CN117752824A

CN117752824A - 预靶向肿瘤免疫探针、生物正交制剂、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN117752824A
Application number: CN202410190108.5A
Authority: CN
Inventors: 史旭东; 汤懿斯; 高苒; 朱瑞敏; 马铖延
Original assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Current assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Priority date: 2024-02-21
Filing date: 2024-02-21
Publication date: 2024-03-26

Abstract

本发明提供了预靶向肿瘤免疫探针、生物正交制剂、试剂盒及应用，属于PET探针技术领域。本发明提供的预靶向肿瘤免疫探针，为标记有放射性核素的NOTA‑瑞珀酸酐，所述NOTA‑瑞珀酸酐具有式I所示结构。本发明提供的预靶向肿瘤免疫探针可以基于四嗪‑瑞珀酸酐生物正交反应体系构建PD‑1/PD‑L1靶向的PET探针，可实现肿瘤的特异性显像，同时可评估肿瘤中PD‑1/PD‑L1表达水平。式I。

Description

预靶向肿瘤免疫探针、生物正交制剂、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及PET探针技术领域，尤其涉及预靶向肿瘤免疫探针、生物正交制剂、试剂盒及应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗是目前最有前景的肿瘤治疗方案之一，与传统化学治疗的作用机制不同，免疫治疗作用于人体的免疫***，诱导调节机体对肿瘤的免疫应答，监控并杀伤肿瘤细胞。肿瘤组织微环境中程序性死亡因子1（programmed cell death-1，PD-1）及其配体（programmed cell death ligand-1，PD-L1）结合形成的免疫检查点可抑制肿瘤免疫应答和产生免疫耐受，促使肿瘤发生免疫逃逸。因此阻断PD-1/PD-L1信号通路可以活化效应T细胞和抑制肿瘤免疫逃逸，从而增强机体抗肿瘤免疫应答。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂已应用于多种类型肿瘤治疗，但由于PD-1/PD-L1的表达水平存在个体差异，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂仅对10~30%的实体瘤患者有效。因此对患者肿瘤微环境中PD-1/PD-L1表达水平的评估具有重要临床意义，可对肿瘤患者免疫治疗响应进行预测，作为患者是否适合PD-1/PD-L1免疫治疗的筛选手段。

目前对PD-1/PD-L1表达水平的评估尚无标准检测手段，主要是通过免疫组化检验、循环肿瘤细胞或相关生物标志物血检等侵入性方法。由于肿瘤异质性及PD-1/PD-L1表达水平的定量难以标准化等因素，现阶段PD-1/PD-L1的评估往往需要结合多种检测手段，才可以实现全面动态监测。而目前基于组织活检的疗效预测手段存在预测准确性差、侵入性强、无法多次取样等问题。免疫PET技术将PET显像的高灵敏度和抗体的高特异性相结合，类似于在活体中进行精准的免疫组化染色，以非侵入性的方式揭示肿瘤患者体内肿瘤标志物的表达水平，并且可实现长期动态可视化监测，有助于肿瘤患者免疫治疗方案的筛选和制定。肿瘤的免疫治疗也可受益于免疫PET影像技术，免疫PET技术可以将免疫检查点在体内的表达实现可视化并进行定量评估，在早期即可筛选出可能从PD-1/PD-L1免疫治疗中获益的患者，并可以实现对治疗效果的实时监测。目前已有Zr-89、I-124等长半衰期核素标记PD-1/PD-L1靶向单克隆抗体构建的靶向PET探针用于评估肿瘤中PD-1/PD-L1的表达水平。长半衰期核素标记的靶向PET探针与单克隆抗体在体内的药代动力学性质匹配，最佳显像时间点为探针注射进入体内后大概一周的时间。在获取高对比度和高特异性的图像的同时，探针在体内较长的循环半衰期对生物体非靶器官造成较高的辐射损伤。

生物正交化学（Bioorthogonal chemistry）体系广泛应用于蛋白质标记和分子影像等领域，具有快速、高选择性和高亲和力等优点，能够在活体细胞发生并且不影响生物体自身生物化学过程，已经成为预靶向显像的重要手段。生物正交化学体系的建立是将可以进行特异性结合的两个功能分子通过化学修饰的手段分别标记在功能性生物大分子（蛋白、抗体、纳米粒子等）和报告分子（荧光基团、放射性核素等）上，然后利用标记报告分子的特征（荧光、放射性等）监测被标记功能性生物大分子在细胞或活体内的实时状态。基于生物正交化学的免疫PET影像技术的研究受到广泛关注，短半衰期核素如F-18、Ga-68、Cu-64等标记的基于生物正交化学的预靶向免疫PET影像探针，可以实现对抗体的体内标记和实时的功能监测，且对生物体产生的辐射损伤明显低于长半衰期核素直接标记抗体的PET探针。

