KR20180092523A - 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 분화 방법 - Google Patents
중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 분화 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 분화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 무혈청 배지 첨가제 조성물은 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화를 매우 효과적으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라 무혈청 배지에 첨가되어 그 효과를 발휘할 수 있기 때문에, 혈청-함유 배지가 갖는 생리학적 다변성, 보관 기간, 세포 특이성, 감염, 비용 등과 같은 문제점이 없어 세포치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 무혈청 배지 첨가제 조성물은 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화를 매우 효과적으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라 무혈청 배지에 첨가되어 그 효과를 발휘할 수 있기 때문에, 혈청-함유 배지가 갖는 생리학적 다변성, 보관 기간, 세포 특이성, 감염, 비용 등과 같은 문제점이 없어 세포치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물에 관한 것이다.
최근 고령화와 사회적 신체활동의 증가로 인해 연골이 손상되는 환자가 늘고 있으며, 손상된 연골을 회복시키는 기술의 개발이 필요한 실정이다. 하지만, 연골조직은 혈관이 없는 조직이고, 연골세포는 세포외기질(ECM)에 의해 이동성이 제한되기 때문에, 자연적 재생이 매우 어렵다.
현재 손상된 연골을 치료하는 방법 중 인공관절 치환술은 최근 그 기술이 발전하여 손상이 많은 연골의 경우, 인공관절 수술을 진행할 수 있고, 수술 성공시 통증이 사라지고 걷는 것이 자연스러워지는 장점이 있다. 또한 최소 침습 방식의 인공관절 수술 등으로 인공관절의 수명이 늘고 회복정도와 속도도 빨라지고 있다. 하지만, 여전히 인공관절수술은 환자에게 여러 가지 부담이 된다. 인공관절은 마모로 인한 수명이 정해져 있으며, 또한 관리 부족, 수술결과에 따라 수명이 달라진다. 그리고 수술이 잘못 되었을 경우, 세균 감염으로 인해 재수술이 필요하며, 일부 뼈의 절삭과정 동안에 부작용 및 합병증의 위험 부담이 존재한다. 따라서 세포를 이용한 근본적인 재생의료의 필요성이 꾸준히 제기되었으며, 환자 자신의 연골세포를 이용한 자가연골세포 이식술에서부터 타가유래 연골세포 이식법, 그리고 자가 및 타가 줄기세포를 연골세포로 분화시켜 치료제로 개발하는 연구가 계속 되어왔다.
한편, 중간엽 줄기세포는 성체줄기세포로서, 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암화나 윤리적인 문제를 극복할 수 있으며, 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하여 세포치료의 세포원으로서 주목을 받고 있다(Park JS et al. Biomaterials, 32(1), pp. 28-38, 2011, Shetty P et al. Asian J Transfus Sci, 4(1), pp. 14-24, 2010, 및 Kume S et al. J Bone Miner Res, 20(9), pp. 1647-58, 2005). 또한, 중간엽 줄기세포는 이식시에도 면역반응을 유발시키지 않기 때문에 세포치료의 효과적인 수단으로써 각광받고 있는 세포원이다. 하지만, 중간엽 줄기세포의 효율적인 분화 기술이 아직 확립되어 있지 않아, 실제 임상 및 산업적 이용에 커다란 한계점으로 인식되고 있다. 예들 들어, 관절연골 손상 치유를 위해서는 생체 내 및 실험실 내에서 줄기세포를 다량의 연골세포주로 분화시킬 수 있는 효율적 분화유도기술 개발은 필수적이다.
이러한 동물세포를 배양하기 위한 배지 개발은 20세기부터 동물유래의 혈청과 조직 추출액에 무기염류, 아미노산, 비타민 등을 첨가함으로써 시작되었으며, 혈청의 중요성이 특히 강조되어 왔다. 하지만, 혈청은 동물세포 배양에서 반드시 필요하지만. 여러 물질이 혼합된 복합산물이며, 미지의 성분이 함유되어 있다는 단점이 있다. 특히, 인간유래 세포를 배양할 경우, 동물유래 우태아 혈청(FBS)의 사용은 바이러스, 마이크로 플라즈마, 프라이온 등의 감염위험이 있기 때문에 안전성에 대한 지적이 계속 제기되어 왔다.
