CN117794952A - 抗tigit抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
特异性结合TIGIT的抗体或其抗原结合片段，其能够有效阻断TIGIT与其配体的结合，解除TIGIT配体对TIGIT下游信号的抑制作用。进一步涉及含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物，编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，涉及这些抗体或其抗原结合片段的治疗和诊断用途。
Description
本发明涉及特异性结合TIGIT的抗体或其抗原结合片段以及含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物。此外，此发明涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，此发明涉及这些抗体或其抗原结合片段的治疗和诊断用途。
T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT,又称WUCAM、Vstm3、VSIG9)是一种新型免疫抑制性受体，由活化的CD8
+T和CD4
+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、调节性T细胞(Tregs)和滤泡辅助性T细胞表达。
TIGIT在肿瘤免疫中参与了一个复杂的调控网络，涉及多个免疫抑制受体(例如，CD96/TACTILE，CD112R/PVRIG)、一个竞争性共刺激受体(DNAM-1/CD226)和多个配体(例如，CD155(PVR/NECL-5)，CD112(Nectin-2/PVRL2))。DNAM-1、TIGIT和CD96在T细胞和NK细胞上表达，并以配体形式共享CD155。在临床前小鼠肿瘤模型中，TIGIT缺陷能够延缓B16F10和MC38皮下肿瘤的生长(Kurtulus S,Sakuishi K,Ngiow SF,et al.TIGIT predominantly regulates the immune response via regulatory T cells.J Clin Invest.2015Nov 2；125(11):4053-62.)。此外，在小鼠体内接种黑色素瘤B16细胞，与TIGIT基因正常表达的小鼠相比，只有非常少的TIGIT-/-小鼠出现了肺转移，并且TIGIT-/-荷瘤小鼠的总体生存期显著延长(Zhang Q,Bi J,Zheng X,et al.Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity.Nat Immunol.2018Jul；19(7):723-732.)。这些结果表明TIGIT作为一个免疫抑制受体在肿瘤免疫中发挥着关键作用。
TIGIT在肿瘤免疫抑制中的作用和PD-1/PD-L1类似，基于TIGIT介导的肿瘤免疫反应的机制，研究人员使用TIGIT阻断型单抗进行治疗干预，增强T或NK细胞的活性来发挥抗肿瘤作用(Guillerey C,Harjunpaa H,Carrie N,et al.TIGIT immune checkpoint blockade restores CD8(+)T-cell immunity against multiple myeloma.Blood 2018,132,1689–1694.)。另有研究报道，抗TIGIT单克隆抗体能够延缓CT26皮下肿瘤和甲基胆蒽(MCA)诱导的纤维瘤的生长，还可以保护小鼠免受4T1或B16肿瘤实 验性转移的影响(Zhang Q,Bi J,Zheng X,et al.Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity.Nat Immunol.2018Jul；19(7):723-732.)。
鉴于TIGIT在免疫反应中的多重作用，TIGIT被认为是一个极具吸引力的肿瘤免疫治疗靶点。因此，本领域存在开发新的TIGIT抗体需求，用于疾病治疗，尤其是癌症治疗。
发明内容
本申请的发明人经过大量的研究，筛选获得了系列抗TIGIT的全人源抗体，其与TIGIT的结合亲和力高，可以有效地阻断TIGIT与其配体CD155/CD112的结合，减少或消除传递至细胞的抑制信号，在动物模型中施用本发明的抗体可以显著抑制肿瘤生长。基于此，本申请还提供了含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物，编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。
ADI-55796
因此，在第一方面，本申请提供了能够特异性结合TIGIT的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:4所示的重链可变区(VH)中含有的VH CDR1或其变体、VH CDR2或其变体以及VH CDR3或其变体；和/或，如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(VL)中含有的VL CDR1或其变体、VL CDR2或其变体以及VL CDR3或其变体；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)。在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:4所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号***定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:1的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:2的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:3的VH CDR3；和/或， 下述3个的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:5的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:6的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:7的VL CDR3；
其中，所述CDR由IMGT编号***定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的框架区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:4所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:8所示的序列或其变体的VL；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:4所示的VH，和/或，如SEQ ID NO:8所示的VL。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人TIGIT和/或阻断人TIGIT与其配体的结合，例如所述结合活性和/或阻断活性优于Tiragolumab。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合小鼠TIGIT和/或阻断小鼠TIGIT与其配体的结合。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具备与人、食蟹猴和/或小鼠TIGIT的交叉反应活性，例如具备与人、食蟹猴和小鼠TIGIT的交叉反应活性。
ADI-55812
在第二方面，本申请提供了能够特异性结合TIGIT的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:12所示的重链可变区(VH)中含有的VH CDR1或其变体、VH CDR2或其变体以及VH CDR3或其变体；和/或，如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区(VL)中含有的VL CDR1或其变体、VL CDR2或其变体以及VL CDR3或其变体；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加 (例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)。在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:12所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。
在某些实施方案中，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号***定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:9的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:10的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:11的VH CDR3；和/或，下述3个的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:13的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:14的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:15的VL CDR3；