目前生物正交化学反应体系主要有无催化剂的四嗪（tetrazine）-桥环烯烃的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应（inverse electron demand Diels-Alder reaction，IED-DAR）、金属催化的叠氮-炔键点击化学体系等，其中基于四嗪和反式环辛烯（TCO）的IED-DAR反应是当前应用较为广泛的一种生物正交化学反应。然而反式环辛烯立体构象不稳定，会影响与四嗪在体内的结合效果，且目前将生物正交化学反应体系进行预靶向免疫PET显像进而用于评估肿瘤中PD-1/PD-L1表达水平的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供预靶向肿瘤免疫探针、生物正交制剂、试剂盒及应用，本发明提供的预靶向肿瘤免疫探针可以基于四嗪-瑞珀酸酐生物正交反应体系构建PD-1/PD-L1靶向的PET探针，可实现肿瘤的特异性显像，同时可评估肿瘤中PD-1/PD-L1表达水平。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种预靶向肿瘤免疫探针，为标记有放射性核素的NOTA-瑞珀酸酐，所述NOTA-瑞珀酸酐具有式I所示结构：

式I。

本发明提供了一种生物正交制剂，包括分装的单抗-四嗪偶联物与PET显像探针；所述单抗-四嗪偶联物中单抗为PD-1单克隆抗体抑制剂或PD-L1单克隆抗体抑制剂；所述PET显像探针为标记有放射性核素的NOTA-瑞珀酸酐，所述NOTA-瑞珀酸酐具有式II所示结构：

式II；

式II中R为，n=0~4。

优选地，所述PD-1单克隆抗体抑制剂为纳武利尤单抗或帕博利珠单抗。

优选地，所述PD-L1单克隆抗体抑制剂为阿特珠单抗或德瓦鲁单抗。

优选地，所述放射性核素包括¹⁸F、⁶⁸Ga或⁶⁴Cu。

本发明提供了上述技术方案所述预靶向肿瘤免疫探针或上述技术方案所述生物正交制剂在制备肿瘤微环境中PD-1或PD-L1表达水平检测试剂中的应用。

本发明提供了上述技术方案所述预靶向肿瘤免疫探针或上述技术方案所述生物正交制剂在制备用于检测肿瘤微环境中PD-1或PD-L1表达水平的PET显像剂中的应用。

优选地，所述肿瘤包括人脑胶质瘤、结直肠癌、卵巢癌或非小细胞肺癌。

本发明提供了一种检测肿瘤微环境中PD-1或PD-L1表达水平的试剂盒，包括分装的单抗-四嗪偶联物与PET显像探针；所述单抗-四嗪偶联物中单抗为PD-1单克隆抗体抑制剂或PD-L1单克隆抗体抑制剂；所述PET显像探针为标记有放射性核素的NOTA-瑞珀酸酐，所述NOTA-瑞珀酸酐具有式II所示结构：

式II；

式II中R为，n=0~4。

优选地，所述单抗-四嗪偶联物的给药剂量为0.5~2mg/kg，所述PET显像探针的给药剂量为37~74MBq/kg。

有益效果：本发明提供的预靶向肿瘤免疫探针可以基于四嗪-瑞珀酸酐生物正交反应体系构建PD-1/PD-L1靶向的PET探针，可实现肿瘤的特异性显像，同时可评估肿瘤中PD-1/PD-L1表达水平。具体来说，瑞珀酸酐作为一种新型桥环烯烃，相比较四嗪-环辛烯生物正交反应体系，瑞珀酸酐具有更高的立体构象稳定性，与四嗪具有更高的反应速率，是更为理想的构建生物正交化学反应的功能分子。其中引入长链PEG（n=4）的探针可实现更长的体内循环半衰期，同时减少与抗体表面已偶联的四嗪的反应空间位阻，从而更好的识别抗体。

附图说明

图1为实施例1中制备单抗-四嗪偶联物与[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐的反应路线图；

