CN117695405A - 一种包裹核酸药物的多肽递送***及其应用 - Google Patents
一种包裹核酸药物的多肽递送***及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117695405A CN117695405A CN202310632432.3A CN202310632432A CN117695405A CN 117695405 A CN117695405 A CN 117695405A CN 202310632432 A CN202310632432 A CN 202310632432A CN 117695405 A CN117695405 A CN 117695405A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- kkk
- sirna
- khw
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 152
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 151
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 150
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 42
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101710158773 L-ascorbate oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 17
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 12
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 claims description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 claims description 2
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 claims description 2
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 87
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 abstract description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 8
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 abstract description 4
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 abstract description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 abstract description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 32
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 18
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical group OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003963 dichloro group Chemical group Cl* 0.000 description 4
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- WMSUFWLPZLCIHP-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 9h-fluoren-9-ylmethyl carbonate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)ON1C(=O)CCC1=O WMSUFWLPZLCIHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- -1 cationic amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种包裹核酸药物的多肽递送***及其应用。所述多肽递送***中多肽结构为KW多肽、KHW多肽、KKK‑KW多肽或者KKK‑KHW多肽。本发明提供的多肽递送***中多肽由天然氨基酸组成，可以在细胞内进行生物降解，不会对目标细胞造成损伤，保证给药的安全性；可与RNA通过静电和氢键的相互作用缠绕，从而组装成包裹RNA的纳米颗粒，包封率高；并且可以同时携带多个不同靶向的siRNA，使其在同一靶向细胞中产生协同的基因沉默效应，提高RNAi的药物疗效；适用范围较广，可以用于包裹siRNA、mRNA、shRNA、microRNA、ASO或DNA等多种药物。
Description
技术领域
本发明涉及多肽递送***技术领域，尤其涉及一种包裹核酸药物的多肽递送***及其应用。
背景技术
分枝型多肽大分子其特性主要包括以下方面：(1)可与RNA通过静电和氢键的相互作用缠绕，从而组装成包裹RNA的纳米颗粒，包封率高且与细胞膜界面具有偏好性；(2)可选择性地靶向多种组织及细胞类型，可用于局部递送或全身递送；(3)可以同时携带多个不同靶向的siRNA，使其在同一靶向细胞中产生协同的基因沉默效应，提高RNAi的药物疗效；(4)适用范围较广，可以用于包裹siRNA、miRNA和mRNA等多种药物；(5)由天然氨基酸组成，可以在细胞内进行生物降解，毒性更低；(6)水溶性好。由于这些特性，使这种多肽大分子在生物、医药领域有着广泛的潜在应用。
但是目前分枝多肽合成存在以下问题：
(1)国内已报道的支链多肽合成方法较少。
(2)已报道的多肽固相合成方法，合成过程中连接下一个氨基酸时，直接加入氨基酸与缩合剂到多肽反应管中，反应不充分而造成副产物生成。
(3)已报道的多肽固相合成方法，纯度不高，存在三氟乙酸残留问题，若利用HPLC进行纯化，纯化效率低，产量损失大。
(4)已报道的多肽固相合成方法，最后得到的多肽含水，需要通过冻干技术来除水，比较耗时。
药物递送***是将药物输送到药物作用靶点的***，裸露的核酸药物容易被血浆和组织中的核酸酶降解，或被肾脏快速过滤清除排出体外使得核酸药物在体内循环的时间很短。药物递送***通常可以提高药物的稳定性，减少药物的降解，提高药物的生物利用度，提高靶区的药物浓度。因此核酸药物的递送需要合适的载体来提高递送效率。