其中，所述CDR由IMGT编号***定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的框架区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:12所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:16所示的序列或其变体的VL；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:12所示的VH，和/或，如SEQ ID NO:16所示的VL。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人TIGIT和/或阻断人TIGIT与其配体的结合，例如所述结合活性和/或阻断活性优于Tiragolumab。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具备与人和食蟹猴TIGIT的 交叉反应活性。
在某些实施方案中，本发明第一方面和第二方面的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，
所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在一些实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体与其所源自的序列相比可以具有一个或多个氨基酸的保守置换。在此类实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体与其所源自的野生型序列相比可以具有相同或基本相同的效应子功能。
在另一些实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体可以包含一个或多个氨基酸突变或化学修饰以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。可以通过将抗体恒定区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基或化学修饰，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如FcR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低或增强)。抗体的Fc区介导几种重要的效应子功能，例如ADCC、吞噬作用、CDC等。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具备ADCC活性。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含突变的(例如氨基酸置换)或化学修饰的Fc区，其中所述突变的或化学修饰的Fc区与野生型Fc区相比提供增加的ADCC活性。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段通过在具有低或无岩藻糖基化活性的宿主细胞中表达来生产，所产生的抗体具有低岩藻糖基化或无岩藻糖基化，进而增加其ADCC活性。此类宿主细胞可以是缺乏表达编码岩藻糖基转移酶(例如FUT8)基因的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在某些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，例如IgG1重链恒定区。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片 段选自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的重链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:22所示的轻链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)
2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子***表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)
2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)
2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
核酸分子
在另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的分离的核酸分子上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的分离的核酸分子上时，本发明所述的分离的核酸分子包含含有所述第一核苷酸序列的第一核酸分子以及含有所述第二核苷酸序列的第二核酸分子。
载体
在另一方面，本申请提供了载体，其包含如上所述的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。
在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的载体上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的载体上时，本发明所述的载体包含含有所述第一核苷酸序列的第一载体以及含有所述第二核苷酸序列的第二载体。
宿主细胞
在另一方面，本申请还提供了宿主细胞，其包含如上所述的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。
在某些实施方案中，所述宿主细胞具有低或无岩藻糖基化活性。在某些实施方案中，所述宿主细胞可以是缺乏表达编码岩藻糖基转移酶(例如FUT8)基因的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
制备方法
在另一方面，本申请提供了制备如上所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述宿主细胞具有低或无岩藻糖基化活性，从而产生低或无岩藻糖化的抗体，以增强其中产生的抗体的ADCC活性。在某些实施方案中，所述宿主细胞可以是缺乏表达编码岩藻糖基转移酶(例如FUT8)基因的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
药物组合物
在另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含如上所述的抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的免疫检查点抑制剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
用途
在另一方面，本申请提供了如上所述的抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于：
(1)在体外或受试者(例如人)体内提高免疫细胞活性；
(2)在受试者(例如人)中增强免疫应答；
(3)在受试者(例如人)中预防和/***；或
(4)在受试者(例如人)中预防和/治疗感染。
在某些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，和/或，NK细胞。
在某些实施方案中，所述免疫应答是T细胞或NK细胞介导的免疫应答。
在某些实施方案中，所述肿瘤涉及TIGIT阳性的侵润T细胞和/或NK细胞，和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112)阳性的肿瘤细胞。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体肿瘤或血液肿瘤(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫/***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经***的肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤。
在某些实施方案中，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人、食蟹猴或小鼠。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用。在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是另外的免疫检查点抑制剂。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联合使用。