图2为NOTA-瑞珀酸酐的MALDI-TOF MS图；

图3为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐的放化纯度测试图；

图4为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐在FBS和PBS中的稳定性测试结果图；

图5为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐与NOTA-瑞珀酸酐的细胞毒性测试结果图；

图6为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐在BALB/c正常小鼠中的代谢分布图；

图7为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐在BALB/c正常小鼠中的代谢分布图（PET/CT图像）；

图8为德瓦鲁单抗在胶质瘤PDX模型中预靶向免疫PET显像的PET/CT图像；

图9为实施例2中制备[¹⁸F]AlF-NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐的反应路线图；

图10为NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐的MALDI-TOF MS图；

图11为[¹⁸F]AlF-NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐在HSA中的稳定性测试结果图；

图12为德瓦鲁单抗在A549非小细胞肺癌模型中预靶向免疫PET显像的PET/CT图像。

具体实施方式

式I。

在本发明中，所述NOTA-瑞珀酸酐的制备方法以及将其进一步标记放射性核素制备目标探针的方法后文会详细说明。在本发明中，所述放射性核素优选包括¹⁸F、⁶⁸Ga或⁶⁴Cu，更优选为¹⁸F。

式II；

式II中R为，n=0~4。

在本发明中，所述n=0、1、2、3或4，优选为0或4。在本发明中，所述PD-1单克隆抗体抑制剂优选为纳武利尤单抗或帕博利珠单抗；所述PD-L1单克隆抗体抑制剂优选为阿特珠单抗或德瓦鲁单抗，更优选为德瓦鲁单抗。在本发明中，所述放射性核素优选包括¹⁸F、⁶⁸Ga或⁶⁴Cu，更优选为¹⁸F。

在本发明中，所述单抗-四嗪偶联物的制备方法优选包括以下步骤：

将四嗪-羧酸衍生物、1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与第一有机溶剂混合，进行活化处理，得到含四嗪-琥珀酰亚胺酯的产物体系；

将所述含四嗪-琥珀酰亚胺酯的产物体系与单抗溶液混合，进行偶联反应，得到所述单抗-四嗪偶联物；

在本发明中，所述四嗪-羧酸衍生物的结构式如下所示：

。

本发明将四嗪-羧酸衍生物、1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与第一有机溶剂混合，进行活化处理，得到含四嗪-琥珀酰亚胺酯的产物体系。在本发明中，所述四嗪-羧酸衍生物、1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比优选为1：1.8~2.2：1.8~2.2，更优选为1：2：2；所述第一有机溶剂优选为乙腈，本发明对所述乙腈的用量没有特殊限定，保证活化处理顺利进行即可。在本发明中，所述活化处理的温度优选为15~35℃，更优选为室温，在本发明的实施例中，所述室温具体为25℃；所述活化处理的时间优选为1.5~2.5h，更优选为2h。

所述活化处理后，本发明无需进行任何后处理，直接将所得含四嗪-琥珀酰亚胺酯的产物体系与单抗溶液混合，进行偶联反应，得到所述单抗-四嗪偶联物。在本发明中，所述单抗溶液中单抗与四嗪-琥珀酰亚胺酯的摩尔比优选为1：8~12，更优选为1：10；所述单抗溶液的溶剂优选为第二有机溶剂，所述第二有机溶剂优选为二甲基亚砜（DMSO），本发明对所述第二有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证偶联反应顺利进行即可。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为2~6℃，更优选为4℃；时间优选为2.5~3.5h，更优选为3h。所述偶联反应后，本发明优选将所得产物体系采用PD-10柱进行纯化（所用流动相优选为PBS缓冲液），得到所述单抗-四嗪偶联物。

在本发明中，具有式II所示结构的NOTA-瑞珀酸酐的制备方法，优选包括以下步骤：

将N-Boc保护的瑞珀酸酐衍生物、三氟乙酸水溶液与第三有机溶剂混合，进行脱保护基反应，得到氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐；

将所述氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐、双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA、碱试剂与第四有机溶剂混合，进行取代反应，得到具有式II所示结构的NOTA-瑞珀酸酐；

所述N-Boc保护的瑞珀酸酐衍生物的结构式如下所示：

；

所述N-Boc保护的瑞珀酸酐衍生物的结构式中R如式II中所定义。

本发明将N-Boc保护的瑞珀酸酐衍生物、三氟乙酸水溶液与第三有机溶剂混合，进行脱保护基反应，得到氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐。在本发明中，所述三氟乙酸水溶液的浓度优选为15~25wt%，更优选为20wt%；所述N-Boc保护的瑞珀酸酐衍生物与三氟乙酸水溶液的用量比优选为0.03mmol：0.4~0.6mL，更优选为0.03mmol：0.5mL；所述第三有机溶剂优选为甲醇，更优选为无水甲醇，本发明对所述第三有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证反应顺利进行即可。在本发明中，所述脱保护基反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为3.5~4.5h，更优选为4h。所述脱保护基反应后，本发明优选将所得产物体系进行旋蒸以去除溶剂，得到氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐。

