CN117795095A - 生物样品中的标记分析物的检测 - Google Patents
生物样品中的标记分析物的检测 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117795095A CN117795095A CN202280040118.XA CN202280040118A CN117795095A CN 117795095 A CN117795095 A CN 117795095A CN 202280040118 A CN202280040118 A CN 202280040118A CN 117795095 A CN117795095 A CN 117795095A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- optical
- marker
- reporter
- moiety
- different
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 148
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 626
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 465
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 389
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 146
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 117
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 86
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 118
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 51
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 51
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 33
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 26
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 16
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 57
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 47
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 37
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 37
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 19
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 18
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 17
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 16
- -1 cell cultures Substances 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 13
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 5
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004820 halides Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 2
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=NC2=C1 RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003512 tertiary amines Chemical group 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M thiocyanate group Chemical group [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMBSZJBWYCGCJP-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N(CC)CC)=CC2=C1 SMBSZJBWYCGCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyrhodamine 6G Chemical compound [Cl-].C=12C=C(C)C(NCC)=CC2=[O+]C=2C=C(NCC)C(C)=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(=O)OCC VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 1
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101000601724 Homo sapiens Paired box protein Pax-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000601664 Homo sapiens Paired box protein Pax-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 1
- 102100040061 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710120843 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 1
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 1
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 102100037504 Paired box protein Pax-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100037502 Paired box protein Pax-8 Human genes 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025831 Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130 Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000009998 heat setting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000010262 intracellular communication Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001507 metal halide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000005309 metal halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical group 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940075930 picrate Drugs 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M picrate anion Chemical compound [O-]C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N rhodamine 110 Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N)=CC2=[O+]C2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 101150077014 sox10 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- ONDSBJMLAHVLMI-UHFFFAOYSA-N trimethylsilyldiazomethane Chemical compound C[Si](C)(C)[CH-][N+]#N ONDSBJMLAHVLMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
用于确定分析物的位置的方法包括：(a)使生物样品暴露于复数个不同类型的探针，其中每种不同类型的探针包含核酸捕获部分和包括至少一个报告物部分的检测部分，其中至少一个报告物部分的特征在于多个标记物区，标记物区中的每一个包含具有序列的寡核苷酸；(b)使生物样品暴露于复数个光学标记物；(c)测量由光学标记物生成的光学信号；(d)用不同的复数个光学标记物重复步骤(b)和(c)；(e)基于测量的光学信号鉴定样品中报告物部分中的一个或更多个；和(f)基于鉴定的报告物部分确定样品中RNA分析物中的一个或更多个的位置。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月6日提交的美国临时专利申请号63/171,297的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用可检测的报告物部分标记生物样品中的分析物、检测该标记分析物以及补偿各种检测误差。
背景技术
荧光成像可以用于检测和量化生物样品中的各种不同分析物。通过用不同的荧光染料标记每种不同类型的分析物，可以执行多种分析物的多路复用检测。在一些测定中，可以检测的不同分析物的数量受到可以分辨的不同荧光测量信号的数量的限制。
发明内容
本公开的特征在于用于标记生物样品中的分析物、测量与标记分析物对应的信号、检测和量化标记分析物以及校正分析物标记和测量信号中的误差的方法、***和试剂盒。分析物各自用多个报告物部分标记，并且选择用于标记每种不同类型分析物的报告物部分，使得通过测量与报告物部分对应的信号，可以在样品中明确地检测每种不同类型的分析物。此外，可以鉴定和校正测量误差诸如未检测到的信号，使得仍然可以可靠地量化相应的标记分析物。该方法、***和试剂盒可以与多种不同类型的报告物部分和样品分析物一起使用。此外，通过选择应用于样品的不同报告物部分的数量和用于标记个别分析物的报告物部分的数量，可以调节可以清楚且可靠地检测的不同分析物的数量。即使使用相对适中数量的不同报告物部分，也可以检测相对大量的不同分析物。
在一方面，本公开的特征在于方法，其包括：(a)将生物样品暴露于复数个不同类型的探针，其中每种不同类型的探针包含与样品中不同类型的RNA分析物结合的核酸捕获部分，以及特征在于至少一个报告物部分的检测部分，其中检测部分与捕获部分连接，并且其中至少一个报告物部分包含多个标记物区，标记物区中的每一个的特征在于具有序列的寡核苷酸；(b)将生物样品暴露于复数个光学标记物，其中光学标记物中的每一个包含具有序列的寡核苷酸和生成光学信号的种类；(c)测量由与报告物部分的互补标记物区杂交的该复数个光学标记物中的光学标记物生成的光学信号；(d)用不同的复数个光学标记物重复步骤(b)和(c)；(e)基于测量的光学信号鉴定样品中报告物部分中的一个或更多个；和(f)基于鉴定的报告物部分确定样品中RNA分析物中的一个或更多个的位置，其中在不同类型的探针间，每种类型的检测部分的至少一个报告物部分与每种其他类型的检测部分的至少一个报告物部分在至少两个标记物区上不同。
该方法的实施方案可以包含以下特征中的任何一个或更多个。
该方法可以包括，对于光学标记物中的至少一个，在测量由光学标记物中的至少一个生成的光学信号之后且在用不同的复数个光学标记物重复步骤(b)和(c)之前，从样品中除去光学标记物中的至少一个。除去光学标记物中的至少一个可以包括使光学标记物中的至少一个从报告物部分的一个或更多个标记物区脱杂交(dehybridize)。
至少一种类型的检测部分的至少一个报告物部分可以包含在至少一个报告物部分内不重复的标记物区。每种类型的检测部分的至少一个报告物部分可以包含在至少一个报告物部分内不重复的标记物区。
至少一种类型的检测部分的至少一个报告物部分可以包含至少3个在至少一个报告物部分内不重复的标记物区。每种类型的检测部分的至少一个报告物部分可以包含至少3个在至少一个报告物部分内不重复的标记物区。
每个标记物区可以包含至少15个核苷酸(例如，至少30个核苷酸)。报告物部分中的每一个的每个标记物区可以包含相同数量的核苷酸。报告物部分中的每一个可以包含相同数量的标记物区。
生成光学信号的种类可以是荧光部分。生成光学信号的种类可以包含至少一种荧光核苷酸。测量由光学标记物生成的光学信号可以包括获得样品中的光学标记物的至少一个图像，以及鉴定与至少一个图像中的光学标记物对应的光学信号。
步骤(b)中的每个复数个光学标记物可以包含相同数量的不同类型的光学标记物。步骤(b)中的每个复数个光学标记物可以包含3个或更多个(例如，5个或更多个)不同类型的光学标记物。该方法可以包括重复步骤(b)直到样品已经暴露于光学标记物集，其中至少一个报告物部分的每个标记物区具有光学标记物集中的互补光学标记物。
该方法可以包括将所述样品暴露于复数个光学标记物中的至少一个超过一次。
每次执行步骤(b)，步骤(b)中的复数个光学标记物的每个成员可以包含生成不同光学信号的种类。不同光学信号可以具有不同的光谱分布。
在复数个光学标记物间，光学标记物中的至少两个可以包含生成光学信号的共同种类，并且该光学标记物中的该至少两个可以在步骤(b)的不同重复期间暴露于样品。在复数个光学标记物间，第一和第二光学标记物可以各自包含生成第一和第二光学标记物的光学信号的第一种类，第三和第四光学标记物可以各自包含生成第三和第四光学标记物的光学信号的第二种类，并且第一和第二种类可以是不同的。由第一和第二种类生成的光学信号可以是不同的。该方法可以包括在步骤(b)的不同重复期间使样品暴露于第一和第二光学标记物，以及在步骤(b)的不同重复期间使样品暴露于第三和第四光学标记物。
除非另有明确说明，方法的实施方案还可以包含本文公开的其他特征中的任一者，并且可以包含此类特征的任何组合，无论此类特征是在共同实施方案中还是在不同实施方案中描述。
在另一方面，本公开的特征在于方法，其包括：使生物样品暴露于第一探针，第一探针包含与样品中的第一RNA结合的第一核酸捕获部分和包含至少一个第一报告物部分的第一检测部分，其中至少一个第一报告物部分的特征在于各自包含具有序列的寡核苷酸的多个第一标记物区，其中每个第一报告物部分中的多个第一标记物区中的每一个的寡核苷酸序列是不同的；使生物样品暴露于第二探针，第二探针包含与样品中的第二RNA结合的第二核酸捕获部分和包含至少一个第二报告物部分的第二检测部分，其中至少一个第二报告物部分的特征在于各自包含具有序列的寡核苷酸的多个第二标记物区，其中每个第二报告物部分中的多个第二标记物区中的每一个的寡核苷酸序列是不同的；使生物样品暴露于多个复数个光学标记物，其中每个复数个光学标记物包含与多个第一和第二标记物区中的至少一个杂交的至少一个光学标记物，直到来自多个复数个光学标记物的光学标记物已经与多个第一和第二标记物区中的每一个杂交；在使生物样品暴露于每个复数个光学标记物之后，测量由与多个第一和第二标记物区中的至少一个杂交的每个复数个光学标记物的至少一个光学标记物生成的空间分辨的光学信号；以及确定样品中的第一和第二RNA的一个或更多个位置，其中第一标记物区中的至少两个与第二标记物区中的每一个不同。
该方法的实施方案可以包含以下特征的任何一个或更多个。
该方法可以包括，对于复数个光学标记物中的至少一个，在测量空间分辨的光学信号之后且在使生物样品暴露于多个复数个光学标记物中的另一个之前，从样品中除去与多个第一和第二标记物区中的至少一个杂交的至少一个光学标记物。除去至少一个光学标记物可以包括将至少一个光学标记物从多个第一和第二标记物区中的至少一个脱杂交。
至少一个第一报告物部分的每个报告物部分可以包含在报告物部分内不重复的第一标记物区。至少一个第二报告物部分的每个报告物部分可以包含在报告物部分内不重复的第二标记物区。至少一个第一报告物部分的每个报告物部分可以包含至少3个在报告物部分内不重复的第一标记物区。至少一个第二报告物部分的每个报告物部分可以包含至少3个在报告物部分内不重复的第二标记物区。
每个标记物区可以包含至少15个核苷酸(例如，至少30个核苷酸)。至少一个第一报告物部分的每个标记物区可以包含相同数量的核苷酸。至少一个第一报告物部分中的每一个可以包含相同数量的标记物区。至少一个第二报告物部分中的每一个可以包含相同数量的标记物区。
