CN117721135A - 一种表达α-淀粉酶的重组菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达α‑淀粉酶的重组菌株及其构建方法和应用。本发明在罗氏真养产碱杆菌中表达外源的α‑淀粉酶基因，通过敲除α‑淀粉酶合成途径的竞争途径PHB合成途径，获得基础菌株△CAB；然后构建载体将α‑淀粉酶基因导入到罗氏真养产碱杆菌，或者整合到基因组上，或者整合到基因组上同时构建含α‑淀粉酶基因的载体合导入到菌株，进而得到多株表达α‑淀粉酶的重组菌株。所述重组菌株能够以甘油和CO2为原料合成α‑淀粉酶，从而在罗氏真养产碱杆菌中建立一条新的利用甘油和CO2为原料生产化合物α‑淀粉酶的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种表达α-淀粉酶的重组菌株及其构建方法和应用。
背景技术
α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物，其大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，α-淀粉酶的合成方法主要有天然合成法和代谢工程合成法。天然合成法主要生产α-淀粉酶的微生物为枯草芽孢杆菌，其采用固体发酵的方法，但该方法具有一定的局限性，只限于低湿状态下生长的微生物，固态状态下各项参数，例如pH、湿度、基质浓度不易侦测，会导致每批发酵条件不易一致、固体发酵培养时间较长、产量及产能常低于液体发酵。
微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此，微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
发明内容
本发明的目的是提供了一种表达α-淀粉酶的重组菌株及其构建方法和应用。本发明是将α-淀粉酶基因通过基因工程手段在罗氏真养产碱杆菌中表达，同时通过将α-淀粉酶基因整合到基因组中，获得三种α-淀粉酶表达菌株，并将菌株进行发酵，通过酶活测定筛选出最优以甘油和CO2为原料合成α-淀粉酶的方法及菌株。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种表达α-淀粉酶的重组菌株的构建方法，其包括以下步骤：
(1)扩增α-淀粉酶基因amyl、基因PJn-amyl、***质粒上下游同源臂基因phaCAB和ldh；
(2)将所述步骤(1)扩增得到的基因amyl和线性化载体p2M-PJn进行组装，得到重组质粒p2M-PJn-amyl；
(3)将所述步骤(1)扩增得到的***质粒上下游同源臂基因phaCAB与pK18框架进行组装，转化感受态细胞，得到重组***质粒pK18-phaCABud；
(4)将所述步骤(1)扩增得到的***质粒上下游同源臂基因ldh、基因PJn-amyl与pK18框架进行组装，转化感受态细胞，得到重组***质粒pK18-ldhud:PJn-amyl；
(5)将含有所述步骤(3)的重组***质粒pK18-phaCABud的菌株作为供体菌，与受体菌和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到△CAB菌株；
(6)将含有所述步骤(2)的重组质粒p2M-PJn-amyl的菌株作为供体菌，与△CAB菌株和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到重组菌株△CAB△ldh p2M-PJn-amyl；
或者将含有所述步骤(4)的重组***质粒pK18-ldhud:PJn-amyl的菌株作为供体菌，与△CAB菌株和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到重组菌株△CAB△ldh:PJn-amyl；
(7)将含有所述步骤(2)的重组质粒p2M-PJn-amyl的菌株作为供体菌，与重组菌株△CAB△ldh:PJn-amyl和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到重组菌株△CAB△ldh:PJn-amyl p2M-PJn-amyl。
进一步的，所述步骤(1)中α-淀粉酶基因amyl的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；基因PJn-amyl的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示。