得到氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐后，本发明将所述氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐、双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA、碱试剂与第四有机溶剂混合，进行取代反应，得到具有式II所示结构的NOTA-瑞珀酸酐。在本发明中，所述氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐与双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA的摩尔比优选为1：0.8~1.2，更优选为1：1；本发明所述第四有机溶剂优选为乙腈，本发明对所述第四有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证反应顺利进行即可；本发明所述碱试剂优选为三乙胺，所述三乙胺的用量优选以使体系pH值为8.8~9.5为基准，更优选以使体系pH值为9为基准。在本发明中，所述取代反应的温度优选为15~35℃，更优选为室温；时间优选为0.5~1.5h，更优选为1h。所述取代反应后，本发明优选将所得产物体系进行旋蒸以去除溶剂，得到粗产物；将所述粗产物进行纯化，得到所述具有式II所示结构的NOTA-瑞珀酸酐。本发明优选根据目标产物具体结构选择合适的纯化方法。具体的，当R中n=0时，本发明优选将所述粗产物采用硅胶柱进行纯化，按体积比计，所用流动相优选为甲醇：二氯甲烷=4：1）。当R中n=4时（也即为具有式I所示结构的NOTA-瑞珀酸酐），本发明优选将所述粗产物采用HPLC进行纯化，所用流动相优选包括流动相A与流动相B；所述流动相A优选为TFA、CH₃CN与水的混合液，所述流动相A中TFA的体积分数优选为0.05%，CH₃CN的体积分数优选为2%；所述流动相B优选为TFA、CH₃CN与水的混合液，所述流动相B中TFA的体积分数优选为0.05%，CH₃CN的体积分数优选为90%。

在本发明中，以放射性核素为¹⁸F为例，将具有式II所示结构的NOTA-瑞珀酸酐进行放射性核素标记的方法优选包括以下步骤：

将NOTA-瑞珀酸酐水溶液、AlCl₃水溶液、乙酸铵缓冲溶液与¹⁸F^-离子混合进行反应，之后经纯化，得到标记有¹⁸F^-的NOTA-瑞珀酸酐。

在本发明中，所述NOTA-瑞珀酸酐水溶液的浓度优选为1mg/mL；所述AlCl₃水溶液的浓度优选为2mM；所述乙酸铵缓冲溶液的浓度优选为0.1M，pH值优选为4.0；所述NOTA-瑞珀酸酐水溶液、AlCl₃水溶液与乙酸铵缓冲溶液的体积比优选为100μL：3μL：1mL；所述¹⁸F^-离子的放射性活度优选为185MBq，所述¹⁸F^-离子优选经医用回旋加速器制备并洗脱至反应管中。在本发明中，所述反应的温度优选为85~95℃，更优选为90℃；时间优选为15~25min，更优选为20min。本发明优选将反应结束后所得产物体系采用Oasis HLB 3-cc cartridge（Waters）柱进行纯化，具体是先采用1mL 0.9%生理盐水洗脱以除去未反应的¹⁸F^-和[¹⁸F]AlF²⁺，然后采用200μL体积分数为80%的乙醇水溶液冲柱得到目标产物。

本发明采用四嗪-瑞珀酸酐生物正交反应体系构建PD-1/PD-L1靶向的肿瘤诊断PET探针可实现肿瘤的特异性显像，同时可评估肿瘤中PD-1/PD-L1表达水平，可作为肿瘤患者是否适合PD-1/PD-L1免疫治疗的评价手段。

本发明提供了上述技术方案所述预靶向肿瘤免疫探针或上述技术方案任一项所述生物正交制剂在制备肿瘤微环境中PD-1或PD-L1表达水平检测试剂中的应用。

在本发明中，所述肿瘤优选包括人脑胶质瘤、结直肠癌、卵巢癌或非小细胞肺癌，更优选为人脑胶质瘤或非小细胞肺癌。

式II；

式II中R为，n=0~4。

在本发明中，所述n=0、1、2、3或4，优选为0或4。在本发明中，所述单抗-四嗪偶联物的给药剂量优选为0.5~2mg/kg（啮齿类大小鼠），所述PET显像探针的给药剂量优选为37~74MBq/kg（啮齿类大小鼠）。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