在另一方面，本申请提供了用于在受试者中增强免疫应答或预防和/或***或感染的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在某些实施方案中，所述肿瘤涉及TIGIT阳性的侵润T细胞和/或NK细胞，和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112)阳性的肿瘤细胞。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体肿瘤或血液肿瘤(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫/***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经***的肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤。
在某些实施方案中，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
本申请的抗体或其抗原结合片段或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本申请的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途 径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过静脉注射或推注给予。
缀合物
在另一方面，本申请提供了缀合物，其包含如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记。
在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
试剂盒
在另一方面，本申请提供了试剂盒，其包括如上所述的抗体或其抗原结合片段或所述的缀合物。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含如上所述的缀合物。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在另一方面，本申请提供了用于检测TIGIT在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段或如上所述的缀合物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗目的，诊断目的，或者非治疗非诊断目的。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的缀合物。
在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片 段。
在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在TIGIT或表达TIGIT的细胞。
在另一方面，本申请还提供了如上所述的抗体或其抗原结合片段或如上所述的缀合物在制备检测试剂中的用途，所述试剂盒用于检测TIGIT在样品中的存在或其水平。
在某些实施方案中，所述检测试剂通过如上所述的方法来检测TIGIT在样品中的存在或其水平。
在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人、食蟹猴或小鼠)的细胞样品(例如，免疫细胞)。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。
除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体 ***的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V
H和V
L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号***进行定义，例如可按照Kabat编号***(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号***(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号***(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号***所定义的CDR。并且，不同编号***之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号***确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号***确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过IMGT编号***确定。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文， 用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)
2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)
2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH
2-VL-接头-VH-COOH或NH
2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)
4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)
2，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
如本文中所使用的，术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。在某些实施方案中，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的。两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的数目的函数(即，百分比同一性＝同一重叠位置的数目/位置的总数×100％)。在某些实施方案中，两个序列长度相同。
两个序列之间的百分比同一性的测定还可使用数学算法来实现。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是Karlin和Altschul的算法，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268，如同Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中改进的。将这样的算法整合至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。
如本文中所使用的，术语“变体”，在多肽的情境中(包括多肽)也指包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加改变的氨基酸序列的多肽或肽。在某些情况下，术语“变体”还指已被修饰(即，通过将任何类型的分子共价连接至多肽或肽)的多肽或肽。例如，但非限制性地，多肽可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白质等。衍生多肽或肽可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来产生，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，变体具有与其所源自的多肽或肽相似、相同或改善的功能。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K
D)表示。在本发明中，术语“K
D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数K
D(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量K
D、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，
3H、
125I、
35S、
14C或
32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如，
)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载 体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐 剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人、食蟹猴、小鼠。在某些实施方案中，所述受试者(例如人、食蟹猴、小鼠)患有与TIGIT相关的疾病(例如，涉及TIGIT阳性的侵润T细胞和/或NK细胞，和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112)阳性的肿瘤细胞的肿瘤)，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，涉及TIGIT阳性的侵润T细胞和/或NK细胞，和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112)阳性的肿瘤细胞的肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止， 或延迟所述疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本发明提供了抗TIGIT的全人源抗体，其与TIGIT的结合亲和力高，可以有效地阻断TIGIT与其配体CD155/CD112的结合，减少或消除传递至细胞的抑制信号，在动物模型中施用本发明的抗体可以显著抑制肿瘤生长。因此，本发明的抗体可以用于多种用途，包括但不限于增强免疫应答，抑制肿瘤生长，抗感染和检测TIGIT蛋白。此外，本发明的全人源抗体可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。因此，本发明的抗体具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