따라서, 인간의 질병 치료를 목적으로 하는 연골세포 분화를 위하여, 각종 바이러스 혹은 균에 노출 위험이 있는 동물유래의 혈청 성분이 배제되고, 안전성이 확보된 연골세포를 생산할 수 있는 무혈청 연골세포 분화용 배지의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포의 분화를 유도할 수 있는 무혈청 배지 첨가제를 개발하기 위해 노력을 기울인 결과, 특정 성장인자들이 조합된 첨가제를 무혈청 배지에 추가하여 중간엽 줄기세포를 배양하면, 연골세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 연골세포 증식 및 배양용 무혈청 배지 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포를 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2, BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 연골세포 증식 및 배양용 무혈청 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 중간엽 줄기세포를 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "BMP-2(bone morphogenetic proteins-2)" 란 골형성 성장인자로서, 골형성을 촉진하는 물질로 알려져 있으나 본 발명에서는 중간엽 줄기세포의 분화를 조절하는 물질로 사용된다. BMP들은 TGF-β (transforming growth factor-β) 슈퍼 패밀리에 속하는 신호전달계 단백질로서 초기 태생기 분화, 태생기 조직형성 및 성인 조직의 항상성 유지 등을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특히, 초기 태생기에서 BMP의 농도 차이는 배아의 등배 형성과정에서 축 형성에 결정적 작용을 한다. 또한, BMP의 활성화 억제는 태생기의 척추동물과 무척추동물의 신경형성에 필수적이다. 세포 외로 분비된 BMP들은 세포막의 Type I과 Type II 세린/쓰레오닌 키나제 (serine/threonine kinase) 수용체들에 결합하여 BMP 신호전달을 시작하게 된다. Type II 수용체는 Type I 수용체를 인산화시키고, 인산화된 Type I 수용체는 세포내의 기질인 Smad 단백질을 인산화시켜 세포 내의 신호전달이 이루어진다. 수용체에 의해 조절되는 Smad 단백질을 R-Smad (Receptor regulated Smad)라고 하며, Smad-1, 2, 3, 5 및 8 들이 R-Smad에 속한다. 이들은 세포 내의 파트너인 Co-Smad (Common partner Smad)인 Smad-4와 결합하여 세포핵 내로 이동하여 전사인자와 결합하여 목표 유전자들의 전사를 조절하는 역할을 한다(Yamamoto & Oelgeschlager, Naturwissenschaften, 2004; 91: 519-34).
본 발명의 일실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 배지에 사용되는 BMP-2의 농도는 0.1ng/ml~20ng/ml 이며, 바람직하게는 1ng/ml~15ng/ml 이며, 더 바람직하게는 5ng/ml~15ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10ng/ml 이다.
본 발명에서 상기 "TGF-β(Transforming growth factor beta)"란 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 세 가지 isoform을 포함하는 다기능성 사이토카인으로 본 발명에서는 TGF-β1 및 TGF-β3가 중간엽 줄기세포의 분화를 조절하는 물질로 사용이 된다. 활성화된 TGF-β는 다른 인자들과 복합체를 형성하여 세린/트레오닌 카이나제 복합체를 형성하고, TGF-β 수용체와 결합한다. TGF-β가 결합한 이후에, TGF-β 수용체-2 카이나제가 인산화되고 TGF-β수용체-1 카이나제를 활성화시켜 신호 전달체계가 활성화된다. 이러한 활성화는 다양한 하위 기질들과 조절 단백질들의 활성화를 유도하여 다양한 면역세포들의 분화, 화학주성, 증식 등을 조절하는 여러 타겟 유전자들의 발현을 유도한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 배지에 사용되는 TGF-β1 또는 TGF-β3의 농도는 0.1ng/ml~20ng/ml 이며, 바람직하게는 1ng/ml~15ng/ml 이며, 더 바람직하게는 5ng/ml~15ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10ng/ml 이다.
본 발명에서 상기 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)는 FGF2, FGF-β와 동일하게 사용되며, 섬유아세포 성장인자 패밀리에 속하는 단백질이다. 정상적인 조직에서 bFGF는 혈관벽의 기저막 및 내피하 세포외기질에 존재한다. 신호 펩타이드가 없는 한, bFGF는 막에 부착된 상태로 존재하게 된다. 정상 조직의 손상이 회복되는 과정이나 종양이 발달하는 과정에서 헤파린 설페이트-분해 효소의 작용에 의해 bFGF가 활성화되며, 이 과정에서 bFGF는 혈관의 신생 과정을 매개하는 것으로 추측되고 있다. 본 발명에서 상기 bFGF는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 조절물질로 사용이 되었으며, 본 발명의 배지 조성물에 필수적으로 포함이 되는 구성성분이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 배지에 사용되는 bFGF의 농도는 0.1ng/ml~20ng/ml 이며, 바람직하게는 1ng/ml~15ng/ml 이며, 더 바람직하게는 5ng/ml~15ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10ng/ml 이다.
본 발명에서 상기 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF)는 표피성장인자수용체에 결합하여 세포의 성장, 증식 및 분화를 촉진하는 성장인자로서, 본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키기 위한 조절물질로서 사용이 된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 배지에 사용되는 EGF의 농도는 0.1ng/ml~20ng/ml 이며, 바람직하게는 1ng/ml~15ng/ml 이며, 더 바람직하게는 5ng/ml~15ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10ng/ml 이다.
본 발명의 상기 무혈청 배지 첨가제 조성물에는 bFGF 및 EGF가 필수적으로 포함이 되며, 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자가 추가로 포함이 된다. 바람직하게는, 상기 성장인자들 중에서 BMP-2와 TGF-β3는 함께 포함이 되지는 않는다.
본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포는 근육골격 손상의 치료, 심장혈관계 질환에서 심장 기능의 개선 및 이식편대숙주질환(GVHD)의 중증도의 개선에 관한 치료 효과의 문헌에 의해 입증된 증거를 지니는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로서(Le Blanc and Pittenger, 2005), 인간을 포함한 포유동물 유래의 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포에서 분리되며, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 세포형태(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포 등)로 분화가 가능한 세포를 의미한다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대, 제대혈, 태반, 활액막, 골막 및 연골막으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 지방, 골수 또는 제대혈로부터 유래된 것일 수 있고, 더 바람직하게는 지방 또는 골수, 가장 바람직하게는 지방에서 유래된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 연골 세포로의 분화 유도를 위해 사용되는 중간엽 줄기세포를 얻기 위한 골수, 지방, 제대혈 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 지방, 제대혈 등은 중배엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이거나 타인 유래의 것일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포는 CD44 및 CD90을 발현하고, CD34, CD45 및 HLA-DR을 발현하지 않는 줄기세포인 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 연골세포는 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골 세포 또는 연골 세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다. 본 발명의 첨가제 조성물이 포함된 무혈청 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포는 연골화(chondrogenesis)와 관련된 특이적 마커의 발현을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 연골세포는 이러한 특이적 마커의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 특이적 마커는 이에 제한되는 것은 아니나, 파이브로넥틴(fibronectin), β1-인테그린(β1-integrin), α5-인테그린(α5-integrin), N-카데린(N-cadherin) 및 콜라겐 타입 2(collagen type 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 배지란 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 특히, 본 발명에서의 상기 배지는 중간엽 줄기세포의 분화를 유도하기 위한 배지이다.
당업계에서 공지된 기본배지 조성물에 본 발명의 상기 첨가제 조성물을 첨가함으로써 연골세포 분화용 무혈청 배지가 제조될 수 있다. 상기 기본배지란 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 중간엽 줄기세포 성장인자를 제외한 혼합물이다.
바람직하게는, 상기 기본배지는 그 구성성분과 함량이 명확하게 확인된 화학적으로 규명된 배지(chemically defined medium)일 수 있다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 구매 가능한 화학적으로 규명된 배지(chemically defined medium)를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 첨가제 조성물이 포함된 무혈청 배지는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 효과를 나타내며, 동물-유래 또는 인간-유래의 혈청이 전혀 포함되지 않은 무혈청 배지라는 것이 가장 큰 특징이다. 혈청은 동물세포 배양에서 반드시 필요하지만, 여러 물질이 혼합된 복합산물이며, 미지의 성분이 함유되어 있다는 단점이 있고 특히, 인간유래 세포를 배양할 경우, 동물유래 우태아 혈청(FBS)의 사용은 바이러스, 마이크로 플라즈마, 프라이온 등의 감염위험이 있기 때문에 안전성에 대한 지적이 계속 제기되어 왔다. 그러나, 본 발명의 첨가제 조성물은 혈청이 포함되지 않은 배지 조성물에 첨가되어 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화 유도할 수 있다. 이러한 무혈청 배지 첨가제 조성물의 개발은 매우 획기적인 것으로서, 혈청-함유 배지가 갖는 다양한 문제점, 예컨대, 생리학적 다변성, 보관 기간, 세포 특이성, 감염, 비용 및 성장 억제제의 영향(Freshney, 2000)과 같은 여러 문제점에서 벗어날 수 있으며, 특히 세포치료제의 허가를 받는데 있어서 매우 유리하다.