四嗪-羧酸衍生物（英文名称为4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzoicacid，缩写为Tz-COOH）以及瑞珀酸酐衍生物（英文名称为7,8-N-[tert-butyl(2-aminoethyl)carbamate]succinimideendo-tricyclo-[4.2.2.0^2.5]deca-3,9-diene）购于南京拜恩特斯生物科技有限公司；双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA购于美国大环公司（Macrocyclics, Inc.）；1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺（英文名称为1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl] carbodiimide，缩写为EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（英文名称为N-Hydroxysuccinimide，缩写为NHS）以及六水合氯化铝（AlCl₃·6H₂O）购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司（Sigma-Aldrich）。

实施例1

1.1 单抗-四嗪偶联物的合成

图1中的b为采用四嗪-羧酸衍生物对PD-L1单克隆抗体抑制剂（德瓦鲁单抗）进行化学修饰制备单抗-四嗪偶联物的反应路线，具体步骤如下：

将300μg（1.3μmol）四嗪-羧酸衍生物（Tz-COOH）溶于乙腈（500μL）中，加入EDC和NHS，且所述Tz-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1：2：2，在室温（25℃）条件下进行活化处理2h，得到含四嗪-琥珀酰亚胺酯的产物体系；将所述含四嗪-琥珀酰亚胺酯的产物体系加入到德瓦鲁单抗（200μg）的DMSO（200μL）溶液中，且四嗪-琥珀酰亚胺酯与德瓦鲁单抗的摩尔比为10：1，在4℃条件下反应3h；反应结束后，将所得产物体系采用PD-10柱进行纯化（所用流动相为PBS缓冲液），得到单抗-四嗪偶联物。

采用紫外-可见分光光度法对所述单抗-四嗪偶联物中Tz-COOH与德瓦鲁单抗的偶联数目进行测定，其中，Tz-COOH的特征吸收峰为540nm，德瓦鲁单抗的特征吸收峰为280nm；结果显示，每个德瓦鲁单抗约结合2个Tz-COOH。

1.2 [¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐的合成

图1中的a为制备[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐的反应路线，具体步骤如下：

（1）将0.03mmol N-Boc保护的瑞珀酸酐衍生物（R中n=0）溶解在1.0mL无水甲醇中，然后加入0.5mL浓度为20wt%的三氟乙酸水溶液，室温（25℃）条件下反应4h；反应结束后，采用旋转蒸发仪将所得产物体系蒸干，得到氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐。

（2）将0.03mmol氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐溶于1mL乙腈，加入0.1mmol三乙胺（调节体系pH值为9），且加入0.03mmol双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA，室温（25℃）条件下搅拌反应1h；反应结束后，将所得产物体系进行旋蒸以去除溶剂，得到粗产物；将所述粗产物采用硅胶柱进行纯化（按体积比计，所用流动相为甲醇：二氯甲烷=4：1），得到NOTA-瑞珀酸酐（NOTA-Reppe anhydride），为粉色产物，产量为12mg，产率为55%。

图2为NOTA-瑞珀酸酐的MALDI-TOF MS图，其中，[M+H]⁺ m/z [C₃₄H₄₂N₆O₈SH]⁺，理论值：695.280，测量值：695.111。

（3）采用[¹⁸F]AlF一步螯合法对NOTA-瑞珀酸酐进行¹⁸F标记，具体是将3μL浓度为2mM的AlCl₃水溶液与100μL浓度为1mg/mL的NOTA-瑞珀酸酐水溶液加入到1mL浓度为0.1M的乙酸铵缓冲溶液（pH=4.0）中，然后加入185MBq ¹⁸F^-离子（医用回旋加速器制备并洗脱至反应管中），在90℃条件下反应20min；反应结束后，将所得产物体系采用Oasis HLB 3-cccartridge（Waters）柱进行纯化（具体是先采用1mL 0.9%生理盐水洗脱以除去未反应的¹⁸F^-和[¹⁸F]AlF²⁺，然后采用200μL体积分数为80%的乙醇水溶液冲柱得到目标产物），得到[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐。

采用放射性薄层色谱测定所述[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐的放射性标记率及放化纯度，结果显示，放射性标记率为68±5%；图3为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐的放化纯度测试图，结果显示，[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐的放化纯度>96%。