图1显示了本发明抗TIGIT抗体对于CHO细胞上过表达的人TIGIT的结合活性。
图2显示了本发明抗TIGIT抗体对于CHO细胞上过表达的食蟹猴TIGIT的结合活性。
图3显示了本发明抗TIGIT抗体对于CHO细胞上过表达的小鼠TIGIT的结合活性。
图4显示了本发明抗TIGIT抗体阻断人CD155与CHO细胞上过表达的人TIGIT的结合的阻断活性。
图5显示了本发明抗TIGIT抗体阻断小鼠CD155与CHO细胞上过表达的小鼠TIGIT的结合的阻断活性。
图6显示了本发明抗TIGIT抗体与激活的人原代T细胞上TIGIT的结合活性。
图7显示了本发明抗TIGIT抗体单抗分子阻断TIGIT/CD155信号通路的阻断活性。
图8A-8B显示了本发明抗TIGIT抗体与抗PD-L1/PD-1分子协同阻断TIGIT/CD155/CD112，PD-L1/PD-1信号通路的阻断活性。
图9A-C显示了本发明抗TIGIT抗体的体外ADCC活性。
图10A-B显示了本发明抗TIGIT抗体在野生型小鼠CT-26肿瘤模型的药效研究。
图11显示了本发明抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体在野生型小鼠CT-26肿瘤模型的协同药效研究。
图12A-B显示了本发明抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体在huTIGIT KI小鼠CT-26肿瘤模型协同药效研究。
图13显示了本发明抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体在混合接种A375和人PBMC的B-NDG小鼠模型的协同药效研究。
图14A-B显示了本发明抗TIGIT抗体在小鼠体内半衰期研究。
序列信息
本申请涉及的序列的描述提供于下表中。
表1：序列信息
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：抗体的制备
1.1酵母展示技术筛选抗TIGIT全人源抗体
基于酵母抗体展示文库(Adimab)，按照现有的方法(参见专利申请WO2009036379、WO2010105256和WO2012009568)进行扩增，其中每个库的多样性达到1×10
9。简言之，前两轮的筛选使用Miltenyi公司的MACS***进行磁珠细胞分选。首先，将文库中酵母细胞(～1×10
10细胞/文库)分别在FACS洗涤缓冲液(含有0.1％BSA的磷酸盐缓冲液)室温孵育15分钟，缓冲液含有100nM生物素标记的人TIGIT抗原(购自Acro，货号：TIT-H5254)。使用50mL预冷的FACS洗涤缓冲液洗一次，再用40mL缓冲液重悬细胞，并加入500μL链霉亲和素磁珠(Miltenyi LS)，室温孵育15分钟。1000rpm离心5分钟弃去上清后，用5mL FACS洗涤缓冲液重悬细胞，将细胞悬液加到Miltenyi LS柱中。加样完成后，用FACS洗涤缓冲液洗柱3次，每次3mL。从磁性区域取下Miltenyi LS柱，用5mL生长培养基洗脱，收集洗脱的酵母细胞并在37℃过夜生长。
使用流式细胞仪进行下一轮的分选：将经过MACS***筛选获得的大约1×10
8的酵母细胞用FACS缓冲液洗三次，于含有低浓度生物素标记的TIGIT抗原(1nM,10nM,100nM)中室温下培养。弃去培养液，细胞用FACS洗涤缓冲液洗两次之后，将细胞与LC-FITC(FITC标记的抗人免疫球蛋白kappa轻链抗体，购自Southern Biotech)(1:100稀释)混合，并与SA-633(链霉亲和素-633，购自Molecular Probes)(1:500稀释)或SA-PE(链霉亲和素-PE，购自Sigma)(1:50稀释)混合，40℃下培养15分钟。用预冷的FACS洗涤缓冲液洗脱两次，并重悬于0.4mL缓冲液中，将细胞转移到带滤器的分离管中。使用FACS ARIA(BD Biosciences)分选细胞。
将通过筛选获得的酵母细胞在30℃下震荡诱导48小时以分泌表达目标抗TIGIT抗体(全长IgG)。诱导结束之后，1300rpm离心10分钟去除酵母细胞，收获上清液。使用 Protein A对上清液中的抗TIGIT抗体进行纯化，pH2.0醋酸溶液洗脱，收获抗TIGIT抗体。
1.2抗人TIGIT抗体的亲和力优化
为了获得更高亲和力的抗人TIGIT抗体，通过但不限于以下方法对上述经筛选获得的抗体进行优化。
1.2.1 CDRH1/CDRH2筛选
将母代分子的CDRH3基因构建入1×10
8多样性的CDRH1/CDRH2基因库中，并对其进行三轮筛选。第一轮使用MACS方法，第二轮，三轮使用FACS方法，对抗体抗原结合物进行亲和力加压，筛选出高亲和力的抗体。
将筛选获得表达抗TIGIT抗体的酵母细胞在30℃震荡培养48小时以产生TIGIT抗体。在诱导表达完成后，1300rpm离心10分钟去除酵母细胞，收获上清液。使用Protein A对上清液中的抗TIGIT抗体进行纯化，pH2.0醋酸溶液洗脱，收获抗TIGIT抗体。使用木瓜蛋白酶并用KappaSelect(GE生命医疗集团)进行纯化获得相应Fab片段。
1.2.2 VHmut筛选
该方法是通过常规的错配PCR方法向重链区域引入突变。PCR过程中，通过使用1μM高突变的碱基类似物dPTP和8-oxo-dGTP，从而将碱基错配概率提高到约0.01bp。
通过错配PCR获得的产物通过同源重组的方法构建入含有重链恒定区的载体中。通过这种方法，在包括TIGIT抗原滴度，未标记抗原竞争，以及使用母本抗体竞争的筛选压力下，获得库容为1×10
7的次级库，通过FACS方法进行三轮筛选，酵母表达对应抗体。
1.2.3 CDRL1/CDRL2/CDRL3筛选
将CDRL3多样性基因通过同源重组构建入CDRL1/CDRL2基因库中,获得库容为1×10
7的次级库，通过一轮MACS,两轮FACS方法进行筛选，酵母表达对应抗体。
本实施例获得经亲和力成熟后的抗体分子ADI-55796和ADI-55812。ADI-55796和ADI-55812的序列及序列编号如表1所示，其中CDR通过IMGT编号***确定。
1.3抗体的表达与纯化
由HEK293细胞表达并纯化实施例中使用的下述对照抗体：Tiragolumab是由HEK293细胞表达的来自基因泰克公司的抗人TIGIT抗体，其轻重链可变区序列与INN list 177NO 1918185-84-8一致。
对于候选克隆ADI-55796和ADI-55812，分别将其重链可变区构建到人IgG1野生型重链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示)，以及人IgG1L234A、L235A改造的 重链恒定区(G1LALA)(氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)中；将其轻链可变区构建到人免疫球蛋白kappa轻链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示)中。经由HEK293表达***瞬时表达纯化，具体操作如下：使用化学转染的方法将带有抗体重链和轻链的pcDNA3.1载体转入HEK293细胞中，在37℃，8％CO
2条件下，培养7天。收集细胞液，13000rpm离心20分钟。取上清液，Protein A纯化上清液，SEC检测抗体纯度，同时控制内毒素含量。最终获得抗体ADI-55796-G1、ADI-55812-G1、ADI-55796-G1LALA、ADI-55812-G1LALA。
实施例2：抗体亲和力检测
采用生物膜层光学干涉技术(ForteBio)测定实施例1获得的抗体ADI-55796-G1、ADI-55812-G1、ADI-55796-G1LALA、ADI-55812-G1LALA结合人、食蟹猴、小鼠TIGIT的结合解离常数(K
D)。Fortebio亲和力测定按照现有方法(Este,P等人High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.Mabs,2013.5(2):p.270-8)进行，所述人、食蟹猴、小鼠TIGIT的胞外段氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。
测量完整IgG抗体与人、食蟹猴、小鼠TIGIT-his蛋白的单价亲和力：传感器在分析缓冲液中线下平衡20分钟，然后线上检测120s建立基线，加载完整的TIGIT抗体至AHQ传感器至厚度1nm进行亲和力检测。将已加载抗体的传感器于100nM TIGIT-his抗原中作用至平台期，然后将传感器转移到分析缓冲液中至少2分钟用于解离速率测量。使用1:1结合模型进行动力学分析。
在如上测定方法中，各分子的K
D值如表2所示：
表2.抗TIGIT抗体分子的K
D值
注："N.B.":no binding；"NA":not available.
