CN117815335A - 一种基于脂肪干细胞svf的骨关节炎治疗组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞治疗技术领域，具体提供了一种基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物及其制备方法，所述基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物由以下组分组成：重量份数为60~70%的脂肪干细胞SVF和补足余量的中药提取物。本发明通过脂肪干细胞SVF配合本发明特有的中药提取物，在促进骨关节软骨恢复的同时，有效消除炎症因子。各中药成分在本发明特有的制备方法下炮制为本发明特有的中药提取物，四者的药性相互配合，在脂肪干细胞SVF注射式治疗的背景下，加速了软骨组织的恢复，同时降低了炎症。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞治疗技术领域，尤其涉及一种基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物及其制备方法。
背景技术
骨关节炎是一种常见疾病，其主要特征是关节软骨退变和疼痛等症状。目前的治疗方法主要包括非甾体消炎药、物理疗法、关节液置换和干细胞移植治疗等。其中干细胞移植治疗是较先进的一类治疗方法，干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞注入骨关节炎关节后，能发挥免疫调节作用，炎症反应调节作用，减少疼痛；分泌抗凋亡因子和抗纤维化因子抑制病情进展；分泌TGF-β、BMP-4等因子，促进内源性干细胞软骨修复；还能分化为软骨细胞帮助修复软骨。然而，目前的针对骨关节炎的干细胞移植治疗手段仍然存在一定的局限性，即移植过来的干细胞会使身体产生免疫反应，在骨关节软骨恢复的同时，炎症因子并未有效消除，这也是骨关节炎治疗后复发率较高的原因之一。
因此，需要开发一种更有效和安全的干细胞移植治疗方法，在使骨关节软骨恢复的同时，有效消除炎症因子。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的是提供一种基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物及其制备方法。
一方面，本发明提供了一种基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物，所述基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物由以下组分组成：
重量份数为33~38%的脂肪干细胞SVF和补足余量的中药提取物。
进一步地，所述脂肪干细胞SVF的重量份数为66%。
另一方面，本发明提供了一种基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法，所述基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法包括：
所述脂肪干细胞SVF的制备方法：
手术采集试验对象的脂肪组织，加入等质量的生理盐水和等质量的0.1%I型胶原酶，混匀后37℃，静置消化40分钟，去掉上层未消化的脂肪组织后，1500~2000r/min离心15min，去除上层后，得脂肪干细胞团，重悬沉淀的脂肪干细胞团，密度调整到1×105个/mL，然后接种在细胞培养瓶中。每个培养瓶加液为1mL细胞悬液加28mL完全培养基，在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养48h后，加入生理盐水洗涤细胞，细胞密度调整到1×105个/mL，得脂肪干细胞SVF；
所述中药提取物的制备方法：
取干制的质量比为3：2：（5~10）：2的当归、金钱草、石斛和黄连，以50目细度粉碎，加15倍质量的水回流提取4次，每次45min，过滤后，65~75℃下0.3MPa第一次减压蒸馏80min；收集剩余物加10倍质量的85％乙醇，混匀后静置5h，100目过滤收集滤液，50~60℃下0.3MPa第二次减压蒸馏回收乙醇至不再流出，收集剩余物得中药膏；
将所述中药膏调节pH值至5.0，用大孔树脂柱进行吸附，上液量流速为2.5BV/h，收集尾液，然后用60％乙醇洗脱，洗脱液用量为2BV，流速为2BV/h，收集洗脱液，60~65℃下0.4MPa第三次减压蒸馏50min后，收集剩余物按0.013g/ml加入NaCl煮沸40min，按0.005g/ml加入注射用活性炭，煮沸45min，冷却至30℃时，通过钛棒过滤器过滤，加注射用纯水稀释至5倍质量，115℃灭菌30min得所述中药提取物。
进一步地，所述离心转速为1800 r/min。
进一步地，所述当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：2：7：2。
进一步地，所述第一次减压蒸馏的温度为70℃。
进一步地，所述第二次减压蒸馏的温度为55℃。
进一步地，所述第三次减压蒸馏的温度为63℃。
通过本发明能够带来如下有益效果：
本发明通过脂肪干细胞SVF配合本发明特有的中药提取物，在促进骨关节软骨恢复的同时，有效消除炎症因子。当归促进血液循环，金钱草镇痛的同时抗氧化，石斛抑制炎症因子的同时滋养软骨组织，黄连降低创口细菌引发的炎症反应，上述中药在本发明特有的制备方法下炮制为本发明特有的中药提取物，四者的药性相互配合，在脂肪干细胞SVF注射式治疗的背景下，加速了软骨组织的恢复，同时降低了炎症反应。
本发明离心的转速是配合本发明中药提取物在促进干细胞活性的情况下在保护干细胞活性与分离杂质的平衡中向分离杂质适当偏离的结果，这也进一步配合了后面降低炎症因子的需要。
本发明三次减压蒸馏的温度是配合各自的蒸馏压力去除杂质的过程，同时也是在该温度下对中药有效活性成分的炮制，温度过低炮制效果不好且杂质难以挥发，温度过高则会破坏活性成分。
具体实施方式
此处为了更清楚的阐释本发明的整体构思，下面以实施例的方式对本发明的整体方案进行详细说明；在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解；然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施；在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
如未特殊说明，下述实施例中各原料组分均可通过商业途径购得，所使用的实验仪器均为实验室常规实验仪器，性能测试方法为本领域已知测试方法。
优选的实施方式如下：
实施例1：
采用以下方法制备获得脂肪干细胞SVF：
手术采集试验对象的脂肪组织，加入等质量的生理盐水和等质量的0.1%I型胶原酶，混匀后37℃，静置消化40分钟，去掉上层未消化的脂肪组织后，1800r/min离心15min，去除上层后，得脂肪干细胞团，重悬沉淀的脂肪干细胞团，密度调整到1×105个/mL，然后接种在细胞培养瓶中。每个培养瓶加液为1mL细胞悬液加28mL完全培养基，在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养48h后，加入生理盐水洗涤细胞，细胞密度调整到1×105个/mL，得脂肪干细胞SVF；
采用以下方法制备获得中药提取物：
取干制的质量比为3：2：7：2的当归、金钱草、石斛和黄连，以50目细度粉碎，加15倍质量的水回流提取4次，每次45min，过滤后，70℃下0.3MPa第一次减压蒸馏80min；收集剩余物加10倍质量的85％乙醇，混匀后静置5h，100目过滤收集滤液，55℃下0.3MPa第二次减压蒸馏回收乙醇至不再流出，收集剩余物得中药膏；
将所述中药膏调节pH值至5.0，用大孔树脂柱进行吸附，上液量流速为2.5BV/h，收集尾液，然后用60％乙醇洗脱，洗脱液用量为2BV，流速为2BV/h，收集洗脱液，63℃下0.4MPa第三次减压蒸馏50min后，收集剩余物按0.013g/ml加入NaCl煮沸40min，按0.005g/ml加入注射用活性炭，煮沸45min，冷却至30℃时，通过钛棒过滤器过滤，加注射用纯水稀释至5倍质量，115℃灭菌30min得所述中药提取物；
将重量份数为66%的脂肪干细胞SVF和补足余量的中药提取物混合制得基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物。
实施例2-13：
实施例2与实施例1的区别仅在于，脂肪干细胞SVF的重量份数为60%；
实施例3与实施例1的区别仅在于，脂肪干细胞SVF的重量份数为70%；
实施例4与实施例1的区别仅在于，离心转速为1500 r/min；
实施例5与实施例1的区别仅在于，离心转速为2000 r/min；
实施例6与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：2：5：2；
实施例7与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：2：10：2；
实施例8与实施例1的区别仅在于，第一次减压蒸馏的温度为65℃；
实施例9与实施例1的区别仅在于，第一次减压蒸馏的温度为75℃；
实施例10与实施例1的区别仅在于，第二次减压蒸馏的温度为50℃；
实施例11与实施例1的区别仅在于，第二次减压蒸馏的温度为60℃；
实施例12与实施例1的区别仅在于，第三次减压蒸馏的温度为60℃；
实施例13与实施例1的区别仅在于，第三次减压蒸馏的温度为65℃；
对比例1-13：
对比例1与实施例1的区别仅在于，脂肪干细胞SVF的重量份数为80%；
对比例2与实施例1的区别仅在于，离心转速为3000 r/min；
对比例3与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为1：2：7：2；
对比例4与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为6：2：7：2；
对比例5与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：1：7：2；
对比例6与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：4：7：2；
对比例7与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：2：7：1；
对比例8与实施例1的区别仅在于，当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：2：7：4；
对比例9与实施例1的区别仅在于，第一次减压蒸馏的温度为85℃；
对比例10与实施例1的区别仅在于，第二次减压蒸馏的温度为70℃；
对比例11与实施例1的区别仅在于，第三次减压蒸馏的温度为75℃；
对比例12与实施例1的区别仅在于，将中药提取物换为等质量的脂肪干细胞SVF；
对比例13与实施例1的区别仅在于，将脂肪干细胞SVF换为等质量的中药提取物。
取各示例所得基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物对65岁的患有相同程度骨关节炎的受试者，使用注射器向各人患骨关节炎的关节处缓慢推注4mL组合物，相同程度以核磁共振成像MRI观察受试者患处的软骨缺失比例20%为准，受试者为75人，分为3组，每组24人分别注射各示例所得基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物，在第二和第三个月分别再注射一次，另有3人不做处理为空白组，在接受治疗后第35周，进行下述检测。
炎症因子测试：
取关节液，采用ELISA法检测IL-1β炎性因子表达，含量检测如表1所示，检测结果单位为pg/ml，保留整数位。
软骨恢复测试：
将患者关节进行核磁共振成像MRI观察，检测关节恢复状况即软骨缺失面积。治疗35周后关节软骨缺失面积如表1所示，单位为%，保留整数位。
上述测试结果取各示例及空白组的3人平均值并保留整数位。
表1：各示例的炎症因子测试和软骨恢复测试结果：
由表1中的数据可知，相较于其他各示例，本发明的实施例，尤其是本发明实施例1的制备方法制得的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物显然具有更好的软骨恢复效果和抗炎效果，即本发明所制得产品在使骨关节软骨恢复的同时，有效消除炎症因子。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明；对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化；凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (8)
1.一种基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物，其特征在于，所述基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物由以下组分组成：
重量份数为60~70%的脂肪干细胞SVF和补足余量的中药提取物。
2.根据权利要求1所述的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物，其特征在于，所述脂肪干细胞SVF的重量份数为66%。
3.一种如权利要求1所述的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法，其特征在于，所述基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法包括：
所述脂肪干细胞SVF的制备方法：
手术采集试验对象的脂肪组织，加入等质量的生理盐水和等质量的0.1%I型胶原酶，混匀后37℃，静置消化40分钟，去掉上层未消化的脂肪组织后，1500~2000r/min离心15min，去除上层后，得脂肪干细胞团，重悬沉淀的脂肪干细胞团，密度调整到1×105个/mL，然后接种在细胞培养瓶中，每个培养瓶加液为1mL细胞悬液加28mL完全培养基，在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养48h后，加入生理盐水洗涤细胞，细胞密度调整到1×105个/mL，得脂肪干细胞SVF；
所述中药提取物的制备方法：
取干制的质量比为3：2：（5~10）：2的当归、金钱草、石斛和黄连，以50目细度粉碎，加15倍质量的水回流提取4次，每次45min，过滤后，65~75℃下0.3MPa第一次减压蒸馏80min；收集剩余物加10倍质量的85％乙醇，混匀后静置5h，100目过滤收集滤液，50~60℃下0.3MPa第二次减压蒸馏回收乙醇至不再流出，收集剩余物得中药膏；
将所述中药膏调节pH值至5.0，用大孔树脂柱进行吸附，上液量流速为2.5BV/h，收集尾液，然后用60％乙醇洗脱，洗脱液用量为2BV，流速为2BV/h，收集洗脱液，60~65℃下0.4MPa第三次减压蒸馏50min后，收集剩余物按0.013g/ml加入NaCl煮沸40min，按0.005g/ml加入注射用活性炭，煮沸45min，冷却至30℃时，通过钛棒过滤器过滤，加注射用纯水稀释至5倍质量，115℃灭菌30min得所述中药提取物。
4.根据权利要求3所述的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法，其特征在于，所述离心转速为1800 r/min。
5.根据权利要求3所述的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法，其特征在于，所述当归、金钱草、石斛和黄连的比例为3：2：7：2。
6.根据权利要求3所述的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法，其特征在于，所述第一次减压蒸馏的温度为70℃。
7.根据权利要求3所述的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法，其特征在于，所述第二次减压蒸馏的温度为55℃。
8.根据权利要求3所述的基于脂肪干细胞SVF的骨关节炎治疗组合物的制备方法，其特征在于，所述第三次减压蒸馏的温度为63℃。
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