CN117757857A - 一种适用于麦角硫因生产的发酵培养基及分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于麦角硫因生产的发酵培养基及分离纯化方法。通过向培养基中加入外源前体物质,实现相关代谢途径的调控,后再通过添加非离子型表面活性剂,增加菌体细胞膜的通透性,促进胞内物质的外排,实现麦角硫因在发酵液中的大量累积;而后依次利用预处理、盐析、离子交换层析、葡聚糖凝胶层析及色谱分离等方法,对发酵产物中的麦角硫因进行分离纯化。本发明显著提高了麦角硫因的发酵产量及分离纯化过程中的收率和纯度,技术方案简单、环境友好,对于麦角硫因的工业化生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于农业、食品及生物医药领域,具体涉及一种酿酒酵母工程菌高产麦角硫因的培养基组成及应用该培养基发酵所得的发酵液分离纯化麦角硫因的方法。
背景技术
麦角硫因(巯基组氨酸三甲基内盐,Ergothioneine,EGT),相对分子质量为229.3,纯品为白色晶体,熔点290℃,易溶于水、甲醇和乙醇。麦角硫因存在两种异构体,即硫醇和硫酮两种形式。麦角硫因是一种由组氨酸衍生的含硫、非蛋白源性氨基酸,在中性或碱性条件下较稳定,是一种优秀的天然抗氧化剂,可以有效去除细胞中的羟基自由基。
麦角硫因可在大部分真菌、部分分枝杆菌、链球菌、蕈菌等微生物中合成,可被植物和动物吸收并积累。人体无法合成麦角硫因,只能通过外界摄取。在人体内,麦角硫因以高浓度积累在多种细胞与组织之中,如血红细胞、骨髓、肝脏、肾脏、以及晶状体和角膜中最为丰富。麦角硫因具有优异的抗氧化作用、消炎作用等,可以对细胞提供多方面的保护。相较于维生素C、谷胱甘肽这两类传统的天然抗氧化剂组分,具有更安全、更温和、更稳定等优点,在近年得到了很多科研人员的关注。
麦角硫因可以通过三种方法制备:化学合成法、提取法以及生物发酵合成法。化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难,且安全性难以得到保证、原料昂贵、合成成本高、产品售价高等,天然生物提取法存在原料杂质多、药物残留高、提取成本高等问题,上述缺点限制了化学法和天然提取制备的麦角硫因的广泛应用。利用深层液体发酵技术生物合成麦角硫因,具有低成本、易规模化生产麦角硫因的潜力,该方法可以通过代谢调控、培养基优化及发酵条件优化等手段,有效地提高麦角硫因的产率,降低生产成本,且大大提高了产品的安全性,拓宽麦角硫因的应用空间。酿酒酵母作为模式生物,具有对人体安全、遗传背景清晰、发酵过程易操控等优点,改造酿酒酵母发酵生产麦角硫因具有巨大的研究价值。
麦角硫因的纯化较复杂,其分离纯化工艺占据了麦角硫因生产过程中较大部分的成本。对于针对液体发酵体系中麦角硫因的提取、分离、纯化等方面的研究主要依赖于通过离子交换层析、凝胶柱层析、制备型高效液相色谱等氨基酸类物质常用分离手段。建立一种高收率的麦角硫因制备方法,对推广麦角硫因产品的广泛应用非常重要。
发明内容
为建立一种麦角硫因的高效生产工艺,本发明提供了一种适于酿酒酵母工程菌液体培养的培养基,并向其中添加非离子型表面活性剂促进胞内产物外排,以减轻产物反馈抑制,实现麦角硫因在发酵液中的大量累积,进一步通过盐析、离子交换层析、凝胶柱层析、色谱分离等,实现麦角硫因的发酵生产。
本发明的首要目的是:
I,本发明提供一种酿酒酵母工程菌发酵生产麦角硫因的合成培养基。
上述酿酒酵母工程菌发酵生产麦角硫因的合成培养基主要由组分a、b、c、d四部分组成,包含葡萄糖、无机盐、氨基酸、维生素等成分。
具体包括:
组分a:葡萄糖15~25g/L;
