CN117757736A - 一种提高cd146+间充质干细胞促血管生成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于组织工程技术领域,提供了一种提高CD146+间充质干细胞促血管生成的方法:采用提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基培养CD146+间充质干细胞。所述培养基包括:IGF 500‑800pg/mL,TGF‑β1 100‑200pg/mL,PDGF‑AA 10‑50ng/mL,EGF 10‑50pg/mL,FGF2 50‑200pg/mL。本发明提供的提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基,可高效地用于体内、外成血管,方便、快捷且高效,有助于提升间充质干细胞在血管生成组织工程中的应用。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域,具体涉及一种提高CD146+间充质干细胞促血管生成能力的方法。
背景技术
公开该背景技术的信息旨在增加对本发明总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一种具有自我更新、多种分化潜能的干细胞。MSCs可在体外贴壁生长,并表达特异性表面抗原。在合适的体外分化条件下,MSCs细胞能够分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞以及跨胚层分化的能力,为临床治疗各种创伤提供细胞来源。
新生血管的生长是一个相当复杂和协调的过程,血管的形成与发展取决于血管生成促进因子和抑制因子的动态平衡,需要细胞与细胞、细胞与基质的相互作用,需要一系列的受体被激活,并由多种促血管生长因子和血管生成抑制因子调节。目前已发现VEGF、bFGF、IGF-1和血小板衍生生长因子(PDGF)等20多种促血管生长因子。MSCs可以通过旁分泌血管内皮生长因子(VEGF)等多种血管生成因子等对血管生成起作用;MSCs也通过旁分泌作用分泌大量的外泌体,许多再生能力已被证明归因于MSCs分泌的外泌体。Shabbir A.等报道(2015),来自MSCs的外泌体在体外以剂量依赖的方式诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成。Oswald J.等(2004)和Wang等(2018)的研究表明,MSCs在一定条件下向血管内皮细胞分化有助于血管生成。
CD146又称黑色素瘤细胞黏附分子(MCAM)或细胞表面糖蛋白MUC18。CD146是血管壁中普遍存在的基质分子,可在血管壁组分细胞中高表达,通过其胞内结构域对细胞外到细胞内的信号进行传导和交流,有助于局部黏连聚集、细胞骨架重组、维持细胞结构和调节细胞的功能。CD146分子可参与各种生物学过程,包括发育、信号转导、细胞迁移、间充质干细胞分化、血管生成和免疫应答。CD146分子是主要表达于内皮细胞的一种黏附分子,也在早期MSCs表面表达。王巧玲等(2020)研究发现,脐带、脂肪、骨髓3种组织来源的CD146+MSCs在经过内皮培养基诱导后,均可表达血管内皮相关刺激因子BFGF、VEGF、Ang-1和EGF。
现有技术中,主要提供了以干细胞为基础,经过诱导分化为内皮细胞的技术,如CN105002143A公开了一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法,该方法采用无饲养层细胞的培养体系,仅通过过表达FLI1相关基因和激活蛋白激酶C通路获得血管内皮样细胞。CN108410796A一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法,采用人内皮细胞株培养上清液培养人骨髓和皮肤间充质干细胞。CN109112094A公开了一种脂肪间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的方法,以诱导培养液培养脂肪间充质干细胞,诱导培养液包括H-DMEM、基于H-DMEM体积1%的正常人血清、50ng/mL的血管内皮细胞生长因子、15ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、10ng/mL的表皮细胞生长因子、以及终浓度为10μM的全反式维甲酸。然而以干细胞为基础诱导分化为血管内皮样细胞的诱导过程长,诱导更加困难,而且获得实体的血管组织诱导成本也高。利用干细胞促进内皮细胞或内皮祖细胞分化为血管内皮细胞进而获得血管类组织具有更简便的过程和更低的成本,在临床上也更加容易,但是具体的诱导条件尚无报道。
发明内容
针对现有技术中的问题,本发明提供一种提高CD146+间充质干细胞促血管生成能力的方法,操作简单,能高效地用于体外成血管,有助于提升间充质干细胞在在骨修复和血管生成组织工程中的应用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基,包括溶解于完全培养基的以下浓度的组分:
***(IGF) 500-800pg/mL,
转化生长因子-β1(TGF-β1) 100-200pg/mL,
血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA) 10-50ng/mL,
表皮细胞生长因子(EGF) 10-50pg/mL,
成纤维细胞生长因子2(FGF2) 50-200pg/mL。
在一些实施例中,上述培养基包括溶解于完全培养基的以下浓度的组分:
***(IGF) 600pg/mL,
转化生长因子-β1(TGF-β1) 150pg/mL,
血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA) 20ng/mL,
表皮细胞生长因子(EGF) 20pg/mL,
成纤维细胞生长因子2(FGF2) 100pg/mL。
所述完全培养基采用基础培养基至少添加血清或血清替代物配制而成,还可以添加抗生素;完全培养基可以采用本领域公知的方法配制获得,或者通过商业购买获得。所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、MEM培养基、IMDM培养基、Ham’s F-12K培养基、RPIM1640培养基。
一种促进血管生成的组合物,包括:
(a)CD146+间充质干细胞;和
(b)提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基。
上述组合物可制备成药剂并通过在靶标部位或静脉注射的方式促进血管生成。
上述组合物在使用浓度下细胞密度为1-2×107/mL,可根据实际注射用量调整组合物中细胞密度。
为了使组合物更好的促进血管生成,组合物中还包括基质胶。所述基质胶可提供三维生长环境,促进血管生成。培养基和基质胶的体积比为1:1-1:10。
一种促进CD146+间充质干细胞促血管生成的方法,包括以下步骤:采用上述提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基培养CD146+间充质干细胞。
一种CD146+间充质干细胞,采用上述提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基培养后获得。
上述CD146+间充质干细胞可用于制备药品,所述药品可用于促进血管生成。
一种CD146+间充质干细胞体外促进体外血管生成的方法,包括以下步骤:
(1)将CD146+间充质干细胞以提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基培养至少一代后,使用低血清含量的完全培养基预培养,收集预培养的CD146+间充质干细胞;
(2)将内皮细胞或内皮祖细胞使用低血清含量的完全培养基预培养,收集预培养的内皮细胞或内皮祖细胞;
(3)将提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基与基质胶混合,获得生长基质;
(4)将步骤(1)和(2)中的两种细胞在生长基质上共培养。
低血清含量的完全培养基中,血清为哺乳动物血清或血清替代物,在一些实施例中,为胎牛血清或人血清,其添加量为1%-2%。血清替代物的含量为0.5%-4%;均按照基础培养基的体积计算。
CD146+间充质干细胞和内皮细胞或内皮祖细胞的数量比为1:(5-10)。
培养基与基质胶的体积比为1:1-1:10。
为了提高上述方法中促进血管生成的速度,上述方法的步骤(4)中,还包括添加CD146+间充质干细胞培养上清液的步骤;所述培养上清液为提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基培养后的。
本发明具有以下优点:
本发明提供的提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基,可高效地用于体内、外成血管,方便、快捷且高效,有助于提升间充质干细胞在血管生成组织工程中的应用。
附图说明
图1是分选富集前后CD146+间充质干细胞的占比;
图2是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞的细胞形态;
图3是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞的表型检测;
图4是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞的成骨染色图片;
图5是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞的成脂染色图片;
图6是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞的成软骨染色图片;
图7是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞体外成血管能力比较,其中,a为空白组体外成血管分析结果;b为实施例组体外成血管分析结果;c为对照组体外成血管分析结果;d为网状数分析结果;e为交叉点数分析结果;
图8是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞血管生成相关基因mRNA表达量;
图9是不同培养基培养后CD146+间充质干细胞体内成血管能力比较,其中,a为空白组体内成血管栓塞图片;图b为实施例组体内成血管栓塞图片;图c为对照组体内成血管栓塞图片;图d为空白组体内成血管CD31-免疫组化检测结果;图e为实施例组体内成血管CD31-免疫组化检测结果;图f为对照组体内成血管CD31-免疫组化检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 CD146+间充质干细胞的培养
使用磁珠分选试剂盒从MSC中富集出CD146阳性的MSC细胞,并使用流式分析方法检测富集到的CD146+ MSC细胞的CD146的阳性比例,检测结果见图1,分选前CD146+比例仅为21.9%,富集后的比例可达74.5%。
1. 促血管生成培养基的配制及CD146+间充质干细胞的培养
将IGF配制成为1mg/mL的储存母液,TGF-β1配制成为1mg/mL的储存母液,PDGF-AA配制成为10mg/mL的储存母液,EGF配制成为1mg/mL的储存母液,FGF2配制成为1mg/mL的储存母液。
将量取上述母液加入含2%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基,获得促血管生成培养基,其细胞因子的含量如表1所示:
表1 不同促血管生成培养基中细胞因子的终浓度
将CD146+间充质干细胞以2×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中,细胞贴壁后更换为培养基1-4分别培养24小时后进行各项检测,以含2%FBS的DMEM培养基为对照。
2. CD146+间充质干细胞预处理后特性检测
(1)细胞形态
将CD146+间充质干细胞于显微镜下拍照观察细胞形态,如图2所示:其中,a为CD146+间充质干细胞的细胞形态;b为培养基3培养的CD146+间充质干细胞的细胞形态。通过形态观察发现,与正常培养的CD146+间充质干细胞相比,添加各培养基培养后的CD146+间充质干细胞均呈梭形纤维状,表明,添加不同促血管生成培养基后并不改变细胞形态,该培养基适于CD146+间充质干细胞的培养和生长。
(2)免疫学表型
将CD146+间充质干细胞制备成1×106/mL的单细胞悬液,使用PBS清洗一次后,使用流式细胞仪以CDllb、CD19、CD34、CD45、CD44、HLA-DR、CD73、CD90、CD105抗体检测培养后MSC表型情况,结果如图3所示:对照组MSCs和促血管生成培养基的阴性标志物CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR均表达阴性(≤2%),阳性标志物CD44、CD73、CD90、CD105均表达阳性(≥95%)。这表明,促血管生成培养基培养后的CD146+间充质干细胞的免疫学表型并无变化。
(3)三系分化能力
将CD146+间充质干细胞以2×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中,融合率达到80%以上后更换成骨或成脂诱导培养液,每周换液两次,成脂诱导培养14天,成骨诱导培养21天。用茜素红S对诱导的成骨细胞进行染色,使用油红O对诱导的成脂细胞进行染色并拍照。
将8×106个/mL CD146+间充质干细胞细胞滴到6孔板中,两个小时添加成软骨诱导培养液,每周换液一次,诱导培养21天,取软骨球放于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋后切片,进行番红O和阿利新蓝染色并拍照。
如图4-6结果显示,正常培养基和促血管生成培养基培养后的CD146+间充质干细胞使用成骨诱导培养基诱导培养后,均可检测到被茜素红S染为红色的钙结节,使用成脂诱导培养基诱导培养后,均可检测到被油红O染为红色的油脂滴,使用成软骨诱导培养基诱导培养后,番红O和阿利新蓝染色后均分别被染成红色和蓝色,表明促血管生成培养基处理后的CD146+间充质干细胞的分化能力并无明显变化。
应用例1 CD146+间充质干细胞的体外促血管生成
以HUVEC细胞为靶细胞验证CD146+间充质干细胞的体外促血管生成能力,按照以下进行实验分组:
具体操作步骤如下:
(1)按照实施例1培养基2的培养配制促血管生成培养基,以同样的配方仅添加200pg/mL FGF2作为对照培养基,将CD146+MSCs分别以上述两种培养基培养并传代3代,第4代贴壁后更换为含2%FBS的DMEM培养基继续培养24h后,收集培养上清液,分别获得试验组培养上清和对照组培养上清,以含2%FBS的DMEM培养基为空白组;
(2)按照试验分组将matrigel基质胶和相应培养基按照体积比1:1混合后铺96孔板,常温凝固后备用;
(3)对HUVEC细胞以含0.2%FBS的DMEM培养液,培养20小时进行饥饿处理;(4)将HUVEC及MSC细胞重悬在步骤(1)收集的培养上清或含2%FBS的DMEM培养基中,使HUVEC浓度为每毫升含3×106个细胞的单细胞悬液,使MSC浓度为每毫升含1×105个细胞的单细胞悬液;
(5)96孔板中每孔加入含待测样本的10μL HUVEC细胞悬液(含3×104个细胞)及10μL MSC细胞悬液(含1000个细胞),使用对应培养基补至100μL,构建成体外共培养***;37℃,5%CO2培养箱中培养4h时观察细胞血管腔形成情况,并拍照计算。
如图7-8所示,构建共培养体系检测血管生产作用后,和CD146+间充质干细胞结果对比,添加本组合物的CD146+间充质干细胞以及添加FGF2处理培养基的CD146+间充质干细胞均可以显著促进HUVEC在Matrigel中形成的网状数量及连接点数量,可以在mRNA水平上显著增强血管生成正相关基因Ang-1、Tie-2、Flk1的表达,显著抑制血管生成负相关基因vasohibin-1的表达。另外与添加FGF2处理培养基的CD146+间充质干细胞相比,添加本组合物的CD146+间充质干细胞也可显著促进HUVEC在Matrigel中形成的网状数量及连接点数量,显著增强血管生成正相关基因Ang-1、Tie-2、Flk1的表达。
应用例2 CD146+间充质干细胞的体内促血管生成
(1)按照实施例1培养基3的培养配制促血管生成培养基,以同样的配方仅添加FGF2作为对照培养基,将CD146+MSCs分别以上述两种培养基培养并传代3代,将第4代CD146+MSCs培养至融合率80%,收集细胞,使用PBS调节细胞密度至5×106/mL,备用;
(2)将6周龄雄性裸鼠,随机分组,每组6只,麻醉后,每只裸鼠取200μL细胞悬液(1×106/只)与200μL Matrigel基质胶以1:1比例混合后,使用1mL注射器植入到裸鼠背部皮下位置;
(3)每天观察小裸鼠的生活状态,21天后,脱颈处死小裸鼠后,去除皮肤组织取出皮下的血管塞,将血管塞放于4%多聚甲醛中固定并石蜡包埋后切片,进行CD31-免疫组化染色,然后扫片分析。
如图9所示,构建体内共培养体系检测血管生产作用后,和CD146+间充质干细胞结果对比,添加本组合物的CD146+间充质干细胞以及添加FGF2处理培养基的CD146+间充质干细胞组血管形成数量增加,且形成血管壁的内皮细胞数量增多。另外与添加FGF2处理培养基的CD146+间充质干细胞相比,添加本组合物的CD146+间充质干细胞组血管形成数量增加,且形成血管壁的内皮细胞数量增多。
Claims (10)
1.一种提高CD146+间充质干细胞促血管生成的培养基,其特征在于,包括溶解于完全培养基的以下浓度的组分:
***(IGF) 500-800pg/mL,
转化生长因子-β1(TGF-β1) 100-200pg/mL,
血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA) 10-50ng/mL,
表皮细胞生长因子(EGF) 10-50pg/mL,
成纤维细胞生长因子2(FGF2) 50-200pg/mL;
优选地,包括溶解于完全培养基的以下浓度的组分:
***(IGF) 600pg/mL,
转化生长因子-β1(TGF-β1) 150pg/mL,
血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA) 20ng/mL,
表皮细胞生长因子(EGF) 20pg/mL,
成纤维细胞生长因子2(FGF2) 100pg/mL。
2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述完全培养基采用基础培养基至少添加血清或血清替代物配制而成,还可以添加抗生素;
所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、MEM培养基、IMDM培养基、Ham’s F-12K培养基或RPIM1640培养基。
3.一种促进血管生成的组合物,其特征在于,包括:
(a)CD146+间充质干细胞;和
(b)权利要求1或2所述的培养基。
4.根据权利要求3所述的组合物,其特征在于,组合物中还包括基质胶;培养基和基质胶的体积比为1:1-1:10。
5.一种提高CD146+间充质干细胞促体外血管生成的方法,其特征在于,包括以下步骤:采用权利要求1或2所述的培养基培养CD146+间充质干细胞。
6.一种CD146+间充质干细胞,其特征在于,采用权利要求1或2所述的培养基培养后获得。
7.一种如权利要求3或4所述的组合物,或如权利要求6所述的CD146+间充质干细胞在制备促进血管生成药剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,组合物或CD146+间充质干细胞在使用浓度下细胞密度为1×105-2×107/mL。
9.一种如权利要求6所述的CD146+间充质干细胞体外促进血管生成的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将CD146+间充质干细胞以权利要求1或2所述的培养基培养至少一代后,使用低血清含量的完全培养基预培养,收集预培养的CD146+间充质干细胞;
(2)将内皮细胞或内皮祖细胞使用低血清含量的完全培养基预培养,收集预培养的内皮细胞或内皮祖细胞;
(3)将权利要求1或2所述的培养基与基质胶混合,获得生长基质;
(4)将步骤(1)和(2)中的两种细胞在生长基质上共培养。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,低血清含量的完全培养基中,血清为哺乳动物血清或血清替代物,如,为胎牛血清或人血清,其添加量为1%-2%;血清替代物的含量为0.5%-2%;均按照基础培养基的体积计算;
CD146+间充质干细胞和内皮细胞或内皮祖细胞的数量比为1:(5-10);
培养基与基质胶的体积比为1:1-1:10;
步骤(4)中,还包括添加CD146+间充质干细胞培养上清液的步骤;所述培养上清液为权利要求1或2所述的培养基培养CD146+间充质干细胞后的。
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