본 발명의 상기 무혈청 배지 첨가제 조성물은 상기 성장인자들 이외에 아스코르베이트, 프롤린, 인슐린, 트랜스페린, 아셀레늄산(selenious acid), 알부민, 인지질 및 덱사메타손으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 무혈청 배지 첨가제 조성물이 포함된 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양해 본 결과, 통상적인 분화 유도용 배지와 유사한 정도로 연골세포로의 분화가 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 무혈청 배지 첨가제 조성물이 포함된 배지는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 뿐만 아니라, 분화된 연골세포를 배양하고 증식시키는 효과 또한 통상적인 혈청 함유 배양 배지와 유사한 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 연골세포 증식 및 배양용 무혈청 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
상기 각각의 성장인자, 중간엽 줄기세포, 연골세포 및 배지에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한 중간엽 줄기세포를 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법은 당업계에서 공지된 세포 배양방법은 제한 없이 이용될 수 있으며, 특히 공지의 3차원 배양방법을 이용할 수 있다. 현재까지 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 3차원 배양방법으로는 펠렛(pellet) 배양과 알지네이트 비드 및 알지네이트 층 배양이 주로 이용되고 있다. 특히, 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이고, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있어서 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포를 본 발명의 첨가제 조성물이 포함된 무혈청 배지를 이용하여 3주간 배양한 결과, 효과적으로 연골세포로 분화가 되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 단계의 배양기간은 바람직하게는 1주 내지 4주, 더 바람직하게는 2주 내지 4주, 가장 바람직하게는 3주일 수 있다.
본 발명의 상기 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법은 분화된 세포가 연골세포인지 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 배양중인 세포가 충분히 연골세포로 분화되는 시기까지 배양기간을 조절할 수 있다.
분화된 세포가 연골세포인지는 연골세포 특이적인 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 확인하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 연골세포에 특이적인 단백질은 파이브로넥틴(fibronectin), β1-인테그린(β1-integrin), α5-인테그린(α5-integrin), N-카데린(N-cadherin) 또는 콜라겐 타입 2(collagen type 2)일 수 있다.
특이적인 유전자의 mRNA 수준에서의 발현 여부는 mRNA를 확인하기 위한 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 판별할 수 있다.
또한 특이적인 유전자의 단백질 수준에서의 발현 여부는 단백질을 확인하기 위한 당업계에 공지된 방법은 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법 (FACS) 또는 단백질 칩을 이용하여 판별할 수 있다.
본 발명의 무혈청 배지 첨가제 조성물은 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화를 매우 효과적으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라 무혈청 배지에 첨가되어 그 효과를 발휘할 수 있기 때문에, 혈청-함유 배지가 갖는 생리학적 다변성, 보관 기간, 세포 특이성, 감염, 비용 등과 같은 문제점이 없어 세포치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 지방조직으로부터 분리한 세포가 중간엽 줄기세포인지 여부를 확인하기 위하여 줄기세포 양성 항원인 CD44 및 CD90, 그리고 줄기세포 음성 항원인 CD34, CD45 및 HLA-DR 마커를 유세포분석기(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 2는 중간엽 줄기세포로부터 연골분화를 위한 무혈청 배지 조건을 확립하기 위하여 3차원 연골 팰랫을 제조하고 양성대조군, 음성대조군 및 실험군 포함 총 10가지 조성의 배지를 처리하여 중간엽 줄기세포를 3주간 배양한 후 최종적으로 형성된 3차원 연골을 관찰한 도면이다.
도 3은 중간엽 줄기세포를 3차원 배양 조건에서 각각의 배지를 처리하여 연골세포로 분화시켰을 때, 연골 분화 마커인 collagen type 2의 발현 여부를 qRT-PCR을 통해 검증한 결과이다.
도 2는 중간엽 줄기세포로부터 연골분화를 위한 무혈청 배지 조건을 확립하기 위하여 3차원 연골 팰랫을 제조하고 양성대조군, 음성대조군 및 실험군 포함 총 10가지 조성의 배지를 처리하여 중간엽 줄기세포를 3주간 배양한 후 최종적으로 형성된 3차원 연골을 관찰한 도면이다.
도 3은 중간엽 줄기세포를 3차원 배양 조건에서 각각의 배지를 처리하여 연골세포로 분화시켰을 때, 연골 분화 마커인 collagen type 2의 발현 여부를 qRT-PCR을 통해 검증한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 중간엽 줄기세포의 추출, 배양 그리고 줄기세포능 검증
지방조직을 수술용 메스로 잘게 자른 후, 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 3회 세척하였다. 이어서 잘게 자른 지방조직을 50ml conical tube에 옮겨 담은 후, 인산완충식염수를 채워 충분히 흔들어 준 후, 원심분리 하였다. Soup을 따라 버린 후, 0.2% collagenase가 포함된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)를 50ml까지 채운 후, 37℃에서 90분간 반응 시켰다. 2000rpm속도로 10분간 원심분리 한 후, 상층에 뜬 분해되지 않은 지방조직을 제거한 후, 일반 DMEM으로 세척 및 원심분리, 제거 작업을 반복하였다.
분리된 지방유래 줄기세포는 무혈청 줄기세포 배양 배지 (chemically defined media)를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여 증식시켰다. 또한 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 DMEM을 사용하여 증식시킬 수도 있다. 증식된 중간엽 줄기세포는 유세포분석기 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 사용하여 줄기세포 양성 항원인 CD44와 CD90 그리고 줄기세포 음성 항원인 CD34, CD45, 그리고 HLA-DR의 마커를 분석함으로써 중간엽 줄기세포임을 검증하였다.
상기 줄기세포의 검증 결과는 각각 도 1을 통해 입증되었으며, 실험에 활용된 줄기세포는 기존에 보고된 바와 같은 정상적인 줄기세포임을 확인하였다.
실시예 2. 중간엽 줄기세포로부터 3차원 연골세포 분화 검증
중간엽 줄기세포로부터 3차원 연골세포 분화를 위하여, 2 x 105개의 중간엽 줄기세포를 15 ml 폴리프로필렌 튜브에 넣고 1000rpm에서 1분간 원심분리한 다음, 폴리프로필렌 튜브 아래에 부착된 중간엽 줄기세포 팰렛을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하여 3차원 중간엽 줄기세포 팰랫을 제작하였다.
이때, 각각의 연골분화 배양액을 넣은 후, 이를 3주간 연골분화 시켰다. 각각의 연골분화 미디어는 2 일 간격으로 교체해 주었고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하며, 양성 대조군에 쓰이는 연골형성배지는 50 ug/ml 아스코베이트-2-포스페이트, 100 nM 덱사메타손, 1% ITS, 10 ng/ml TGF-beta1 이 포함된 배지를 사용하였다. 또한 실험군으로는 bFGF 와 EGF를 포함하며, BMP-2, TGF-β1, 또는 TGF-β3중 하나를 포함하는 것과 두 개 이상을 포함하는 것을 비교그룹으로 검증하였으며, 음성대조군 또한 설정하였다. 각각의 실험군에 사용된 배지의 조성은 하기 표 1에 나타내었다:
상기 표에서 기본배지는 DMEM 배지를 사용하였으며, 각각의 성장인자들은 모두 10ng/ml의 농도가 되도록 배지에 첨가하였다.
최종적으로 상기와 같이 세포를 배양하고 3주 후, 생성된 3차원 연골조직체는 도 2 에서와 같이 배열되었다.
실시예
3. Real time
PCR을
통한 연골 분화 검증
각 그룹을 통해 연골분화된 팰랫의 연골 분화 정도를 비교 검증하기 위해서 상기 실시예 2에서 분화된 연골세포에서 연골분화 마커의 발현 정도를 Real time PCR을 통해 분석하였다. 연골세포 관련 마커 유전자로서 Collagen type 2를 사용하였고, 하우스키핑 유전자로서 GAPDH를 사용하여 함께 분석하였다.
상기 Real Time-PCR은 다음과 같이 수행하였다. 즉, 각 그룹에서 얻어진 팰랫을 액체질소를 이용하여 얼린 후, 트리졸(TRIzol, Life Technologies, Inc. Grand Island, NY) 방법을 통하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 1 ㎍으로 cDNA를 만들고, Real-time PCR을 이용하여 유전자 발현의 변화를 측정하였다. 상기 Real Time-PCR에 사용된 프라이머 세트 및 각각의 분화 마커는 다음 표 2와 같다.
상기와 같이 Real time PCR을 수행한 결과는 도 3과 같다. 연골분화를 수행한 상태에서, 연골 분화 지표 마커인 collagen type 2의 발현이 bFGF 와 EGF를 포함하며, BMP-2, TGF-β1, 또는 TGF-β3중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 그룹 CD1012-2~4번에서 기존 혈청기반 미디어(양성대조군)와 유사할 정도로 연골분화가 진행되는 것을 관찰할 수 있었으며, 보다 상세하게는 TGF-β3가 추가된 그룹(CD1012-4번)에서 연골 분화가 가장 효율적으로 나타났다.
흥미롭게도, 도 3의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이 BMP-2, TGF-β1 또는 TGF-β3 각각의 성장인자들은 배지에 동일한 양으로 첨가가 되었음에도 불구하고, 이들 세 가지 성장인자들 중에서 두 가지 이상이 함께 포함된 배지에서는 어느 한 가지 성장인자만 포함된 배지보다도 연골분화 효율이 낮게 나타났다. 이는, 상기 세 가지 성장인자들 각각이 연골세포로의 분화를 유도하는 신호전달체계가 다른 성장인자에 의해 간섭 받았기 때문인 것으로 추측해 볼 수 있었다.
본 발명의 무혈청 배지 첨가제 조성물은 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화를 매우 효과적으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라 무혈청 배지에 첨가되어 그 효과를 발휘할 수 있기 때문에, 혈청-함유 배지가 갖는 생리학적 다변성, 보관 기간, 세포 특이성, 감염, 비용 등과 같은 문제점이 없어 세포치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
<110> ABION Inc.
<120> Serum-free medium additive composition and method for inducing
chondrogenesis of mesenchymal stem cells
<130> NP17-0012
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Collagen type 2 primer forward
<400> 1
ttcagctatg gagatgacaa tc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Collagen type 2 primer reverse
<400> 2
agagtcctag agtgactgag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH primer forward
<400> 3
cggatttggt cgtattgggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH primer reverse
<400> 4
cagggatgat gttctggaga 20
Claims (6)
- 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자, 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대, 제대혈, 태반, 활액막, 골막 및 연골막으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에서 유래된 것을 특징으로 하는 무혈청 배지 첨가제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아스코르베이트, 프롤린, 인슐린, 트랜스페린, 아셀레늄산(selenious acid), 알부민, 인지질 및 덱사메타손으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 배지 첨가제 조성물.
- 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2,BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는, 연골세포 증식 및 배양용 무혈청 배지 첨가제 조성물.
- 중간엽 줄기세포를 골형성 유도 성장인자 (bone morphogenic protein-2, BMP-2), 형질전환 성장인자-베타1 (tansforming growth factor-β1, TGF-β1) 및 형질전환 성장인자-베타3 (tansforming growth factor-β3, TGF-β3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자와 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계는 1주 내지 4주간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR (1) | KR20180092523A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023163559A1 (ko) * | 2022-02-25 | 2023-08-31 | 주식회사 강스템바이오텍 | 무혈청배지를 이용한 줄기세포 배양 방법 |
-
2017
- 2017-02-09 KR KR1020170018308A patent/KR20180092523A/ko not_active Application Discontinuation
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|---|---|---|---|---|
| WO2023163559A1 (ko) * | 2022-02-25 | 2023-08-31 | 주식회사 강스템바이오텍 | 무혈청배지를 이용한 줄기세포 배양 방법 |
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