由表2结果可见：(1)抗TIGIT克隆ADI-55796、ADI-55812均与人TIGIT和食蟹猴TIGIT有较高结合活性，此外，ADI-55796还具备与小鼠TIGIT的交叉结合活性。
实施例3：抗TIGIT抗体与过表达人/食蟹猴/小鼠TIGIT CHO细胞的结合活性及阻断活性
3.1基于流式细胞术检测法检测抗TIGIT抗体与过表达在CHO细胞上人/食蟹猴/小鼠TIGIT的结合活性。
具体地，通过转染克隆到MCS的人TIGIT、食蟹猴TIGIT、小鼠TIGIT cDNA的pCHO1.0载体(购自Invitrogen)加压筛选产生过表达人TIGIT的CHO-S细胞(CHO-huTIGIT细胞)，过表达食蟹猴TIGIT的CHO-S细胞(CHO-cynoTIGIT细胞)以及过表达小鼠TIGIT的CHO-S细胞(CHO-muTIGIT细胞)。将扩大培养的过表达细胞调整至合适细胞密度加入96孔流式板，离心后加入梯度稀释的待测样品，4℃孵育30分钟。PBS清洗两次，加入对应稀释至合适浓度的荧光二抗，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。加入PBS重悬细胞，在CytoFlex流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。采用Graphpad软件作图分析获得EC50数值。结果如表3和图1-3所示。
3.2基于流式细胞术检测法检测抗TIGIT抗体阻断人CD155与过表达在CHO细胞上人TIGIT的结合，阻断小鼠CD155与过表达在CHO细胞上小鼠TIGIT的结合的阻断活性。
具体地，将扩大培养的CHO-huTIGIT细胞调整细胞密度至2×10
6细胞/mL，100μL/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的单克隆抗体用PBS稀释，400nM开始3倍稀释共12个点。将稀释好的样品60μL/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃共孵育30分钟。然后60μL/孔加入带有Mouse IgG2a Fc Tag的人CD155蛋白，终浓度为2μg/mL，4℃共孵育30分钟，PBS清洗两次。100μL/孔加入用PBS稀释100倍的APC羊抗鼠IgG抗体，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。100μL/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。
将扩大培养的CHO-muTIGIT细胞调整细胞密度至2×10
6细胞/mL，100μL/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的单克隆抗体用PBS稀释，400nM开始3倍稀释共12个点。将稀释好的样品60μL/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃共孵育30分钟。然后60μL/孔加入带有Mouse IgG2a Fc Tag的小鼠CD155蛋白，终浓度为2μg/mL，4℃共孵育30分钟,PBS清洗两次。100μL/孔加入用PBS稀释100倍的APC羊抗鼠IgG抗体，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。100μL/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex流式细 胞仪上进行检测并计算对应的MFI。采用Graphpad软件作图分析获得IC50数值。结果如表3和图4-5所示。
表3.抗TIGIT抗体与过表达细胞结合阻断活性汇总表
注："N.B.":no binding；and"NA":not available.