光学标记物中的每一个可以包含生成光学信号的种类。生成光学信号的种类可以是荧光部分。生成光学信号的种类可以包含至少一种荧光核苷酸。测量由至少一个光学标记物生成的空间分辨的光学信号可以包括获得样品中至少一个光学标记物的至少一个图像，以及鉴定与至少一个图像中的光学标记物对应的光学信号。
每个复数个光学标记物可以包含相同数量的不同类型的光学标记物。每个复数个光学标记物可以包含3个或更多个不同类型的光学标记物(例如，5个或更多个不同类型的光学标记物)。多个复数个光学标记物的超过一个中可以存在至少一种类型的光学标记物。每个复数个光学标记物的光学标记物可以包含生成彼此不同的光学信号的各自种类。不同的光学信号可以具有不同的光谱分布。
在多个复数个光学标记物间，至少两种类型的光学标记物可以包含生成共同光学信号的共同种类，并且至少两种类型的光学标记物可以存在于不同的复数个光学标记物中。生物样品可以在不同的时间暴露于不同的复数个。
除非另有明确说明，方法的实施方案还可以包含本文公开的任何其他特征，并且可以包含此类特征的任何组合，无论此类特征是在共同实施方案中还是在不同实施方案中描述。
在进一步地方面，本发明的特征在于包含多个复数个探针的组合物，其中每个复数个探针靶向不同类型的分析物，并包含与复数个探针所靶向的类型的分析物结合的捕获部分和与捕获部分连接并包含至少一个报告物部分的检测部分，其中至少一个报告物部分包含各自特征在于具有序列的寡核苷酸的多个标记物区，其中对于每个复数个探针，至少一个报告物部分的标记物区与其他复数个探针的至少一个报告物部分的标记物区在至少两个标记物区上不同。
组合物的实施方案可以包含以下特征的任何一个或更多个。
对于复数个探针中的至少一个，至少一个报告物部分的标记物区可以彼此不同。对于每个复数个探针，至少一个报告物部分的标记物区可以彼此不同。多个复数个探针可以包含50个或更多个复数个探针(例如500个或更多个复数个探针)。
每个复数个探针可以靶向不同的RNA。每个复数个探针的捕获部分可以包含具有序列的寡核苷酸，该序列与RNA分析物至少部分互补。对于复数个探针中的至少一个，至少一个报告物部分的多个标记物区可以包含至少3个标记物区(例如，至少4个标记物区)。对于复数个探针中的每一个，至少一个报告物部分的多个标记物区可以包含至少3个标记物区。
对于复数个探针中的至少一个，至少一个报告物部分的多个标记物区的寡核苷酸序列可以具有共同的长度。对于复数个探针中的每一个，至少一个报告物部分的多个标记物区的寡核苷酸序列可以具有共同的长度。对于复数个探针中的至少一个，至少一个报告物部分的多个标记物区的寡核苷酸序列可以在长度上不同。
对于复数个探针中的至少一个，至少一个报告物部分的多个标记物区的寡核苷酸序列可以具有共同的长度，该共同的长度不同于复数个探针中另一个的至少一个报告物部分的多个标记物区的寡核苷酸序列的共同的长度。
对于每个复数个探针，至少一个报告物部分的多个标记物区中的每一个可以包含至少15个核苷酸(例如，至少30个核苷酸)。对于每个复数个探针，至少一个报告物部分的标记物区可以与其他复数个探针的至少一个报告物部分的标记物区在至少三个标记物区上不同。
每个复数个探针可以靶向不同的肽。每个复数个探针的捕获部分可以包含选择性结合蛋白质分析物的抗体。
复数个探针中的至少一个可以包含选择性结合至RNA的探针，并且复数个探针中的至少一个可以包含选择性结合至蛋白质的探针。
除非另有明确说明，组合物的实施方案也可以包含本文公开的任何其他特征，并且可以包含此类特征的任何组合，无论此类特征是否在共同的实施方案或不同的实施方案中描述。
在另一方面，本公开的特征在于试剂盒，其包含包装材料和包装材料内的本文公开的任何组合物。
试剂盒的实施方案可以包含以下特征的任何一个或更多个。
组合物可以是第一组合物，并且试剂盒可以包含包装材料内的第二组合物，并且包含复数个光学标记物，其中每个光学标记物的特征在于寡核苷酸序列和生成光学信号的种类。光学标记物中的每一个的寡核苷酸序列可以不同。生成光学信号的种类中的至少一些可以是多个光学标记物所共有的。
每个光学标记物的寡核苷酸序列可以包括至少15个核苷酸(例如，至少30个核苷酸)。生成光学信号的种类可以包含荧光部分。生成光学信号的种类可以包含染料。生成光学信号的种类可以包含至少一种荧光核苷酸。
每个光学标记物的寡核苷酸序列可以具有共同的长度。光学标记物的寡核苷酸序列中的至少一些可以具有不同的长度。光学标记物的寡核苷酸序列可以是DNA序列。
光学标记物可以以多个组包装在包装材料内。
除非另有明确说明，否则试剂盒的实施方案也可以包含本文公开的其他特征中的任一者，并且可以包含此类特征的任何组合，无论此类特征是否在共同的实施方案或不同的实施方案中描述。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本文主题的实践或测试中，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用其整体并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是例示性的，并不意图限制。
一个或更多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐述。根据说明书、附图和权利要求书，其他特征和优势将是显而易见的。
附图说明
图1是生物样品中的标记分析物的示例的示意图。
图2A是报告物部分的一个示例的示意图。
图2B是报告物部分的另一个示例的示意图。
图2C是报告物部分的进一步的示例的示意图。
图3是显示了用于经由光学标记物的多个杂交循环检测样品中的分析物的一系列示例步骤的流程图。
图4A是显示了用于鉴定样品中的分析物的检测循环的示例集的示意图。
图4B是显示了样品中两种不同类型的分析物的示意图。
图4C是显示了两种不同类型的分析物的位置的图4B的样品的示意图。
图4D是显示了在含有图4B的两种不同分析物的样品上执行的6个检测循环的每一个中测量的光学信号的示意图。
图5是探针的示例的示意图。
图6是探针的另一个示例的示意图。
图7是用于分析生物样品的***的示意图。
图8是控制器的示意图。
在各个附图中，相似的参考符号表示相似的元件。
详细说明
介绍
多路复用荧光检测是广泛已知的用于检测生物样品中的蛋白质、核酸和其他分析物的技术。常规的荧光成像方法涉及将不同的荧光染料应用于样品中的不同分析物，然后将染料暴露于入射光以使每种染料发射荧光。通过光谱分辨来自不同染料的荧光发射信号，可以鉴定和量化样品中的分析物。当荧光发射信号也如在多光谱荧光图像中那样被空间分辨时，可以获得关于样品中多个位置处的多个不同分析物的存在和丰度的信息。此信息对于各种研究和临床诊断目的是有价值的，包括鉴定疾病的标志物，阐明细胞内通讯途径，评估基因表达和细胞调节活性，以及监测药物和其他治疗试验和干预的有效性。
在常规的荧光成像方法中，可以被检测的分析物的数量会受到可被检测和分辨的不同测量信号的数量的限制。存在用于将荧光发射信号与光谱重叠的染料的方法，即使在重叠显著时。例如，只要对个别荧光染料的纯光谱(即，特征向量)的相对较好的估计是可用的或可测量的，则可以使用诸如光谱分离的特征向量分解法来分离此类信号。然而，由于所涉及的染料的光谱拥塞，即使用此类技术，可以分辨的不同测量信号的数量——以及相应的可量化的不同分析物的数量——可能相对有限。
对于某些类型的测定，对不同分析物数量的限制可能并不代表显著的缺点。例如，对于某些肿瘤特异性测定，其经由选择性结合至标记物的基于抗体的探针来靶向相对少量表达的细胞标记物，上述限制可能不代表显著的缺点。然而，靶向更多不同细胞标志物集的测定，设计为获得关于细胞中表达的蛋白质的更普遍信息的蛋白质组学测定，以及靶向细胞RNA和DNA的核酸测定可以被设计为量化数十、数百或数千个不同的肽和/或转录物。对于这些广泛的测定，上述限制可能代表重大的障碍。
增加可检测和量化的不同分析物数量的一种方法涉及使用具有窄光谱和不同发射特征的报告物部分。例如，可以合成基于量子点的报告物部分并将其掺入特异性结合至不同类型的分析物的探针中。通过控制量子点的组成和尺寸分布，可以获得具有(光谱上)紧密间隔但可分辨的荧光发射信号的不同报告物部分的群体。掺入到不同类型的探针中，可分辨的报告物部分可以用于鉴定比用常规的基于荧光染料的报告物部分通常可能的更大量的不同分析物。
然而，随着不同分析物数量的增加，与合成不同报告物部分的群体相关的复杂性增加，在使用前合成和表征报告物部分所需的时间也增加。对于涉及数百种不同分析物(即，肽或核酸分析物，诸如RNA转录物)的测定，上面讨论的合成负担可能太重大而不能使此类方法切实可行且成本有效。
本文所述的方法涉及用不同报告物部分的组合来标记个别分析物，而不是通过仅与该类型的分析物特异性结合的不同报告物部分为每种类型的分析物分配不同的“颜色”。特别地，每种不同类型的分析物用报告物部分的不同组合来标记，使得以组合进行由报告物部分生成的信号的检测，独特地鉴定不同类型的分析物。通过用报告物部分的组合来标记分析物，需要相对较少的个别地不同的报告物部分以区分不同的分析物集。结果，可以大量地减少与分辨光谱上紧密间隔的发射信号相关联的光谱拥塞和困难。结果，可以可靠地检测和量化更大量的不同分析物。此外，设计用于靶向特定的分析物组的现有探针集可以更容易地扩增以包含用于额外分析物的探针，而无需借助复杂的合成方法来产生严格控制的光谱上不同的报告物部分的分布。
图1是显示生物样品10中的标记分析物100的示意图。分析物100与捕获部分102结合，捕获部分102通过接头104与报告物部分106缀合。生物样品10可以是各种不同类型的样品的任何一种。生物样品10的实例包括但不限于组织切片(例如，新鲜切片、新鲜冷冻切片、***固定的石蜡包埋切片)、组织活检、细胞、细胞悬浮液、细胞分散体、细胞培养物和各种体液，诸如血液、尿液、间质液和淋巴液。
在一些实施方案中，生物样品10可以固定化在表面上。例如，该表面可以是玻片、板、孔、管、膜(membrane)或薄膜(film)的表面。在一些实施方案中，生物样品10可以安装在玻片上。在某些实施方案中，生物样品10可以使用固定剂固定，诸如醛、醇、氧化剂、水银、苦味酸盐、HOPE固定剂或另一固定剂。生物样品10可以替代地或另外地使用热固定来固定。也可以通过浸渍或灌注来实现固定。
分析物100可以是多种不同分析物中的任何一种。在一些实施方案中，分析物100是RNA种类。在某些实施方案中，分析物100是DNA种类。分析物100的其他实例包括但不限于抗原，肽，蛋白质，和其他含有氨基酸的部分，以及寡核苷酸，包括含有DNA碱基、RNA碱基、DNA和RNA碱基以及合成碱基的寡核苷酸、核酸片段和脂质。
分析物100可以是临床相关的生物标志物，特别是在肿瘤组织、肿瘤微环境和代表其他疾病状态的组织中表达的生物标志物。此类生物标志物的实例包括但不限于：肿瘤标志物，诸如Sox10、S100、泛细胞角蛋白、PAX5、PAX8；免疫细胞标识符，诸如CD3、CD4、CD8、CD20、FoxP3、CD45RA、CD45LCA、CD68、CD163、CD11c、CD33、HLADR；活化标志物，诸如Ki67、颗粒酶B；和检查点相关标志物，诸如TIM3、LAG3、PD1、PDL1、CTLA4、CD80、CD86、IDO-1、VISTA、CD47、CD26。
捕获部分102选择性地结合至样品10中的分析物100以使报告物部分106附着于分析物。各种不同的可逆和不可逆结合机制可以发生在捕获部分102和分析物100之间。在某些实施方案中，当分析物100是RNA或DNA时，捕获部分102可以是与分析物100至少部分地互补的RNA或DNA，并通过与分析物100杂交而结合到分析物100。在一些实施方案中，当捕获部分102是抗体或抗体片段并且分析物100是抗原时，结合发生在抗原表位与抗体或抗体片段的互补位(paratope)之间。在某些实施方案中，当捕获部分102是抗体或抗体片段并且分析物100是脂质时，结合可以发生在抗体或抗体片段上的识别位点与脂质的头基(例如，磷脂头基)之间。在一些实施方案中，捕获部分102与分析物100之间的结合可以经由一个或更多个共价键的形成而发生。替代地或另外，捕获部分102与分析物100之间的结合可以经由一个或更多个非共价键的形成而发生。可以使用各种固定剂以促进共价键和/或非共价键的形成。
接头104可以以各种不同的方式实现。在一些实施方案中，例如，接头104是非共价键或共价键。换言之，捕获部分102和报告物部分106可以经由键直接连接，在它们之间没有间插部分。
在某些实施方案中，接头104可以作为一抗-二抗对实现。为了用报告物部分106标记分析物100，将分析物100暴露于第一标记剂，该第一标记剂包含缀合至一抗的捕获部分102，该一抗充当接头104的一部分。一旦第一标记剂选择性结合至分析物100，引入包含缀合至二抗的报告物部分106的第二标记剂，该二抗充当接头104的另一部分。二抗与一抗选择性地结合，形成由相关抗体组成的接头104，并且用报告物部分106标记分析物100。
在一些实施方案中，接头104可以作为双链核酸(例如，至少部分互补的杂交核酸链)实现。为了用报告物部分106标记分析物100，将分析物100暴露于第一标记剂，该第一标记剂包含连接至第一核酸的捕获部分102，该第一核酸充当接头104的一部分。一旦第一标记剂选择性结合至分析物100，引入包含连接至第二核酸的报告物部分106的第二标记剂，该第二核酸充当接头104的另一部分。第二核酸与第一核酸至少部分地互补，并且选择性地与第一核酸杂交，用报告物部分106标记分析物100。
在前述实例中，捕获部分102可以通过缀合与第一核酸连接，例如，捕获部分102可以共价地键合至第一核酸。替代地，第一核酸可以是与捕获部分102邻接的核酸序列。换言之，核酸分子(例如，单链或部分双链的核酸分子)可以包含由充当捕获部分102的捕获核酸序列组成的捕获区和由充当接头104的第一核酸的连接核酸序列组成的连接区。
以相同的方式，报告物部分106可以通过共价键合连接到第二核酸。替代地，第二核酸可以是与报告物部分106邻接的核酸序列。换句话说，核酸分子(例如，单链或部分双链的核酸分子)可以包含由充当接头104的第二核酸的连接核酸序列组成的连接区，以及包含形成报告物部分106的本文所述标记物区的报告区。
在一些实施方案中，充当接头104的部分的第一和第二核酸不直接杂交。反而，第一和第二核酸各自与桥接寡核苷酸的部分杂交，该桥接寡核苷酸包含与第一和第二核酸中的每一个至少部分地互补的核酸序列。桥接寡核苷酸可以是线性的，使得单个捕获部分连接至单个报告物部分。替代地，桥接寡核苷酸可以是分支的，并且可以包括与捕获部分102杂交的单个核酸序列和与报告物部分杂交的多个核酸序列。结果，单个捕获部分102可以连接到多个报告物部分106，允许放大与捕获部分102选择性结合的分析物对应的光学信号。
在某些实施方案中，接头104可以作为各种脂肪族和/或芳香族连接种类的任一种实现。此类种类的实例包括但不限于C1-20环状和非环状烷基种类、C2-20环状和非环状烯烃种类、C2-20环状和非环状炔烃种类和C3-24芳香族种类。前述种类中的任一者可以包含杂原子，诸如但不限于O、S、N和P。前述种类中的任一者还可以包含选自下组的一个或更多个取代基：卤化物基团；硝基基团；叠氮化物基团；羟基基团；伯胺、仲胺和叔胺基团；醛基团；酮基团；酰胺基团；醚基团；酯基团；硫氰酸酯基团；和异硫氰酸酯基团。
通常，报告物部分106包含两个或更多个不同的标记物区。报告物部分106的每个标记物区结合至生成光学信号的光学标记物。例如，在一些实施方案中，每个标记物区包含核酸序列(例如，DNA序列或RNA序列)。
报告物部分106通常可以具有掺入多个标记物区的各种结构。图2A显示了报告物部分106的实例，其包含通过接头204a-c以线性几何形状连接的四个不同的标记物区202a-d。通常，接头204a-c可以个别地对应于上述接头104中的任一者。接头204a-c可以各自相同，或者接头204a-c中的一个或更多个可以与其他接头不同。
特别地，在一些实施方案中，报告物部分106内接头中的一个或更多个是非共价键或共价键。换言之，报告物部分106中标记物区中的一个或更多个可以通过键直接连接，在它们之间没有间插部分。
在某些实施方案中，报告物部分106内接头中的一个或更多个作为一抗-二抗对实现。例如，一个标记物区可以缀合至一抗，该一抗充当接头的一部分。另一个标记物区缀合至二抗，该二抗充当接头的另一部分。二抗与一抗选择性地结合，形成由相关抗体组成的接头，并且连接两个标记物区。
在一些实施方案中，报告物部分106内接头中的一个或更多个可以作为双链核酸(例如，至少部分互补的杂交核酸链)实现。一个标记物区可以连接至第一核酸，该第一核酸充当接头的一部分，并且第二标记物区可以连接至第二核酸，该第二核酸充当接头的另一部分。第二核酸与第一核酸至少部分地互补，并且选择性地与第一核酸杂交，连接第一和第二标记物区。
在前述实例中，第一和第二标记物区的任一者或两者可以通过缀合(例如共价键合)分别连接至第一和第二核酸。替代地，第一核酸可以是与第一标记物区邻接的核酸序列。换言之，核酸分子(例如，单链或部分双链的核酸分子)可以包含标记物区和由充当接头的第一核酸的连接核酸序列组成的连接区。
以相同的方式，第二标记物区可以通过共价键合连接至第二核酸。替代地，第二核酸可以是与第二标记物区邻接的核酸序列。换句话说，核酸分子(例如，单链或部分双链的核酸分子)可以包含由连接核酸序列组成的连接区和第二标记物区，该连接核酸序列充当接头的第二核酸。
在一些实施方案中，充当标记物区之间的接头的一部分的第一和第二核酸不直接杂交。相反，第一和第二核酸各自与桥接寡核苷酸的部分杂交，该桥接寡核苷酸包含与第一和第二核酸中的每一个至少部分地互补的核酸序列。
