CN117741162A - 一种检测供者特异性抗体的细胞学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，首先，采用和目标供者抗原同种或同类的多态性抗原基因不表达的、或被定向清除的人源细胞作为载体细胞；然后，在载体细胞中导入目标供者抗原表达基因，使得载体细胞表面表达目标供者抗原，而成为供者特异性抗体的检测细胞；最后，通过比对受者血清分别和目标供者抗原的载体细胞及检测细胞的不同反应水平，判断受者血清中是否存在供者特异性抗体。本发明既解决了细胞学交叉反应法检出的供者特异性抗体无法明确判定抗体具体所针对的特异性靶抗原的缺点；又解决了纯化抗原检测法中，因纯化的目标供者抗原中存在变性抗原，或因非人源细胞表达的目标供者抗原的仿真度不够，而引起的假阳性反应的问题。
Description
技术领域
本发明属于抗体检测技术领域，涉及一种检测供者特异性抗体的细胞学方法。
背景技术
在异体器官移植或细胞治疗时，如果移植物的供受者之间存在不一样的抗原，供者特有的抗原常会引起患者产生特异性抗体，即供者特异性抗体（Donor SpecificAntibody，DSA）。DSA是引起抗体介导的排斥反应（Antibody Mediated Rejection，AMR）的致病因素，是移植失败、移植患者死亡的最主要原因之一。
目前，移植实验室检测DSA的方法主要包括两种：细胞学交叉反应法、和纯化抗原检测法（Transplantation Reviews, Vol 18, No 4 (October), 2004: pp 192-203）；Surg Today (2005) 35:605-612）。
1. DSA的细胞学交叉反应检测法
DSA的细胞学交叉反应法是采用供者细胞和患者血清发生孵育反应，来检测患者血清样本中是否存在可以结合供者细胞表面抗原的特异性抗体。采用的供者细胞包括但不限于血管内皮细胞、血细胞、移植物来源的组织细胞。判断DSA检测结果的方法包括：1）DSA的补体依赖性细胞毒作用判定法（Complement dependent cytotoxicity，CDC），即根据患者样本中的抗体在结合了供者细胞后，能否激活补体并杀伤供者细胞，根据供者细胞被杀伤与否，判定是否存在DSA；2）DSA和供者细胞发生结合反应的流式细胞鉴定法，即在供者细胞和患者血清发生孵育反应后，采用荧光标记的二抗，来确认供者细胞表面是否结合了相应的抗体。
由于供者细胞表面可能存在超过一种以上的供者特异性抗原，DSA的细胞学交叉反应法检出的抗体可能是针对一种或一种以上的供者抗原。因此，该方法的缺点是，基于该检测法检出的DSA，我们无法确定DSA具体所针对的是哪一种供者抗原，即DSA相应抗原的不确定性。
2. DSA的纯化抗原检测法
随着对异体移植中和排斥反应相关抗原的深入研究，人类白细胞抗原（HumanLeukocyte Antigen，HLA）被发现是一类非常常见的、最具多态性的DSA的靶抗原。其余被发现的靶抗原还包括ABO血型抗原、血小板特异性抗原、MICA抗原等。由于DSA的细胞学交叉反应检测法检出的DSA所针对的相应供者抗原的不确定性，自2000年前后起，移植检测领域开始采用纯化的HLA来检测针对HLA的供者特异性抗体（Transplantation Reviews, Vol 18,No 4 (October), 2004: pp 192-203, Surg Today (2005) 35:605-612）。该检测技术是采用基因重组技术，在原核或真核细胞中表达供者特有的HLA抗原，然后采用纯化的供者HLA抗原，借由酶联免疫吸附实验（ELISA）、固相膜、蛋白芯片、流式微球、luminex液相芯片微球等技术平台，来检测患者血清样本中的针对供者HLA的DSA。
经过近20年的临床应用，人们逐渐发现，DSA的纯化抗原检测法也有其特有的致命缺陷。首先，假如供者抗原的表达***是原核细胞，表达的供者抗原不能很好模拟人类组织细胞表面的供者抗原的真实结构，异常结构的供者抗原可能导致无法准确检测DSA，或检测出由异常供者抗原引起的假阳性DSA反应；其次，体外表达的供者抗原在制备成DSA检测试剂时，需要经过载体细胞裂解、抗原纯化、洗脱、浓缩、固相载体包被等一系列可能引起供者抗原发生结构变性的过程。现有的市场HLA-DSA检测产品，几乎无一例外地被发现检测试剂中所用的纯化的供者抗原，都存在不同程度的变性，从而导致由变性抗原引起的DSA的假阳性反应（中国医药生物技术协会移植技术分会，上海市肾脏移植质控中心专家委员会. 肾移植人类白细胞抗原分型和抗体检测专家共识. 中华医学杂志，2022, 102(10): 705-717； 中国输血协会HLA专委会 中国医药生物技术协会移植技术分会，HLA抗体检测中重点问题的专家共识，中华器官移植杂志 2022 年 3 月第 43 卷第 3 期）。
发明内容
针对当前两种DSA检测技术各自存在的无法解决的致命缺陷，本发明提供了一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，通过重组表达特定供者抗原的人源载体细胞，检测移植物受者样本中的供者抗原特异性抗体。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，包括如下步骤：
1）采用和目标供者抗原同种或同类的多态性抗原基因不表达的、或被定向敲除的人源细胞作为载体细胞；
2）在载体细胞中转入目标供者抗原的表达基因，制备成细胞表面表达目标供者抗原的检测细胞；
3）采用目标供者抗原的载体细胞及检测细胞分别和受者血清发生反应，根据两种细胞和受者血清的不同反应水平，判断受者血清中是否存在目标供者抗原特异性的抗体。
进一步地，步骤1）中，所述的载体细胞包括但不限于血管内皮细胞，外周血有核细胞，或从移植物中纯化的组织细胞，以及上述细胞（即血管内皮细胞、外周血有核细胞、或从移植物中纯化的组织细胞）在体外扩增培养后的细胞。
进一步地，步骤2）中，在载体细胞中转入目标供者抗原的表达基因的方式包括生化、物理、或病毒感染的方式。
进一步地，步骤2）中，还包括将目标供者抗原的表达基因导入载体细胞后，进一步确认目标供者抗原在检测细胞表面的表达量。
进一步地，步骤3）中，比对两种细胞和受者血清的不同反应水平的方法包括：流式细胞检测法、补体依赖性细胞毒检测法、或检测补体片段结合反应的方法。
本发明具有如下有益效果：
本发明既解决了DSA细胞学交叉反应法检出的DSA无法明确判定其具体所针对的特异性靶抗原的缺点；又解决了DSA的纯化抗原检测法中，因纯化的供者抗原中存在变性抗原，或因非人源细胞表达的供者抗原的仿真度不够，而引起的假阳性反应的问题。
附图说明
图1. 检测供者特异性抗体的细胞学方法（以检测供者HLA特异性抗体为例）。
图2为载体细胞与阴性对照抗体反应的结果。
图3为载体细胞与CB-01单克隆抗体反应的结果。
图4为目的蛋白HLAⅠ类A-1101抗原重链表达载体的构建。
图5为β2微球蛋白（β2m）表达载体的构建。
图6供者HLA抗原A-1101的特异性抗体的检测。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
以检测供者HLA特异性抗体为例，本发明检测供者特异性抗体的细胞学方法，主要包括：
1）采用内源性HLA基因被定向敲除的、或本身不表达HLA的人源细胞作为“载体细胞”；
2）在“载体细胞”中转入特定目标供者抗原HLA的表达基因，使得“载体细胞”表面表达特定的供者HLA而成为“检测细胞”；
3）将“检测细胞”和含有抗供者HLA抗体的被检样本发生孵育反应；
4）采用荧光标记的二抗来确定“检测细胞”表面是否结合有抗供者HLA的抗体。
实施例
本实施例中，提供了检测HLA-I类抗原A-1101的供者特异性抗体的细胞学方法，主要包括以下步骤：
1）本实施例采用了经基因检测或细胞膜表面抗原表达验证确认的、细胞表面不表达HLA的人源淋巴细胞作为载体细胞，并用CB-01单克隆抗体（可特异性结合人源HLA-I类抗原）确认细胞表面无A-1101表达（图2为载体细胞与阴性对照抗体反应的结果，图3为载体细胞与CB-01单克隆抗体反应的结果）；
2）通过在目的基因序列的两侧分别添加Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ 酶切位点，将A-1101的重链基因序列（GenBank: BAA04117.1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/BAA04117.1）和β2微球蛋白基因序列（GenBank:NP_004039.1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_004039.1）分别***到pcDNA3.1(+)载体和pcDNA3.1/hygro+载体的适当区域中，成功构建分别含有A-1101的重链结构和β2微球蛋白基因序列的载体（图4和图5）；
3）在载体细胞中转入构建完成的A-1101重链和β2微球蛋白的真核细胞表达质粒：
a. 电转前2天，将细胞转移至T75培养瓶，待细胞进入指数生长期，此时细胞状态良好，密度约为（2-10）×106。为提高细胞存活率，在电转前两个小时给细胞更换新鲜的培养基；
b. 将细胞转移至离心管中，300×g，离心3 min后弃上清；
c. 加入5mL的PBS洗涤细胞，300×g，离心3 min后弃上清，重复洗涤2次；
d. 用PBS将细胞重悬，利用血球计数板对细胞悬液进行计数，根据密度取5×106个细胞转移到离心管中，300×g，离心3 min后弃上清；
e. 用100μL 的RPMI1640培养基重悬细胞，加入重链表达质粒和β2m表达质粒各10μg 混匀，并用RPMI1640培养基将反应总体系补充至200μL；
f. 室温孵育10分钟，后小心转移至0.2cm电极杯；
g. 将电转仪电压设置为155V，放入电极杯，电击时间0.4ms；
h. 电转后将电极杯于冰上孵育10分钟，之后将细胞转入T75培养瓶，补充新鲜的培养基，调整细胞密度为2×105/mL；
i. 细胞培养48小时后，加入G418（使用浓度为800μg/mL）筛选；
j. 筛选1-2周，大量细胞死亡，第4-5周，开始增殖***，持续加药筛选2个月，2-4天换液一次，可得到稳定表达目的蛋白的细胞。
4）HLA单克隆抗体的抗原表达量的验证性筛查，筛选出细胞表面A-1101高表达的细胞：
a. 将上述筛选得到的稳转细胞转移到离心管中，300×g，离心3 min后弃上清；
b. 加入5mL的PBS洗涤细胞，300×g，离心3 min后弃上清，重复洗涤2次；
c. 用PBS重选细胞，利用血球计数板对细胞悬液进行计数，根据一个检测反应1×106的细胞量，吸取对应体积的细胞液到15mL离心管中，300×g，离心3 min后弃上清；
d. 加入50μL配制好的检测抗体（CB-01）（终浓度2μg/mL），4℃，孵育30min；
e. 反应结束后，加入洗涤缓冲液清洗细胞3次；
f. 加入50μL配制好的荧光二抗（终浓度2μg/mL），4℃，孵育30min；
g. 反应结束后，加入洗涤缓冲液清洗细胞3次，利用300μL的PBS重悬细胞，转移至流式管中上机检测；
h. 根据流式结果，在无菌环境中分选出荧光表达量最高的10%的细胞，扩大培养，最终获得A-1101高表达的细胞。
5）采用细胞表面不表达A-1101的载体细胞、及经基因转染后高表达A-1101的检测细胞分别和血清样本发生结合反应：
a. 将上述两种细胞分别转移到离心管中，300×g，离心3 min后弃上清；
b. 加入5mL的PBS洗涤细胞，300×g，离心3 min后弃上清，重复洗涤2次；
c. 用PBS重选细胞，利用血球计数板对细胞悬液进行计数，根据一个检测反应1×105的细胞量，吸取对应体积的细胞液到1.5mL EP管中，300×g，离心3 min后弃上清；
d. 加入20μL待检测的血清样本，室温孵育30min；
e. 反应结束后，加入洗涤缓冲液清洗细胞3次；
f. 加入50μL配制好的FITC标记的抗人-IgG二抗（终浓度1μg/mL），室温孵育30min；
g. 反应结束后，加入洗涤缓冲液清洗细胞3次，利用300μL的PBS重悬细胞，转移至流式管中上机检测。
6）采用流式细胞仪检测并比较载体细胞和检测细胞表面结合的荧光标记二抗的荧光强度的水平差异，定性判断患者血清中是否存在A-1101特异性的抗体。
如图6所示，虚线显示的是被检样本和细胞表面不表达目标供者抗原A-1101的载体细胞的反应结果；实线显示的是被检样本和载体细胞表面表达了目标供者抗原A-1101的检测细胞的反应结果。
通过比较同一个被检样本分别和载体细胞及检测细胞的不同的反应结果，可以确认被检样本中存在针对检测细胞表面的供者抗原A-1101的特异性抗体。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (5)
1.一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，包括如下步骤：
1）采用和目标供者抗原同种或同类的多态性抗原基因不表达的、或被定向敲除的人源细胞作为载体细胞；
2）在载体细胞中转入目标供者抗原的表达基因，制备成细胞表面表达目标供者抗原的检测细胞；
3）采用目标供者抗原的载体细胞及检测细胞分别和受者血清发生反应，根据两种细胞和受者血清的不同反应水平，判断受者血清中是否存在目标供者抗原特异性的抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤1）中，所述的载体细胞包括血管内皮细胞，外周血有核细胞，或从移植物中纯化的组织细胞，以及上述细胞在体外扩增培养后的细胞。
3.根据权利要求1所述的一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤2）中，在载体细胞中转入目标供者抗原的表达基因的方式包括生化、物理、或病毒感染的方式。
4.根据权利要求1或3所述的一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤2）中，还包括将目标供者抗原的表达基因导入载体细胞后，进一步确认目标供者抗原在检测细胞表面的表达量。
5.根据权利要求1所述的一种检测供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤3）中，比对两种细胞和受者血清的不同反应水平的方法包括：流式细胞检测法、补体依赖性细胞毒检测法、或检测补体片段结合反应的方法。
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