按照不同递送技术分类，核酸药物递送平台可分为：病毒载体递送***，非病毒载体递送***(包括基于脂质的纳米颗粒、GalNAc共轭连接递送***以及基于肽的递送***)，其它递送***包括磁性纳米颗粒递送、原生质体递送以及基于超声、电穿孔或磁力的物理方法等。
基于多肽的基因递送***已成为一类新的非病毒载体，与聚合物和脂质载体相比，具有较好的生物相容性、设计多样性、易于合成和免疫反应风险较低等优点。然而，多肽递送体系近年来已成为医药领域的研究热点，有望为各种重大疾病的精准治疗提供新思路。合适的多肽递送***可以包裹核酸，保护核酸药物不受到核酸酶的降解，同时将核酸药物递送到细胞中。本发明旨在为核酸药物的递送提供一种安全有效的多肽纳米颗粒***。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种包裹核酸药物的多肽递送***及其应用，所述多肽递送***安全有效，可以有效保护核酸药物，提高核酸药物的稳定性，同时对细胞有较好的转染效率，且能在细胞中正常释放核酸药物，在核酸药物递送领域有着广泛的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种包裹核酸药物的多肽递送***，所述多肽递送***中多肽结构为KW多肽、KHW多肽、KKK-KW多肽或者KKK-KHW多肽；其中所述KKK-KW多肽或者KKK-KHW多肽的结构通式如下：
式中R为KW多肽或KHW多肽；所述KW多肽序列为KWHHHKWHHHKWHHHKWHHHK；KHW多肽序列为KHWHKHWHKHWWHKHWHK。
进一步地，所述多肽中带正电的赖氨酸、组氨酸与带负电的核酸药物通过静电相互作用结合，形成多肽纳米颗粒；所述多肽中色氨酸在细胞膜上起锚定作用。
作为优选，所述核酸药物选自siRNA、mRNA、shRNA、microRNA、ASO、DNA或质粒。进一步优选，所述核酸药物选自siRNA或mRNA。多肽与siRNA是以相互缠绕的方式形成相对不光滑的纳米颗粒，其中赖氨酸和组氨酸带有正电，并与核酸药物通过静电作用结合，色氨酸在细胞膜上起着锚定作用。
作为优选，所述KW多肽：siRNA的摩尔比为1～60：1～10；所述KKK-KW多肽：siRNA的摩尔比为1～20：1～10；所述KKK-KW多肽：mRNA的质量比为0.5～8：1。
作为优选，所述KHW多肽：siRNA的摩尔比为1～20：20～1；所述KKK-KHW多肽：siRNA的摩尔比为1～20：20～1；所述KKK-KHW多肽：mRNA的质量比为0.5～8：1。
本发明还提供所述的包裹核酸药物的多肽递送***的制备方法，所述方法操作如下：先将多肽溶于pH为2-5的水中配制成0.5-5mg/mL的多肽溶液，按照摩尔比将核酸药物与多肽混合静置，然后加入水或DMEM培养基静置5～25min，即可得到包裹核酸的多肽复合物溶液。
本发明还提供所述多肽递送***在siRNA转染、siRNA基因沉默、mRNA疫苗或CRISPR/Cas9基因编辑中的应用。优选在siRNA转染和siRNA基因沉默中的应用，其中转染和基因沉默的细胞选自Vero细胞、HEK293细胞、293T细胞、293A细胞、MDCK细胞、W2细胞、RPE细胞等中的任意一种，肿瘤细胞选自乳腺癌Hela细胞、胰腺癌PANC-1细胞、肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞等中的任意一种。
本发明还提供所述多肽递送***在制备预防或治疗感染性疾病、癌症或代谢性疾病的药物中的应用。
本发明提供的多肽传送***中多肽由天然氨基酸组成，可以在细胞内进行生物降解，不会对目标细胞造成无意的损伤，保证给药的安全性。本多肽递送***中有两个主要的结构域：一个是负责多肽自组装的氨基酸配对域，另一个是细胞渗透域，是细胞渗透的官能团或一组阳离子氨基酸。赖氨酸(K)：是带正电的碱性氨基酸，且侧链上的氨基可与其他氨基酸的羧基脱水缩合，形成支链多肽。色氨酸(W)由于其芳香性、扁平的刚性形状和π电子结构，在膜界面上有很强的偏好，并作为细胞膜上的锚点，从而增强肽-膜相互作用。组氨酸(H)被证明可以通过质子海绵效应增强内吞体膜的破坏。
多肽递送***通过局部或全身给药的方式将siRNA和mRNA递送至除肝脏外众多靶向器官，克服了药物的靶向性和稳定性障碍；并且可以同时携带多个不同靶向的siRNA，使其在同一靶向细胞中产生协同的基因沉默效应，提高RNAi的药物疗效；适用范围较广，可以用于包裹siRNA、mRNA、microRNA、ASO或DNA等多种药物。由于这些特性，使得KKK-KW和KKK-KHW多肽递送***在核酸药物领域有着广泛的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的多肽递送***能将核酸药物递送至细胞中，且递送效率、转染效果优于市售脂质体试剂，包封率高，毒性低。
本发明通过敲减实验结果证明，多肽递送***在胞内能正常释放siRNA，且siRNA的沉默效果优于市售脂质体试剂，该实验只需在常温下静置30分钟内即可完成。本发明通过马尔文粒径仪测试发现，上述纳米颗粒包裹核酸后直径约为100-200nm且包封率大于90％。
本发明公开的核酸-KKK-KW复合物能包裹siRNA和mRNA；能有效转染HEK293细胞和Vero细胞，转染效果优于商用转染试剂RNAiMAX和Lipo2000；体外转染siRNA基因沉默效率优于商用试剂Lipo2000，与RNAiMAX相当；粒径均一，电位为正；包封率高于90％；细胞毒性小，远低于Lipo2000。
本发明通过细胞毒性实验发现，KKK-KHW的细胞毒性同Lipo2000和RNAiMAX相当，对细胞毒性较小。通过血清酶降解实验发现KKK-KHW可以有效保护siRNA和mRNA，在孵育6h后几乎未被血清酶降解。
本发明中的KKK-KHW与siRNA在摩尔比为5：1时就可将siRNA完全包封，KKK-KHW与mRNA在比为2：1时可将其完全包封。KKK-KHW在siRNA低浓度和高浓度情况下转染效率均由于Lipo2000和RNAiMAX。KKK-KHW将siGFP递送至细胞内，可将敲低EGFP且抑制率约为40％。
附图说明
图1Fmoc4-KKK-OH的反应式；
图2Fmoc-KKK-OH的合成步骤；
图3R4-KKK-CONH2的合成步骤图；
图4是siRNA与KW多肽按不同摩尔比混合形成siRNA-KW复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图5是siRNA-KW复合物在不同siRNA浓度及不同细胞中的转染效率；
图6是siRNA与KKK-KW多肽按不同摩尔比混合形成siRNA-KKK-KW复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图7是siRNA-KKK-KW复合物在HEK293细胞中不同摩尔比的转染效率；
图8是siRNA-KKK-KW复合物在不同siRNA浓度及不同细胞中的转染效率；