组分b:硫酸铵10~20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸铜0.1~0.2mg/L、氯化钙0.1g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸锰0.4mg/L、硫酸锌0.4mg/L、氯化铁0.2mg/L、硫酸亚铁0.01~0.1mg/L、硝酸钾10~12g/L、对氨基苯甲酸0.2mg/L、碘化钾0.1mg/L、钼酸钠0.2mg/L、硼酸0.5mg/L;
组分c:维生素B10.4 mg/L、维生素B20.2 mg/L、维生素B30.4 mg/L、维生素B50.5~1g/L、维生素B61~2mg/L、维生素B70.1~1mg/L、维生素B90.002mg/L、肌醇2mg/L;
组分d:L-精氨酸0.3~0.7g/L、L-半胱氨酸0.05~0.1g/L、L-赖氨酸0.05~0.15g/L、L-苏氨酸0.05~0.15g/L、L-天冬氨酸0.2~0.4g/L、L-异亮氨酸0.2~0.6g/L、L-苯丙氨酸0.01~0.1g/L、L-脯氨酸0.05~0.15g/L、L-丝氨酸0.2~0.6g/L、L-酪氨酸0.01~0.1g/L、L-缬氨酸0.01~0.1g/L、L-甲硫氨酸0.3~0.7g/L、L-色氨酸0.3~0.7g/L、L-组氨酸1~2g/L、L-亮氨酸0.2~0.4g/L、L-谷氨酸0.01~0.1g/L、L-谷氨酰胺0.01~0.1g/L、L-甘氨酸0.1~0.3g/L、L-丙氨酸0.01~0.1g/L、L-天冬酰胺0.05~0.1g/L、L-尿嘧啶0.05~0.15g/L、腺嘌呤0.05~0.15g/L、6-巯基嘌呤1~1.5g/L。
上述合成培养基还包括非离子型表面活性剂,如Triton X-100或吐温80。
上述合成培养基与非离子型表面活性剂Triton X-100制备含有Triton X-100的合成培养基,以1L体积培养基为例,其制备步骤如下:
SI-1将组分a、b、c分别溶于200mL水中,单独装于锥形瓶中,121℃条件灭菌20~30min;
SI-2将组分d溶于400mL水中,单独装于锥形瓶中,使用无菌的0.22μm滤膜过滤除菌;
SI-3将组分a、b、c、d混合,配制成合成培养基;
SI-4称取适量Triton X-100,于121℃条件灭菌20~30min后,将其加入SI-3配制的合成培养基中,制备含有Triton X-100的合成培养基,Triton X-100终浓度为0.1%~2%(v/v)。
本发明同时请求保护含有类似Triton X-100等非离子型表面活性剂的合成培养基在酿酒酵母发酵生产麦角硫因中的应用。
所述应用为:以酿酒酵母为生产菌株,将其按2~10%(v/v)接种量接种至含有Triton X-100的液体合成培养基中,28-32℃,150-250rpm下培养48~72h,Triton X-100的添加量为0.1~2%(v/v)。
更具体地,所述方法包括:
1)菌种活化:将-80℃保存的酿酒酵母接种到液体合成培养基中,28-32℃,150-250rpm活化16-24h;
2)液体培养:配制由组分a、b、c、d组成的合成培养基,将终浓度为0.1~2%(v/v)Triton X-100加入上述合成培养基中,而后接入上述活化的种子液,接种量为2~10%(v/v),28-32℃,150-250rpm培养48~72h。
进一步的,在酿酒酵母培养初始或中后期(0~36h)向合成培养基中添加0.1~2%(v/v)Triton X-100均能提高麦角硫因的发酵产量。
本发明另一目的是:
II,本发明提出了一种基于酿酒酵母发酵液制备麦角硫因的方法。
上述基于酿酒酵母发酵液制备麦角硫因的方法包括:发酵液的预处理、盐析脱色素、利用阳离子交换树脂进行离子交换层析、利用葡聚糖凝胶进行凝胶柱层析、液相色谱分离等。
具体步骤如下:
SII-1收集富含麦角硫因的发酵液的步骤,包括:
1)发酵结束后离心收集上清,细胞沉淀醇提后离心并取上清,混合两部分上清液即可得含麦角硫因的发酵混合液;
2)对所述含麦角硫因发酵混合液进行醇沉处理后进行超滤,去除蛋白质等,收集超滤透过液,经减压蒸馏得到麦角硫因浓缩液;