测试例1

1.1 [¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐（简称为PET探针）的体外稳定性测试

将100μL 3.7MBq PET探针分别与900μL胎牛血清（FBS）以及PBS缓冲液混合，分别于不同时间点（0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h）取样，采用纸层析Radio-TLC，绘制时间-放化纯度的稳定性曲线，以测试PET探针在FBS以及PBS中的稳定性。

图4为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐在FBS和PBS中的稳定性测试结果图，结果显示，PET探针在FBS和PBS中12h均可保持较高稳定性。

1.2 PET探针的细胞毒性实验

将人脑胶质瘤细胞系U87MG进行常规复苏、培养、传代，在96孔板中每孔铺1×10³；设2个组别：a）PET探针组，b）无标记的NOTA-瑞珀酸酐组；药物与细胞共孵育24 h，其中药物浓度设置为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL；之后CCK8法测定PET探针毒性，用酶标仪于570 nm处测定吸光度（OD值），并计算细胞存活率。

图5为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐与NOTA-瑞珀酸酐的细胞毒性测试结果图，其中¹⁸F-RA对应[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐，RA对应NOTA-瑞珀酸酐；结果显示，两种药物对U87MG细胞系无毒性。

1.3 PET探针在正常小鼠的体内生物学分布及PET显像

（1）将PET探针经尾静脉注射到正常Balb/c小鼠体内（37kBq/10μL 0.9%生理盐水），注射后在不同时间点眼眶放血处死并进行解剖，取主要器官（心、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、肌肉、骨骼等组织器官）称重，置于γ-计数器测量其计数，经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率（%ID/g）：每克组织注射剂量分布（%ID/g）=各组织器官的放射性计数（CPM）/各组织器官的质量（g）/注射剂量；研究其在体内的吸收、分布、代谢、清除等行为，绘制PET探针的药物代谢动力学曲线参数，探索PET探针的体内分布规律；并于不同时间点眼眶采血，测定放射性计数，绘制时间-活度曲线，计算血液半清除速率。

图6为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐在BALB/c正常小鼠中的代谢分布图，结果显示，PET探针主要通过肝脏和肾脏进行代谢和快速清除，其中，尾静脉注射1h后肝脏（7.63 %ID/g）和肾脏（10.22 %ID/g）的摄取到达峰值，小肠因PET探针的肝胆管代谢亦呈现较高摄取；2h后PET探针可快速清除（肝脏0.84 %ID/g；肾脏2.84 %ID/g）；非代谢器官如肺、肌肉和骨骼对PET探针的摄取较低。

（2）对正常Balb/c小鼠进行小动物体内PET/CT显像，观察PET探针在模型体内的生物分布，具体步骤为：将PET探针（14.9±0.5MBq/100μL 0.9%生理盐水）采用尾静脉注射小鼠（5只/组），置于小动物PET/CT扫描设备（Siemens Inveon MM, Germany）进行全身PET/CT扫描，期间使用2%异氟烷混合1mL/min流速的医用氧气维持小鼠麻醉状态；扫描结束后采用滤波反投影法（FBP，Filtered back projection）重建得到图像，以CT为模板计算各器官摄取PET探针的量（%ID/g），通过注射PET探针后不同时间（30min、1h、2h）显像结果分析，确定PET探针的最佳显像时间。

图7为[¹⁸F]AlF-NOTA-瑞珀酸酐在BALB/c正常小鼠中的代谢分布图（PET/CT图像），结果显示与上述各器官的摄取与生物分布实验结果一致。

1.4 预靶向免疫PET显像评估人脑胶质瘤PDX模型中PD-L1的表达水平

（1）人脑胶质瘤PDX模型的构建：将新鲜外科手术后的人脑胶质瘤组织样本，通过皮下接种到重度免疫缺陷的NSG小鼠身上，记为P1代；待P1代长到1.5cm大小左右，取出肿瘤，切成小块后，再次接种在NSG小鼠体内，记为P2代；将P2代肿瘤样本复苏后，接种到NSG小鼠体内，每5天测量肿瘤体积，待肿瘤直径达到0.5~1cm时即得到了人脑胶质瘤PDX模型。

（2）对已构建的人脑胶质瘤PDX模型进行预靶向小动物免疫PET/CT显像，观察PET探针在模型体内的生物分布，评估PET探针的诊断效果，具体步骤为：将偶联了四嗪衍生物的德瓦鲁单抗（即实施例1制备的单抗-四嗪偶联物）采用尾静脉注射到人脑胶质瘤PDX模型小鼠中（5只，每只注射剂量为200μg单抗-四嗪偶联物/200μL 0.9%生理盐水），然后于48h后注射PET探针（14.9±0.5MBq/100μL 0.9%生理盐水），置于小动物PET/CT扫描设备进行扫描，并通过注射PET探针后不同时间（1h、2h、24h）显像结果分析，确定PET探针的最佳注射时间和最佳显像时间，以评价PET探针在人源化PDX模型中PD-1/PD-L1表达水平评价的准确性、灵敏度。

图8为德瓦鲁单抗在胶质瘤PDX模型中预靶向免疫PET显像的PET/CT图像，其中a为PET探针注射后1h的体内分布图，b为PET探针注射后2h的体内分布图，c为PET探针注射后24h的体内分布图，白色箭头为肿瘤区域；结果显示，在尾静脉注射PET探针1h后，肿瘤中PET探针摄取量为2.3% ID/g，2h后为2.1% ID/g，24h后PET探针摄取值降为1.7% ID/g。这说明PET探针可实现对肿瘤的靶向显像并评估肿瘤中PD-L1的表达水平。

实施例2

图9为制备[¹⁸F]AlF-NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐的反应路线，具体步骤如下：

（1）将0.03mmol N-Boc保护的瑞珀酸酐衍生物（R中n=4）溶解在1.0mL无水甲醇中，然后加入0.5mL浓度为20wt%的三氟乙酸水溶液，室温（25℃）条件下反应4h；反应结束后，采用旋转蒸发仪将所得产物体系蒸干，得到氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐。

（2）将0.03mmol氨基功能团化的瑞珀酸酐三氟乙酸盐溶于1mL乙腈，加入0.1mmol三乙胺（调节体系pH值为9），且加入0.03mmol双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA，室温（25℃）条件下搅拌反应1h；反应结束后，将所得产物体系进行旋蒸以去除溶剂，得到粗产物；将所述粗产物采用HPLC进行纯化（流动相A为TFA、CH₃CN与水的混合液，所述流动相A中TFA的体积分数为0.05%，CH₃CN的体积分数为2%；流动相B为TFA、CH₃CN与水的混合液，所述流动相B中TFA的体积分数为0.05%，CH₃CN的体积分数为90%），冻干得到NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐（NOTA-PEG₄-Reppe anhydride），为淡黄色产物，产量为5.2mg，产率为21%。

图10为NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐的MALDI-TOF MS图，其中，[M+H]⁺ m/z [C₄₂H₅₈N₆O₁₂SH]⁺，理论值：872.020，测量值：872.029。

（3）按照实施例1的方法操作，将NOTA-瑞珀酸酐替换为NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐，最终制备得到[¹⁸F]AlF-NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐。

采用放射性薄层色谱测定所述[¹⁸F]AlF-NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐的放射性标记率及放化纯度，结果显示，未经衰减校正的放射性标记率为30%，放化纯度>95%。

测试例2

1.1 [¹⁸F]AlF-NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐（简称为PEG₄-PET探针）的体外稳定性测试

将100μL 3.7MBq PEG₄-PET探针与900μL人血清白蛋白（HSA）溶液混合，分别于不同时间点（0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h）取样，采用纸层析Radio-TLC，绘制时间-放化纯度的稳定性曲线，以测试PEG₄-PET探针在HSA中的稳定性。

图11为[¹⁸F]AlF-NOTA-PEG₄-瑞珀酸酐在HSA中的稳定性测试结果图，结果显示，PEG₄-PET探针在HSA中可保持较长时间的稳定性。

1.2 基于生物正交化学的非小细胞肺癌模型体内预靶向的PET/CT成像

（1）非小细胞肺癌模型构建：将非小细胞肺癌细胞系A549，分别取1×10⁶细胞注入BALB/c-nu裸鼠右侧腋下，注射后隔天观察，测量肿瘤生长情况，待肿瘤达0.5~1cm时备用。

（2）采用预靶向免疫PET显像策略，使用小动物PET/CT扫描设备考察PEG₄-PET探针在非小细胞肺癌细胞系A549皮下接种裸鼠模型体内的代谢和生物分布状况，并进行定量分析，具体步骤为：尾静脉预先注射实施例1制备的单抗-四嗪偶联物（4只，每只注射剂量为200μg单抗-四嗪偶联物/200μL 0.9%生理盐水），48h后再注射PEG₄-PET探针，并通过注射PEG₄-PET探针后不同时间（1h、2h、24h）显像结果分析。