图9是siRNA-KKK-KW复合物的体外转染基因沉默效率；
图10是siRNA-KKK-KW复合物的包封率的标准曲线；
图11是siRNA-KKK-KW复合物的细胞毒性及IC50值；
图12是mRNA与KKK-KW多肽按不同摩尔比混合形成mRNA-KKK-KW复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图13是mRNA-KKK-KW复合物的包封率的标准曲线；
图14是KKK-KHW对siRNA包裹能力检测电泳图
图15是KKK-KHW对mRNA包裹能力检测电泳图
图16是Vero细胞中KKK-KHW递送siRNA的递送效率
图17是Vero细胞中KKK-KHW递送siRNA的递送效率
图18是KKK-KHW递送siRNA的敲减效率
图19是KKK-KHW-siRNA血清酶降解水平；
图20是KKK-KHW的细胞毒性及IC50检测；
图21是KKK-KW和KKK-KHW递送mRNA的体外生物学活性检测；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。以下实施例涉及到的英文简写含义如表1所示。
表1
实施例1
一种四支链多肽R4-KKK-CONH2的制备方法，结构如下所示：
式中，K为赖氨酸，R为1～20种氨基酸不同排列组合的任意直链多肽序列，包括但不限定于KW序列(KWHHHKWHHHKWHHHKWHHHK)和KHW序列(KHWHKHWHKHWWHKHWHK)。
步骤1：合成多肽Fmoc-KKK-OH
在二氯树脂上接3个Fmoc-Lys(Boc)-OH：二氯树脂溶胀经，DMF清洗后接入第一个Fmoc-Lys(Boc)-OH；反应结束后依次经清洗、封端和清洗；然后脱保护再进行清洗，配制lys缩合液，连接个Fmoc-Lys(Boc)-OH，重复第二个lys步骤连接第3个Fmoc-Lys(Boc)-OH，经清洗后进行裂解，裂解反应后进行沉淀；沉淀溶解后再去除TFA，然后沉淀和除水，得到多肽Fmoc-KKK-OH。
步骤1中每加入一个氨基酸的量为二氯树脂量的4eq；
步骤1中涉及的封端方法为：加入AcOH的量为二氯树脂量*4eq，然后加TEA*8eq；所述步骤3中涉及的封端方法为：加入AcOH的量为AM树脂量*4eq，AcOH先和HBTU反应10min，然后加DIPEA。
Fmoc-KKK-OH的LC-MS检测如图3所示：选择正离子模式，m/z范围：200～800，Frag＝15.0V。
LC-MS结果分析：Fmoc-KKK-OH的精确分子量为：624.4。检测分子量为：625.2[M+H]+，313.2[M+2H]2+，209.0[M+3H]3+，合成的Fmoc-KKK-OH结构正确。
步骤2：合成主链Fmoc4-KKK-OH
Fmoc-KKK-OH与Fmoc-OSu在碱性条件下反应生产Fmoc4-KKK-OH反应式如图1所示。
(1)将Fmoc-KKK-OH溶于10mLTHF+10mLMeOH中，加入455μl TEA，放入圆底烧瓶；把Fmoc-OSu加入10mLTHF并放入恒压滴液漏斗中，置于圆底烧瓶上，缓慢滴加20min，滴加完后室温搅拌反应2h。
(2)旋转蒸发溶剂浓缩至5ml，加入30mLEA，10mLPE混匀，放置-20℃冰箱过夜，等待沉淀析出。
(3)12000r/min，离心2min，去上清，固体用3mLDCM+1mLMeOH超声溶解，加入30mLEA，混匀后离心，去上清，此步骤重复3～4次，爬板看是否除杂干净。
(4)Fmoc4-KKK-OH的LC-MS检测如图5所示：选择负正离子模式，m/z范围：900～1400，Frag＝15.0V。
LC-MS结果分析：Fmoc4-KKK-OH的精确分子量为：1290.57。检测分子量为：1289.4[M-H]-，1325.4[M+Cl]-，合成的Fmoc4-KKK-OH结构正确。
步骤3：合成四支链多肽R4-KKK-CONH2
AM树脂溶胀、DMF清洗、脱保护、再经清洗后，配制缩合液接入Fmoc4-KKK-OH，反应结束后依次经清洗、封端和清洗，然后脱保护再进行清洗，配制侧链第一个氨基酸缩合液接入第一个侧链氨基酸，经清洗后重复上述步骤同时合成4个R侧链，反应结束后经清洗后进行裂解；裂解反应后进行沉淀；沉淀溶解后再去除TFA，然后沉淀和除水，得到四支链多肽R4-KKK-CONH2；
步骤1和步骤3中涉及的清洗方法为：2次DMF清洗，2次DCM溶胀，2次EtOH收缩，DCM溶胀和DMF清洗；使用量没过树脂即可。
步骤1和步骤3中连接下一个氨基酸时，需要提前配制氨基酸缩合液，将氨基酸与HBTU按物质的量比1：1溶于DMF中单独反应10min，然后倒入多肽反应管中，再加入DIPEA。这DIPEA配制过程如下：DIPEA：DMF体积比174：826，加的量是每0.1mmol氨基酸加0.6ml。
步骤1和步骤3中裂解反应后进行沉淀；沉淀溶解后去除TFA，然后再沉淀和除水，具体操作如下：裂解后采用冰***进行沉淀，1-5℃下析出沉淀，离心分离得到沉淀；
沉淀物去除TFA：采用少量MeOH超声溶解离心后的沉淀，滴加微量TEA与TFA反应成盐，然后滴加到30倍体积EA中析出沉淀，12000r/min离心2min，离心后的沉淀用MeOH溶解后滴加TEA，再滴加到EA中析出沉淀后离心，重复2～3次直到滴加TEA不再冒白烟，此时完全除去多肽中的TFA残留，收集离心后的沉淀。
沉淀物去除TFA后收集的沉淀采用少量MeOH超声溶解，然后进行旋转蒸发至透明膜状，然后加入PE和EA析出白色浑浊，旋干得白色粉末状多肽。此步骤通过多次有机溶剂溶解沉淀并旋干可将产物中的水带出，达到除水的目的，产物后续不需要再经过冻干处理。
Fmoc-KKK-OH的合成步骤如图2所示，R4-KKK-CONH2的合成步骤如图3所示。
实施例2 KKK-KW多肽的制备
四支链多肽KW4-KKK-CONH2的合成方法，结构如下所示，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1：合成多肽Fmoc-KKK-OH；
步骤2：合成主链Fmoc4-KKK-OH；
步骤3：合成四支链多肽KW4-KKK-CONH2；
LC-MS检测：选择正离子模式，m/z范围：100～2200，Frag＝100.0V。
LC-MS结果分析：KW4-KKK-CONH2的精确分子量为：12524.32。检测分子量为：118.1[M+107H]107+，235.3[M+59Na]59+，合成的KW4-KKK-CONH2结构正确。
HPLC检测条件及结果：
柱子：C8(10*250mm，5μm)；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：220nm；流动相：A0.05％磷酸水溶液，B HPLC甲醇；方法：0→20min，65％A→40％A，20→30min，40％A→0％A；保留时间：7.328min；纯度：99.1％。
实施例3 KKK-KHW的制备
四支链多肽KHW4-KKK-CONH2的合成方法，结构如下所示，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1：合成多肽Fmoc-KKK-OH