由表3和图1-3可以得出如下结论：(1)ADI-55796、ADI-55812与人TIGIT和食蟹猴TIGIT的结合活性均优于对照分子Tiragolumab。(2)ADI-55796与CHO细胞表面过表达的小鼠TIGIT蛋白有明显结合。
由表3和图4-5可以得出如下结论：(1)ADI-55796、ADI-55812阻断人CD155与CHO细胞表面过表达的人TIGIT蛋白的结合的阻断活性均优于对照分子Tiragolumab。(2)与CHO细胞表面过表达的小鼠TIGIT蛋白有结合的抗TIGIT抗体分子ADI-55796也可以明显阻断小鼠CD155与CHO细胞表面过表达的小鼠TIGIT蛋白的结合。
实施例4：抗TIGIT抗体与原代T细胞表面TIGIT结合
基于流式细胞术检测法检测发明抗TIGIT抗体与激活T细胞表面的TIGIT结合活性。
具体地，将人PBMC按照STEMCELL公司提供的试验方案(stemcell,货号：#17951C)进行分选获得human total T细胞。用X-VIVO15培养基(购自lonza，货号：04-418Q)调整T细胞浓度至1.0×10
6cells/mL，加入1μL IL-2储备液(100万IU)，同时1:1(bead-to-cell)加入CD3/CD28Dynabeads(购自gibco，货号：11132D)，于37℃，5％CO
2培养箱内培养48小时。将活化后的T细胞调整至合适细胞密度加入96孔流式板，离心后加入梯度稀释的待测样品，4℃孵育30分钟。PBS清洗两次，加入对应稀释至合适浓度的荧光二抗，4℃孵育30分钟，PBS清洗两次。加入PBS重悬细胞，在CytoFlex流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。结果如图6所示，结果表明本发明抗TIGIT抗 体ADI-55796-G1、ADI-55796-G1LALA、ADI-55812-G1、ADI-55812-G1LALA可以结合激活T细胞表面的TIGIT分子，且结合活性优于对照分子Tiragolumab。
实施例5：荧光素酶报告基因***检测抗TIGIT抗体活性
为进一步在细胞水平检测TIGIT抗体的阻断活性，本实施例构建了荧光素酶报告基因***，简言之，利用慢病毒转染细胞，构建了过表达人CD155和OKT-3scFv的CHO-K1细胞株(CHO-K1-CD155)，构建了过表达人TIGIT和NF-AT luciferase报告基因的Jurkat细胞株(Jurkat-TIGIT-luc)，后续利用这一报告基因***开展相关试验。
具体地，消化获取CHO-K1-CD155功能细胞，调整细胞密度，100μL/孔加入96孔白底板中，贴壁培养过夜。第二天，制备Jurkat-TIGIT-luc效应细胞悬液，将待测样品用反应培养基(RPMI1640+10％FBS)梯度稀释。取出白底板，吸去培养上清，将上述稀释好的样品40μL/孔加入白底板，同时40μL/孔加入Jurkat-TIGIT-luc效应细胞悬液，置于37℃，5％CO
2培养箱培养6h，期间将Bio-Glo TM reagent(购自promega，货号：G7940)恢复至室温。培养完成，取出细胞，室温平衡5分钟，80μL/孔加入Bio-Glo TM reagent，使用多功能酶标仪读取荧光信号值。结果如图7所示，结果表明本发明抗TIGIT抗体ADI-55796-G1、ADI-55796-G1LALA、ADI-55812-G1、ADI-55812-G1LALA可以阻断CD155介导的TIGIT下游信号通路阻断活性，上调报告基因荧光素酶表达。
实施例6：荧光素酶报告基因***检测抗TIGIT抗体与抗PD-L1/PD-1抗体协同效应
为进一步在细胞水平检测TIGIT抗体和抗PD-1/PD-L1抗体的协同阻断活性，本实施例构建了如下荧光素酶报告基因***，简单描述为，在实施例5的基础上，慢病毒感染CHO-K1-CD155以过表达CD122和PD-L1获得CHO-K1-CD155-CD112-PD-L1功能细胞，慢病毒感染Jurkat-TIGIT-luc以过表达PD-1，获得Jurkat-TIGIT-PD-1-luc效应细胞悬液，后续利用这一报告基因***开展相关试验。
具体地，消化获取CHO-K1-CD155-CD112-PD-L1功能细胞，调整细胞密度，100μL/孔加入96孔白底板中，贴壁培养过夜。第二天，制备Jurkat-TIGIT-PD-1-luc效应细胞悬液，将待测样品(其中，所用抗PD-1/PD-L1的抗体为Atezolizumab和Pembrolizumab)用反应培养基梯度稀释。取出白底板，吸去培养上清，将上述稀释好的样品40μL/孔加入白底板，同时40μL/孔加入Jurkat-TIGIT-PD-1-luc效应细胞悬液，置于37℃，5％CO
2 培养箱培养6h，期间将Bio-Glo TM reagent恢复至室温。培养完成，取出细胞，室温平衡5分钟，80μL/孔加入Bio-Glo TM reagent，使用多功能酶标仪读取荧光信号值。结果如图8A-B所示，结果表明本发明抗TIGIT抗体ADI-55796-G1、ADI-55796-G1LALA、ADI-55812-G1、ADI-55812-G1LALA可以与抗PD-1/PD-L1抗体协同解除CD155介导的TIGIT下游抑制信号通路，以及PD-L1介导的PD-1下游抑制信号通路，上调报告基因荧光素酶表达。
实施例7：抗TIGIT抗体体外ADCC活性检测
基于荧光素酶报告基因***，检测本发明抗TIGIT抗体体外ADCC活性。
具体地，扩大培养Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16ADCC效应细胞(购自Promega)，用含10％low IgG FBS的1640培养基重悬细胞至4×10
6细胞/mL。用含10％low IgG FBS的1640培养基重悬CHO-huTIGIT细胞，CHO-cynoTIGIT细胞，CHO-muTIGIT细胞稀释至1.6×10
6细胞/mL。将上述3种细胞悬液分别与Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16细胞1:1混合均匀，50μL/孔加入无菌96孔白底板内，加入含10％low IgG FBS的1640培养基梯度稀释的待检测抗体样品。37℃，5％CO
2共孵育6小时。培养完成，取出细胞，室温平衡5分钟，100μL/孔加入Bio-Glo TM reagent，使用多功能酶标仪读取荧光信号值。结果如图9A-C所示，结果表明本发明抗TIGIT抗体ADI-55796-G1、ADI-55812-G1在荧光素酶报告基因***中可以体外介导对CHO-huTIGIT细胞，CHO-cynoTIGIT细胞，CHO-muTIGIT细胞的ADCC活性。
实施例8：抗TIGIT抗体在野生型Balb/c小鼠体内药效学研究
本实验采用在野生型Balb/c小鼠体内接种CT-26结肠癌细胞(购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司)测定本发明抗TIGIT抗体的抗肿瘤作用。
具体地，首先采用皮下接种的方式建立CT-26细胞荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至100-200mm
3时进行分组，腹腔注射给予不同剂量的本发明抗TIGIT抗体进行治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-3天/次，连续监测2到3周，给药剂量和方式如表4-5。结果如图10A-B所示，结果表明本发明抗TIGIT抗体ADI-55796-G1可以显著抑制小鼠肿瘤的生长，且呈剂量依赖关系。
表4抗TIGIT抗体肿瘤抑制活性试验方案
表5抗TIGIT抗体剂量依赖性肿瘤抑制活性试验方案
实施例9：抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体在野生型Balb/c小鼠体内协同药效学研究
本实验采用在野生型Balb/c小鼠体内接种CT-26肿瘤细胞测定本发明抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体的协同抗肿瘤作用。
具体地，首先采用皮下接种的方式建立CT-26细胞荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至100-200mm
3时进行分组，腹腔注射给予本发明抗TIGIT抗体和/或抗PD-L1抗体(Atezolizumab)治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-3天/次，连续监测2到3周，给药剂量和方式如表6。结果如图11所示，结果表明本发明抗TIGIT抗体ADI-55796-G1与抗PD-L1抗体Atezolizumab联合用药组，肿瘤抑制活性显著优于对应的两单抗治疗组。提示本发明抗TIGIT抗体ADI-55796-G1可以与抗PD-L1抗体Atezolizumab在野生型小鼠CT-26模型中发挥协同抗肿瘤活性。
表6：抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体给药方案
实施例10：抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体在huTIGIT KI小鼠体内协同药效学研究
本实验采用在人TIGIT转基因小鼠(huTIGIT KI小鼠)体内移植CT-26肿瘤细胞测定本发明TIGIT抗体与抗PD-L1抗体的协同抗肿瘤作用。
具体地，首先采用皮下接种的方式建立CT-26荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至80-120mm
3时进行分组，腹腔注射给予不同抗体和不同剂量的治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-3天/次，连续监测2到3周，给药剂量和方式如表7-8。结果如图12A-B所示，结果表明本发明的抗TIGIT抗体ADI-55796-G1、ADI-55796-G1LALA、ADI-55812-G1，均在人TIGIT转基因小鼠移植CT-26肿瘤细胞模型内观察到与抗PD-L1抗体Atezolizuamb的协同抗肿瘤活性。
表7：抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体给药方案(对应图12A)
表8：抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体给药方案(对应图12B)
实施例11：抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体在B-NDG小鼠混合接种A375和人PBMC体内协同药效学研究
本实验在B-NDG小鼠混合接种A375(购自Addexbio，货号：C0020004)，人PBMC细胞(上海妙顺,A10S033014/PB100C)的模型中测定本发明TIGIT抗体与抗PD-L1抗体的协同抗肿瘤作用。
具体地，首先采用皮下混合接种的方式建立A375，人PBMC荷瘤小鼠模型，待平均肿瘤体积长至200mm
3左右时进行分组，腹腔注射给予不同抗体和不同剂量的治疗，监测各组小鼠瘤体积和体重变化，监测频率均为2-3天/次，连续监测2到3周，给药剂量和方式如表9。结果如图13所示，结果表明联合施用本发明的抗TIGIT抗体ADI-55796-G1以及抗PD-L1单抗C-Ye-18-5(参见PCT专利申请：PCT/IB2020/058303)具有显著协同作用。
表9：抗TIGIT抗体与抗PD-L1抗体A375模型协同给药方案
实施例12：抗TIGIT抗体与小鼠体内半衰期研究
采用尾静脉单次注射法，检测本发明抗TIGIT抗体在小鼠体内半衰期。
具体地，实验用Balb/c小鼠，雌雄各半，12/12小时光/暗调节，温度24±2℃，湿度40-70％，自由进水饮食。实验当天对Balb/c小鼠单次尾静脉注射单克隆抗体分子，注射剂量为10mg/kg。取血时间点：给药后5分钟、0.5小时、2小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时、504小时于小鼠眼眶采血。全血样品2-8℃放置30分钟，12000rpm离心5分钟收集血清，所得血清再于2-8℃，12000rpm离心5分钟，-80℃保存，ELISA检测血清中单克隆抗体分子含量。结果如图14A-14B所示，结果表明本发明抗TIGIT抗体ADI-55796-G1、ADI-55812-G1单次注射在小鼠体内半衰期分别为257小时和249小时。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (17)
- 能够特异性结合TIGIT的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)如SEQ ID NO:4所示的重链可变区(VH)中含有的VH CDR1或其变体、VH CDR2或其变体以及VH CDR3或其变体；和/或，如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(VL)中含有的VL CDR1或其变体、VL CDR2或其变体以及VL CDR3或其变体；或，(b)如SEQ ID NO:12所示的重链可变区(VH)中含有的VH CDR1或其变体、VH CDR2或其变体以及VH CDR3或其变体；和/或，如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区(VL)中含有的VL CDR1或其变体、VL CDR2或其变体以及VL CDR3或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)；优选地，所述的置换是保守置换；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)如SEQ ID NO:4所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；或，(b)如SEQ ID NO:12所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；或，优选地，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号***定义。
- 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)下述3个重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:1的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:2的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:3的VH CDR3；和/或，下述3个的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:5的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:6的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:7的VL CDR3；或，(b)下述3个重链可变区(VH)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:9的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:10的VH CDR2、序列为SEQ ID NO:11的VH CDR3；和/或，下述3个轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO:13的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:14的VL CDR2、序列为SEQ ID NO:15的VL CDR3； 或，其中，所述CDR由IMGT编号***定义。
- 权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的框架区；例如，所述抗体或其抗原结合片段包含人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区；例如，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。