在某些实施方案中，报告物部分106内接头中的一个或更多个可以作为各种脂肪族和/或芳香族连接种类的任一种实现。此类种类的实例包括但不限于C1-20环状和非环状烷基种类、C2-20环状和非环状烯烃种类、C2-20环状和非环状炔烃种类和C3-24芳香族种类。前述种类中的任一者可以包含杂原子，诸如但不限于O、S、N和P。前述种类中的任一者还可以包含选自下组的一个或更多个取代基：卤化物基团；硝基基团；叠氮化物基团；羟基基团；伯胺、仲胺和叔胺基团；醛基团；酮基团；酰胺基团；醚基团；酯基团；硫氰酸酯基团；和异硫氰酸酯基团。
图2B显示了报告物部分106的另一实例，其中四个不同的标记物区202a-d与共同的接头204a缀合。接头204a可以对应于上述接头104中的任一者。此外，接头204a可以对应于与标记物区202a-d缀合的珠或颗粒。
图2C显示了报告物部分106的又一实例，其中六个不同的标记物区202a-202f缀合至接头204a-c。在图2C中，接头204b-c各自个别地缀合至三个标记物区，而接头204a缀合至两个标记物区202a、202d，并且还直接或间接地缀合至捕获部分102。接头204a-c可以各自对应于上述的不同类型的接头中的任一者。接头204a-c可以各自相同，或者接头204a-c中的一个或更多个可以不同。
尽管图2A-2C中所示的实例包含4个或6个不同的标记物区，更一般地，每个报告物部分106可以包含2个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个，12个或者更多个、15个或者更多个、20个或者更多个或甚至更多)不同的标记物区。
在一些实施方案中，报告物部分106中的标记物区中的每一个是不同的(即具有不同的核酸序列)。替代地，在某些实施方案中，报告物部分106中标记物区中的一个或更多个具有与报告物部分106中的另一个标记物区共同的序列(即，它们重复)。报告物部分中重复的标记物区的数量可以是2个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个)。报告物部分106中相同的标记物区可以用于信号放大和/或对由光学标记物的错误(或无)杂交引起的检测误差的补偿。
在一些实施方案中，每个标记物区包含形成核酸序列的多个核苷酸碱基。报告物部分106的标记物区可以各自具有相同数量的核苷酸，或者标记物区中的一个或更多个可以具有不同数量的核苷酸。在某些实施方案中，标记物区中的每一个具有相同数量的核苷酸。在一些实施方案中，标记物区中的每一个具有不同数量的核苷酸。
每个标记物区可以独立地包括DNA碱基(例如，A、C、G、T)、RNA碱基(例如，A、C、G、U)以及DNA和/或RNA碱基的任何组合。每个标记物区还可以包含非天然(例如合成的)核苷酸，包含DNA类似物和/或RNA类似物。此类合成类似物的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、二醇核酸和苏糖核酸。
每个标记物区的长度(例如，标记物区中核苷酸的数量)通常可以根据需要选择，以确保与光学标记物的高效和选择性杂交。在一些实施方案中，每个标记物区可以包含至少5个(例如，至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个)核苷酸。
在一些实施方案中，每个标记物区可以具有5-30个之间、5-25个之间、5-20个之间、10-20个之间、10-30个之间、10-50个之间、10-70个之间、10-100个之间、20-50个之间、20-70个之间、20-100个之间、30-50个之间、30-70个之间、30-100个之间、40-70个之间、40-100个之间、50-70个之间、50-100个之间、60-70个之间、60-80个之间、60-90个之间或60-100个之间的核苷酸。
在某些实施方案中，每个标记物区可以具有不超过5个(例如，不超过10个、不超过15个、不超过20个、不超过25个、不超过30个、不超过35个、不超过40个、不超过45个、不超过50个、不超过55个、不超过60个、不超过65个、不超过70个、不超过75个、不超过80个、不超过85个、不超过90个、不超过95个，或不超过100个)核苷酸。
在一些实施方案中，每个标记物区可以是完全单链的。替代地，在某些实施方案中，一个或更多个标记物区可以是至少部分双链的。标记物区的部分双链部分可以在标记物区的3’端处、在标记物区的5’端处，或在标记物区5’端和3’端之间。
在一些实施方案中，与样品10中的分析物100结合的每个报告物部分106包含相同数量的标记物区。然而，在某些实施方案中，与样品10中的分析物结合的至少一个报告物部分106包含与结合至样品中的分析物的其他报告物部分106不同数量的标记物区。在某些实施方案中，样品10可以包含2或更多(例如，3或更多、4或更多、5或更多、6或更多，或甚至更多)组的报告物部分，其中每组内的报告物部分具有与其他组中的报告物部分不同数量的标记物区。如上所讨论的，每组的每个报告物部分与样品中的不同分析物结合。
在样品10中的一个或更多个分析物100各自通过捕获部分102与不同的报告物部分106结合的情况下，可以通过样品中的光学标记物结合和成像的逐次循环来检测和量化样品中的分析物。对于结合到包含寡核苷酸标记物区的报告物部分106的分析物，包含与生成光学信号的种类缀合的寡核苷酸的光学标记物可以与寡核苷酸标记物区杂交。通过测量由每个光学标记物生成的光学信号，可以鉴定和量化样品中的个别分析物，因为样品中的每个不同类型的分析物与不同类型的报告物部分缀合，并且因此归因于与每个类型的报告物部分杂交的光学标记物的光学信号的组合是独特的。
在报告物部分106的标记物区是基于寡核苷酸的情况下，用于本文所述方法的光学标记物通常还包含寡核苷酸。光学标记物的寡核苷酸各自具有至少部分或完全与缀合至样品中分析物的报告物部分106的标记物区之一互补的序列。光学标记物的寡核苷酸可以各自具有相同或不同数量的碱基。更一般地，光学标记物的寡核苷酸可以具有与以上讨论的标记物区的寡核苷酸相同的性质。
通常，每个光学标记物包含至少一个生成光学信号的种类，其在本文中称为“染料”。换言之，染料是与入射光相互作用的部分，并且可以测量从其发射的光并用于检测样品中染料的存在。通常，染料可以是荧光部分、吸收部分(例如，显色部分)或另一种类型的发射光的部分，或者改变穿过样品或从样品反射的入射光，其中该样品中存在染料，使得可以通过测量来自样品的透射光或反射光的变化来确定染料的存在。
在某些实施方案中，光学标记物可以包含半抗原。半抗原可以随后(或同时)与染料结合以提供标记部分，该标记部分可以通过测量来自样品的发射光、透射光或反射光来检测。
光学标记物中通常可以使用多种不同的染料。例如，染料可以是呫吨基染料(xanthene-based dye)，诸如荧光素染料和/或罗丹明染料。合适的荧光素和罗丹明染料的实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常缩写为FAM和F)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110。
染料也可以是花青基染料。此类染料的合适实例包括但不限于染料Cy3、Cy5和Cy7。染料还可以是香豆素染料(例如，伞形酮)、苯甲亚胺染料(例如，Hoechst染料中的任一种，诸如Hoechst 33258)、菲啶染料(例如，德克萨斯红)、乙锭染料、吖啶染料、咔唑染料、吩嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料(例如BODIPY染料中的任一种)和喹啉染料。
当染料是荧光种类时，染料可以是对应于以下非限制性实例和/或其衍生物中的任一个的部分：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪基、荧光素、R1 10、JOE、R6G、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、萘基荧光素、德克萨斯红、Cy3和Cy5。
在某些实施方案中，染料可以包含一种或更多种基于量子点的种类。基于量子点的荧光团可提供许多不同的光谱带中的荧光发射光谱，并且合适的基于量子点的染料可以用作本文所述方法中的标记性种类。
分析物的多个循环检测
为了检测样品中的分析物，通常执行光学标记物杂交和检测的一个或更多个循环。图3是显示了用于检测和量化样品中的多个类型的分析物的示例步骤集的流程图。在步骤302中，将多个分析物与报告物部分缀合，其中每种不同类型的分析物与不同类型的报告物部分缀合，该报告物部分具有以上所讨论的标记物区的独特组合。
接下来，在步骤304中，将样品暴露于一个或更多个光学标记物集。该光学标记物集通常包含1到8个之间的不同光学标记物(例如，两个、三个或四个不同的光学标记物)，但是通常可以包含任何数量的光学标记物。
通常，在步骤304中引入的光学标记物中的一个或更多个可以与样品中不同类型的报告物部分中的每一个中的一个或更多个标记物区杂交。为了提高在样品中鉴定不同类型的报告物部分的效率(例如，通过减少检测循环的数量)，可以选择光学标记物集，使得对于样品中存在的不同类型的报告物部分的至少一种(并且更一般地，超过一种)，所引入的多个不同光学标记物集与报告物部分/多个报告物部分的不同标记物区杂交，并且生成光学信号。以这种方式，可以在单个检测循环中鉴定这些报告物部分的多个标记物区，减少了完全阐明与报告物部分相关的所有标记物区所需的循环数量。通过在每个循环中选择光学标记物集，使得多个不同的光学标记物与样品中存在的不同报告物部分中的一个或更多个的不同标记物区杂交，可以更有效地利用检测循环的数量来鉴定不同的报告物部分，并从而检测样品中的特定分析物。
相反地，作为上述一般光学标记物选择和利用方法学的简化，在一些实施方案中，可以任选地选择光学标记物集，使得在步骤304中，对于与不同类型的报告物部分缀合的每种不同类型的分析物，该集中最多一个光学标记物与每种不同类型的报告物部分杂交。换句话说，在包括步骤304的每个检测循环中，可以鉴定每个不同类型的报告物部分的最多一个标记物区。由于对光学标记物选择的这种限制，包含D不同标记物区的每种类型的报告物部分可以在最少的D检测循环后被完全地鉴定。随着与不同类型的报告物部分缀合的不同类型的分析物的数量增加，为完全鉴定不同类型报告物部分中的每一个而进行的检测循环的数量通常增加，特别是如果每个集中不同光学标记物的数量保持恒定。
虽然这种光学标记物集的选择可能不如更通用的方法学有效，在更通用的方法学中，不只是光学标记物与如上所述的样品中不同类型的报告物部分中的一个或更多个杂交，但这种光学标记物集的选择在某些情况下可以是有用的。例如，在其中光学标记物可以彼此相互作用(例如通过荧光共振激发转移、供体-受体淬灭或光诱导电子转移)的样品中，以使得它们与共同报告物部分杂交的方式引入某些光学标记物可能是不利的，因为以如此紧密接近来放置光学标记物可能促进此类相互作用，这通过熄灭、掩蔽或以其他方式干扰由光学标记物生成的信号，从而破坏对与之杂交的标记物区的成功检测。在此类情况下，通过选择光学标记物集，使得来自该集的至多一个光学标记物与样品中每种不同类型的报告物部分杂交，可以减少不同类型的光学标记物之间的相互作用。
接下来，在步骤306中，测量与该光学标记物集相对应的光学信号。在一些实施方案中，通过获得具有该光学标记物集的样品的一个或更多个图像(例如，多光谱图像)测量光学信号，该光学标记物集与缀合至样品的分析物的报告物部分的互补标记物区杂交。为了获得一个或更多个图像，将样品暴露于入射光，并且使用成像检测器(诸如CCD阵列或基于CMOS的阵列检测器)检测由光学标记物生成的信号辐射(例如荧光发射)。
通常，在步骤304中引入的不同的光学标记物中的每一个根据不同的光谱分布生成信号辐射，并且因此与不同的检测通道相关联。在实践中，可以以各种方式检测不同检测通道中的信号辐射。在一些实施方案中，在每个检测通道与其他检测通道光谱上良好分离的情况下，由每个不同类型的光学标记物生成的信号辐射在不同的检测通道中光谱上相对良好分离。如此，通过光谱过滤(例如，使用复数个光学带通滤波器)和/或通过使用与CCD阵列或基于CMOS的阵列检测器结合的光谱分辨检测器(例如，光栅、棱镜或其他光谱色散元件)，可以容易地分离和检测由不同类型光学标记物中的每一个引起的信号辐射。
在某些实施方案中，由不同光学标记物生成的信号辐射的光谱分布可以重叠到不可忽略的程度，使得单独的光学过滤和光谱色散方法不足以分离由不同光学标记物中的每一个生成的信号辐射。因为信号辐射的光谱分布在一定程度上是光谱卷积的，因此对由光学标记物中的每一个生成的信号的精确检测可以涉及更复杂的光谱去卷积技术，以精确地分离测量信号并将其分配给特定的光学标记物。
在此类情况下，可以任选地将包含来自多个不同光学标记物的信号辐射的样品图像分解成图像集，其中该集中的每个图像基本上仅对应于来自一个光学标记物的信号辐射。可以使用各种方法来执行此类的分解，包含例如光谱解混合方法，其涉及对测量的光学信号执行特征向量分解，分解为来自“纯”光谱分量的个别贡献(例如，来自每个光学标记物的贡献)。
通常，分析物存在于样品中的不同空间位置。因此，对于样品图像中的每个像素，在该像素处测量的任何光学信号将由与报告物部分杂交的光学标记物生成，报告物部分与捕获部分连接，捕获部分与样品中对应于该像素的位置处的一种分析物特异性地结合。在实施方案中，在检测循环中，多个光学标记物与报告物部分杂交，因此在对应于报告物部分的像素处生成并检测多个光学信号。如上所述，如果多个光学信号在光谱上被良好分离，则可以通过光谱过滤方法来分辨和检测它们。可替代地，如果多个光学信号在光谱上重叠，则在像素处的测量信号——其对应于多个信号的卷积——可以被分解为分量信号(例如，分量图像)，该分量信号个别地对应于基本上仅由单个光学标记物生成的光学信号。
此外，如上所述，如果选择光学标记物集使得该集中至多一个光学标记物与样品中的每个报告物部分106杂交，则一个或更多个图像集中的每个像素将至多包含与该集中的一个光学标记物对应的光学信号。在此类情况下，通常不需要用于光谱分解测量的信号的方法来分离由多个光学标记物生成的信号。然而，此类方法仍然可以用于例如，补偿可以由存在于其中的不感兴趣的其他种类生成的自发荧光和光谱贡献的影响。
还应注意，在样品的每个图像中，某些像素可以是“暗的”(即，具有零或非常低的聚集信号强度)。暗像素表示在当前检测循环期间，没有光学标记物与样品中对应于暗像素的位置处的报告物部分杂交。如果在所有检测循环的所有图像中的特定像素处没有测量到光学信号，则在样品中对应于暗像素的位置处不存在捕获部分靶向的不同类型的分析物。
步骤306生成样品的一个或更多个图像集。在该图像集中的共同位置处的特定像素对应于样品中的相同位置，该相同位置由图像中的共同像素位置表示。总体上，对应于共同像素位置的图像集上的像素与由在样品中的对应位置处杂交的光学标记物生成的光学信号相关。因为在检测循环中由每个不同类型的光学标记物生成的光学信号是已知的，所以可以确定图像中每个像素位置处的特定标记物区的存在。在所有检测循环完成后，存在于每个像素位置处的特定的标记物区集可以用于确定存在于像素位置处的报告物部分106的类型，并因此确定存在于像素位置处的分析物的类型，如下面进一步详细描述的。
在步骤306之后，在步骤308中，可以从样品中除去光学标记物集或使其失活。在步骤308中，可以使用各种不同的方法来除去光学标记物或使其失活。
在一些实施方案中，与报告物部分的标记物区杂交的光学标记物可以通过脱杂交容易地除去。可以使用各种方法完成脱杂交，包括但不限于：暴露于一种或更多种离液试剂(chaotropic reagent)；通过加热进行热诱导去杂化；立足点介导的链置换(toeholdmediated strand displacement,TMSD)；和使用酶如RNA酶、DNA酶的酶促链置换。
在某些实施方案中，可以从报告物部分除去部分光学标记物，而光学标记物的其他部分保留在样品中。例如，一种或更多种还原剂可以用于切割将染料部分连接至光学标记物中的寡核苷酸的共价键。然后可以将切割的染料部分从样品中洗去。寡核苷酸可以任选地保持与报告物部分中的标记物区杂交。各种不同的还原剂可以用于此目的。例如，三(2-羧乙基)膦(TCEP)可以用于切割通过二硫键与光学标记物中的寡核苷酸连接的染料部分。
在一些实施方案中，不从样品中除去光学标记物，而是使其失活，使得它们在随后的检测循环中不生成光学信号。可以使用各种方法来使光学标记物失活。例如，在某些实施方案中，光学标记物的化学漂白可以用于使标记物失活。
接下来，在步骤310中，如果样品中存在的分析物的分析完成，则工作流程结束。然而，如果分析未完成，则执行步骤304、306和308的一个或更多个额外循环。在每个额外的循环中，将光学标记物集引入样品中，并与样品中报告物部分的标记物区结合。在任选地从样品中除去光学标记物和/或使其失活之前，如上所述地测量并任选地分解对应于光学标记物集的光学信号。
图3显示的工作流程可以重复任何数量的循环，以检测和量化样品中的分析物100。在一些实施方案中，在特定循环中使用的每个光学标记物集是独特的；换言之，在随后的循环中没有光学标记物被重新使用。以这种方式，在整个工作流程中，每个报告物部分的个别标记物区仅被检测一次。
在某些实施方案中，为了执行误差检查和/或校正结合和成像误差，例如不完全杂交和/或光学成像像差，可以在图3中一个以上的循环中将某些光学标记物应用于样品。通过这样做，例如，可以验证在先前循环中测量的光学信号，并且可以在后来的循环中测量可能在先前循环中不存在的光学信号(例如，由于光学标记物的不完全杂交)。
还应当注意，尽管在一些实施方案中，光学标记物中的每一个在图3所示的工作流程期间仅被引入样品一次，与报告物部分的不同标记物区结合但具有相同染料的光学标记物可以用于工作流程的不同循环中。换言之，假设相同循环中的不同光学标记物不包含相同的染料，测量的信号可以明确地归因于不同的光学标记物。当不同的光学标记物包含相同的染料时，这种明确的分配仍然是可能的，只要在图3中的不同循环期间应用光学标记物并且测量相应的信号。