步骤2：合成主链Fmoc4-KKK-OH
步骤3：合成四支链多肽KHW4-KKK-CONH2
LC-MS检测：选择正离子模式，m/z范围：200～1400，Frag＝50.0V。
LC-MS结果分析：KHW4-KKK-CONH2的精确分子量为：11963.97。检测分子量为：227.2[M+53H]53+，268.1[M+52K]52+，317.1[M+43K]43+，380.8[M+35K]35+，449.3[M+28Na]28+，542.4[M+23Na]23+，704.2[M+17H]17+，合成的KHW4-KKK-CONH2结构正确。
HPLC检测条件及结果：
柱子：C8(10*250mm，5μm)；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：220nm；流动相：A0.05％磷酸水溶液，B HPLC甲醇；方法：0→20min，65％A→40％A，20→30min，40％A→0％A；保留时间：7.548min；纯度：99.1％。
实施例4核酸多肽复合物的制备
先将多肽(KW、KHW、KKK-KHW或KKK-KW)溶于pH为2-4的水中配制成1mg/mL的多肽溶液，按照摩尔比将mRNA、siRNA或者siRNA-FAM(200nM)与多肽溶液混合静置5min，然后加入一定量的水或DMEM培养基静置5～25min，即可得到核酸-KKK-KW复合物溶液。
本实施例采用的siRNA的基因名称GFP-1，其正链的碱基顺序如下，siRNA为擎科生物合成。
正链5’-3’GGCUACGUCCAGGAGCGCA
反链5’-3’UGCGCUCCUGGACGUAGCC
实施例5研究siRNA与KW多肽、KKK-KW多肽的结合能力
利用琼脂糖凝胶电泳技术(1.2％w/v，1×TBE，55V，1h)，分别研究了siRNA与KW多肽、KKK-KW多肽在一系列不同摩尔比下的结合能力。凝胶阻滞实验的原理为：单独的siRNA由于尺寸小和带负电荷，很容易通过凝胶迁移；当siRNA与多肽没有结合或结合不完全时，由于尺寸小和带负电荷，很容易通过凝胶迁移，显示的荧光强度较强；当阳离子siRNA-多肽复合物含正电荷和尺寸较大时，它们通过凝胶的迁移受到阻碍，因此，在琼脂糖凝胶中检测到的游离siRNA将减少，显示的荧光强度减弱；当siRNA-多肽复合物全部结合时，在琼脂糖凝胶检测不到游离siRNA，荧光不显示。
如图4所示，第1道，siRNA由于其体积小且带负电荷，很容易通过凝胶迁移。随之摩尔比的增大，由于阳离子siRNA-KW复合物的尺寸较大和正电荷，它们在凝胶中的迁移受到阻碍，荧光强度逐渐减弱。当siRNA：KW摩尔比为1：30时，siRNA分子与KW多肽完全结合，因此在琼脂糖凝胶中未检测到游离的siRNA。故当siRNA：KW摩尔比大于1：30时，siRNA分子都能与KW多肽完全结合。
如图6所示，第1道为siRNA，随之摩尔比的增大，当siRNA：KKK-KW摩尔比为1：10时，siRNA分子与KKK-KW多肽完全结合，因此在琼脂糖凝胶中未检测到游离的siRNA。故当siRNA：KKK-KW摩尔比大于1：10时，siRNA分子都能与KKK-KW多肽完全结合。
实施例6 siRNA-KW复合物在不同siRNA浓度及不同细胞中的转染效率的考察
同时考察HEK293和Vero两种细胞的转染效率。将带有荧光标记的siRNA-FAM与KW多肽按照摩尔比1：30配备siRNA-KW复合物，分别接种于24孔板的细胞中进行转染，37℃培养24h后去掉培养基，用PBS清洗细胞三次，用胰酶消化细胞，每孔加入150uL的PBS将细胞吹匀，取20uL细胞悬液加入细胞计数板中，用细胞计数仪Count Star S2的“GFP模式”进行转染率检测。
如图5所示，siRNA-KW复合物可进行细胞转染，在Vero细胞中转染效率比商用转染试剂RNAiMAX低，在HEK293细胞中转染效率比商用转染试剂RNAiMAX高。
实施例7 siRNA-KKK-KW复合物在HEK293细胞中不同摩尔比转染效的考察
将带有荧光标记的siRNA-FAM(200nM)与KKK-KW多肽按照一系列摩尔比1：10、1：12、1：14、1：16配备siRNA-KKK-KW复合物，加入到24孔板的HEK293细胞中进行转染，37℃培养24h后去掉培养基，用PBS清洗细胞三次，用胰酶消化细胞，每孔加入150uL的PBS将细胞吹匀，取20uL细胞悬液加入细胞计数板中，用细胞计数仪Count Star S2的“GFP模式”进行转染率检测，当siRNA-KKK-KW复合物转染进入细胞中，在曝光强度4000下可看到明场中的细胞和暗场中的荧光相对应，并通过检测荧光值来显示转染效率。
如图7所示，在HEK293细胞中，KKK-KW多肽对siRNA的转染效率远高于商用转染试剂RNAiMAX和Lipo2000，KKK-KW多肽的最高转染效率为80.2％。
实施例8 siRNA-KKK-KW复合物在不同siRNA浓度及不同细胞中的转染效率的考察
将带有荧光标记的siRNA-FAM(50nM、100nM、200nM)分别与KKK-KW多肽按照摩尔比1：16配制siRNA-KKK-KW复合物，分别接种于24孔板的HEK293细胞和Vero细胞中进行转染，37℃培养24h后去掉培养基，用PBS清洗细胞三次，用胰酶消化细胞，每孔加入150uL的PBS将细胞吹匀，取20uL细胞悬液加入细胞计数板中，用细胞计数仪Count Star S2的“GFP模式”进行转染率检测，当siRNA-KKK-KW复合物转染进入细胞中，在曝光强度4000下可看到明场中的细胞和暗场中的荧光相对应，并通过检测荧光值来显示转染效率。
如图8所示，在HEK293细胞和Vero细胞中，KKK-KW多肽对siRNA的转染效率比商用转染试剂RNAiMAX和lipo2000都高。
实施例9 siRNA-KKK-KW复合物的体外转染基因沉默效率的考察
将Vero细胞以每孔1.5*105个/孔的细胞量接种于24孔板中，并孵育24h。接下来，用商用试剂EL转染PEGFP-N3质粒进入Vero细胞，4～6h后进行清洗换液，用不同递送***Lipo2000、KKK-KW、RNAiMAX分别转染siGFP(100nM、200nM)，在37℃培养24小时后去掉培养基，用PBS清洗细胞三次，用胰酶消化细胞，每孔加入150uL的PBS将细胞吹匀，取20uL细胞悬液加入细胞计数板中，用细胞计数仪Count Star S2的“GFP模式”进行转染率检测，当siRNA-KKK-KW复合物转染进入细胞中，在曝光强度500下可看到明场中的细胞和暗场中的荧光相对应，并通过检测荧光值来显示转染效率。
体外转染研究了siRNA-KKK-KW复合物在siRNA水平上沉默EGFP基因的效率。以RNAiMAX和Lipo2000为阳性对照。如图9所示，在Vero细胞中，siRNA-KKK-KW复合物在摩尔比1：16时诱导EGFP基因沉默效率达到53％，siRNA-RNAiMAX复合物诱导EGFP基因沉默率为65％，siRNA-Lipo2000复合物诱导EGFP基因沉默率为51％。结果表明KKK-KW多肽可以有效地将siRNA递送到细胞质中，并诱导特异性基因沉默，且KKK-KW多肽的基因沉默效率优于商用试剂Lipo2000，与RNAiMAX相当。