- 权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)包含如SEQ ID NO:4所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:8所示的序列或其变体的VL；或，(b)包含如SEQ ID NO:12所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:16所示的序列或其变体的VL；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；优选地，所述的置换是保守置换；例如，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:4所示的VH，和/或，如SEQ ID NO:8所示的VL；例如，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:12所示的VH，和/或，如SEQ ID NO:16所示的VL。
- 权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区；优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区；优选地，所述抗体或其抗原结合片段具备ADCC活性；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含突变的或化学修饰的Fc区，其与野生型 Fc区相比提供增加的ADCC活性；优选地，所述抗体或其抗原结合片段是低岩藻糖基化或无岩藻糖基化的；优选地，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。
- 权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
- 分离的核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
- 载体，其包含权利要求7所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
- 宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的载体；优选地，所述宿主细胞具有低或无岩藻糖基化活性，例如选自缺乏表达编码岩藻糖基转移酶基因的哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。
- 制备权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段；优选地，所述宿主细胞具有低或无岩藻糖基化活性，例如选自缺乏表达编码岩藻糖基转移酶基因的哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。
- 药物组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；优选地，所述药物组合物还包含另外的免疫检查点抑制剂；优选地，所述药物组合物还包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
- 权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求11所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于：(1)在体外或受试者(例如人)体内提高免疫细胞活性；(2)在受试者(例如人)中增强免疫应答；(3)在受试者(例如人)中预防和/***；或(4)在受试者(例如人)中预防和/治疗感染；优选地，所述免疫细胞是T细胞，和/或，NK细胞；优选地，所述免疫应答是T细胞或NK细胞介导的免疫应答；优选地，所述肿瘤涉及TIGIT阳性的侵润T细胞和/或NK细胞，和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112)阳性的肿瘤细胞；优选地，所述肿瘤选自实体肿瘤或血液肿瘤(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)；优选地，所述肿瘤选自结直肠癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫/***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经***的肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤；优选地，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染；优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人、食蟹猴或小鼠；优选地，所述抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用；优选地，所述另外的药学活性剂是另外的免疫检查点抑制剂；优选地，所述抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联合使用。
- 用于在受试者中增强免疫应答或预防和/或***或感染的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的药物组合物；优选地，所述肿瘤涉及TIGIT阳性的侵润T细胞和/或NK细胞，和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112)阳性的肿瘤细胞；优选地，所述肿瘤选自实体肿瘤或血液肿瘤(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)；优选地，所述肿瘤选自结直肠癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫/***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胃肠癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经***的肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤；优选地，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染；优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。
- 缀合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记；优选地，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
- 试剂盒，其包括权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求14所述的缀合物；优选地，所述试剂盒包含权利要求14所述的缀合物；优选地，所述试剂盒包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
- 用于检测TIGIT在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求14所述的缀合物；优选地，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；优选地，所述方法包括使用权利要求14所述的缀合物；优选地，所述方法包括使用权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、 化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。
- 权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求14所述的缀合物在制备检测试剂中的用途，所述试剂盒用于检测TIGIT在样品中的存在或其水平；优选地，所述检测试剂通过权利要求16所述的方法来检测TIGIT在样品中的存在或其水平；优选地，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人、食蟹猴或小鼠)的细胞样品(例如，免疫细胞)。
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