通常，图3中的工作流程通常持续进行，直到执行了足够数量的循环以明确地鉴定分析物中的每一个。在一些实施方案中，继续工作流程，直到已经引入与报告物部分106中的每一个的标记物区中的每一个结合或关联的光学标记物，并且已经测量可归因于其的信号。
在某些实施方案中，取决于分析物的数量、不同报告物部分的数量和每个报告物部分中标记物区的数量，可以明确地鉴定分析物中的每一个，而无需引入和测量与每个报告物部分的每个标记物区结合或关联的光学标记物。例如，样品中的分析物可以与包含6个标记物区的报告物部分缀合，但是可以通过将光学标记物仅与一些或全部报告物部分的标记物区的子集(例如，3个或4个)结合或缔合来明确地鉴定某些感兴趣的分析物。以这种方式，可以省略一个或更多个检测循环，从而节省与省略的循环相关的费用和时间。例如，此方法可以应用于对有限数量的感兴趣的分析物的测定，而广义测定允许鉴定更多数量的不同分析物。仅提供关于不感兴趣的分析物的信息或不提供对鉴定感兴趣的分析物有用的额外信息的前述检测循环缩短了与测定相关的时间，并且可以通过限制所使用的不同光学标记物的数量来降低相关成本。
图4A是显示了示例的示意图，该示例说明了通过基于寡核苷酸的光学标记物的杂交和脱杂交的多个循环检测样品10中的分析物100。分析物100与捕获部分102结合，捕获部分102(通过接头104)与包含标记物区202a-d的报告物部分连接。标记物区202a-d的每一个包含不同的寡核苷酸序列，并且相应的序列被标记为a、b、c和d以供参考。对于指定为x的寡核苷酸序列，将与序列x杂交的部分或完全互补的序列指定为x’。因此，例如，序列a’与序列a互补并杂交，序列b’与序列b互补并杂交，等等。
为了检测分析物100，如上文所述结合图3执行多个检测循环。在每个循环中，将一个或更多个具有寡核苷酸序列的光学标记物引入样品中。具有与标记物区202a-d的序列至少部分互补的序列的光学标记物与相应的标记物区杂交。由杂交的光学标记物生成的信号的测量揭示了样品中特定空间位置处的标记物区的存在。归因于特定报告物部分中标记物区中的每一个的信号在样品中的共同定位揭示了在样品中该位置处存在报告物部分，并因此揭示了与报告物部分缀合的分析物100的存在。
通常，在每个检测循环内，每个不同类型的光学标记物包含不同的寡核苷酸序列，并生成可区分的光学信号。因此，在每个循环内，在一个或更多个光学标记物与互补的报告物部分的标记物区杂交之后，可以测量和区分对应于不同类型的光学标记物的光学信号，鉴定已经与互补的报告物部分的标记物区杂交的不同类型的光学标记物。
由不同类型的光学标记物生成的光学信号可以以各种方式区分。在一些实施方案中，例如，不同类型的光学标记物包含以不同波长带(即，具有不同中心波长和/或不同最大发射强度波长的带)发射光的不同染料(例如，荧光染料)。如果波长带在光谱上充分分离，则可以通过光谱过滤和/或相关技术将光学信号彼此区分。
对于在光谱上分离不佳的光学信号(例如，当在检测循环中使用相对较多数量的不同类型的光学标记物时)，或者具有非高斯发射带形状的光学信号，可以使用各种计算技术将测量的光学信号分离成基本上个别地对应于仅一个光学标记物的分量信号。例如，特征向量分解方法(诸如光谱解混合)可以用于将样品的多光谱图像分解成单分量图像集，每个单分量图像对应于仅来自不同类型的光学标记物之一的光谱贡献。
为了检测样品10中的分析物100，在检测序列的不同循环中检测图4A中报告物部分106的个别标记物区。为了说明的目的，在图4A的每个检测循环内，引入了三种不同类型的光学标记物。不同类型的光学标记物中的每一个包含不同的寡核苷酸和在三个不同波长带之一中生成光学信号的荧光部分。使用上述方法，三个不同波长带的每一个中的光学信号可以彼此区分。
应注意，在不同的检测循环中，三个不同的波长带可以相同或不同。在一些实施方案中，例如，在每个检测循环中引入三种不同类型的光学标记物，并且不同类型的光学标记物中的每一个仅在三个不同波长带之一中生成光学信号，其中三个不同波长带在所有循环中保持相同。换句话说，在每个检测循环中重复使用相同的三个不同的波长带集。
在某些实施方案中，不同类型的光学标记物在其中生成光学信号的一些或所有波长带从一个循环到下一个循环是不同的。换言之，一些波长带可以从一个循环到下一个循环被重新使用，或者没有一个波长带可以被重复使用。通常，除了在特定检测循环内，不同类型的光学标记物中的每一个生成可以与由该循环内其他类型的光学标记物生成的光学循环区分的光学信号之外，对不同波长带可以被重复使用或不被重复使用的方式没有限制。
还应注意，在图4A中的每个检测循环中引入三种不同类型的光学标记物仅是用于说明目的的示例。更一般地，可以在每个循环中引入任何数量的不同类型的光学标记物。可以引入的不同类型的光学标记物的数量在所有循环中可以是相同的，或者可以在循环中变化。此外，在一些实施方案中，如图4A所示，每种类型的光学标记物在所有检测循环中仅被引入一次。然而，更一般地，可以在多于一个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，或者甚至更多)的检测循环中引入光学标记物中的一些或所有。例如，在多个检测循环中引入光学标记物中的一个或更多个可以允许验证已经归因于特定光学标记物的先前检测的光学信号。
图4A中的表格显示了为检测样品中的分析物100的光学标记物杂交和测量的几个循环的示例。在每个循环中，第一类型的光学标记物在波长带1中生成光学信号，第二类型的光学标记物在波长带2中生成学信号，并且第三类型的光学标记物在波长带3中生成光学信号。应注意，从一个循环到下一个循环，波长带1、2和3可以是相同的，或者，波长带的一些或所有可以在任何两个循环之间不同。标识符“1”、“2”和“3”仅标示不同的波长带，并且在每个波长带中生成的光学信号是可区分的，以允许鉴定生成信号的光学标记物，并因此鉴定与它们杂交的互补标记物区。
在循环1中，将分别具有序列a’、e’和j’的光学标记物引入样品中。具有序列a’的第一类型的光学标记物在波长带1中生成光学信号，具有序列e’的第二种、类型的光学标记物在波长带2中生成光学信号，并且具有序列j’的第三类型光学标记物在波长带3中生成光学信号。只有具有序列a’的光学标记物与报告物部分106杂交(即与具有序列a的标记物区202a杂交)。因此，在循环1中，在波长带1中的样品中的分析物100的位置处测量到阳性信号(即，非零光学信号)。在波长带2或波长带3中均未测量到阳性信号。
在循环2中，引入分别具有相应序列b’、r’和v’的光学标记物。具有序列b’的第一类型的光学标记物在波长带1中生成光学信号，具有序列r’的第二类型的光学标记物在波长带2中生成光学信号，而具有序列v’'的第三类型的光学标记物在波长带3中生成光学信号。只有具有序列b’的光学标记物与报告物部分106杂交(与具有序列b的标记物区202b杂交)。因此，在循环2中，在波长带1中的样品中的分析物100的位置处测量到阳性信号。在波长带2或波长带3中均未测量到阳性信号。
在循环3-6中引入的不同类型的光学标记物如图4A所示。在循环4(在波长带2中，但不在波长带1或3中)和6(在波长带3中，但不在波长带1或2中)中的分析物100的位置处测量到阳性信号。在循环3或5中的任何波长带中均未测量到阳性信号，因为在那些循环中没有光学标记物与报告物部分106的任何标记物区杂交。在循环1(在波长带1中)、2(在波长带1中)、4(在波长带2中)和6(在波长带3中)中测量的阳性信号的组合直接鉴定出，序列a、b、c、和d存在于报告物部分106中，因为那些特定的波长带分别在循环1、2、4和6中被分配给具有互补的寡核苷酸序列a’、b’、c’和d’的光学标记物。由于标记物区a-b-c-d的组合对于靶向分析物100的捕获部分102是特异性的，因此可以明确地确定样品中分析物100的存在。此外，测量的信号强度与样品中每个位置的分析物100的量相关，并且因此可以在样品中空间上量化样品分析物100。
还应注意，前述方法不区分报告物部分106内的标记物区的不同排序。在图4A的示例中，通过执行所示的6个检测循环，可以确定报告物部分106包含标记物区a、b、c、d。然而，报告物部分106内标记物区的具体顺序并未确定。因此，标记物区的特定顺序可以是a-b-c-d、b-d-c-a、c-b-d-a、d-b-a-c或序列a、b、c和d的任何其他有序的非重复的组合。
在图4A的示例中，在6个检测循环的每一个中引入的每个光学标记物集中，最多一个光学标记物与报告分子106的标记物区杂交。然而，如上所述，更一般地，选择光学标记物集使得在检测循环的一个或更多个中，多个不同的光学标记物可以与个别报告物部分106杂交，并生成光学信号，该光学信号被检测并用于鉴定报告物部分中相应的标记物区。通过以这种方式选择光学标记物集，可以通过在每个检测循环期间增加可用检测通道的使用来提高测定的总效率。
在图4A显示的示例是代表性的并阐明了单个分析物100的检测，然而，通常，样品包含许多不同的分析物，并且本文所述的方法、组合物和试剂盒用于检测许多不同的分析物。例如，在一些实施方案中，使用本文所述的方法、组合物和/或试剂盒检测样品中的10个或更多个(例如，20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个、80个或更多个、100个或更多个、120个或更多个、140个或更多个、160个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、700个或更多个、1000个或更多个、1500个或更多个、2000个或更多个、3000个或更多个、5000个或更多个、7000个或更多个、10000个或更多个、15000个或更多个、20000个或更多个、30000个或更多个、40000个或更多个、50000个或更多个，或甚至更多)不同的分析物。
当样品含有多个不同的分析物时，每种不同类型的分析物选择性地与不同类型的探针结合，探针包含对该类型的分析物特异的捕获部分和与该捕获部分连接的报告物部分。本文所述的多循环检测方法用于检测多种不同类型的分析物。在每个检测循环期间，在该循环中引入的不同光学标记物可以与样品中的报告物部分中的互补标记物区杂交，互补标记物区与不同类型的捕获部分连接。通常，在每个循环中，可以选择引入的光学标记物集，使得多个光学标记物与至少一些不同类型的报告物部分杂交，这确保个别检测循环有效地用于阐明存在于样品的每个位置的标记物区，并因此阐明报告物部分。
图4B显示了特异性结合至样品10中两个不同分析物的两种探针。具体地，第一探针包括特异性结合至第一类型的分析物100a的捕获部分102a，并且第一探针通过接头104a连接到报告物部分106a，报告物部分106a包含分别具有寡核苷酸序列a、b、c和d的标记物区202a-202d。第二探针包含特异性结合至第二类型的分析物100b的捕获部分102b，并且第二探针通过接头104b连接到报告物部分106b，报告物部分106b包含分别具有寡核苷酸序列e、m、b和g的标记物区202e-202h。
图4C是样品10的示意图，在样品10中，分析物100a存在于位置400a处，而分析物100b存在于位置400b处。应注意，样品10中的每个物理位置仅存在一种类型的分析物。换句话说，样品10中的两个分析物分子在样品10的任何位置都不是空间上一致的。相反，每个分析物分子都存在于不同的位置，尽管特定的分析物分子对在样品10内可能非常接近。无论样品中两个分析物分子的距离有多近，都可以使用本文所述的方法。
图4D以表格形式显示了在6个检测循环内位置400a和400b处的来自样品10的测量的光学信号。上面的表格显示了在位置400a(分析物100a位于样品中的位置)处的测量的光学信号。下面的表格显示了在位置400b(分析物100b位于样品中的位置)处的测量的光学信号。在每个表中，旭日形字符指示在特定波长带中测量到光学信号，并且实心方形字符指示在特定波长带中没有测量到光学信号。
如每个表的第1列中所显示，执行6个检测循环。在每个检测循环中引入三个光学标记物。每个检测循环中光学标记物中的每一个的寡核苷酸序列和它们在其中生成光学信号的波长带显示在每个表的第2-4列中。由于检测循环是在整个样品10上执行的，所以第1-4列在两个表中是相同的。
上面的表指示，在样品10中的位置(例如，像素)400a处在如下有序对中测量的阳性光学信号：(循环1，波长带1)，其对应于具有寡核苷酸序列a’的光学标记物；(循环2，波长带1)，其对应于具有寡核苷酸序列b’的光学标记物；(循环4，波长带2)，其对应于具有寡核苷酸序列c’的光学标记物；和(循环6，波长带3)，其对应于具有寡核苷酸序列d’光学标记物。由于报告物部分106a(其仅存在于样品中的位置400a处)包含具有寡核苷酸序列a、b、c和d的标记物区，因此测量到这些阳性光学信号。
下面的表格指示，在样品10中的位置(例如，像素)400b处测量的阳性信号。报告物部分106b仅存在于位置400b处，并含有具有寡核苷酸序列e、m、b和g的标记物区。在样品中的位置400b处测量的阳性信号由以下有序对表示：(循环1，波长带2)，其对应于具有寡核苷酸序列e’的光学标记物；(循环2，波长带1)，其对应于具有寡核苷酸序列b’的光学标记物；(循环5，波长带1)，其对应于具有寡核苷酸序列g’的光学标记物；和(循环5，波长带2)，其对应于具有寡核苷酸序列m’的光学标记物。
在图4D所示的6个检测循环之后，对应于样品位置400a的图像像素中的每一个与标记物区a、b、c和d的阳性信号相关联。因为只有报告物部分106a对应于标记物区的组合，所以可以明确地鉴定位置400a处的分析物100a的存在。类似地，对应于样品位置400b的图像像素中的每一个与标记物区e、b、g和m的阳性信号相关联。只有报告物部分106b对应于标记物区的组合，因此可以明确地鉴定位置400b处的分析物100b的存在。
从循环2的结果可以明显看出，当不同的报告物部分含有相同的标记物区(报告物部分106a和106b各自含有具有图4b中的寡核苷酸序列b的标记物区)时，在引入互补的光学标记物(例如，具有寡核苷酸序列b’的光学标记物)的检测循环中，从与不同报告物部分中的每一个杂交的光学标记物中测量光学信号。然而，由于捕获部分和分析物之间相互作用的特定性质，报告物部分与不同的分析物关联。在本实例中，报告物部分106a凭借捕获部分102a和分析物100a之间的特异性相互作用与分析物100a结合，报告物部分106b仅通过捕获部分102b和分析物100b之间的特异性相互作用仅与分析物100b结合。结果，对应于报告物部分106a的光学信号将仅在位置400a处被测量，并且对应于报告物部分106b的光学信号将仅在位置400b处被测量，即使光学信号是由具有寡核苷酸序列b’的相同光学标记物生成的。
由于分析物100a和100b在样品10中处于空间上不同的位置，所以对应于具有序列b’的光学标记物的测量的光学信号具有不同的含义。在位置400a处测量的信号对应于报告物部分106a和分析物100a，而在位置400b处测量的信号对应于报告物部分106b和分析物100b。
通常，事先(a priori)并不知道任何分析物位于样品内的何处。相反，特定类型的分析物的位置由每个像素位置处的累积光学信号测量来确定。具体而言，样品中的每个位置(其对应于为检测光学信号而获得的样品图像中的特定像素)与在多个检测循环期间光学标记物所生成的测量的光学信号集相关联。在每个位置/像素处，测量的光学信号集与在检测循环期间引入的某些光学标记物相关联。因为光学标记物的寡核苷酸序列是已知的，所以在每个位置/像素处测量的光学信号集与在该位置/像素处的标记物区集相关联。
不考虑标记物区的排序的情况下，每种不同类型的报告物部分含有标记物区的独特组合。因此，在特定位置/像素处的标记物区集将该位置/像素与在该位置/像素处的特定报告物部分以及因此特定分析物独特地相关联。以这种方式，在样品内的每个位置/像素处，可以检测任何一种分析物的存在。再次参以上图4B-4D中的示例，标记物区a、b、c和d在样品10中的位置400a处的共同定位鉴定了位置400a处的分析物100a。类似地，标记物区e、m、b和g在样品10中的位置400b处的共同定位鉴定位置400b处的分析物100b。
对于不能确定标记物区集的位置/像素(即，没有测量到光学信号)，没有分析物位于那些位置/像素。对于确定了不完整或错误的标记物区集的位置/像素，如果不能校正所确定的标记物区集，则在那些位置/像素处的分析物的存在或不存在以及分析物的性质是不确定的。
如前所述，在一些实施方案中，在多循环检测程序中的两个或更多个检测循环中引入一个或更多个光学标记物可以是有利的。例如，再次参考图4A的示例，在循环6之后，可以执行额外的检测循环7，其中再次引入先前引入的光学标记物中的一个或更多个。仅作为示例，考虑检测循环，其中引入具有寡核苷酸序列a’(与波长带1相关联)、s’(与波长带2相关联)和q’(与波长带3相关联)的光学标记物。对应于序列s’和q’的光学标记物将不与报告物部分106杂交，因此在任何波长带中都不生成测量的信号。对应于序列a’的光学标记物将再次与报告物部分106杂交，并生成波长带1中的光学信号。
如上所述，通过获得样品的一个或更多个图像来检测信号。名义上，对应于具有序列a’的光学标记物的信号的空间分布应该与循环1中对应于具有序列a’的光学标记物的信号的空间分布相同。因此，在循环7中的位置/像素中的每一者处由具有序列a’的光学标记物生成的测量的光学信号可以用作与在循环1中测量的具有序列a’的光学标记物对应的光学信号的验证。可以校正差异，或者可以标记观察到差异的像素并在进一步分析中忽略。
因此，虽然在多于一个检测循环中引入光学标记物可以增加执行测定的时间，但这样做也可以提供对先前测量的光学信号的验证，当样品质量差和/或某些分析物不容易或可重复地结合到捕获部分时，这可能是重要的考虑因素。应注意，当在光学信号的测量之后将光学标记物脱杂交时，在多于一个检测循环中引入光学标记物是有利的。相反，如果将光学标记物灭活化或仅部分除去，则稍后重新引入相同的光学标记物可能会更加困难。
报告物代码的选择
在前面的讨论中，应用于报告物部分106的标记物区的主要限制是每个报告物部分中的标记物区的组合是独特的。对于包含寡核苷酸标记物区的报告物部分106，此限制规定每种类型的报告物部分(即，用于通过捕获部分102的选择性结合来鉴定特定类型的分析物100的报告物部分)中的标记物区的寡核苷酸序列在用于鉴定其他类型的分析物的报告物部分中不重复。
在实践中，可以对报告物部分106的标记物区施加其他限制，以进一步确保检测特定类型的报告物部分和它们选择性结合的分析物，并校正在光学标记物与标记物区结合(例如，杂交)以及该结合或相关光学标记物的成像期间可能发生的错误。结合期间可能发生的错误包括但不限于：光学标记物与报告物部分中相应标记物区的不完全杂交；在光学信号测量期间或之前，光学标记物的偶然脱杂交；光学标记物与报告物部分中多个不同标记物区的交叉杂交；以及在循环结束时光学标记物的不完全除去。在成像期间可能发生的错误包括但不限于：由结合到报告物部分的光学标记物生成的光学信号的遮蔽(例如，由报告物部分和/或光学标记物的样品特征或构象变化引起的遮蔽)；其他样品特征对光学标记物生成的光学信号的偶然淬灭；以及由于光学标记物的非特异性定位而导致的分辨率损失。
通常，可以施加用于配置报告物部分106的标记物区的限制来校正当标记分析物并测量来自标记分析物的对应光学信号时可能出现的许多不同类型的错误。这些包括，例如，减少或消除光学标记物与报告物部分106的标记物区的错误杂交。尽管标记物区和光学标记物的序列之间存在一定程度的偶然互补性，但通常不会以这种方式校正光学标记物与其不意图对应的标记物区的杂交。然而，可以确定和校正以异常方式出现一次的报告物部分106的标记物区附近的光学标记物的错误空间位置，当预期光学标记物和标记物区杂交时，正如可以确定和校正出现一次的报告物部分106的标记物区附近的光学标记物的缺失。
可以校正的错误还可以包含当不同的光学标记物生成光谱类似的光学信号时出现的个别区域(其可以对应于样品中的体素)的不正确分配。当来自不同光学标记物的测量的信号足够类似时，将与信号关联的空间区域分配给正确的标记分析物是具有挑战性的。例如，通过使光学标记物在多个荧光通道间分布(即，选择光学标记物使得它们具有充分不同的荧光发射光谱)可以减少或最小化此类错误，使得可以容易地区分从不同光学标记物测量的光学信号。
通过选择光学标记物、标记物区的适当组合和使用多循环检测方法论可以校正的附加错误包含当报告物部分106的标记物区和光学标记物之间应当发生杂交时缺失可检测的光学信号。在通常情况下，与报告物部分106的标记物区充分互补的光学标记物与标记物区杂交，并且可以检测由光学标记物生成的光学信号。然而，当杂交没有发生时，由于诸如立体化学限制和/或偶然脱杂交的因素，可能测量不到光学标记物导致的预期光学信号，导致测量的光学信号的缺失，否则该测量的光学信号将被预期并用于鉴定标记分析物。通过适当选择光学标记物、报告物部分106中的标记物区以及使用多循环检测方法论，可以校正检测期间预期测量的光学信号的缺失，确保仍然可以鉴定样品中的标记分析物。
在用不同报告物部分106标记的样品中的多个分析物的鉴定期间，为了提供对错误的校正，根据某些限制选择不同报告物部分的个别标记物区，并且在上面结合图3描述的多循环检测方法论中使用的光学标记物也被适当地选择，以确保即使在多循环检测方法论期间发生某些类型的检测错误时，个别标记分析物仍然可以与另一个区分。
为了进一步描述与多循环检测方法论有关的标记物区和光学标记物的选择，使用以下术语。通常，每个报告物部分106包含M个不同的标记物区。对于M＝4，如图4所示，标记物区是202a-202d。然而，更一般地，报告物部分106可以包含任何数量M的标记物区，使得M可以是2或更多(例如，3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10或更多，或者甚至更多)。
典型地，被分析的样品中的每种不同类型的分析物用不同类型的报告物部分106(即具有不同标记物区组合的报告物部分106)来标记。在一些实施方案中，不同类型的报告物部分中的每一个包含相同数量M的标记物区。在某些实施方案中，不同类型的分析物用不同类型的报告物部分106来标记，并且在不同类型的报告物部分中，一个或更多个具有与其他类型的报告物部分不同数量的标记物区。例如，在不同类型的报告物部分中，可以有一或更多(例如，2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10或更多或甚至更多)组的不同类型的报告物部分，每个组具有不同数量的标记物区。每个此类组可以包含一个或更多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或甚至更多个)标记物区。
每个标记物区由形成核苷酸序列的多个核苷酸碱基组成。在一些实施方案中，报告物部分内的M个标记物区中的每一个具有相同数量的核苷酸碱基。在某些实施方案中，M个标记物区中的一个或更多个由第一数量的核苷酸碱基组成，并且M个标记物区中的一个或更多个由不同于第一数量的核苷酸碱基的第二数量的核苷酸碱基组成。通常，报告物部分内的M个标记物区的任何可以包含任何数量的核苷酸碱基。
在用于标记样品中不同分析物的多个报告物部分间，在某些实施方案中，用于标记第一分析物的第一报告物部分中的M个标记物区可以各自具有核苷酸碱基，核苷酸碱基的数量与用于标记不同于第一分析物的第二分析物的第二报告物部分中的M个标记物区相同。然而，更一般地，第一报告物部分的标记物区的一个或更多个中的核苷酸数量可以不同于第二报告物部分的一个或对应标记物区中的核苷酸数量。本文所述的任何报告物部分中的每个标记物区可以独立地包含2个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个、80个或更多个、90个或更多个、100个或更多个、120个或更多个、140个或更多个、160个或更多个、180个或更多个、200个或更多个，或甚至更多个)核苷酸碱基。例如，可以选择任何标记物区中的核苷酸碱基数量，以控制标记物区和光学标记物之间杂交的动力学、结合强度和严格性。
每个报告物部分106中的M个标记物区形成报告物代码C。通常，样品中的每个分析物用不同的报告物部分106来标记，即含有形成报告物代码C的M个标记物区的独特组合的报告物部分106。因此，为了检测样品中的T个不同分析物，使用具有T个独特报告物代码C的报告物部分池。特别地，将样品暴露于包含T个独特报告物部分106的组合物，该报告物部分中的每一个连接(例如，通过接头104)到相应的捕获剂102，捕获剂102特异性结合分析物中的一种不同分析物。具有相同类型的报告物代码C的所有报告物部分与相同类型的捕获剂连接，使得样品中相同类型的多个分析物用具有相同报告物代码C的相同类型报告物部分来标记。以这种方式，用具有独特报告物代码C的独特报告物部分来标记样品中的每个不同类型的分析物。因此，检测报告物代码C中的每一个允许在样品中鉴定不同类型的分析物中的每一个，并且确定不同报告物代码C中的每一个的量允许在样品中量化不同类型的分析物。
通常，可以根据需要选择独特报告物代码的数量T，其可以与样品所暴露的组合物中独特报告物部分106的数量相同，并且也可以与检测到的独特分析物的数量相同。例如，T可以是2或更多(例如，3或更多、4或更多、5或更多、10或更多、15或更多、20或更多、25或更多、30或更多、35或更多、40或更多、45或更多、50或更多、60或更多、70或更多、80或更多、90或更多、100或更多、200或更多、300或更多、400或更多、500或更多、600或更多、800或更多、1000或更多、1500或更多、2000或更多、2500或更多、3000或更多、3500或更多、4000或更多、5000或更多、6000或更多、7000或更多、8000或更多、9000或更多、10000或更多、15000或更多、20000或更多、30000或更多、40000或更多、50000或更多，或甚至更多)。
为了理解在光学标记物的杂交和检测相应信号以鉴定分析物期间的错误的性质，考虑N个不同寡核苷酸序列的池。仅为了说明的目的，可以假设N为26，用从“a”到“z”的单字母标识符标示寡核苷酸序列中的每一个。应注意，仅通过解释的方式使用N的值和单字母寡核苷酸序列标识符，并且通常N可以具有任何值，并且寡核苷酸序列可以以任何方式标示。
进一步考虑具有四个标记物区(具有寡核苷酸序列a-b-c-d)的特定报告物代码C*。报告物代码C*是报告物部分106的一部分，报告物部分106连接至捕获部分102。捕获部分102转而在样品中的空间位置L处与样品中的特定分析物特异性结合。
在多个检测循环期间，为了检测报告物代码C*的存在，具有互补寡核苷酸序列a’、b’、c’和d’的光学标记物以某种顺序依序与报告物代码C*的相应标记物区杂交。通过多次杂交和检测循环，在样品中的位置L处检测到与具有序列a’、b’、c’和d’的杂交的光学标记物对应的光学信号。基于此信息，可以确定在位置L处呈现报告物代码C*。此外，因为报告分子代码C*与特异性结合至特定分析物Y的捕获部分102缀合，所以可以鉴定分析物Y在位置L处的存在。
在一些实施方案中，选择T个独特报告物代码C，使得当在杂交和检测光学标记物期间发生单减错误(singledrop error)时，代码中的每一个是可区分的。在上述实例中，预期在位置L处测量与具有寡核苷酸序列a’、b’、c’和d’的光学标记物对应的光学信号。当在位置L处没有测量到与这些光学标记物的一个对应的光学信号时，发生单减错误。任何一个预期的光学信号都可能是丢失的信号。例如，在位置L处测量的光学信号可以对应于具有序列a’、b’和d’的光学标记物，因此基于在位置l处测量的光学信号的报告物代码c*是a-b-d。
在这些情况下，从光学标记物的多个杂交循环和随后对来自杂交的标记物的发射光的检测中确定的报告物代码c*是错误的，因为它仅含有三个标记物区a、b、d，而不是四个标记物区。如果对与探针池内的捕获部分缀合的T个独特报告物代码C的选择没有任何限制，则不可能确定哪个分析物位于样品中的位置L处。这种模糊性的出现是因为不可能确定哪个额外的标记物区(即，来自a-z)存在于报告物代码C*内,中并且没有被检测到。
为了确保检测的具有单减错误的报告物代码C仍然可以与探针的组合物中的其他报告物代码C区分，可以根据特定限制来选择报告物代码。通常，探针的组合物包含不同类型的探针，其中每种不同类型的探针包含与不同类型报告物部分106连接的捕获部分102，报告物部分106含有不同类型的报告物代码C。为确保具有单减错误的报告物代码可以与其他报告探针区分，选择每种类型的报告物代码C，在不考虑报告物代码中标记物区的相对位置的情况下，使得其与组合物中其他类型的报告物代码C中的每一个在至少两个标记物区上不同。
因此，例如，如果组合物含有一种类型的报告物代码a-b-c-d，其存在于一种类型的报告物部分106中，报告物部分106与选择性结合第一类型的分析物的捕获部分102连接，则该组合物在任何不同类型的报告物部分106(报告物部分106与捕获部分102连接，捕获部分102与不同于第一类型的分析物的第二类型的分析物选择性结合)中不含有任何以下报告物代码的示例：a-b-c-e(因为此代码与a-b-c-d仅一个标记物区不同)，d-c-b-f(因为此代码与a-b-c-d仅一个标记物区不同)，b-g-d-a(因为此代码与a-b-c-d仅一个标记物区不同)和c-a-h-b(因为此代码与a-b-c-d仅一个标记物区不同)。在上述实例中，标记物区的顺序对于确定报告物代码之间的差异并不重要。因此，d-c-b-f与a-b-c-d仅一个标记物区不同(例如，f替换了a)，即使标记物区b、c和d的相对排序在代码之间不同。
由于标记物区的相对排序无关紧要，所以组合物在任何不同类型的报告物部分中也不含有任何以下报告物代码的示例：a-d-b-c、c-d-a-b和b-a-d-c。这些报告物代码中的每一个都与a-b-c-d没有任何不同，因为标记物区的相对排序并不重要。在一些实施方案中，在组合物中根本不存在诸如此类的代码--其与a-b-c-d仅在标记物区的相对排序上不同。在某些实施方案中，诸如此类的代码可以存在于组合物中，但仅作为报告物部分106的一部分，报告物部分106与选择性结合第一类型的分析物的捕获部分连接。
应注意，报告物代码的前述示例不是穷举的，并且上面讨论的限制也将其他报告物代码C排除在组合物的报告物部分106之外。
通过将上述限制应用于选择组合物中不同类型探针的不同类型报告物部分中存在的报告物代码c，仍然可以区分由单减错误生成的检测的报告物代码。例如，如果报告物代码a-b-c-d由于单减错误而被检测为a-b-d，则检测的代码a-b-d仍然可以与其他类型探针的其他报告物代码区分，因为组合物中其他类型探针的其他报告物代码将不具有a、b和d标记物区的组合，因为每个报告物代码与连接至不同类型的捕获部分的所有其他报告物代码在至少两个标记物区上不同。换句话说，检测的含有单减错误的报告物代码a-b-d仍然可以与诸如a-b-e-f、d-b-r-s、b-a-f-g和g-h-c-d的报告物代码区分。
在一些实施方案中，选择T个独特报告物代码C，使得当在杂交和检测光学标记物期间发生单加错误(single add error)时，代码中的每一个是可区分的。继续前面的讨论，预期在位置L处测量与具有寡核苷酸序列a’、b’、c’和d’的光学标记物对应的光学信号。当在位置L处测量到与额外光学标记物对应的光学信号时，发生单加错误。额外光学信号可以对应于光学标记物的任何一个。例如，在位置L处测量的光学信号可以对应于具有序列a’、b’、c’、d’和e’的光学标记物，因此基于在位置L处测量的光学信号的报告物代码c*是a-b-c-d-e。
为了确保具有检测的单加错误的报告物代码C仍然可以与探针组合物中的其他报告物代码C区分，选择每种类型的报告物代码C，在不考虑报告物代码中标记物区的相对位置的情况下，使得其与组合物中其他类型的报告物代码C中的每一个在至少两个标记物区上不同。
参考上面的实例，假设除了作为第一探针的一部分的报告物代码a-b-c-d(其被错误地检测为a-b-c-d-e)之外，组合物还含有作为第二探针的一部分的报告物代码a-b-e-f，其与报告物代码a-b-c-d在在两个标记物区(即，第三和第四标记物区)上不同。如果正确检测报告物代码a-b-e-f，则可以基于标记物区f(即，基于来自具有寡核苷酸序列f’的光学标记物的测量的信号)将第二探针与第一探针区分。以类似的方式，根据上述限制，当报告物代码存在于组合物的探针中时，可以区分每种不同类型的探针，以及它们选择性结合的不同分析物，即使当检测到报告物代码具有单加错误时。
在一些实施方案中，选择T个独特报告物代码C，使得可以确定在杂交和检测光学标记物期间的单替换错误的发生。再次回到上面的讨论，预期在位置L处测量与具有寡核苷酸序列a’、b’、c’和d’的光学标记物对应的光学信号。当在位置L处测量对应于未预期的光学标记物的光学信号来代替预期的光学标记物信号时，发生单替换错误。可以检测替换光学信号来代替任何一个光学标记物。例如，在位置L处测量的光学信号可以对应于具有序列a’、b’、c’和e’的光学标记物，因此基于在位置L处测量的光学信号的报告物代码C*包含序列a、b、c和e，而不是序列a、b、c和d。
然而，虽然可以将对应于序列a、b、c和e的组合的报告物代码C识别为无效，但是由于不知道序列a、b、c和e的哪一个被错误地检测，因此不一定能校正报告物代码。换言之，序列a、b、c或e的任何一个都可能是被错误检测的序列。因此，尽管所确定的包含序列a、b、c和e的报告物代码C可以被鉴定为无效，但在没有额外信息的情况下，可能无法确定正确的报告物代码。因此，对应于此类报告物代码的检测信号可以简单地从进一步考虑中消除，因为它们是错误的。
为了确保检测的具有单替换错误的报告物代码C可以被鉴定为错误，选择每种类型的报告物代码C，在不考虑报告物代码中标记物区的相对位置的情况下，使得其与组合物中其他类型的报告物代码C中的每一个在至少两个标记物区上不同。
除了单加(single add)、单减(singledrop)和单替换(single replacement)错误之外，还可能发生特异于报告物代码的其他类型的检测错误。一个此类实例是双减错误，其中报告物部分106含有Q个标记物区，但仅检测到(Q-2)个标记物区。例如，报告物部分106可以包含形成报告物代码C的4个标记物区a-b-c-d，但在检测期间，仅检测到标记物区a和b。因此，检测的报告物代码是a-b。
另一实例是双加错误，其中报告物部分106含有Q个标记物区，但检测到(Q+2)个标记物区。例如，报告物部分106包含形成报告物代码C的标记物区a-b-c-d，但是在检测期间，将报告物代码确定为a-b-c-d-e-f。
在一些实施方案中，可以鉴定双加和/或双减错误，但是在没有额外信息的情况下不能校正。因此，如上面关于单替换错误所讨论的，可以简单地从进一步的考虑中消除相应的检测信号，因为它们是错误的。
在某些实施方案中，可以通过如上所述对报告物代码C的选择施加限制来校正双加和/或双减错误。例如，为了能够区分与两种不同类型的捕获剂102连接的两个报告物部分106的报告物代码，可以根据以下限制来选择组合物中的报告物代码C，该限制是选择每种类型的报告物代码C使得在不考虑报告物代码中标记物区的相对位置的情况下，其与组合物中其他类型的报告物代码C中的每一个在至少三个标记物区上不同。当组合物中的报告物部分在至少三个标记物区上不同时，经受错误的检测(具有双加或双减错误)的报告物部分仍然可以与组合物中的其他报告物部分区分。
在一些实施方案中，可以将其他限制应用于报告物代码C的选择，以确保在杂交和检测光学标记物期间可以将不同类型的报告物部分彼此区分。例如，可以选择报告物代码C，使得每个代码不含有任何重复的寡核苷酸序列。换句话说，每个报告物部分106含有Q个标记物区，并且Q个标记物区中的每一个在报告物部分中是不同的。
可用的报告物代码C的数量取决于应用于代码选择的限制。为了说明相关因素，考虑一个示例，其中每个报告物部分包含Q＝4个标记物区(即，每个报告物代码C包含4个寡核苷酸序列)。选择一组报告物代码C用于检测样品中的分析物，使得在该组代码间，每个代码与该组中其他代码中的每一个在至少两个寡核苷酸上不同(例如，不考虑标记物区的顺序的情况下，报告物代码所对应的每种类型的报告物部分与其他类型的报告物部分中的每一个在至少两个标记物区上不同)。此外，每个代码不含有任何重复的寡核苷酸(例如，每种类型的报告物部分含有4个不同的标记物区，其中没有一个在报告物部分内重复)。
通过首先组装所有可能的代码的列表，可以使用一次取Q的N个核苷酸序列池来计算合适的代码集；接受第一代码；然后依次考虑每个剩余的可能的代码，并且如果它与其他接受的代码在至少2个寡核苷酸上不同，则接受它，或者如果它与其他接受的代码仅在1个核苷酸上不同，则拒绝它。持续此方式直到考虑了所有可能的代码。结果是可接受的代码集，它们彼此之间在至少两个核苷酸上不同。这可以人工或使用计算机程序来完成。
如果在不同类型的报告物部分106内含有每个报告物代码C，报告物部分106与选择性结合至不同分析物的不同类型的捕获部分102连接，则在没有其他考虑的情况下，可以检测的不同分析物的数量，由Tmax给出。对于不同的N和Q的值，可以检测的不同分析物的数量的示例如表1所示。这些示例说明，使用相对少的核苷酸N的数量可以检测大量的分析物，其中每个部分含有相对少的标记物区Q的数量。
| N | Q | Tmax |
| 18 | 4 | 140 |
| 27 | 4 | 594 |
| 36 | 4 | 1320 |
| 18 | 5 | 336 |
| 27 | 5 | 2474 |
| 18 | 6 | 672 |
表1
检测的光学信号的校准
在一些实施方案中，可以在多循环杂交和检测光学标记物期间执行额外的校准和误差检查步骤。例如，再次参考图3和4A-4D，为了解码报告物部分106，与报告物部分106的互补标记物区杂交的光学标记物通常在多循环杂交和检测程序中引入一次。样品中所有报告物部分106单次暴露于特定光学标记物，通常足以确保样品中所有报告物部分中的所有互补标记物区与特定光学标记物杂交，并且检测到由光学标记物生成的光学信号。
然而，在一些实施方案中，光学标记物中的一个或更多个在多于一个循环的多循环检测程序中与报告物部分106杂交。对一个或更多个光学标记物的重复暴露可以作为对由光学标记物生成的测量的检测信号的验证来执行。例如，特定光学标记物与样品中报告物部分的初始杂交生成与光学标记物对应的光学信号的空间分布。通过在稍后的循环中重复暴露于相同的光学标记物，可以验证测量的光学信号(即，从样品的图像获得)的空间分布，并且如果需要，可以基于在重复暴露之后获得的第二测量的光学信号的空间分布进行校正。可以使用两种验证以确保初始没有测量到虚假光学信号，并且确保检测到初始应该测量的光学信号。通过以此类方式验证测量的光学信号，可以证实特定分析物的空间分布的测量。此外，还可以验证通过对分析物的空间分布进行积分而获得的特定分析物的定量测量。
在某些实施方案中，包含报告物部分的探针还可以包含光学标记物的结合区，光学标记物不是报告物部分的一部分，而是用于执行标准化或校准功能。图5是显示包含上述探针的许多特征的探针500的实施方案的示意图。除了包含Q个标记物区的报告物部分106外，探针500还包含一个或更多个验证区510。验证区510中的每一个通常包含可以具有与前述标记物区相同的部分或全部特性的寡核苷酸序列。
通常选择验证区510中的每一个的序列，使得它们不与光学标记物的任何序列互补。这样，在杂交和检测光学标记物期间，没有光学标记物与探针500的验证区杂交，并且没有测量到与验证区杂交的光学标记物所对应的光学信号。
然而，可以将图3所示的程序修改为包含一个或更多个标准化步骤，其中将生成以下光学信号的标准化光学标记物引入样品中并与探针的验证区之一杂交，标准化光学标记物生成的光学信号不同于与报告物部分的标记物区杂交的光学标记物生成的光学信号。标准化光学标记物生成标准化光学信号，以与前述相同的方式检测标准化光学信号。
通常，探针500可以包含一个或更多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，或甚至更多)验证区510。探针500中验证区中的每一个可以是不同的(例如，可以具有不同的寡核苷酸序列)，或者替代地，验证区510中的一个或更多个可以与探针500中的另一个验证区相同。
在引入到样品中的复数个探针500间，并且复数个探针的成员与样品中的不同分析物结合，在一些实施方案中，复数个探针的每个成员可以包含一个或更多个验证区510的相同集。替代地，在某些实施方案中，复数个探针中的一些或全部的验证区可以不同。例如，在复数个探针包含选择性结合到多种不同类型的分析物(例如，样品中的多个不同核酸)的探针的情况下，探针中的每一个可以具有所有探针共同的第一验证区，以及在一些探针中不同的第二验证区。第二验证区的序列可以取决于，例如被探针选择性结合的分析物所落入的特定类别或分组。作为一个示例，可以基于被探针结合的分析物的来源选择第二验证区的序列。
以这种方式，通过测量对应于与探针的标准化区杂交的标准化光学标记物的信号，可以在多分析物测定中可靠地将测量的与特定组或类的分析物对应的光学信号与其他光学信号区分。此外，特别是通过测量由标准化光学标记物生成的光学信号(标准化光学标记物与存在于所有探针中的标准化区域杂交)，可以相对于彼此校正样品的不同部分中测量的光学信号。换言之，由标准化光学标记物生成的光学信号充当样品上的公共参考光学信号，其中可以推测信号的变化可以是由样品的不均一、检测灵敏度的差异以及可能在空间视场间产生成像变化的其他因素引起的。使用来自标准化光学标记物的光学信号作为参考信号，可以针对此类变化校正由与报告物部分106的标记物区杂交的光学标记物生成的测量的光学信号。多种此类校正是可能的，包括但不限于将来自报告物部分的光学信号除以相应的标准化光学标记物信号(即，空间分辨的校正)，将来自报告物部分的光学信号归一化或缩放以产生可再现地偏离参考标准化光学信号的信号，以及使用标准化光学信号在测量的光学信号中建立阳性和阴性信号检测的阈值，测量的光学信号来自与报告物部分的标记物区杂交的光学标记物。
前面的讨论集中于针对含有报告物部分106的特定分析物的探针。在一些实施方案中，探针可以含有多个报告物部分106，以有效地放大与用于鉴定特定分析物的特定标记物区对应的测量的信号。
图6显示了探针600的示意图，探针600包含与图55中的探针500类似的许多特征。探针600包含检测部分610，检测部分610包含G个报告物部分106。通常，报告物部分中的每一个含有标记物区的相同独特组合，标记物区与报告物部分以及与选择性结合到捕获部分102的分析物独特地相关联。在一些实施方案中，G个报告物部分106中的每一个都是相同的。在某些实施方案中，一些报告物部分彼此不同，但每个报告物部分仍包含相同的与结合到捕获部分102的分析物关联的标记物区的独特组合。
检测部分610通常可以包含任何数量G的报告物部分106.在一些实施方案中，例如，G为1个或更多(例如，2或更多、3或更多、5或更多、7或更多、10或更多、15或更多、20或更多、25或更多、30或更多、35或更多、40或更多、50或更多、60或更多、70或更多、100或更多、120或更多、150或更多、200或更多、300或更多、400或更多、500或更多、700或更多、1000或更多、1200或更多、1400或更多、1600或更多、1800或更多、2000或更多、2500或更多、3000或更多、4000或更多、5000或更多、7000或更多、10000或更多，或甚至更多)。
检测部分610中报告物部分106中的每一个可以普遍地且独立地具有以上所述的与报告物部分有关的任何性质和特征。此外，检测部分610还可以包含本文所述的任何其他种类、部分和序列，例如但不限于一个或更多个验证区。存在于探针600中的捕获部分102和接头104可以普遍地且独立地具有本文所述的与捕获部分和接头有关的任何性质和特征。
包含多个报告物部分106的探针600可以使用各种方法制造。在一些实施方案中，例如，可以通过执行延伸反应(例如滚环扩增(RCA))形成探针600。
在某些实施方案中，探针600可以通过以依序的方式相继连接报告物部分106来执行。每个报告物部分可以包含第一反应端，第一反应端与报告物部分的活化的第二端形成共价键。可以使检测部分610中的末端报告物部分106的第二端活化(例如，通过光活化(photolabilizing)末端报告物部分第二端处的保护基团)，并引入新的报告物部分。在末端报告物部分的活化的第二端和新报告物部分的反应性第一端之间形成共价键，通过另一个报告物部分106延伸检测部分610。
在一些实施方案中，探针600可以形成为分支或树形结构，其中检测部分610包含多个报告物部分106。例如，捕获部分102可以通过具有寡核苷酸序列的第一核酸形成，其一部分选择性地结合样品中的分析物(例如RNA)。第一核酸的寡核苷酸序列的另一部分充当接头104的一部分。探针600还可以包含分支检测部分610。分支检测部分610的一部分包含与充当接头104的一部分的第一核酸的一部分杂交的寡核苷酸序列。分支检测部分610的另一部分由包含多个报告物部分106的分支寡核苷酸序列组成。其中每个都包含多个标记物区，光学标记物可以选择性地与标记物区杂交。
可以使用多种不同的分支探针。在某些实施方案中，例如，探针600包含三种不同类型的核酸。第一核酸如上所述，并且包含寡核苷酸序列，寡核苷酸序列的第一部分充当捕获部分102，寡核苷酸序列的第二部分充当接头104的一部分。第二核酸是中间核酸。中间核酸的第一部分与第一核酸的一部分杂交并充当接头104的一部分。中间核酸的第二部分包含共同寡核苷酸序列的多个拷贝，共同寡核苷酸序列充当分支杂交位置。探针还包含一个或更多个第三核酸，其中每个包含第一部分，第一部分具有与共同寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，共同寡核苷酸序列是与第二核酸的共同寡核苷酸序列，使得每个第三核酸与第二核酸的共同寡核苷酸序列之一杂交。第三核酸中的每一个还包含一个或更多个报告物部分，每个报告物部分具有如前所述的多个标记物区。由第一核酸、第二核酸和一个或更多个第三核酸组成的整个构建体形成探针600。
可以使用的分支探针的实例包括但不限于美国专利9,783,841和美国专利申请公开号US 2015/0105298中描述的那些，其中每个的整体内容通过引用并入本文。
由于检测部分610含有多个报告物部分106，所以当光学标记物与多个报告物部分的标记物区杂交时生成的光学信号通常比由单个光学标记物生成的光学信号更强。更高强度的光学信号允许检测低浓度的分析物，甚至可以以这种方式检测单个分析物分子。光学标记物杂交、光学信号测量和标记物脱杂交和/或灭活通常可以如上所述执行。
组合物和试剂盒
本文所述的探针、报告物部分和光学标记物可以包含在各种组合物中。在一些实施方案中，组合物可用于如上文结合图3和图4A-4D所述的样品分析。替代地，或另外地，该组合物可用于根据步骤和/或程序的不同集分析样品。
在一些实施方案中，样品可以任选地暴露于其中的组合物可以包含复数个探针。探针中的每一个可以包含任选的捕获部分102、任选的接头104和检测部分610。检测部分610可以包含一个或更多个报告物部分106。报告物部分106可以具有本文所述的任何标记物区以及任何数量的标记物区。探针还可以任选地包含一个或更多个验证区510，以及本文所述的任何其他特征。
可以根据上述限制来选择组合物中报告物部分的标记物区，以在组合物中生成不同类型的探针。特别地，组合物可以包含不同类型探针的组或群体，其中每种不同类型的探针选择性地结合到样品中不同类型的分析物。相同类型的探针各自包含相同的报告物部分，或者任选地，包含彼此为不可区分的变体的报告物部分(即，其中标记物区的排序不同，但标记物区对应于相同的寡核苷酸序列的报告物部分)。在不考虑每种类型探针中标记物区的相对排序的情况下，每种类型的探针具有与组合物内其他类型的报告物部分的探针不同的报告物部分。
如上所讨论的，在组合物内，可以任选地选择报告物部分，使得在不考虑报告物部分中标记物区的相对位置的情况下，第一类型的探针的报告物部分的标记物区与组合物中其他类型中的每一个的探针的报告物部分的标记物区在至少两个标记物区上不同。以这种方式选择标记物区确保可以鉴定和校正杂交和检测期间的单加、单减和单替换错误。
此外，可以任选地选择报告物部分，使得在特定的报告物部分中，没有标记物区是重复的。换言之，对于具有Q个标记物区的报告物部分，Q个标记物区中的每一个相对于报告物部分中的其他标记物区是不同的。此限制确保所有Q个标记物区可以用于报告物部分的鉴定。
组合物通常可以包含靶向样品中任何数量的不同类型的分析物的不同类型的探针的群体或组。在一些实施方案中，例如，组合物可以包含2个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个、2000个或更多个、3000个或更多个、4000个或更多个、5000个或更多个、10000个或更多个，或甚至更多)不同类型的探针的群体或组。
组合物内的每个探针的群或组通常可以包含任何数量的特定类型的探针，并且特定类型的探针选择性地结合到样品中特定类型的分析物。例如，特定类型的探针的数量可以是1或更多(例如，2或更多、3或更多、5或更多、10或更多、50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、500或更多、1000或更多、2000或更多、3000或更多、5000或更多、7000或更多、10000或更多、30000或更多、50000或更多，或甚至更多)。
在一些实施方案中，组合物可以包含本文所述的任何报告物部分。报告物部分可以作为较大分子的一部分存在，即作为探针或检测部分的一部分，或者替代地，可以与组合物内其他部分和实体解偶联。组合物还可以包含作为检测部分的一部分存在的报告物部分，检测部分或作为探针的一部分存在，或替代地，在组合物内解偶联。
在这种情况下，可以根据上述的限制来选择报告物部分的标记物区，以在组合物中生成不同类型的报告物部分，以及任选地，在组合物中生成不同类型的检测部分，以及在组合物中生成不同类型的探针。特别地，组合物可以包含不同类型的报告物部分的组或群体，其中相同类型的报告物部分彼此相同或仅在它们的标记物区的相对排序上不同，并且每种类型的报告物部分与组合物内不同类型的报告物部分不同。
在组合物内，可以任选地选择报告物部分，使得在不考虑报告物部分中标记物区的相对顺序的情况下，组合物中第一类型的报告物部分(例如，是第一类型的探针的一部分的报告物部分)的标记物区与其他类型的报告物部分(例如，是其他类型探针的一部分的报告物部分)的标记物区在至少两个标记物区上不同。以此类方式选择标记物区确保可以鉴定和校正杂交和检测期间的单加、单减和单替换错误。
此外，可以任选地选择报告物部分，使得在特定的报告物部分中，没有标记物区是重复的。换言之，对于具有Q个标记物区的报告物部分，Q个标记物区中的每一个相对于报告物部分中的其他标记物区是不同的。此限制确保所有Q个标记物区可以用于报告物部分的鉴定。
组合物通常可以包含不同类型的报告物部分的群体或组。在一些实施方案中，例如，组合物可以包含2个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个、2000个或更多个、3000个或更多个、4000个或更多个、5000个或更多个、10000个或更多个，或甚至更多个)不同类型的报告物部分的群体或组。
组合物内每个不同类型的报告物部分的群体或组通常可以包含任何数量的报告物部分。例如，特定类型的报告物部分的数量可以是1或更多(例如，2或更多、3或更多、5或更多、10或更多、50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、500或更多、1000或更多、2000或更多、3000或更多、5000或更多、7000或更多、10000或更多、30000或更多、50000或更多，或甚至更多)。
通常，组合物可以包括不同类型的检测部分的群体或组，其中每个包括相同(或不能区分的)类型的一个或更多个报告物部分。在一些实施方案中，例如，组合物可以包含2个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个、2000个或更多个、3000个或更多个、4000个或更多个、5000个或更多个、10000个或更多个，或甚至更多)不同类型的检测部分的群体或组。
组合物内每个不同类型的检测部分的群体或组通常可以包含任何数量的检测部分。例如，特定类型的检测部分的数量可以是1或更多(例如，2或更多、3或更多、5或更多、10或更多、50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、500或更多、1000或更多、2000或更多、3000或更多、5000或更多、7000或更多、10000或更多、30000或更多、50000或更多，或甚至更多)。
在一些实施方案中，组合物可以包含一种或更多种额外的组分。例如，在一些实施方案中，组合物可以包含一种或更多种缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括但不限于柠檬酸钠盐水(SSC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)。
在某些实施方案中，组合物包含一种或更多种光学标记物。光学标记物可以包含本文所述的任何光学标记物。典型地，如结合图3和4A-4D所描述的，将样品暴露于组或池中的光学标记物，其中每个此类组包含2个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、8个或更多个，或者甚至更多)不同的光学标记物。在组合物内，可以任选地将光学标记物分成子组合物，其中每个含有光学标记物的组或池。在某些实施方案中，在子组合物中，每个光学标记物可以仅存在于一个子组合物中。替代地，在一些实施方案中，一种或更多种光学标记物可以存在于超过一个的子组合物中。
如上所述，将样品暴露于包含光学标记物的组合物，以使一些或全部的光学标记物与报告物部分的互补标记物区杂交。在某些实施方案中，将样品同时暴露于光学标记物的整个组合物。替代地，在一些实施方案中，如前面所讨论的将样品依序暴露于组合物的子组合物，。
在一些实施方案中，光学标记物存在于与上述探针和/或报告物部分相同的组合物中。在某些实施方案中，光学标记物存在于不同的组合物中，样品在暴露于包含探针和/或报告物部分的组合物后暴露于该不同的组合物。
包含光学标记物的组合物还可以任选地包含额外的组分。例如，在一些实施方案中，组合物可以包含一种或更多种缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括但不限于柠檬酸钠盐水(SSC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)。
上述组合物中的一个或更多个可以作为用于分析样品的试剂盒的一部分被包含。试剂盒可以包含封装试剂盒内容物的外壳或包装。组合物可以包含在试剂盒的容器内；此类容器可以由多种材料形成，包括(但不限于)塑料和玻璃。
试剂盒还可以任选地包含各种其他组分。例如，在一些实施方案中，试剂盒可以包含一种或更多种脱杂交试剂。此类试剂的实例包括但不限于氢氧化钠、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、SDS、甲醇和乙醇。
在某些实施方案中，试剂盒可以包含一种或更多种缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括但不限于柠檬酸钠盐水(SSC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)。
试剂盒还可以任选地包含印刷或以其他方式记录在多种不同介质(例如纸、计算机可读存储介质)的任一种上的说明书，该说明书描述了试剂盒的某些组分在靶向样品中各种类型的分析物的测定中的用途。
样品分析***和组件
本文所述的方法可以在各种不同的分析***中实施，包括以半自动或全自动方式执行一些或所有步骤的***。此类***700的一个实例在图7中示意性地显示。***700包含存储单元702、标记站704、成像站706和平移设备710，这些组件的每一个连接到控制器708，其包含执行与控制器508关联的控制功能并且还可以执行本文所述的其他分析功能中的任一者的一个或更多个电子处理器。
平移设备710包含玻片操纵器712，该玻片操纵器712连接到其上配置有用于分析的生物样品的个别玻片，并在***中的不同位置之间运输玻片。样品配置于其上的玻片的实例在图7中标示为玻片750。可以以多种方式实施玻片操纵器712。例如，在一些实施方案中，玻片操纵器712是抓取器并且包含一个或更多个臂或手指，臂或手指在玻片750的表面上施加压力以提起并运输玻片750。在某些实施方案中，玻片操纵器712包含具有一个或更多个吸口的构件，抽吸口使用减压来提起个别玻片750。在某些实施方案中，玻片操纵器712包含一个或更多个在玻片750下面***以举起玻片的构件。通常，玻片操纵器712可以允许玻片750旋转位移约三个正交轴以及沿三个正交轴的平移。
平移设备710还可以包含轨道或传送带713，其在***700中的位置之间运送个别玻片750或玻片的容器。在一些实施方案中，轨道713是沿着位置之间的单个方向来回移动的线性轨道。在某些实施方案中，轨道713是在***中的位置间循环的连续轨道(例如，环形、椭圆形或另一连续形状)。
如上所述，在操作期间，控制器708可以向平移设备710传送适当的控制信号，以从存储单元702取回一个或更多个玻片750，并将一个或更多个玻片存放到存储单元702中。此外，控制器708可以将控制信号传送到平移设备710以激活标记站704，从而将流体、试剂和组合物递送至玻片750，并从玻片750除去流体、试剂、组合物(及其组分)。标记站704包含连接至一个或更多个贮存器(reservoir)718以及一个或更多个泵和/或真空源719的流体设备714。流体设备714包含一个或更多个流体导管(例如，注射器、管、移液管)连接到一个或更多个贮存器718，并且任选地相对于玻片550定位，以将本文公开的任何试剂和/或组合物递送到配置在玻片550上的生物样品。任选可定位的流体导管可以由柔性导管材料(例如各种常规聚合物材料的任何一种或更多种)制成，并与机器人致动器(图7中未显示)连接，机器人致动器连接到控制器708并从控制器708接收定位指令。
在***的操作期间，控制器708向平移设备710传送信号，以将玻片750定位在标记站704内，并向流体设备714传送信号以使流体导管中的一个或更多个将流体、试剂和/或组合物从贮存器718递送到配置在玻片550上的生物样品。进一步，控制器708传送信号，以激活一个或更多个泵和/或真空源，从而选择性的从生物样品中除去流体、试剂和/或组合物(及其组分)。以这种方式，控制器708(将指令传送到标记站704)可以以自动方式实施本文所述的标记、暴露、测量和除去/灭活步骤中的任一者。
成像站706包含辐射源720、物镜724、分束器722和图像检测器726。辐射源720可以包含各种不同源的任何一个或更多个，包括但不限于LED、激光二极管、金属卤化物源、白炽光源和荧光源。图像检测器726可以包含一个或更多个不同的检测器类型，包括但不限于CCD检测器和CMOS检测器。在***700的操作过程中，为了获得配置在玻片550上的生物样品的图像，控制器708激活平移设备710以将玻片750定位在成像站706内。然后，控制器708将控制信号传送到成像站的组件，激活光源720以将照明辐射传送到样品，该照明辐射穿过分束器722和物镜724并入射到样品上。发射光从样品穿过物镜574，从分束器722反射，并入射到图像检测器726上，图像检测器726测量发射光的图像。
在图7中，将成像站配置为获得样品的荧光或反射光图像。然而，应理解，在一些实施方案中，检测器726可以定位在玻片750的与源720相对侧，以测量样品的透射光图像。在某些实施方案中，成像站706包含用于测量样品的透射和反射或发射光(例如，荧光)图像的多个检测器。在控制器708的控制下，成像站706可以获得对应于本文所述的任何不同类型的染料、染色剂、探针和标记剂的任何不同类型的图像。
此外，应注意，虽然在图7的示例***700中标记站704和成像站706是分离的，但是在一些实施方案中，标记站和成像站可以在控制器708的控制下组合成单个站，并且其执行如本文所述的样品标记和成像功能。
样品分析中步骤中的每一个消耗一定量的时间，并且可以通过在***700中的多个位置中平移多个玻片750且并行的执行某些操作来获得提高的效率。例如，在多个玻片750的分析期间，其上配置有第一样品的第一玻片可以定位在标记站处，并且流体设备可以将一个或更多个探针递送到样品并将样品与递送的探针一起温育。同时，其上配置有第二样品的第二玻片可以定位在成像站处，以获得样品的一个或更多个图像。其上配置有第三样品的第三玻片可以定位在标记站处，在此处控制器708激活一个或更多个泵和/或真空源719以从配置在第三玻片上的样品中除去流体、试剂和/或组合物(及其组分)。其上配置有第四样品的第四玻片可以定位在标记站处，在此处控制器708激活流体设备714以递送一种或更多种流体、试剂和/或组合物，并将第四样品与流体、试剂和/或组合物一起温育。也可以同时处理其他玻片750--经历本文所讨论的任何操作。
当每个玻片到达制备或分析工作流程中的一个或更多个步骤集的末尾时，通过平移设备710将玻片运输到***中的不同位置，例如运输到不同的站，或者运输到相同站内的不同位置。以此方式，***700可以并行的分析多个样品，确保***700的组件的工作循环保持相对较高，相对于个别样品的简单线性处理增加对于多个样品的***的总处理量。
***700的额外的方面和特征在美国专利申请公开号US2020/0393343中描述，其全部内容通过引用并入本文。
图8显示了控制器708的示例，其可以与本文公开的***和方法一起使用。控制器708可以包含一个或更多个处理器802、存储器804、存储装置806和用于互连的接口808。处理器802可以处理用于在控制器内执行的指令，包括存储在存储器804中或存储装置806上的指令。例如，指令可以指示处理器802执行本文公开的任何分析和控制步骤。
存储器804可以存储用于处理器802的可执行指令、关于***的参数(诸如激发和检测波长)的信息以及所测量的图像信息。存储装置806可以是计算机可读介质，诸如软盘装置、硬盘装置、光盘装置或磁带装置、闪存或其他类似的固态存储装置，或者装置阵列，其包含存储区域网络中的装置或其他配置。存储装置806可以存储如上所述可以由处理器802执行的指令，以及可以由存储器804存储的任何其他信息。
在一些实施方案中，控制器708可以包含图形处理单元以在外部输入/输出装置(诸如，显示器816)上显示图形信息(例如，使用GUI或文本界面)。图形信息可以通过显示装置(例如，CRT(阴极射线管)或LCD(液晶显示器)监视器)来显示，用于显示本文公开的任何信息，诸如所测量和计算的光谱和图像。用户可以使用输入装置(例如，键盘、指向装置、触摸屏、语音识别装置)向控制器708提供输入。在一些实施方案中，一个或更多个此类装置可以是控制器708的部分。
***700的用户可以经由输入装置向控制器708提供各种不同类型的指令和信息。指令和信息可以包含，例如，关于与本文所述的任何工作流程关联的任何参数(例如，染料、标记物、探针、试剂、条件)的信息，用于样品图像的定量分析的校准信息，以及技术人员对样品图像进行人工分析之后的指令。控制器708可以使用这些各种类型的信息的任何一种来执行本文所述的方法和功能。还应注意，这些类型的信息的任何一种都可以存储(例如，在存储装置806中)并且在需要时由控制器708调用。
本文公开的方法可以由控制器708通过执行由控制器708可执行和/或可解释的一个或更多个计算机程序中的指令来实施。这些计算机程序(也称为程序、软件、软件应用或代码)包含用于可编程处理器的机器指令，并且可以以高级过程序式和/或面向对象的编程语言，和/或以汇编/机器语言来实施。例如，计算机程序可以含有如上所述可以存储在存储器804中、存储单元806中和/或有形的、计算机可读介质上并由处理器802执行的指令。如本文所用，术语“计算机可读介质”是指用于向可编程处理器提供机器指令和/或数据的任何计算机程序产品、设备和/或装置(例如，磁盘、光盘、存储器、可编程逻辑器件(PLD)、ASIC和电子电路)，包含接收机器指令的机器可读介质。
通过执行如上所述的指令(其可以可选地是控制器708的一部分)，可以将控制器配置为实施结合本文的任何工作流程所描述的各种步骤的任何一个或更多个中。例如，控制器708可以选择性地将特定流体、试剂和/或组合物引导到生物样品的特定区域(例如，通过激活流体设备714)，并选择性地从样品中除去流体、试剂和/或组合物(及其组分)。控制器718可以选择特定探针(具有特定报告物部分)以递送至生物样品，并选择特定光学标记物(包括根据上述标准的光学标记物的组合)以递送至样品。控制器718可以从样品中的光学标记物获得光学信号的测量，并且基于从成像站接收的图像确定光学信号的位置。
控制器718可以基于光学信号的位置和在标记物曝光和成像的一个或更多个循环中递送到样品的光学标记物的类型来确定样品中特定分析物的位置。例如，在工作流程(例如，参见图3)的每个循环期间，控制器718可以鉴定存在于样品中特定位置的特定标记物区。基于样品中特定位置处存在的标记物区的组合，控制器718(例如，通过与存储的关于特定类型探针中的标记物区的组合的信息进行比较)可以鉴定样品中特定位置处的特定分析物。在来自光学标记物的测量的信号不能明确地用于鉴定样品中的位置处的特定分析物的情况下，控制器718还可以实施如本文所述的错误校正步骤。
应用
本文所述的杂交和信号检测方法、组合物和试剂盒可以与多种不同的探针和分析物一起使用，并且可以用于多种不同的样品中。该方法不依赖于样品中分析物与探针结合的方式，也不依赖于分析物的性质。此外，除了本文所述的标记物区的方面之外，探针可以具有多种不同的结构组成和功能。只要它们不干扰光学标记物的杂交，可以存在探针的额外结构特征而不干扰本文所述的方法。
可应用方法、组合物和试剂盒的样品包含组织样品(例如，组织切片)，包含新鲜的、新鲜冷冻的和***固定的石蜡包埋(FFPE)样品。其他样品包括但不限于细胞和组织裂解物、体液(例如，血液、尿液、唾液、淋巴液、肾液和其他此类液体)、厚组织(例如，实体瘤组织、活检样品)、个别细胞、细胞和其他生物材料的悬浮液和抽吸的样品。
其他实施方案
虽然本公开描述了具体的实施方式，但是这些不应被解释为对本公开的范围的限制，而应解释为对某些实施方案中的特征的描述。在单独实施方案的上下文中描述的特征通常也可以在单个实施方案中组合实施。相反，在单个实施方案的上下文中描述的各种特征也可以在多个实施方案中单独地或以任何合适的子组合实施。此外，尽管上文可以将特征描述为存在于某些组合中，并且甚至最初如此要求保护，但是来自所要求保护的组合的一个或更多个特征通常可以从该组合中切离，并且要求保护的组合可以涉及子组合或子组合的变型。
除了本文明确公开的实施方案之外，应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行各种修改。因此，其他实施方案也在所附权利要求的范围内。
Claims (82)
1.方法，其包括：
(a)使生物样品暴露于复数个不同类型的探针，其中每种不同类型的探针包含：
核酸捕获部分，其与所述样品中不同类型的RNA分析物结合；和
检测部分，其包含至少一个报告物部分，其中所述检测部分与所述捕获部分连接，并且其中所述至少一个报告物部分包含多个标记物区，所述标记物区中的每一个包含具有序列的寡核苷酸；
(b)使所述生物样品暴露于复数个光学标记物，其中所述光学标记物中的每一个包含具有序列的寡核苷酸和生成光学信号的种类；
(c)测量由与所述报告物部分的互补标记物区杂交的所述复数个光学标记物的光学标记物生成的光学信号；
(d)用不同的复数个光学标记物重复步骤(b)和(c)；
(e)基于测量的光学信号鉴定所述样品中所述报告物部分中的一个或更多个；和
(f)基于鉴定的报告物部分确定所述样品中所述RNA分析物中的一个或更多个的位置，
其中在所述不同类型的探针间，每种类型的检测部分的所述至少一个报告物部分与每种其他类型的检测部分的所述至少一个报告物部分在至少两个标记物区上不同。
2.权利要求1的方法，其进一步包括：对于所述光学标记物中的至少一个，在测量由所述光学标记物中的所述至少一个生成的光学信号之后且用不同的复数个光学标记物重复步骤(b)和(c)之前，从所述样品中除去所述光学标记物中的所述至少一个。
3.权利要求2的方法，其中除去所述光学标记物中的所述至少一个包括使所述光学标记物中的所述至少一个从所述报告物部分的一个或更多个标记物区脱杂交。
4.权利要求1的方法，其中至少一种类型的检测部分的所述至少一个报告物部分包含在所述至少一个报告物部分内不重复的标记物区。
5.权利要求4的方法，其中每种类型的检测部分的所述至少一个报告物部分包含在所述至少一个报告物部分内不重复的标记物区。
6.权利要求1的方法，其中至少一种类型的检测部分的所述至少一个报告物部分包含至少3个在所述至少一个报告物部分内不重复的标记物区。
7.权利要求6的方法，其中每种类型的检测部分的所述至少一个报告物部分包含至少3个在所述至少一个报告物部分内不重复的标记物区。
8.权利要求1的方法，其中每个标记物区包含至少15个核苷酸。
9.权利要求8的方法，其中每个标记物区包含至少30个核苷酸。
10.权利要求1的方法，其中所述报告物部分中的每一个的每个标记物区包含相同数量的核苷酸。
11.权利要求1的方法，其中所述报告物部分中的每一个包含相同数量的标记物区。
12.权利要求1的方法，其中生成所述光学信号的所述种类是荧光部分。
13.权利要求1的方法，其中生成所述光学信号的所述种类包含至少一种荧光核苷酸。
14.权利要求1的方法，其中测量由所述光学标记物生成的光学信号包括获得所述样品中的所述光学标记物的至少一个图像，并且鉴定与所述至少一个图像中的所述光学标记物对应的光学信号。
15.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的每个复数个光学标记物包含相同数量的不同类型的光学标记物。
16.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的每个复数个光学标记物包含3个或更多个不同类型的光学标记物。
17.权利要求16的方法，其中步骤(b)中的每个复数个光学标记物包含5个或更多个不同类型的光学标记物。
18.权利要求1的方法，其进一步包括，重复步骤(b)直到所述样品已经暴露于光学标记物集，其中所述至少一个报告物部分的每个标记物区在所述光学标记物集中具有互补光学标记物。
19.权利要求1的方法，其进一步包括将所述样品暴露于所述复数个光学标记物中的至少一个超过一次。
20.权利要求1的方法，其中每次执行步骤(b)，步骤(b)中的所述复数个光学标记物的每个成员包含生成不同光学信号的种类。
21.权利要求20的方法，其中所述不同光学信号具有不同的光谱分布。
22.权利要求1的方法，其中在所述复数个光学标记物间：
所述光学标记物中的至少两个包含生成所述光学信号的共同种类；和
在步骤(b)的不同重复期间，使所述光学标记物中的所述至少两个暴露于所述样品。
23.权利要求1的方法，其中在所述复数个光学标记物间：
第一和第二光学标记物各自包含生成所述第一和第二光学标记物的所述光学信号的第一种类；
第三和第四光学标记物各自包含生成所述第三和第四光学标记物的所述光学信号的第二种类；和
所述第一和第二种类是不同的。
24.权利要求18的方法，其中由所述第一和第二种类生成的所述光学信号是不同的。
25.权利要求24的方法，其进一步包括：
在步骤(b)的不同重复期间，使所述样品暴露于所述第一和第二光学标记物；和
在步骤(b)的不同重复期间，使所述样品暴露于所述第三和第四光学标记物。
26.方法，其包括：
使生物样品暴露于第一探针，所述第一探针包括与所述样品中的第一RNA结合的第一核酸捕获部分以及包含至少一个第一报告物部分的第一检测部分，其中所述至少一个第一报告物部分包括各自包含具有序列的寡核苷酸的多个第一标记物区，其中每个第一报告物部分中的所述多个第一标记物区的每一个的所述寡核苷酸序列是不同的；
使所述生物样品暴露于第二探针，所述第二探针包含与所述样品中的第二RNA结合的第二核酸捕获部分以及包含至少一个第二报告物部分的第二检测部分，其中所述至少一个第二报告物部分包括各自具有序列的寡核苷酸的多个第二标记物区，其中每个第二报告物部分中的所述多个第二标记物区的每一个的所述寡核苷酸序列是不同的；
使所述生物样品暴露于多个复数个光学标记物，其中每个复数个光学标记物包含与所述多个第一和第二标记物区的至少一个杂交的至少一个光学标记物，直到来自所述多个复数个光学标记物的光学标记物已经与所述多个第一和第二标记物区的每一个杂交；
在使所述生物样品暴露于每个复数个光学标记物后，测量由与所述多个第一和第二标记物区的至少一个杂交的每个复数个光学标记物的所述至少一个光学标记物生成的空间分辨的光学信号；和
确定所述样品中所述第一和第二RNA的一个或更多个位置，
其中所述第一标记物区中的至少两个与所述第二标记物区中的每一个不同。
27.权利要求26的方法，其进一步包括，对于所述复数个光学标记物的至少一个，在测量空间分辨的光学信号之后且在使所述生物样品暴露于所述多个复数个光学标记物中的另一个之前，从所述样品中除去与所述多个第一和第二标记物区中的至少一个杂交的所述至少一个光学标记物。
28.权利要求27的方法，其中除去所述至少一个光学标记物包括使所述至少一个光学标记物从所述多个第一和第二标记物区中的至少一个脱杂交。
29.权利要求26的方法，其中所述至少一个第一报告物部分的每个报告物部分包含在所述报告物部分内不重复的第一标记物区。
30.权利要求29的方法，其中所述至少一个第二报告物部分的每个报告物部分包含在所述报告物部分内不重复的第二标记物区。
31.权利要求26的方法，其中所述至少一个第一报告物部分的每个报告物部分包含至少3个在所述报告物部分内不重复的第一标记物区。
32.权利要求31的方法，其中所述至少一个第二报告物部分的每个报告物部分包含至少3个在所述报告物部分内不重复的第二标记物区。
33.权利要求26的方法，其中每个标记物区包含至少15个核苷酸。
34.权利要求33的方法，其中每个标记物区包含至少30个核苷酸。
35.权利要求26的方法，其中所述至少一个第一报告物部分的每个标记物区包含相同数量的核苷酸。
36.权利要求26的方法，其中所述至少一个第一报告物部分的每一个包含相同数量的标记物区。
37.权利要求36的方法，其中所述至少一个第二报告物部分的每一个包含相同数量的标记物区。
38.权利要求26的方法，其中所述光学标记物中的每一个包含生成光学信号的种类。
39.权利要求38的方法，其中生成所述光学信号的所述种类是荧光部分。
40.权利要求38的方法，其中生成所述光学信号的所述种类包含至少一种荧光核苷酸。
41.权利要求26的方法，其中测量由所述至少一个光学标记物生成的空间分辨的光学信号包括，获得所述样品中所述至少一个光学标记物的至少一个图像，并且鉴定与所述至少一个图像中的光学标记物对应的光学信号。
42.权利要求26的方法，其中每个复数个光学标记物包含相同数量的不同类型的光学标记物。
43.权利要求26的方法，其中每个复数个光学标记物包含3个或更多个不同类型的光学标记物。
44.权利要求43的方法，其中每个复数个光学标记物包含5个或更多个不同类型的光学标记物。
45.权利要求26的方法，其中所述多个复数个光学标记物的超过一个中存在至少一种类型的光学标记物。
46.权利要求26所述的方法，其中每个复数个光学标记物的所述光学标记物包含生成彼此不同的光学信号的各自种类。
47.权利要求46的方法，其中所述不同的光学信号具有不同的光谱分布。
48.权利要求26的方法，其中在所述多个复数个光学标记物间，至少两种类型的所述光学标记物包含生成共同光学信号的共同种类，并且其中所述至少两种类型的光学标记物存在于不同的复数个光学标记物中。
49.权利要求48的方法，其中使所述生物样品在不同的时间暴露于所述不同的复数个。
50.组合物，其包含：
多个复数个探针，其中每个复数个探针靶向不同类型的分析物并且包含捕获部分和检测部分，所述捕获部分与所述复数个探针所靶向的类型的分析物结合，所述检测部分与捕获部分连接并包含至少一个报告物部分，其中所述至少一个报告物部分包括各自包含具有序列的寡核苷酸的多个标记物区，
其中对于每个复数个探针，所述至少一个报告物部分的所述标记物区与其他复数个探针的所述至少一个报告物部分的所述标记物区在至少两个标记物区上不同。
51.权利要求50的组合物，其中对于所述复数个探针的至少一个，所述至少一个报告物部分的所述标记物区彼此不同。
52.权利要求51的组合物，其中对于每个复数个探针，所述至少一个报告物部分的所述标记物区彼此不同。
53.权利要求50的组合物，其中所述多个复数个探针包含50个或更多个复数个探针。
54.权利要求53的组合物，其中所述多个复数个探针包含500个或更多个复数个探针。
55.权利要求50的组合物，其中每个复数个探针靶向不同的RNA。
56.权利要求50的组合物，其中每个复数个探针的所述捕获部分包含具有序列的寡核苷酸，所述序列与RNA分析物至少部分地互补。
57.权利要求50的组合物，其中对于所述复数个探针的至少一个，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区包含至少3个标记物区。
58.权利要求57的组合物，其中对于所述复数个探针的至少一个，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区包含至少4个标记物区。
59.权利要求57的组合物，其中对于所述复数个探针的每一个，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区包含至少3个标记物区。
60.权利要求50的组合物，其中对于所述复数个探针的至少一个，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区的所述寡核苷酸序列具有共同的长度。
61.权利要求60的组合物，其中对于所述复数个探针的每一个，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区的所述寡核苷酸序列具有共同的长度。
62.权利要求50的组合物，其中对于所述复数个探针的至少一个，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区的所述寡核苷酸序列在长度上不同。
63.权利要求50的组合物，其中对于所述复数个探针的至少一个，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区的所述寡核苷酸序列具有共同的长度，所述共同的长度不同于所述复数个探针中另一个的所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区的所述寡核苷酸序列的共同的长度。
64.权利要求50的组合物，其中对于每个复数个探针，所述至少一个报告物部分的所述多个标记物区中的每一个包含至少15个核苷酸。
65.权利要求64的组合物，其中所述多个标记物区中的每一个包含至少30个核苷酸。
66.权利要求50的组合物，其中对于每个复数个探针，所述至少一个报告物部分的所述标记物区与其他复数个探针的所述至少一个报告物部分的所述标记物区在至少三个标记物区上不同。
67.权利要求50的组合物，其中每个复数个探针靶向不同的肽。
68.权利要求50的组合物，其中每个复数个探针的所述捕获部分包含选择性结合蛋白质分析物的抗体。
69.权利要求50的组合物，其中所述复数个探针的至少一个包含选择性结合至RNA的探针，并且所述复数个探针的至少一个包含选择性结合至蛋白质的探针。
70.试剂盒，其包含：
包装材料；和
所述包装材料内的权利要求50-69中任一项的组合物。
71.权利要求70的试剂盒，其中所述组合物是第一组合物，所述试剂盒进一步包含所述包装材料内的第二组合物，并且包含复数个光学标记物，其中每个光学标记物包含寡核苷酸序列和生成光学信号的种类。
72.权利要求71的试剂盒，其中所述光学标记物中的每一个的所述寡核苷酸序列是不同的。
73.权利要求71的试剂盒，其中生成所述光学信号的所述种类中的至少一些是多个光学标记物所共有的。
74.权利要求71的试剂盒，其中每个光学标记物的所述寡核苷酸序列包含至少15个核苷酸。
75.权利要求74的试剂盒，其中每个光学标记物的所述寡核苷酸序列包含至少30个核苷酸。
76.权利要求71的试剂盒，其中生成所述光学信号的所述种类包含荧光部分。
77.权利要求71的试剂盒，其中生成所述光学信号的所述种类包含染料。
78.权利要求71的试剂盒，其中生成所述光学信号的所述种类包含至少一种荧光核苷酸。
79.权利要求71的试剂盒，其中每个光学标记物的所述寡核苷酸序列具有共同的长度。
80.权利要求71的试剂盒，其中所述光学标记物的所述寡核苷酸序列中的至少一些具有不同的长度。
81.权利要求71的试剂盒，其中所述光学标记物的所述寡核苷酸序列是DNA序列。
82.权利要求71的试剂盒，其中将所述光学标记物以多个组包装在所述包装材料内。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163171297P | 2021-04-06 | 2021-04-06 | |
| US63/171,297 | 2021-04-06 | ||
| PCT/US2022/023674 WO2022216824A1 (en) | 2021-04-06 | 2022-04-06 | Detection of labeled analytes in biological samples |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117795095A true CN117795095A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=81393063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280040118.XA Pending CN117795095A (zh) | 2021-04-06 | 2022-04-06 | 生物样品中的标记分析物的检测 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220316004A1 (zh) |
| EP (1) | EP4320270A1 (zh) |
| CN (1) | CN117795095A (zh) |
| WO (1) | WO2022216824A1 (zh) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9783841B2 (en) | 2012-10-04 | 2017-10-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Detection of target nucleic acids in a cellular sample |
| US20150105298A1 (en) | 2013-10-10 | 2015-04-16 | The Research Foundation For The State University Of New York | Multi-oligomer in situ hybridization probes |
| CA3023566A1 (en) * | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Nanostring Technologies, Inc. | Methods for detecting target nucleic acids in a sample |
| EP3794146A1 (en) * | 2018-05-14 | 2021-03-24 | Nanostring Technologies, Inc. | Chemical compositions and methods of using same |
| CN114556074A (zh) | 2019-06-14 | 2022-05-27 | 阿科亚生物科学股份有限公司 | 多重组织成像 |
| US20210403992A1 (en) * | 2020-06-29 | 2021-12-30 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | METHOD COMBINING SINGLE CELL GENE EXPRESSION MAPPING AND TARGETED RNA OR c-DNA SEQUENCING USING PADLOCK OLIGONUCLEOTIDES COMPRISING A BARCODE REGION |
-
2022
- 2022-04-06 CN CN202280040118.XA patent/CN117795095A/zh active Pending
- 2022-04-06 US US17/714,628 patent/US20220316004A1/en active Pending
- 2022-04-06 EP EP22719702.7A patent/EP4320270A1/en active Pending
- 2022-04-06 WO PCT/US2022/023674 patent/WO2022216824A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220316004A1 (en) | 2022-10-06 |
| EP4320270A1 (en) | 2024-02-14 |
| WO2022216824A1 (en) | 2022-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021203155B2 (en) | Simultaneous quantification of a plurality of proteins in a user-defined region of a cross-sectioned tissue | |
| AU2021203139B2 (en) | Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue | |
| EP3610242B1 (en) | Target molecule density determination in a fluorescence image | |
| US10365213B2 (en) | Reliable fluorescence correction method for two-color measurement fluorescence system | |
| US20220364160A1 (en) | Amplification of RNA Detection Signals in Biological Samples | |
| CN117795095A (zh) | 生物样品中的标记分析物的检测 | |
| JP7280339B2 (ja) | ペプチド核酸コンジュゲート | |
| US20230130371A1 (en) | RNA Detection by Selective Labeling and Amplification | |
| JP3969361B2 (ja) | 固定化された物質の定量方法 | |
| US20220064698A1 (en) | Multiplexed imaging reagent compositions and kits | |
| US20210395804A1 (en) | Sensitive and multiplexed detection of nucleic acids and proteins for large scale serological testing | |
| US20220155311A1 (en) | Multiplexed Imaging with Nanobody Probes | |
| EP2515271B1 (en) | Method of analysing reagent beads | |
| US20040020993A1 (en) | Method for luminescent identification and calibration | |
| JP4076698B2 (ja) | 生体由来物質の検出方法および装置 | |
| JP2020130094A (ja) | 核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測方法、および核酸配列計測装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |