肌肉衰老指标的蛋白水平变化。
图8为实施例8中LJSD001菌在延缓自然衰老雌性小鼠认知减退中的作用。A为PBS和LJSD001菌分别处理的自然衰老雌性小鼠(分别对应图中Aged、Aged+L.j)以及年轻对照雌性小鼠(对应图中Young组)进行新物体识别实验时三组小鼠的新事物认知指数；B为Y迷宫实验时三组小鼠正确率；C为Y迷宫实验时三组小鼠的错误次数；D为Morris水迷宫实验时三组小鼠平均游泳速度；E为Morris水迷宫实验时三组小鼠训练期找到平台的平均潜伏时间；F为Morris水迷宫实验三组小鼠检测日穿越平台次数；G为Morris水迷宫实验三组小鼠游泳轨迹代表图；H为Morris水迷宫实验三组小鼠检测日第1次穿越平台潜伏时间。
图9为实施例9中LJSD001菌可改善自然衰老雌性小鼠神经炎症及突触可塑性。A为PBS和LJSD001菌分别处理的自然衰老雌性小鼠(分别对应图中Aged、Aged+L.j)以及年轻对照雌性小鼠(对应图中Young组)的透射电镜代表图，比较三组小鼠血脑屏障超微结构，比例尺＝500nm；B为三组小鼠海马CA1、CA3及DG区Iba1免疫荧光染色代表图，放大倍数400X；C为三组小鼠海马CA1、CA3及DG区每个视野Iba1+小胶质细胞数目对比；D为三组小鼠脑组织高尔基染色代表图，放大倍数400X。E为三组小鼠脑组织高尔基染色统计图，每50μm树突棘数量对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。
实施例1：约氏乳杆菌(LJSD001菌)的分离鉴定
本实施例所述约氏乳杆菌(LJSD001菌)由我们独立分离出来的，种水平通过16srRNA基因测序鉴定确认，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏日期为：2021年11月17日；保藏编号为：CGMCC NO.23929，菌株名称：约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)-LJSD001菌。
1.菌株分离：约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)分离自猪的粪便。取5g粪便，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，吸取合适稀释度的稀释液0.1ml在MRS琼脂上均匀涂布，37℃培养48h后，将生长出的菌落通过平板划线接种到新的MRS固体培养基进行纯化培养48h。
2.菌株富集：将纯化培养后的菌株，在无菌操作台上用接种环逐一接种到无菌MRS肉汤培养基中，置于摇床中，37℃培养48h后进行16S rRNA基因鉴定。
3.16S rRNA基因鉴定：将富集后的菌液，使用细菌通用引物进行菌落PCR扩增后，送至上海美吉生物公司进行16S rRNA基因测序鉴定，在NCBI上进行序列比对，发现与约氏乳酸杆菌属的Lactobacillus johnsonii的16S rRNA基因序列同源相似性最高，确定该菌株为约氏乳杆菌。
4.全基因组鉴定：将上述菌株进一步在上海美吉生物公司进行全基因组测序，进行Circos基因组圈图分析，比较基因组物种进化树分析以及泛基因组Venn图分析。
结果如图1a中A所示，为LJSD001菌亚种的全基因组测序完成图，Circos基因组圈图分析。图1b中B为种LJSD001菌亚种比较基因组物种进化树分析。图1中C为LJSD001菌亚种泛基因组Venn图分析。综上结果以及根据文献调研，该菌株不同于既往已报道的菌株，为新发现的约氏乳杆菌亚种。
实施例2：LJSD001菌可以延长雌性早衰小鼠的寿命
将1mL-80℃保存的LJSD001菌菌株取出，转移至少量的灭菌MRS液体培养基中进行活化培养3代，其中少量是指灭菌MRS液体培养基的体积为5-10mL，在本实施例中灭菌MRS液体培养基为10mL，培养条件为37℃，24h；然后将菌液以2％的比例接种于大量的灭菌MRS液体培养基中37℃扩大培养24h后进行活菌计数，本实施例中大量是指灭菌MRS液体培养基的体积为200mL，然后将菌液分装，3000r/min，4℃离心15min，弃上清液收集菌体；用pH7.0的PBS缓冲液重悬根据活菌计数结果，将菌悬液浓度调整至109CFU/200μL，4℃保存备用，得到LJSD001菌悬液。每周重新制备一次。
将6-8周雌性Zmpste24-/-小鼠，随机分为2组，每组15只。小鼠适应一周后，两组分别予PBS和LJSD001菌灌胃，PBS灌胃量为200μL，LJSD001灌菌剂量为109CFU/200μL，隔天一次。记录每只小鼠的生存曲线。
结果如图2所示，图2A和2B分别为LJSD001菌和PBS干预早衰鼠的整体外观情况。图2C为LJSD001菌和PBS干预早衰鼠的体重变化。图2D为LJSD001菌干预对早衰小鼠总体生存曲线的影响。图2E可看出LJSD001菌干预对雄性早衰小鼠的寿命没有影响。图2F则可看出LJSD001菌干预可以延长雌性早衰小鼠的寿命。
实施例3：LJSD001菌改善自然衰老小鼠的虚弱指数
将10个月自然衰老雌性小鼠，随机分为2组，每组10只。小鼠适应一周后，两组分别予PBS和LJSD001菌灌胃，PBS灌胃量200μL，LJSD001菌剂量为灌菌剂量为109CFU/200μL，隔天一次。干预10个月后进行虚弱指数评分。
按照上表各项指标，计算虚弱指数，每只小鼠的虚弱指数为每项得分的之和除以项目总数。结果如图3A所示为LJSD001菌和PBS处理的自然衰老雌性小鼠的整体观；如图B所示，与PBS处理的老龄小鼠相比，LJSD001菌处理的自然衰老雌性小鼠的虚弱指数更低。这些数据表明，LJSD001菌改善了自然衰老雌性小鼠的虚弱指数。
实施例4：LJSD001菌改善肝脏的脂质沉积
将10个月自然衰老雌性小鼠，随机分为2组，每组10只。小鼠适应一周后，两组分别予PBS和LJSD001菌灌胃，PBS灌胃量200μL，LJSD001菌剂量为10 9CFU/200μL每只小鼠，隔天一次。干预10个月后，取4月龄的雌性小鼠作为年轻对照，牺牲三组小鼠进行进一步的研究。
收集三组小鼠的肝脏组织，4％多聚甲醛固定后进行油红染色以评估肝脏中油脂沉积情况，并通过试剂盒检测肝脏中甘油三脂的含量。
如图4A油红染色所示，与PBS处理的老龄小鼠相比，LJSD001菌处理的自然衰老雌性小鼠的肝脏脂质沉积更少。如图4B甘油三脂试剂盒检测，LJSD001菌处理的自然衰老雌性小鼠的甘油三脂含量更低。
实施例5：LJSD001菌改善肠道稳态
牺牲上述小鼠，收集三组小鼠的结肠组织：4％多聚甲醛固定后进行HE染色以评估形态学改变，进行PAS染色检测结肠组织中的糖类含量；衰老相关的β-半乳糖苷酶染色固定液固定后，加入染色液放入37℃培养箱中孵育过夜，然后在光学显微镜下进行观察并拍照，评估结肠组织细胞的衰老程度。收集三组小鼠的结肠组织，提取蛋白进行蛋白免疫印记实验检测p21、p53等衰老相关指标的表达。在老年鼠第20个月时对三组小鼠进行了荧光标记的葡聚糖(FITC-dextran)灌胃(根据小鼠体重调整灌胃量，按0.6mg/g计算)，灌胃4小时后，取外周血，用分光光度计(490nm)检测血清中FITC含量来评估肠道通透性。免疫荧光技术用Muc2抗体检测肠道组织黏液层厚度：留取含有一段粪便的肠道组织，石蜡切片后，用1：500浓度的Muc2抗体孵育，检测每组小鼠肠道组织黏液层，并进行厚度统计。收集结肠组织进行扫描电镜和透射电镜实验，直观检测结肠上皮黏液层和屏障结构，评估肠道黏膜屏障的完整性。收集三组小鼠的结肠组织，提取mRNA逆转录成cDNA后进行荧光定量PCR实验检测occludin、muc2、zo-1等屏障相关指标的表达。收集肠道固有层的免疫细胞，通过流式细胞术进行T细胞衰老指标的检测。
结果如图5A所示，SA-β-gal染色以及PAS染色提示肠道细胞衰老程度在LJSD001菌干预组明显降低。图5B示肠道衰老相关指标p53和p21的蛋白表达水平在LJSD001菌干预组显著下降。此外，图5C中荧光标记的葡聚糖(FITC-dextran)实验表明，LJSD001菌干预组老年小鼠的肠道通透性得到了明显的改善。图5D示Muc2抗体免疫荧光表明LJSD001菌干预组老年小鼠肠道组织的黏液层更厚。图5E示肠道组织透射电镜更直观证实LJSD001菌干预可以改善老年小鼠肠道黏膜的紧密连接。图5F进一步荧光定量PCR实验也表明LJSD001菌可以增加老年小鼠肠道细胞紧密连接蛋白Occludin,Muc2以及Zo-1的表达。图5G和H通过流式细胞术检测肠道免疫细胞的衰老情况，发现LJSD001菌可以适当延缓肠道CD8T细胞和CD4T细胞的衰老。以上研究结果提示LJSD001菌可以改善C57BL/6老年小鼠的肠道稳态。
实施例6：LJSD001菌可以改善自然衰老小鼠的骨质疏松
在上述三组小鼠牺牲后，收集三组小鼠股骨样本在4％多聚甲醛中固定过夜后，通过微型CT(InspeXio SMX-225CT FPD HR)在225kV加速电压和4μm分辨率的条件下进行扫描。然后在相同条件下，使用数据分析软件VGStudio MAX(Volume Graphics，海德堡，德国)重建每个样本，并在骨骺生长板下方截取相同体积的立方体区域，分析骨体积分数：骨体积/总体积BV/TV(bone volume/tissue volume)，骨小梁数Tb.N(trabecular number)的重建参数，评估骨质疏松水平。
结果如图6A所示为老年鼠20月龄时三组小鼠股骨样本微型CT进行扫描后3D重建代表图。图6B为三组小鼠骨体积分数：骨体积/总体积(BV/TV)比较，LJSD001菌干预可以改善自然衰老雌性小鼠的骨体积分数。图6C为各组小鼠骨小梁数(Tb.N)比较，LJSD001菌干预可以改善自然衰老雌性小鼠的骨小梁数。LJSD001菌可以改善自然衰老小鼠的骨质疏松。
实施例7：LJSD001菌可以改善自然衰老小鼠的肌肉衰老
在小鼠牺牲前，三组小鼠分别进行握力试验。水平放置抓力测定仪，启动仪器后，将小鼠放置在抓力板上，抓住小鼠尾部轻轻向后牵拉，待小鼠抓牢抓力板后，均匀用力后拉，致使小鼠松爪，待仪器记录小鼠的最大抓力。每只小鼠测定3次，取平均值作为测量结果，用以评价小鼠的肌肉力量。
结果如图7A所示，LJSD001菌干预具有提高衰老小鼠的肌力的能力，进一步如7B所示，LJSD001菌干预可以降低衰老小鼠肌肉组织P53衰老蛋白的表达。LJSD001菌可以改善自然衰老小鼠的肌肉衰老。
实施例8：LJSD001菌可以改善自然衰老小鼠的认知能力
在小鼠牺牲前，三组小鼠分别进行新事物识别实验、Y迷宫和Morris水迷宫实验评估小鼠的认知水平和空间记忆水平。
A..新事物识别实验：在进行测试或训练前24小时，将小鼠放在测试的房间内，适应测试环境。开始训练时，将A，B两个相同的物体放在一侧壁的左右两端，小鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度要一致。小鼠放入测试10分钟，放入后立即开启录像设备记录小鼠与这两个物体接触的次数。10分钟结束后，立即将小鼠放回原来饲养笼内，1小时后再进行测试。再次测试时将场地内的B物体换作C物体，C物体不同于B物体，仍将小鼠背向两物体，鼻尖据两物体距离相同，观察5分钟时间，同样用录像设备录像，分别记录小鼠对C物体和A物体的探究次数。认知指数(recognition index,RI)计算公式为：RI＝探究新物体C的次数/(探究新物体C的次数+探究旧物体A的次数)×100％。
B.Y迷宫实验：Y迷宫由3个相同的臂组成,分别称为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区。通常把下臂(Ⅰ臂)定为起步区,左侧(Ⅱ臂)为安全区,右侧(Ⅲ臂)为电击区,三臂相交处为隔离区(0区)。实验提前一天先将小鼠放入迷宫,让其适应5min，小鼠在起步区予以电击致其逃至安全区,灯光持续15s，然后熄灯休息45s，开始下一次操作。每次实验在每只小鼠上重复20次为一轮。实验在黑暗、安静的环境中进行。凡小鼠受电击后10s内一次性从起步区逃至安全区的反应称为“正确反应”,否则为“错误反应”。以连续10次电击中正确反应达9次或以上定为学会标准。第二天检测日，给与每只小鼠20轮刺激，记录每只小鼠的“正确反应”和“错误反应”次数。
C.Morris水迷宫实验：水迷宫直径100cm，水深21cm，水池内壁已做黑色喷塑处理，平台直径9cm，平台高度20cm，肉眼观察水面无法看到平台位置，水温21～22℃。试验共历时8天，训练6天，休息1天，第8天检测。训练期：将平台置于东北象限，将小鼠分别从3个不同的起始点面向池壁放入水池。自由录像记录***记录小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)和游泳路径，小鼠找到平台后或60s内找不到平台(潜伏期记为60s)，则由实验者将其拿上平台，在平台上休息10s，再进行下一次试验。每日以小鼠3次训练潜伏期的平均值作为小鼠当日的平均潜伏时间。检测日：在潜伏期训练完成后，进行小鼠的穿台试验，即把水下的平台撤掉，记录小鼠在60s内穿越平台的次数及第1次穿越平台潜伏时间。图像数据分析采用SMART3.0分析***。
结果如图8A所示，在新物体识别实验中，雌性老年鼠的认知指数低于年轻小鼠，但LJSD001菌干预可以提高雌性老年鼠的认知指数；如图8B和8C所示，在Y迷宫中，雌性老年鼠和雌性年轻小鼠相比表现为较低的正确率和较高的错误次数，LJSD001菌干预可以提高雌性老年鼠的正确率以及降低错误次数；进一步LJSD001菌干预后的老年鼠进行水迷宫的检测，首先如图8D所示，两组老年鼠的游泳速度没有差别；如图8E所示，在连续6天的水迷宫训练期间，LJSD001菌干预的老年鼠表现出更快的学***台的时间；如图8F-H所示，在第8天水迷宫的检测日，LJSD001菌干预的老年鼠更快找到隐藏的平台位置，以及更多地穿越平台位置。综上，补充LJSD001菌可显著提高雌性老年小鼠的认知水平和空间记忆水平，提示LJSD001菌可延缓老年雌性小鼠的认知减退。
实施例9：LJSD001菌可改善雌性C57BL/6老年小鼠神经炎症及突触可塑性
在上述三组小鼠牺牲后，分别通过透射电镜观察血脑屏障的超微结构，免疫荧光检测大脑中小胶质细胞的活化以及通过高尔基染色检测小鼠树突棘的密度。
透射电镜：分别收集三组小鼠左侧的大脑皮质组织并迅速固定在戊二醛中。固定24小时后，迅速解剖皮层组织并将其分成薄片。用1％的四氧化锇来固定这些切片，然后用2％的醋酸铀水溶液来染色。接着用不同浓度的乙醇和丙酮进行梯度脱水，再嵌入环氧树脂中。最后用超微切片机将环氧树脂器皿切成超薄切片(70纳米)，然后用4％醋酸铀和柠檬酸铅在铜栅上染色。使用TEM(日立公司，HT7800，日本)观察三组小鼠血脑屏障区域的超微结构。
组织免疫荧光：将脑片脱蜡至水以进行抗原修复，然后用5％牛血清白蛋白(BSA)在室温下阻断30分钟，然后在4℃下与Iba1(1：200)一抗培养过夜。然后将切片与Alexa488二抗(1：400)在37℃下孵育1小时。最后，用DAPI对切片的细胞核进行染色(Cat.FD8396,Fude Biological technology,China)。使用Leica TCS SP8-DIVE双光子显微镜拍摄照片。
高尔基染色：分别将三组小鼠脑组织经蒸馏水快速洗去表面的血液后直接放入瓶内高尔基染色固定液中，送由赛维尔生物服务公司完成后续高尔基染色和扫描。
结果如图9A所示，在老年鼠20月龄时通过透射电镜检测，发现外源性补充LJSD001菌可以增强雌性C57BL/6老年小鼠大脑皮层的紧密连接；小胶质细胞的激活与神经炎症有关，被认为在神经退行性疾病的发病机制中至关重要，其激活标志物是Iba1。如图9B-C所示免疫荧光染色显示，老年组小鼠海马CA3区和DG区Iba1+小胶质细胞数量明显高于年轻组，而外源性补充LJSD001菌可以显著降低海马CA3区和DG区Iba1+小胶质细胞的数量。突触的可塑性在神经***信号传导过程中起重要介导作用，高尔基染色显示，如图9D-E所示，老年小鼠树突棘的密度显著低于年轻组，而LJSD001菌干预后树突棘的密度显著高于老年组。以上研究结果提示LJSD001菌可以改善雌性C57BL/6老年小鼠神经炎症及突触可塑性。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)LJSD001，其特征在于，所述约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)LJSD001保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.23929。
2.包含权利要求1所述的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)LJSD001的菌剂。
3.权利要求1所述的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)LJSD001在制备延缓雌性动物衰老的制剂中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述延缓雌性动物衰老包括延长雌性早衰动物的寿命。
5.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述延缓雌性动物衰老包括改善自然衰老雌性动物的虚弱指数。
6.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述延缓雌性动物衰老包括改善自然衰老雌性动物肝脏的脂质沉积。
7.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述延缓雌性动物衰老包括改善自然衰老雌性动物的肠道稳态。
8.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述延缓雌性动物衰老包括改善自然衰老雌性动物的骨质疏松。
9.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述延缓雌性动物衰老包括改善自然衰老雌性动物的肌肉衰老。
10.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述延缓雌性动物衰老包括改善自然衰老雌性动物的神经衰老。
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