实施例10 siRNA-KKK-KW复合物的粒径、PDI及电位检测
将siRNA(200nM)与KKK-KW多肽按照一系列摩尔比1：10、1：12、1：14、1：16配备siRNA-KKK-KW复合物，静置5min后加入到无酶无菌水中，混匀后进行粒径、PDI及电位的检测。
如表2所示，在最佳摩尔比1：16时，siRNA-KKK-KW复合物在水中的粒径为231.4nm，PDI为0.3877，电位为35.65mV。
表2
实施例11 siRNA-KKK-KW复合物的包封率检测
采用Quant-it试剂盒的方法检测siRNA-KKK-KW复合物的包封率。将Quant-itreagent solution加入到1×TE buffer中配制成反应液，将不同摩尔比下的siRNA-KKK-KW复合物与反应液混合静置5min，加入到酶标板中，在激发波长485nm，发射波长520nm，用酶标仪检测荧光值。
计算公式：包封率＝1-(测得的游离RNA荧光值-空白/总RNA荧光值-空白)*100％。
如表3和图10所示，siRNA-KKK-KW复合物的包封率大于90％，在摩尔比1：16时，包封率高达94.6％。
表3
实施例12 siRNA-KKK-KW复合物的细胞毒性及IC50值的检测
用Vero细胞铺2个96孔板，每孔需要8000个细胞，每个板留出1列空白组不铺细胞。在37℃培养24h后给药。细胞毒性的检测需8个实验组，分别为给药组siRNA-KKK-KW、siRNA-RNAiMAX、siRNA-Lipo2000、KKK-KW、Lipo2000、RNAiMAX，对照组Cell和空白组Blank。IC50的检测实验分别设置给药组0.1uM、0.5uM、1uM、10uM、25uM、50uM、75uM、100uM，对照组Cell和空白组Blank。再培养24h后，将细胞板取出，每孔加入10uLCCK-8，37℃孵育1h，然后使用450nm波长的酶标仪进行检测。
细胞存活率＝(给药组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)*100％
如图11所示，在Vero细胞中siRNA-KKK-KW复合物的细胞毒性低于siRNA-Lipo2000，与siRNA-RNAiMAX相当。如图11所示，siRNA-KKK-KW复合物的IC50为56.38uM。
实施例13研究mRNA与KKK-KW多肽的结合能力
利用琼脂糖凝胶电泳技术(1.2％w/v，1×TBE，55V，1h)，研究了一个编码新冠病毒S蛋白的mRNA与KKK-KW多肽在一系列不同质量比下的结合能力。所述mRNA为表达新冠病毒原始株S蛋白RBD区域的mRNA。
如图12所示，当mRNA：KKK-KW质量比大于1：2时，mRNA分子都能与KKK-KW多肽完全结合。
实施例14 mRNA-KKK-KW复合物的粒径、PDI及电位检测
将mRNA(200nM)与KKK-KW多肽按照质量比1：2和1：4分别配备mRNA-KKK-KW复合物，静置5min后加入到无酶无菌水中，混匀后进行粒径、PDI及电位的检测。
如表4所示，在质量比1：2时，mRNA-KKK-KW复合物在水中的粒径为180.8nm，PDI为0.1655，电位为15.63mV；在质量比1：4时，mRNA-KKK-KW复合物在水中的粒径为211nm，PDI为0.258，电位为19.89mV。
表4
实施例15 mRNA-KKK-KW复合物的包封率检测
采用Quant-it试剂盒的方法检测mRNA-KKK-KW复合物的包封率。
计算公式：包封率＝1-(测得的游离RNA荧光值-空白/总RNA荧光值-空白)*100％。
如表5和图13所示，mRNA-KKK-KW复合物在质量比1：2时，包封率为91.27％，在质量比1：4时，包封率为81.86％。
表5
实施例16 KKK-KHW对siRNA包裹能力的检测
采用琼脂糖凝胶电泳实验研究KKK-KHW、KHW侧链在不同摩尔比下对siRNA的包裹能力。siRNA：KKK-KHW的摩尔比选择为1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10；siRNA：KHW侧链的摩尔比选择为1：5、1：10、1：16、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60。配制1.2％的琼脂糖凝胶，将多肽粉末溶解为1ug/uL，按照以上摩尔比混合KKK-KHW和siRNA，常温静置30min后加入DNAloadingbuffer，将样品加入孔中。电压为80V，跑胶1h后将凝胶置于凝胶成像仪下进行观察，被KKK-KHW包裹完全后的复合物由于粒径大于琼脂糖凝胶的孔径，故不会跑出胶孔。确定siRNA：KKK-KHW在摩尔比为1：5时被完全包裹，siRNA：KHW侧链在摩尔比为1：30时被完全包裹，结果如图14所示。
实施例17 KKK-KHW对mRNA包裹能力的检测
采用琼脂糖凝胶电泳实验研究KKK-KHW在不同质量比下对mRNA的包裹能力。mRNA：KKK-KHW的质量比选择为2：1、1：1、1：2、1：4、1：6、1：8。配制1.2％的琼脂糖凝胶，将多肽粉末溶解为1ug/uL，按照以上质量比混合KKK-KHW和mRNA，常温静置30min后加入DNAloadingbuffer，将样品加入孔中。电压为80V，跑胶1h后将凝胶置于凝胶成像仪下进行观察，被KKK-KHW包裹完全后的复合物由于粒径大于琼脂糖凝胶的孔径，故不会跑出胶孔。确定mRNA：KKK-KHW在质量比为1：2时被完全包裹，如图15所示。
实施例18 KKK-KHW包裹siRNA和mRNA的纳米颗粒粒径大小、PDI及电位检测
siRNA：KKK-KHW按照1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10摩尔比进行配制，静置10min后加入1mL水，再次静置10min。将待测液用注射器加入一次性折叠式毛细管比色皿，使用马尔文粒度仪进行粒径和电位的检测。参数设置时，材料选择蛋白质。分散体系为水，温度为25℃，平衡时间为60s。测得KKK-KHW与siRNA在摩尔比为1：5时粒径为267.3nm。mRNA：KKK-KHW按照1：2、1：4的质量比进行配制，溶剂为水或DMEM。siRNA、mRNA与KKK-KHW组成的纳米颗粒在水中颗粒均匀且粒径较小，如表6和表7所示。
表6
表7
实施例19 KKK-KHW包裹siRNA和mRNA的包封率测定
RiboGreen染料在与RNA结合时表现出荧光特质，荧光信号强度与RNA浓度呈正相关，通过荧光信号强度反映RNA的浓度。将检测试剂盒从冰箱取出，室温放置30min。将20*TEbuffer稀释为1*TE buffer，用1*TE buffer稀释Quant-it reagent。KKK-KHW与siRNA和mRNA混合后静置20min，取一个黑色96孔酶标板，每孔加入198uL稀释后的Quant-itreagent solution，再加入2uL待测样品，每个样品做6个复孔，同时设置裸RNA组和仅多肽的对照组。孵育5min后检测，荧光酶标仪上测量样品的荧光，荧光激发波长485nm，发射波长520nm。结果显示KKK-KHW包裹siRNA的包封率均大于95％，KKK-KHW包裹mRNA的包封率约为90％。如表8所示。