图12为德瓦鲁单抗在A549非小细胞肺癌模型中预靶向免疫PET显像的PET/CT图像，其中a为PEG₄-PET探针注射后1h的体内分布图，b为PEG₄-PET探针注射后2h的体内分布图，c为PEG₄-PET探针注射后24h的体内分布图，白色箭头为肿瘤区域；结果显示，PEG₄-PET探针在注射1h后肿瘤模型中的摄取值为1.6±0.5% ID/g，2h后达到最高值4.6±0.3% ID/g，24h的摄取值降为0.5±0.2% ID/g。这说明该生物正交化学PEG₄-PET探针可以可视化肿瘤中PD-L1的表达水平，并可实现定量评估。

由以上实施例以及测试可知，本发明基于四嗪-瑞珀酸酐衍生物的生物正交化学反应体系，构建了可用于评估肿瘤微环境中PD-1/PD-L1表达水平的预靶向免疫PET探针。具体的，本发明将高亲和力的PD-1单克隆抗体抑制剂（如纳武利尤单抗、帕博利珠单抗）或PD-L1单克隆抗体抑制剂（如阿特珠单抗、德瓦鲁单抗）分别与四嗪衍生物偶联，从而构建得到“双特异性”单抗；同时对瑞珀酸酐（Reppe anhydride）衍生物进行F-18、Ga-68、Cu-64这类短半衰期正电子核素进行放射性标记，得到可与单抗特异性偶联的PET探针。本发明中肿瘤模型体内PET显像实验证实了该PET探针可应用于量化评估肿瘤中PD-1/PD-L1的表达水平，可为肿瘤患者PD-1/PD-L1免疫治疗策略的制定及疗效评价提供重要依据。PD-1/PD-L1的表达水平的可视化影像学检测能够克服组织活检存在的预测准确性差、侵入性强、无法多次取样等问题，同时基于短半衰期核素的预靶向免疫PET显像策略无疑可以很好地解决辐射损伤的问题，即首先对生物体注射单抗，经过大概1周的体内循环之后，待抗体与靶组织实现特异性结合之后，接着注射短半衰期核素标记的PET探针，其迅速与率先注射的修饰抗体在靶组织结合。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种预靶向肿瘤免疫探针，其特征在于，为标记有放射性核素的NOTA-瑞珀酸酐，所述NOTA-瑞珀酸酐具有式I所示结构：

式I。

2.一种生物正交制剂，其特征在于，包括分装的单抗-四嗪偶联物与PET显像探针；所述单抗-四嗪偶联物中单抗为PD-1单克隆抗体抑制剂或PD-L1单克隆抗体抑制剂；所述PET显像探针为标记有放射性核素的NOTA-瑞珀酸酐，所述NOTA-瑞珀酸酐具有式II所示结构：

式II；

式II中R为，n=0~4。

3.根据权利要求2所述的生物正交制剂，其特征在于，所述PD-1单克隆抗体抑制剂为纳武利尤单抗或帕博利珠单抗。

4.根据权利要求2所述的生物正交制剂，其特征在于，所述PD-L1单克隆抗体抑制剂为阿特珠单抗或德瓦鲁单抗。

5.根据权利要求2~4任一项所述的生物正交制剂，其特征在于，所述放射性核素包括¹⁸F、⁶⁸Ga或⁶⁴Cu。

6.权利要求1所述预靶向肿瘤免疫探针或权利要求2~5任一项所述生物正交制剂在制备肿瘤微环境中PD-1或PD-L1表达水平检测试剂中的应用。

7.权利要求1所述预靶向肿瘤免疫探针或权利要求2~5任一项所述生物正交制剂在制备用于检测肿瘤微环境中PD-1或PD-L1表达水平的PET显像剂中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括人脑胶质瘤、结直肠癌、卵巢癌或非小细胞肺癌。

9.一种检测肿瘤微环境中PD-1或PD-L1表达水平的试剂盒，其特征在于，包括分装的单抗-四嗪偶联物与PET显像探针；所述单抗-四嗪偶联物中单抗为PD-1单克隆抗体抑制剂或PD-L1单克隆抗体抑制剂；所述PET显像探针为标记有放射性核素的NOTA-瑞珀酸酐，所述NOTA-瑞珀酸酐具有式II所示结构：

式II；

式II中R为，n=0~4。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述单抗-四嗪偶联物的给药剂量为0.5~2mg/kg，所述PET显像探针的给药剂量为37~74MBq/kg。