进一步的，所述步骤(1)***质粒上下游同源臂基因phaCAB的上游同源臂基因phaCAB-up的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游同源臂基因phaCAB-down的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
进一步的，所述步骤(1)中***质粒上下游同源臂基因ldh的上游同源臂基因如SEQ ID No.12所示，下游同源臂基因ldh-down的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
进一步的，所述步骤(2)中的线性化载体p2M-PJn是以合成质粒p2M-PJn-vgb为模板，利用引物p2M-PJn RF和p2M-PJn RR扩增获得的；所述引物序列为：
p2M-PJn RF：5’-ATGTATATCTCCTTCTTAAAAGATCTTTTG-3’；
p2M-PJn RR：5’-CATTAATGAATCGGCCAACG-3’。
进一步的，所述步骤(3)和(4)中的pK18框架是以质粒pk18mobSacB为模板，利用引物pK18 RF和pK18 RR反向扩增得到；所述引物序列为：
pK18 RF：5’-GTCGACCTGCAGGCATGCAAGC-3’
pK18 RR：5’-GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGG-3’。
进一步的，所述步骤(5)中的受体菌为罗氏真养产碱杆菌；所述辅助菌为含有载体pRK2013的大肠杆菌。
本发明还提供了所述的构建方法构建得到的重组菌株。
本发明还提供了所述的重组菌株在制备合成α-淀粉酶的生物催化剂中的应用。
进一步的，所述重组菌株能够以甘油和CO2为原料合成α-淀粉酶。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益技术效果：
(1)本发明通过基因改造罗氏真养产碱杆菌使其能利用廉价碳源甘油和CO2生产α-淀粉酶；
(2)本发明采用液体发酵方法，克服了固体发酵的弊端；
(3)本发明通过构建三种表达α-淀粉酶的罗氏真养产碱杆菌H16△CAB△ldh p2M-PJn-amyl、H16△CAB△ldh:PJn-amyl、H16△CAB△ldh:PJn-amyl p2M-PJn-amyl，进行发酵并通过测定酶活，这三种罗氏真养产碱杆菌表达的α-淀粉酶酶活均高于野生型菌株，其中菌株H16△CAB△ldh:PJn-amyl p2M-PJn-amyl表达的α-淀粉酶效果最好，酶活为6.09μmolGlu/min/mL。
综上，本发明通过基因工程的手段，在细胞中表达α-淀粉酶基因，获得的重组菌株含有表达α-淀粉酶的基因，这些重组菌株能够从甘油和碳酸氢钠中合成α-淀粉酶，最终在罗氏真养产碱杆菌中成功建立一种高效的α-淀粉酶生物合成代谢途径，并获得了多株合成α-淀粉酶效果很好的重组菌株，从而建立一条新的利用甘油和CO2为原料的生物催化剂生产的α-淀粉酶生物法。
附图说明
图1是本发明中合成α-淀粉酶新途径的改造示意图。
图2是本发明中phaCAB基因敲除示意图。
图3是本发明中p2M-PJn-amyl的质粒图谱。
图4是本发明中pK18-phaCABud的质粒图谱。
图5是本发明中pK18-ldhud:PJn-amyl的质粒图谱。
图6是本发明中酶活测定结果图。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。
实施例1
如图1所示，本发明通过在罗氏真养产碱杆菌(Cupriavidus necator H16)(也可用市售罗氏真养产碱杆菌)中表达来源于蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)的α-淀粉酶，并利用甘油和CO2生物合成α-淀粉酶。
1.外源基因的克隆
1.1外源基因的克隆
1.1.1蜡状芽孢杆菌中α-淀粉酶基因的克隆
本发明选择了来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的α-淀粉酶基因(amyl)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因包含在载体pMV-1961中。利用下列引物amyl-F(5’-GGCCCCCCCTCGAGGTCGACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGG-3’)(SEQ ID No.2)和amyl-R(5’-AGGAATTCGATATCAAGCTTACAGATAAAACGAAAGGCCCAGT-3’)(SEQ ID No.3)，以合成质粒pMV-1961为模板扩增α-amyl片段。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
PCR程序为：95℃3min；30循环×(95℃15s，66℃15s，72℃2min)；72℃5min；16℃∞。
1.1.2PJn-amyl基因的克隆
基因PJn-amyl的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，其是以构架质粒p2M-PJn-amyl为模板，利用引物PJn-amyl RF(5’-GACGGCAGAGAGACAATCAAATCGGTTCGTACCTCCTCA-3’)(SEQID No.4)和PJn-amyl RR(5’-ATTGCGATTTTCTTCATAAGCTTGCGGCGCTTGCGCTTCACGGC-3’)(SEQID No.5)进行扩增获得的。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为1.8kb，与预期相符。将扩增正确的片段进行回收，用于后续载体的构建。
1.1.3***质粒上下游同源臂基因phaCAB-up、phaCAB-down的克隆
***质粒上游同源臂基因phaCAB-up的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，是以生物公司合成质粒pJQ200TC-phaCABup-down为模板，由引物Cup F(5’-TGCCTGCAGGTCGACATGCAGGCCGCTGCCG-3’)(SEQ ID No.8)和Cup R(5’-AACCAGGCCGGCAGGGATTTGATTGTCTCTCTGCCGT-3’)(SEQ ID No.9)扩增得到。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为1kb，与预期相符。将扩增正确的片段进行回收，用于后续载体的构建。
PCR程序为：95℃3min；30循环×(95℃15s，68℃15s，72℃60s)；72℃5min；16℃∞。
***质粒下游同源臂基因phaCAB-down的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，是以质粒pJQ200TC-phaCABup-down为模板，由引物Bdown F(5’-AGAGACAATCAAATCCCTGCCGGCCTGGTTCAA-3’)(SEQ ID No.10)和Bdown R(5’-TCCTCTAGAGTCGACGCTGCCAGTGTCTTACTTCTTG-3’)(SEQ ID No.11)扩增得到。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为1kb，与预期相符。将扩增正确的片段进行回收，用于后续载体的构建。
PCR程序为：95℃3min；30循环×(95℃15s，65℃15s，72℃60s)；72℃5min；16℃∞。
1.1.4***质粒上下游同源臂基因ldh-up、ldh-down的克隆
***质粒上游同源臂基因ldh-up的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，是以C.necator H16基因组为模板，由引物ldh-up F(5’-TAAGTTGGGTAACGCCGCAGTGCCTGCGTGGT-3’)(SEQ ID No.14)和ldh-up R(5’-GGTTCGTACCTCCTCAGACCCAGC-3’)(SEQ ID No.15)扩增得到。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为1kb，与预期相符。
将扩增正确的片段进行回收，用于后续载体的构建。
PCR程序为：95℃3min；30循环×(95℃15s，69℃15s，72℃60s)；72℃5min；16℃∞。
***质粒下游同源臂基因ldh-down的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，是以C.necator H16基因组为模板，由引物ldh-down F(5’-GACGGCAGAGAGACAATCAAATCGGTTCGTACCTCCTCA-3’)(SEQ ID No.16)和ldh-downR(5’-CGCAAACCGCCTCTCCAGCGTTCGCTCAGGCG-3’)(SEQ ID No.17)扩增得到，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为1kb，与预期相符。将扩增正确的片段进行回收，用于后续载体的构建。
PCR程序为：95℃3min；30循环×(95℃15s，71℃15s，72℃60s)；72℃5min；16℃∞。
2.表达载体的构建
2.1p2M-PJn-amyl载体的构建
载体p2M-PJn(p2M-PJn序列如SEQ ID No.26所示)以合成质粒p2M-PJn-vgb为模板，利用引物p2M-PJn RF(5’-ATGTATATCTCCTTCTTAAAAGATCTTTTG-3’)(SEQ ID No.18)和p2M-PJn RR(5’-CATTAATGAATCGGCCAACG-3’)(SEQ ID No.19)扩增获得。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为5kb，与预期相符。将扩增正确的片段进行回收，用于后续载体的构建。
利用Gibson组装将amyl片段克隆到p2M-PJn质粒上，其体系如下所示：
使用In-Fusion试剂盒进行Gibson组装，连接体系置于50℃孵育30min。转化感受态细胞E.coli DH5α，涂布含有终浓度为50μg/mL卡纳霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中培养12-18h，挑取10个单菌落，利用验证引物P2MY F(5’-GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG-3’)(SEQ ID No.20)和P2MY R(5’-GCACGACAGGTTTC-CCGACTG-3’)(SEQ ID No.21)进行菌液PCR验证，将验证正确的菌液接种于终浓度为50μg/mL卡纳霉素的LB溶液中，37℃培养箱中培养12-18h，取培养好的菌液与40％甘油1：1混合后保藏至-80℃冰箱中，余下菌液进行质粒的提取。获得重组质粒p2M-PJn-amyl(图3)。
2.2pK18-phaCABud载体的构建
pK18框架由质粒pk18mobSacB为模板，利用引物pK18 RF(5’-GTCGACCTGCAGGCATGCAAGC-3’)(SEQ ID No.22)和pK18 RR(5’-GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGG-3’)(SEQ ID No.23)反向扩增得到。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为5kb，与预期相符。将扩增正确的片段进行回收。
利用Gibson组装将phaCAB-up、phaCAB-down片段克隆到pK18质粒上，其体系如下所示：
使用In-Fusion试剂盒进行Gibson组装，连接体系置于50℃孵育30min。转化感受态细胞E.coli DH5α，涂布含有终浓度为50μg/mL卡纳霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中培养12-18h，挑取9个单菌落，利用引物pK18Y F(5’-CACGACGTTGTAAAACGACG-3’)(SEQ IDNo.24)和pK18Y R(5’-CGTTGGCCGATTCATTAATGC-3’)(SEQ ID No.25)进行菌液PCR验证，将验证正确的菌液接种于终浓度为50μg/mL卡纳霉素的LB溶液中，37℃培养箱中培养12-18h，取培养好的菌液与40％甘油1：1混合后保藏至-80℃冰箱中，余下菌液进行质粒的提取。获得重组***质粒pK18-phaCABud(图4)。
2.3pK18-ldhud:PJn-amyl载体的构建
pK18框架由质粒pk18mobSacB为模板，利用引物pK18 RF和pK18 RR反向扩增得到。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到清晰的单一目的条带，大小约为5kb，与预期相符。将扩增正确的片段进行回收。
利用Gibson组装将ldh-up基因、ldh-down基因和PJn-amyl片段克隆到pK18质粒上，其体系如下所示：
使用In-Fusion试剂盒进行Gibson组装，连接体系置于50℃孵育30min。转化感受态细胞E.coli DH5α，涂布含有终浓度为50μg/mL卡纳霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中培养12-18h，挑取10个单菌落，利用引物pK18YF和pK18Y R进行菌液PCR验证，将验证正确的菌液接种于终浓度为50μg/mL卡纳霉素的LB溶液中，37℃培养箱中培养12-18h，取培养好的菌液与40％甘油1：1混合后保藏至-80℃冰箱中，余下菌液进行质粒的提取。获得重组***质粒pK18-ldhud:PJn-amyl(图5)。
3.C.necator H16竞争途径关键基因的敲除
本发明中利用***质粒pK18-phaCABud双交换的原理敲除C.necator H16中基因组上的phaCAB基因片段，敲除过程如图2所示。
(1)含有敲除载体pK18-phaCABud的大肠杆菌即为接合转化的供体菌，野生型C.necator H16为受体菌，含有载体pRK2013的大肠杆菌T1 pRK2013为辅助菌；
(2)将供体菌在含有卡纳霉素(200μg/mL)的LB培养基中37℃培养12h；受体菌在含有庆大霉素(40μg/mL)的LB中30℃培养24h；
(3)分别取供体菌10mL，受体菌5mL和辅助菌10mL，4000rpm离心10min收集菌体；
(4)用5mL不含任何抗性的LB培养基重悬菌体，4000rpm离心10min再次收集菌体，用枪头吸净离心管底液体；
(5)加入30μL不含任何抗性的LB培养基重悬并混合菌体，将得到的混合菌液集中滴加在放有纤维滤纸的无抗LB固体平板培养基上，30℃下放置培养24h；
(6)用枪头将滤纸上的菌苔全部洗入1mL无菌水中，轻轻吹吸使菌液分布均匀，取100μL涂至含有卡纳霉素(200μg/mL)和庆大霉素(40μg/mL)的双抗LB固体平板上，30℃放置培养48h；
(7)挑取上述平板中生长的单克隆接种于含有卡纳霉素(200μg/mL)、庆大霉素(40μg/mL)的LB培养基中培养48～72h，取20μL转接无NaCl的10mL LB培养基中，取750μL保藏于40％的甘油中放置于-80℃冰箱中；
(8)将双抗培养基中生长的菌株接种于无NaCl 10mL LB培养基中培养48～72h，待菌株生长后，取100μL涂布于无NaCl的20％蔗糖LB板上；
(9)待无NaCl的20％蔗糖LB板长出单菌落后，挑取单菌落接种于含庆大霉素(40μg/mL)的LB培养基中；
(10)待菌株生长后，取750μL保藏于40％的甘油中放置于-80℃冰箱中，剩余菌液均用于提取基因组，利用引物pK18Y F和pK18Y R进行PCR验证，同时验证菌株是否存在卡那霉素抗性。验证正确获得H16△CAB菌株。
4.C.necator H16工程菌株的构建
4.1H16△CAB△ldh:PJn-amyl菌株的构建
利用双亲结合将α-淀粉酶基因amyl整合到H16△CAB基因组中：
(1)含有淀粉酶表达基因载体pK18-ldhud:PJn-amyl的供体菌大肠杆菌、受体菌H16△CAB、辅助菌T1 pRK2013划线，并按表1接种验证菌株是否存在干扰抗性。
表1菌株抗性和干扰抗性及浓度
(2)将供体菌、受体菌和辅助菌在相应的抗性中进行培养，待OD600到1.0左右时收菌。
(3)将供体菌、受体菌和辅助菌各取10mL，分别4000rpm离心10min收集菌体。
(4)用5mL不含任何抗性的LB培养基重悬菌体，4000rpm离心10min再次收集菌体，用枪头吸净离心管底液体。
(5)各加入30μL不含任何抗性的LB培养基重悬菌体，将得到的供体菌、受体菌和辅助菌菌液混合、有枪头搅拌均匀(不可吹吸，放置气泡进入干扰菌之间的接触)，然后集中滴加在放有纤维滤纸的无抗LB固体平板培养基上，30℃下放置培养24h.
(6)用枪头将滤纸上的菌苔全部洗入1mL无菌水中，轻轻吹吸使菌液分布均匀，将菌液做适当稀释(10-1)后取100μL涂至含有Cm 50μg/μL和Gm40μg/μL的双抗LB固体平板上，30℃放置培养48～72h。
(7)挑取上述平板中生长的单克隆接种于含有Cm 50μg/μL、Gm 40μg/μL和果糖的MSM培养基中培养24～48h，利用引物P2MY F和P2MY进行菌液PCR验证。验证正确的菌株进一步培养提取质粒进行PCR和测序验证。最终获得H16△CAB△ldh:PJn-amyl菌株。
4.2H16△CAB△ldh p2M-PJn-amyl菌株的构建
利用双亲结合将质粒p2M-PJn-amyl导入到H16△CAB菌株中：
(1)含有淀粉酶表达基因p2M-PJn-amyl的供体菌大肠杆菌、受体菌H16△CAB、辅助菌T1 pRK2013划线，并按表2接种验证菌株是否存在干扰抗性。
表2菌株抗性和干扰抗性及浓度
其他步骤与4.1的步骤(2)-步骤(7)相同。最终获得H16△CAB△ldh p2M-PJn-amyl菌株。
4.3H16△CAB△ldh:PJn-amyl p2M-PJn-amyl菌株的构建
利用双亲结合将p2M-PJn-amyl整合到H16△CAB△ldh:PJn-amyl菌株中：
(1)含有淀粉酶表达基因载体p2M-PJn-amyl的供体菌大肠杆菌、受体菌H16△CAB△ldh:PJn-amyl、辅助菌T1 pRK2013划线，并按表3接种验证菌株是否存在干扰抗性。
表3菌株抗性和干扰抗性及浓度
其他步骤与4.1的步骤(2)-步骤(7)相同。最终获得H16△CAB△ldh:PJn-amylp2M-PJn-amyl菌株。
5.工程罗氏真养产碱杆菌的培养
自-80℃取出罗氏真养产碱杆菌工程菌株，按照1％接菌量接菌至20mL以4g/L的果糖为碳源的MSM抗性培养基，该培养基含抗生素硫酸庆大霉素，简称Gm，终浓度为40μg/mL。30℃，200rpm摇床培养至OD600≈2.0。接种针蘸取菌液，三区划线至MSM Gm 40抗性板，封口膜封口后，于30℃培养箱倒置培养。待长出单菌落后，用接种针挑取单菌落接菌与20mL MSMGm 40液体培养基，作为一级种子液；30℃，200rpm摇床培养至OD600≈2.0，按照1％接菌量接菌至20mL MSM Gm 40液体培养基，作为二级种子液；30℃，200rpm摇床培养至OD600≈1.0，完成活化，可进行后续接合实验。
6.工程菌发酵试验
自接合板上挑取单菌落接种到20mL含0.5mol/L碳酸氢钠和2％甘油的MSM液体培养基中，作为发酵种子液，培养3d，至OD600为2.0以上。再取菌液转接到含1mol/L碳酸氢钠1mL和40％甘油1mL的100mL MSM发酵培养基中，控制初始OD600为0.8。培养24h后离心取上清作为粗酶液。用于酶活测定。
7.α-淀粉酶活测定
对于α-淀粉酶的测定，选用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法，DNS在碱性条件下与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显红棕色，在540nm处有最大吸收峰。
(1)葡萄糖标准曲线的绘制
①DNS法测定
稀释不同浓度的葡萄糖标准溶液：0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL。
CK组1.5mL离心管中加入100μL蒸馏水；测定组1.5mL离心管中加入不同浓度的葡萄糖标准溶液70μL，蒸馏水30μL。两组30℃静置2h。加100μL DNS终止反应，吹吸混匀。沸水浴5min，立即冰浴降温，使颜色稳定，短暂离心。用蒸馏水调零，于540nm下测吸光度。
②标准曲线绘制
将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078mg/mL的标准溶液，取250μL样本沸水浴5min作为对照管，以葡萄糖的浓度为x轴，OD540的吸光度为y轴，绘制标准曲线。使用索莱宝公司的α-淀粉酶活性检测试剂盒进行标准曲线的测定。
③计算公式
在分析条件下，每毫升α-淀粉酶酶液每分钟降解淀粉生成1μmoL还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
其中X：将OD代入标准曲线中所得还原糖的浓度，mg/mL；V：加入反应体系中样品的体积，70μL；M：还原糖(葡萄糖)的相对分子质量，180；T：反应时间，120min。
(2)制备酶液
取OD600＝2.0的等量菌液于2mL带盖离心管中，称重并配平，4℃，4000rpm，10min低温离心，收集上清。
(3)DNS法测α-淀粉酶酶活
对照组和实验组分别于1.5mL离心管中加入存放至4℃的酶液70μL。实验组于30℃预热。空白组沸水浴10min，冰浴冷却至室温，短暂离心。加入30μL 1％可溶性淀粉，混匀。30℃培养箱反应2h。加100μL DNS终止反应，吹吸混匀。沸水浴10min，立即冰浴降温，使颜色稳定，短暂离心。用蒸馏水调零，540nm下测吸光度。
实验结果如图6所示。在H16△CAB△ldh p2M-PJn-amyl、H16△CAB△ldh:PJn-amyl、H16△CAB△ldh:PJn-amyl p2M-PJn-amyl三种工程菌中均成功表达α-淀粉酶，且通过DNS法测定的酶活结果显示，在菌株H16△-CAB△ldh p2M-PJn-amyl、H16△CAB△ldh:PJn-amyl表达α-淀粉酶的效果无明显差别，分别为5.20μmol Glu/min/mL和5.16μmol Glu/min/mL，菌株H16△CAB△ldh:PJn-amylp2M-PJn-amyl表达的α-淀粉酶效果最好，酶活为6.09μmol Glu/min/mL，约是野生型菌株H16W p2M-PJn-amyl的2倍，为表达α-淀粉酶的最优菌株。由此说明，本发明制备的罗氏真养产碱杆菌重组工程菌能够很好的分泌α-淀粉酶，且酶活要明显优于野生型菌株。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种表达α-淀粉酶的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)扩增α-淀粉酶基因amyl、基因PJn-amyl、***质粒上下游同源臂基因phaCAB和ldh；
(2)将所述步骤(1)扩增得到的基因amyl和线性化载体p2M-PJn进行组装，得到重组质粒p2M-PJn-amyl；
(3)将所述步骤(1)扩增得到的***质粒上下游同源臂基因phaCAB与pK18框架进行组装，转化感受态细胞，得到重组***质粒pK18-phaCABud；
(4)将所述步骤(1)扩增得到的***质粒上下游同源臂基因ldh、基因PJ n-amyl与pK18框架进行组装，转化感受态细胞，得到重组***质粒pK18-ldhud:PJn-amyl；
(5)将含有所述步骤(3)的重组***质粒pK18-phaCABud的菌株作为供体菌，与受体菌和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到△CAB菌株；
(6)将含有所述步骤(2)的重组质粒p2M-PJn-amyl的菌株作为供体菌，与△CAB菌株和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到重组菌株△CAB△ldh p2M-PJn-amyl；
或者将含有所述步骤(4)的重组***质粒pK18-ldhud:PJn-amyl的菌株作为供体菌，与△CAB菌株和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到重组菌株△CAB△ldh:PJn-amyl；
(7)将含有所述步骤(2)的重组质粒p2M-PJn-amyl的菌株作为供体菌，与重组菌株△CAB△ldh:PJn-amyl和辅助菌混合培养，经抗性筛选、验证后，得到重组菌株△CAB△ldh:PJn-amyl p2M-PJn-amyl。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中α-淀粉酶基因amyl的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；基因PJn-amyl的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)***质粒上下游同源臂基因phaCAB的上游同源臂基因phaCAB-up的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游同源臂基因phaCAB-down的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中***质粒上下游同源臂基因ldh的上游同源臂基因如SEQ ID No.12所示，下游同源臂基因ldh-down的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的线性化载体p2M-PJn，其是以合成质粒p2M-PJn-vgb为模板，利用引物p2M-PJn RF和p2M-PJn RR扩增获得的；所述引物序列为：
p2M-PJn RF：5’-ATGTATATCTCCTTCTTAAAAGATCTTTTG-3’；
p2M-PJn RR：5’-CATTAATGAATCGGCCAACG-3’。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)和(4)中的pK18框架是以质粒pk18mobSacB为模板，利用引物pK18 RF和pK18 RR反向扩增得到；所述引物序列为：
pK18 RF：5’-GTCGACCTGCAGGCATGCAAGC-3’
pK18 RR：5’-GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGG-3’。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中的受体菌为罗氏真养产碱杆菌；所述辅助菌为含有载体pRK2013的大肠杆菌。
8.权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的重组菌株。
9.权利要求8所述的重组菌株在制备合成α-淀粉酶的生物催化剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重组菌株能够以甘油和CO2为原料合成α-淀粉酶。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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