表8
实施例20 Vero细胞中KKK-KHW递送siRNA的递送效率检测
使用万分之一天平称量1mg KKK-KHW到离心管中，用1mL灭菌水(pH＝3)溶解KKK-KHW，涡旋混匀。siRNA-FAM干粉按照标识加入DEPC水，溶解至20uM。Vero细胞铺板，细胞量为1.5*105个/孔，铺板后培养18-24h。siRNA在24孔板中的终浓度为50nM、100nM、200nM，KKK-KHW按照摩尔比1：7和1：10的比例与siRNA混合静置5min，静置完成后加入100uL opti-MEM培养基，再静置15min后将混合物加入24孔板。对照组为Lipo2000和RNAiMAX组，siRNA在24孔板中的终浓度为50nM、100nM、200nM，50nM时Lipo2000和RNAiMAX的使用量为1uL/孔，100nM时Lipo2000和RNAiMAX的使用量为2uL/孔，200nM时Lipo2000和RNAiMAX的使用量为3uL/孔，转染方法参照说明书。转染后24h，将24孔板中的培养基弃去，用PBS清洗细胞3次，将PBS弃去后每孔加入100uL胰酶，润洗后将胰酶弃去消化3min。每孔加入150uLPBS将细胞重悬，取20uL细胞液加入细胞计数板中，使用Countstar细胞分析仪的GFP模块进行分析。结果如图16和图17所示，KKK-KHW和KKK-KW的转染效率优于Lipo2000和RNAiMAX。
实施例21 KKK-KHW递送siRNA的敲减效率检测
Vero细胞铺板，细胞量为1.5*105个/孔，铺板后培养18-24h。使用转染试剂EL(TRANS)将pEGFP-N3按照说明书步骤转染至细胞内，每孔的pEGFP-N3为1ug。质粒转染6h后进行siRNA转染。转染前用1*PBS洗板3遍，排除EL转染试剂的影响。siGFP在24孔板中的终浓度为100nM、200nM，KKK-KHW按照摩尔比1：10的比例与siRNA混合静置5min，静置完成后加入100uL opti-MEM培养基，再静置15min后将混合物加入24孔板。对照组为Lipo2000和RNAiMAX组。将24孔板中的培养基弃去，用PBS清洗细胞3次，将siRNA混合物加入孔板中。24h后使用Countstar细胞分析仪的GFP模块进行分析。结果显示KKK-KHW递送的siRNA能敲减EGFP抑制其荧光蛋白的表达。如图18所示。
实施例22 KKK-KHW-siRNA血清酶降解水平检测
KKK-KHW-siRNA实验组(10％FBS)，取12μLKKK-KHW+3μLsiRNA，混合5min。取15μL加入15μLDMEM(50％FBS)于200μLEP管中混合，37℃孵育0h，2h，6h。siRNA对照组取3μL siRNA加入12uL DEPC水，取15μL加入15μLDMEM(50％FBS)于200μLEP管中混合，37℃孵育0h，2h，6h。对照组取12μL KKK-KHW加入3uL DEPC水，取15μL加入15μLDMEM(50％FBS)于200μLEP管中混合，37℃孵育0h，2h，6h。配置浓度为1％的琼脂糖凝胶。上样前实验组取出10uL样品加入2uL 1％的SDS解聚，混匀室温孵育2min。每孔加入10uL样品，琼脂糖凝胶电泳30min。KKK-KHW可以有效保护siRNA不被血清酶降解，如图19所示。
实施例23 KKK-KHW的细胞毒性及IC50检测
Vero细胞铺96孔板，每孔8000个细胞，96孔板的四周用100uLPBS补齐，留出1列空白组不铺细胞。24h给药，siRNA终浓度为100nM，每个样品6个复孔。24h后检测细胞毒性，将细胞板取出，每孔加入10uLCCK-8，37℃孵育1h；1h后使用450nm波长的酶标仪进行检测；计算细胞存活率＝(给药组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)*100％，结果如图20所示。
实施例24 KKK-KW和KKK-KHW递送mRNA的体外生物学活性检测
使用KKK-KHW、KKK-KW和Lipo2000转染试剂、将mRNA(新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Spike蛋白受体结合区域)引入293A细胞，培养后取上清液，采用直接ELISA法检测RBD蛋白的表达。首先将HEK293细胞以每孔3*105个/孔的细胞量接种于12孔板中，37℃，5％CO2培养24小时后，备用。将KKK-KW和KKK-KHW溶解为1ug/uL，mRNA(3ug/孔)与KKK-KHW(12ug/孔)和KKK-KW(12ug/孔)的混合质量比为1：4，在Opti-MEM中混合室温静置20min，加入细胞板。Lipo2000与mRNA的混合质量比为1：1，按照lipo2000说明书混合后室温静置20min，加入细胞板。37℃培养24h后，离心收集细胞上清，ELISA检测RBD蛋白的表达。按照说明书制备标准曲线，检测样品准备，用1×稀释缓冲液将待测细胞上清稀释至适合浓度，记录稀释倍数。检测样品处理：洗板：用1×洗涤缓冲液洗板三次。样本孵育：每孔加入100μl对照品、待测样品、Lipo2000 Only样品和标准曲线各浓度标准品溶液，ELISA空白对照加入100μl 1×稀释缓冲液，双复孔方式加入酶标板中，用封板膜封上，25℃孵育2小时。洗板：用1×洗涤缓冲液洗板三次。酶标检测抗体孵育：除ELISA空白对照孔外，每孔加入100μl预先配制至工作浓度的检测抗体，ELISA空白对照加入100μl 1×稀释缓冲液,用封板膜封上，25℃孵育1小时。洗板：用1×洗涤缓冲液洗板三次。显色：将预先配制的底物液每孔200μl加入到酶标板中，25℃避光孵育20分钟。终止：每孔加入50μl终止液至酶标板中。多功能酶标仪上设置检测波长450nm，测定其吸收值。如图21结果显示KKK-KHW和KKK-KW均能将mRNA递送至细胞内并正常表达，其中KKK-KHW的效果优于KKK-KW。
综上，本发明提供的多肽递送***能通过局部或全身给药的方式将siRNA和mRNA递送至除肝脏外众多靶向器官，克服了药物的靶向性和稳定性障碍；并且可以同时携带多个不同靶向的siRNA，使其在同一靶向细胞中产生协同的基因沉默效应，提高RNAi的药物疗效；适用范围较广，可以用于包裹siRNA、mRNA、microRNA、ASO或DNA等多种药物。由于这些特性，使得KKK-KW和KKK-KHW多肽递送***在核酸药物领域有着广泛的应用前景。
需要说明的是上述实施例仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种包裹核酸药物的多肽递送***，其特征在于，所述多肽递送***中多肽为KW多肽、KHW多肽、KKK-KW多肽或者KKK-KHW多肽；其中所述KKK-KW多肽或者KKK-KHW多肽的结构通式如下：
式中R为KW多肽或KHW多肽；所述KW多肽序列为KWHHHKWHHHKWHHHKWHHHK；KHW多肽序列为KHWHKHWHKHWWHKHWHK。
2.根据权利要求1所述的包裹核酸药物的多肽递送***，其特征在于，所述多肽中带正电的赖氨酸、组氨酸与带负电的核酸药物通过静电相互作用结合，形成多肽纳米颗粒；所述多肽中的色氨酸在细胞膜上起锚定作用。
3.根据权利要求1所述的包裹核酸药物的多肽递送***，其特征在于，所述核酸药物选自siRNA、mRNA、shRNA、microRNA、ASO、DNA或质粒。
4.根据权利要求1所述的包裹核酸药物的多肽递送***，其特征在于，所述核酸药物选自siRNA或mRNA。
5.根据权利要求4所述的包裹核酸药物的多肽递送***，其特征在于，所述KW多肽：siRNA的摩尔比为1～60：1～10；所述KKK-KW多肽：siRNA的摩尔比为1～20：1～10；所述KKK-KW多肽：mRNA的质量比为0.5～8：1。
6.根据权利要求4所述的包裹核酸药物的多肽递送***，其特征在于，所述KHW多肽：siRNA的摩尔比为1～20：20～1；所述KKK-KHW多肽：siRNA的摩尔比为1～20：20～1；所述KKK-KHW多肽：mRNA的质量比为0.5～8：1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的包裹核酸药物的多肽递送***的制备方法，其特征在于，所述方法操作如下：先将多肽溶于pH为2-5的水中配制成0.5-5mg/mL的多肽溶液，按照摩尔比或质量比将核酸药物与多肽混合静置，然后加入水或培养基中静置5～25min，即可得到包裹核酸的多肽复合物溶液。
8.如权利要求1-6任一项所述的多肽递送***在mRNA疫苗、siRNA治疗、siRNA基因沉默、RNA转染或CRISPR/Cas9基因编辑中的应用。
9.如权利要求1-6任一所述的多肽递送***在制备预防或治疗感染性疾病、癌症或代谢性疾病的药物中的应用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2022117327373 | 2022-12-30 | ||
| CN202211732737 | 2022-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117695405A true CN117695405A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90157626
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310023681.2A Active CN117700490B (zh) | 2022-12-30 | 2023-01-09 | 一种四支链多肽及其制备方法 |
| CN202310632432.3A Pending CN117695405A (zh) | 2022-12-30 | 2023-05-31 | 一种包裹核酸药物的多肽递送***及其应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310023681.2A Active CN117700490B (zh) | 2022-12-30 | 2023-01-09 | 一种四支链多肽及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN117700490B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101060849A (zh) * | 2004-11-17 | 2007-10-24 | 巴尔的摩马里兰大学 | 作为有效的siRNA载体的高分支HK肽 |
| US20140350082A1 (en) * | 2011-11-24 | 2014-11-27 | Pu Chen | PEPTIDE SEQUENCE DESIGN AND USE THEREOF FOR PEPTIDE-MEDIATED siRNA DELIVERY |
| US20170119900A1 (en) * | 2013-12-18 | 2017-05-04 | Pu Chen | Peptide, Complex of Peptide and SiRNA and Use Thereof |
| US20220389059A1 (en) * | 2019-03-08 | 2022-12-08 | The Queen's University Of Belfast | A peptide for the delivery of anionic materials |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2171531C (en) * | 1993-09-13 | 2005-11-22 | Jean Marc Sabatier | Multiple branch peptide constructions for use against hiv |
| US7070807B2 (en) * | 1999-12-29 | 2006-07-04 | Mixson A James | Branched histidine copolymers and methods for using same |
| RU2771605C2 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-05-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Пептиды для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот |
-
2023
- 2023-01-09 CN CN202310023681.2A patent/CN117700490B/zh active Active
- 2023-05-31 CN CN202310632432.3A patent/CN117695405A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101060849A (zh) * | 2004-11-17 | 2007-10-24 | 巴尔的摩马里兰大学 | 作为有效的siRNA载体的高分支HK肽 |
| US20140350082A1 (en) * | 2011-11-24 | 2014-11-27 | Pu Chen | PEPTIDE SEQUENCE DESIGN AND USE THEREOF FOR PEPTIDE-MEDIATED siRNA DELIVERY |
| US20170119900A1 (en) * | 2013-12-18 | 2017-05-04 | Pu Chen | Peptide, Complex of Peptide and SiRNA and Use Thereof |