SII-2对所述浓缩液进行盐析脱色素处理,具体步骤:
取一定体积的上述浓缩液,加入固体硫酸铵充分溶解,使其终浓度达到40-45%饱和度,随后加入与浓缩液等体积的无水乙醇,混合振荡1~5min,静置分相。收集下相溶液,冷冻干燥后,用无水乙醇溶解,10000rpm离心2~5min,收集上清液。
SII-3对所述上清液进行离子交换层析的步骤,包括:
取1~3份预处理的732阳离子交换树脂,向加入10~15份体积的SII-2收集的清液,在pH 2、20~30℃条件下进行动态吸附2~3h;随后,将吸附后的732阳离子交换树脂进行装柱解吸附,解吸温度25℃、解吸时间4~6h、解吸液为1~2mol/LNaOH;
SII-4对所述洗脱液进行凝胶柱层析的步骤,包括:
取葡聚糖凝胶Sephadex G-10,经预处理后装于16×200mm层析柱,将2份体积的离子交换层析洗脱液沿着层析柱的管壁缓慢加入到凝胶床面上,控制吸附/解吸附温度25℃、吸附pH 10、并使用pH 4~5的40%乙醇进行洗脱。
SII-5对所述洗脱液进行色谱分离的步骤,包括:
对洗脱液进行色谱纯化,所述色谱的条件为:高效液相色谱Waters e2695,检测器为Waters 2998,紫外检测波长为254nm,色谱柱选用XCharge C18色谱柱,柱温设定25℃,流动相条件为甲醇:0.1%甲酸(5:95),流速为0.8mL/min,进样量为100μL。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明通过使用一种新的麦角硫因酿酒酵母工程菌培养基,并在优化改进了已有麦角硫因分离技术使酿酒酵母S.cerevisiae M0-EGT的麦角硫因产量及分离纯化部分收率和纯度得到了不同程度的提升,进而降低了麦角硫因发酵生产的成本,对实现酿酒酵母产麦角硫因的工业化生产有着重要意义。
附图说明
图1KNO3对酵母工程菌MKP-0-EGT细胞生长及麦角硫因合成的影响。(a)工程菌MKP-0-EGT细胞生长曲线;(b)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因产量变化;(c)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因合成能力分析。
图2组氨酸对酵母工程菌MKP-0-EGT细胞生长及麦角硫因合成的影响。(a)工程菌MKP-0-EGT细胞生长曲线;(b)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因产量变化;(c)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因合成能力分析。
图3维生素B5对酵母工程菌M0-EGT细胞生长及麦角硫因合成的影响。(a)工程菌MKP-0-EGT细胞生长曲线;(b)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因产量变化;(c)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因合成能力分析。
图4 6-巯基嘌呤对酵母工程菌M0-EGT细胞生长及麦角硫因合成的影响。(a)工程菌MKP-0-EGT细胞生长曲线;(b)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因产量变化;(c)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因合成能力分析。
图5 Triton X-100对酵母工程菌M0-EGT细胞生长及麦角硫因合成的影响。(a)工程菌MKP-0-EGT细胞生长曲线;(b)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因产量变化;(c)工程菌MKP-0-EGT麦角硫因合成能力分析。
图6 5-L生物反应器的发酵参数。(a)未优化培养基体系细胞生长及麦角硫因合成情况;(b)未优化培养基体系麦角硫因合成能力分析;(c)优化培养基体系细胞生长及麦角硫因合成情况(d)优化培养基体系麦角硫因合成能力分析。
图7盐析处理脱色素。
图8离子交换层析条件优化。(a)732阳离子交换树脂的静态吸附与动态吸附比较;(b)pH对吸附效率的影响;(c)温度对吸附效率的影响;(d)吸附时间对吸附效率的影响;(e)动态解吸附与静态解吸附比较;(f)温度对解吸附效率的影响;(g)解吸附时间对解吸附效率的影响;(h)解吸液种类对解吸附效率的影响。
图9葡聚糖凝胶层析条件优化。(a)温度对葡聚糖凝胶Sephadex G-10吸附效果的影响;(b)pH对葡聚糖凝胶Sephadex G-10吸附效果的影响;(c)不同种类洗脱液的洗脱效果;(d)不同pH的洗脱效果;(e)不同时间收集液的麦角硫因含量分析。
图10液相色谱纯化麦角硫因。(a)麦角硫因标准品峰图;(b)色谱分离纯化后样品峰图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明所述方法可普遍使用酿酒酵母,为详述本发明,下面实施例以酿酒酵母S.cerevisiaeM0-EGT为例进行阐述。
实施例1:KNO3促进酵母工程菌M0-EGT积累麦角硫因
菌种活化:将从-80℃甘油保存的酿酒酵母工程菌接种到液体合成培养基中,30℃,180rpm活化16~24h;
液体培养:
①配制由组分a、b、c、d组成的合成培养基
维生素B10.4 mg/L、维生素B20.2 mg/L、维生素B30.4 mg/L、维生素B50.5mg/L、维生素B61 mg/L、维生素B70.2 mg/L、维生素B90.002 mg/L、肌醇2mg/L、无水葡萄糖20g、L-精氨酸0.5g、L-半胱氨酸0.07g、L-赖氨酸0.1g、L-苏氨酸0.1g、L-天冬氨酸0.3g、L-异亮氨酸0.4g、L-苯丙氨酸0.05g、L-脯氨酸0.1g、L-丝氨酸0.4g、L-酪氨酸0.05g、L-缬氨酸0.05g、L-甲硫氨酸0.5g、L-色氨酸0.5g、L-组氨酸1g、L-尿嘧啶0.1g、L-亮氨酸0.3g、腺嘌呤0.1g、L-谷氨酸0.04g、L-谷氨酰胺0.04g、L-甘氨酸0.2g、L-丙氨酸0.05g、L-天冬酰胺0.08g、硫酸铵15g、无水硫酸铜0.1mg、无水硫酸亚铁0.05mg、磷酸二氢钾1g、硼酸0.5mg、对氨基苯甲酸0.2mg、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.4mg、硫酸锌0.4mg、氯化铁0.2mg、氯化钙0.1g、碘化钾0.1mg、钼酸钠0.2mg、氯化钠0.1g、去离子水1L。
②将上述合成培养基加入到含有终浓度为0.1mol/L KNO3的锥形瓶中,而后接入活化的菌液,接种量为2%(v/v),30℃,180rpm培养72h。发酵过程中取样检测生物量、麦角硫因产量,并计算菌体的单位细胞生产能力。结果如图1所示,初始培养基中KNO3的添加,使发酵液中的麦角硫因含量得到了一定程度的提高(较对照组提高30.50%)。此外,KNO3的添加能够显著提高该菌株的麦角硫因生产能力。其中添加0.1mol/L的KNO3可以使麦角硫因的单位细胞产量增长31.90%。
发酵液中麦角硫因含量使用高效液相色谱进行检测。高效液相色谱Waterse2695,检测器为Waters 2998,紫外检测波长为254nm,色谱柱选用XCharge C185μm 4.6mm×250mm Column,柱温设定25℃,流动相条件为甲醇:0.1%甲酸(5:95),流速为0.8mL/min,进样量为10μL。
实施例2:组氨酸促进酵母工程菌M0-EGT积累麦角硫因
菌种活化:将从-80℃甘油保存的酿酒酵母工程菌接种到液体合成培养基中,30℃,180rpm活化24h;
液体培养:
①配制由组分a、b、c、d组成的合成培养基
本实施例与实施例1的区别在于,添加终浓度为0.1mol/L KNO3,且暂不添加组氨酸。
②加入到含有终浓度为1g/L组氨酸的锥形瓶中,而后接入活化的菌液,接种量为2%(v/v),30℃,180rpm培养72h。发酵过程中取样检测生物量、麦角硫因产量,并计算菌体的单位细胞生产能力。如图2所示,当向培养基中额外添加1g/L的组氨酸时,48h发酵液中的麦角硫因含量从11.11mg/L提高到20.75mg/L,同比增长86.72%。与对照组相比,向培养基中添加1g/L组氨酸可以使麦角硫因的单位细胞产量增长75.67%。
实施例3:维生素B5促进酵母工程菌M0-EGT积累麦角硫因
菌种活化:将从-80℃甘油保存的酿酒酵母工程菌接种到液体合成培养基中,30℃,180rpm活化24h;
液体培养:
①配制由组分a、b、c、d组成的合成培养基
本实施例与实施例1的区别在于,添加终浓度为0.1mol/L KNO3,且暂不添加维生素B5。
②加入到含有终浓度为0.1~1g/L维生素B5的锥形瓶中,而后接入活化的菌液,接种量为2%(v/v),30℃,180rpm培养72h。发酵过程中取样检测生物量、麦角硫因产量,并计算菌体的单位细胞生产能力。图3所示,当向培养基中添加1g/L的维生素B5时,发酵终点的生物量较对照组减少了16.04%,而当向培养基中添加较低浓度(0.1g/L或0.5g/L)的维生素B5时,发酵液中的麦角硫因浓度得到了小幅提升。低浓度维生素B5的添加提升了菌体的麦角硫因生产能力,其中向培养基中添加0.5g/L的维生素B5可以使麦角硫因的单位细胞产量增长17.64%。
实施例4:6-巯基嘌呤促进酵母工程菌M0-EGT积累麦角硫因
菌种活化:将从-80℃甘油保存的酿酒酵母工程菌接种到液体合成培养基中,30℃,180rpm活化24h;
液体培养:
①配制由组分a、b、c、d组成的合成培养基
本实施例与实施例1的区别在于,添加终浓度为0.1mol/L KNO3,且暂不添加6-巯基嘌呤。
②加入到含有终浓度为1g/L 6-巯基嘌呤的锥形瓶中,而后接入活化的菌液,接种量为2%(v/v),30℃,180rpm培养72h。发酵过程中取样检测生物量、麦角硫因产量,并计算菌体的单位细胞生产能力。图4所示,当向初始培养基中添加0.1g/L的6-巯基嘌呤时,发酵终点的生物量较对照组下降了15.46%,而其麦角硫因产量则未受到影响。结果表明,6-巯基嘌呤显著提高了菌体的麦角硫因生产能力,添加0.1g/L的6-巯基嘌呤可以使麦角硫因的单位细胞产量增长16.30%。
实施例5:Triton X-100促进酵母工程菌M0-EGT积累麦角硫因
菌种活化:将从-80℃甘油保存的酿酒酵母工程菌接种到液体合成培养基中,30℃,180rpm活化24h;
液体培养:
①配制由组分a、b、c、d组成的合成培养基
②加入到含有终浓度为0.1%~2%(v/v)Triton X-100的锥形瓶中,而后接入活化的菌液,接种量为2%(v/v),30℃,180rpm培养48h。发酵过程中取样检测生物量、麦角硫因产量,并计算菌体的单位细胞生产能力。图5所示,曲拉通X-100的添加极大程度地提高了发酵液中的麦角硫因含量,且可以显著提高菌株的麦角硫因生产能力,其中向培养基中添加2%的Triton X-100可以使麦角硫因的单位细胞产量增长207.49%。
实施例6:麦角硫因液体发酵(5-L发酵罐体系)
1)菌种活化:将从-80℃甘油保存的酿酒酵母工程菌接种到液体合成培养基中,30℃,180rpm活化24h;
2)种子培养:将活化的种子,按接种量2%(v/v)接种到液体合成培养基中,30℃培养24h;
3)5-L发酵罐发酵:将种子液接种到5-L发酵罐中,接种量为10%(v/v),培养条件为30℃,180rpm。发酵过程中取样检测生物量、麦角硫因产量,并计算菌体的单位细胞生产能力。如图6所示,与未优化培养基相比,使用优化后的培养基进行补料分批发酵可使288h麦角硫因的产量增加101.57%,延长发酵时间能使麦角硫因产量进一步提高。使用优化后培养基可以使菌体的比生产速率随时间的增加而呈现上升趋势,且比生产速率峰值相较使用未优化培养基提高了193.31%。补料分批发酵的结果表明,本实验所优化培养基可大幅度增加S.cerevisiae M0-EGT菌株的麦角硫因生产能力。
实施例7:离子交换层析分离麦角硫因
经过盐析脱色处理后(图7),本实验对离子交换层析分离条件进行了优化。将离子交换层析的实验条件设置为使用732阳离子交换树脂;动态吸附、吸附pH 2、吸附温度25℃、吸附时间2h;动态解吸附、解吸附温度25℃、解吸时间4h、解吸液为2mol/LNaOH。基于上述条件对麦角硫因发酵液进行离子交换层析吸附与解吸附条件优化(图8),基于最佳条件最终麦角硫因的得率为70.58%。
实施例8:凝胶柱层析分离麦角硫因
取10g葡聚糖凝胶Sephadex G-10,经预处理后装于16×200mm层析柱,将2mL的离子交换层析洗脱液沿着层析柱的管壁缓慢加入到凝胶床面上,实验优化结果如图9,控制实验吸附/解吸附温度25℃、吸附pH 10、并使用pH 4的40%乙醇进行洗脱。由图9(e)可知,麦角硫因洗脱组分主要存在于8-16号离心管内,收集该部分洗脱液后浓缩,计算回收率为81.27%。
实施例9:液相色谱分离麦角硫因
进行色谱纯化,所述色谱的条件为:高效液相色谱Waters e2695,检测器为Waters2998,紫外检测波长为254nm,色谱柱选用XCharge C185μm 4.6mm×250mm Column,柱温设定25℃,流动相条件为甲醇:0.1%甲酸(5:95),流速为0.8mL/min,进样量为100μL。麦角硫因的保留时间约为9.8min,收集这个时间段洗脱液,冷冻干燥后可得纯度为81.20%的麦角硫因干粉(图10)。
以上所述,仅为本发明创造较佳的具体实施方式,但本发明创造的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内,根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酿酒酵母工程菌高产麦角硫因的培养基,其特征在于,主要由葡萄糖、无机盐、维生素和氨基酸组成;其中
组分a:葡萄糖15~25g/L;
组分b:硫酸铵10~20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸铜0.1~0.2mg/L、氯化钙0.1g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸锰0.4mg/L、硫酸锌0.4mg/L、氯化铁0.2mg/L、硫酸亚铁0.01~0.1mg/L、硝酸钾10~12g/L、对氨基苯甲酸0.2mg/L、碘化钾0.1mg/L、钼酸钠0.2mg/L、硼酸0.5mg/L;
组分c:维生素B10.4mg/L、维生素B20.2 mg/L、维生素B30.4 mg/L、维生素B50.5~1g/L、维生素B61~2mg/L、维生素B70.1~1mg/L、维生素B90.002mg/L、肌醇2mg/L;
组分d:L-精氨酸0.3~0.7g/L、L-半胱氨酸0.05~0.1g/L、L-赖氨酸0.05~0.15g/L、L-苏氨酸0.05~0.15g/L、L-天冬氨酸0.2~0.4g/L、L-异亮氨酸0.2~0.6g/L、L-苯丙氨酸0.01~0.1g/L、L-脯氨酸0.05~0.15g/L、L-丝氨酸0.2~0.6g/L、L-酪氨酸0.01~0.1g/L、L-缬氨酸0.01~0.1g/L、L-甲硫氨酸0.3~0.7g/L、L-色氨酸0.3~0.7g/L、L-组氨酸1~2g/L、L-亮氨酸0.2~0.4g/L、L-谷氨酸0.01~0.1g/L、L-谷氨酰胺0.01~0.1g/L、L-甘氨酸0.1~0.3g/L、L-丙氨酸0.01~0.1g/L、L-天冬酰胺0.05~0.1g/L、L-尿嘧啶0.05~0.15g/L、腺嘌呤0.05~0.15g/L、6-巯基嘌呤1~1.5g/L。
2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,还包括非离子型表面活性剂Triton X-100或吐温80。
3.根据权利要求1所述的培养基的制备方法,其特征在于,其制备步骤如下:
SI-1以1L体积培养基计,将组分a、b、c分别溶于200mL水中,单独装于锥形瓶中,121℃条件灭菌20~30min;
SI-2将组分d溶于400mL水中,单独装于锥形瓶中,使用无菌的0.22μm滤膜过滤除菌;
SI-3将组分a、b、c、d混合,配制成合成培养基;
SI-4称取适量Triton X-100,于121℃条件灭菌20~30min后,将其加入SI-3配制的合成培养基中,制备含有Triton X-100的合成培养基,Triton X-100终浓度为0.1%~2%(v/v)。
4.权利要求1所述合成培养基在酿酒酵母发酵生产麦角硫因中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,以酿酒酵母为生产菌株,将其按2~10%(v/v)接种量接种至含有Triton X-100的液体合成培养基中,28-32℃,150-250rpm下培养48~72h,Triton X-100的添加量为0.1~2%(v/v)。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述方法包括:
1)菌种活化:将-80℃保存的酿酒酵母接种到液体合成培养基中,28-32℃,150-250rpm活化16-24h;
2)液体培养:配制由组分a、b、c、d组成的合成培养基,将终浓度为0.1~2%(v/v)Triton X-100加入上述合成培养基中,而后接入上述活化的种子液,接种量为2~10%(v/v),28-32℃,150-250rpm培养48~72h。
7.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,在酿酒酵母培养初始或中后期向合成培养基中添加0.1~2%(v/v)Triton X-100。
8.一种基于酿酒酵母发酵液制备麦角硫因的方法,其特征在于,制备方法包括:
SII-1发酵液的预处理;
SII-2盐析脱色素;
SII-3利用阳离子交换树脂进行离子交换层析;
取1~3份预处理的732阳离子交换树脂,向加入10~15份体积的SII-2收集的清液,在pH 2、20~30℃条件下进行动态吸附2~3h;随后,将吸附后的732阳离子交换树脂进行装柱解吸附,解吸温度25℃、解吸时间4~6h、解吸液为1~2mol/LNaOH;
SII-4利用葡聚糖凝胶进行凝胶柱层析;
SII-5液相色谱分离。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,SII-4具体步骤:
取葡聚糖凝胶Sephadex G-10,经预处理后装于16×200mm层析柱,将2份体积的离子交换层析洗脱液沿着层析柱的管壁缓慢加入到凝胶床面上,控制吸附/解吸附温度25℃、吸附pH 10、并使用pH 4~5的40%乙醇进行洗脱。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,SII-5具体步骤:
对洗脱液进行色谱纯化,所述色谱的条件为:高效液相色谱Waters e2695,检测器为Waters 2998,紫外检测波长为254nm,色谱柱选用XCharge C18色谱柱,柱温设定25℃,流动相条件为甲醇:0.1%甲酸(5:95),流速为0.8mL/min,进样量为100μL。
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