| US20220389059A1 (en) * | 2019-03-08 | 2022-12-08 | The Queen's University Of Belfast | A peptide for the delivery of anionic materials |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JIAXI HE等: "Location of a single histidine within peptide carriers increases mRNA delivery", J GENE MED, vol. 23, no. 2, 21 December 2020 (2020-12-21), pages 1 - 11 * |
| PATRICK MIDOUX等: "Efficient Gene Transfer by Histidylated Polylysine/pDNA Complexes", BIOCONJUGATE CHEM, 11 March 1999 (1999-03-11), pages 406 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117700490B (zh) | 2024-06-11 |
| CN117700490A (zh) | 2024-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kurosaki et al. | Ternary complexes of pDNA, polyethylenimine, and γ-polyglutamic acid for gene delivery systems | |
| Tripathi et al. | Linear polyethylenimine-graft-chitosan copolymers as efficient DNA/siRNA delivery vectors in vitro and in vivo | |
| AU2005294699B2 (en) | Biodegradable cationic polymers | |
| Hu et al. | Intracellular pathways and nuclear localization signal peptide-mediated gene transfection by cationic polymeric nanovectors | |
| Shigeta et al. | Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte-selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells | |
| Aravindan et al. | Effect of acyl chain length on transfection efficiency and toxicity of polyethylenimine | |
| CN109355310B (zh) | Ros响应的基因递送载体及其制备方法和应用 | |
| CN106890343B (zh) | 一种靶向型多肽纳米基因载体复合物 | |
| Cheng et al. | The effect of guanidinylation of PEGylated poly (2-aminoethyl methacrylate) on the systemic delivery of siRNA | |
| CN110746599B (zh) | 具有高效基因递送能力的UV光响应性超支化聚β-氨基酯及其制备方法与应用 | |
| Wang et al. | Functionalized O-carboxymethyl-chitosan/polyethylenimine based novel dual pH-responsive nanocarriers for controlled co-delivery of DOX and genes | |
| Gao et al. | A “self-accelerating endosomal escape” siRNA delivery nanosystem for significantly suppressing hyperplasia via blocking the ERK2 pathway | |
| CN102250348B (zh) | 一种聚乙烯亚胺衍生物及其作为基因传递的载体 | |
| CN104419004B (zh) | 改性聚乙烯亚胺及其制备方法和基因转染试剂及其应用 | |
| WO2022262050A1 (zh) | 一种非病毒载体及其制备方法与应用 | |
| CN106086079B (zh) | 多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用 | |
| Eldredge et al. | Focused library approach to discover discrete dipeptide bolaamphiphiles for siRNA delivery | |
| CN117695405A (zh) | 一种包裹核酸药物的多肽递送***及其应用 | |
| CN107937443B (zh) | 一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用 | |
| CN106512020B (zh) | 一种靶向缺血心肌的纳米化microRNA精准诊疗*** | |
| CN102516535B (zh) | 可降解亚胺类聚阳离子及其合成方法、纳米颗粒 | |
| CN108403665B (zh) | EpDT3适配体修饰的***癌靶向给药载体、递送***及其制备与应用 | |
| CN108753829B (zh) | 骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用 | |
| Liu et al. | Construction of traceable cucurbit [7] uril-based virus-mimicking quaternary complexes with aggregation-induced emission for efficient gene transfection | |
| Sun et al. | New amphiphilic N-phosphoryl oligopeptides designed for gene delivery |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |