CN117686714A - 猪圆环病毒3型elisa抗原检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒及其应用，本发明提出一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，包括检测板、抗原标准品、兔多抗及抗兔酶标二抗；其中，所述检测板包被有抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体；所述兔多抗为抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体；所述抗原标准品为PCV3 cap标准品。在本发明的技术方案中，通过联用抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体和抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体，以使得在检测过程中，样本中的PCV3 cap蛋白抗原能同时结合上述抗体，以提高单位抗原结合抗体的数量，从而提高单位抗原结合酶标二抗的数量，提高信号强度，降低定性检测时的最低检出限，提高检测灵敏度。

Description

猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪圆环病毒3型（PCV3）是近年来新发现的一种病毒，感染后会导致猪呼吸、消化等多***炎症和免疫、繁殖***障碍，引起混合感染、继发感染等。目前PCV3在国内外已逐渐呈现流行趋势，给生猪养殖产业造成相当大的经济损失，PCV3疫苗产品的研发具有重要意义。PCV3病毒粒子呈二十面体，无囊膜，直径13～25 nm，衣壳蛋白由60个蛋白质亚基组成，属于共价闭合环状单链DNA基因组结构，基因组全长约为2,000nt，主要包括3个开放性阅读框（opening reading frame，ORF），其中ORF2是变异最大的区域，编码唯一的结构蛋白（Cap蛋白），与病毒的感染和免疫有较强的相关性。Cap蛋白为PCV3病毒的主要保护性抗原表位，是制备PCV3疫苗的理想靶抗原。
PCV3 Cap蛋白含量是影响疫苗免疫效果的最主要因素。目前抗原定量检测方法多用酶联免疫吸附实验法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)。ELISA定量方法将已知的抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，然后进行抗原的定量，检测结果准确且稳定。然而现有定量方法的最低检出限仍较高，当检测样本中猪圆环病毒3型的浓度较低时，难以准确检测猪圆环病毒3型的含量。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒及其应用，旨在解决现有猪圆环病毒3型检测方法灵敏度低的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，包括检测板、抗原标准品、兔多抗及抗兔酶标二抗；
其中，所述检测板包被有抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体；
所述兔多抗为抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体；
所述抗原标准品为PCV3 cap标准品。
可选地，所述检测板上开有多个检测孔，所述抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体包被于多个检测孔内；和/或，
所述抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体的含量为0.05~0.1μg/孔。
可选地，所述抗原标准品为PCV3 cap标准品，所述PCV3 cap标准品的质量浓度为3~5μg/ml。
可选地，所述兔多抗为抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体，所述抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体的质量浓度为0.5~1.5μg/ml。
可选地，所述抗兔酶标二抗包括羊抗兔酶标二抗溶液，其中，所述羊抗兔酶标二抗的质量浓度为0.5~1ug/mL。
可选地，所述猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒还包括洗涤液、显色液及终止液。
可选地，所述浓缩洗涤液包括磷酸盐溶液，所述磷酸盐溶液的pH为7.0~7.4；和/或，
所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液、双氧水及乙酸钠；和/或，
所述终止液包括硫酸溶液。
本发明还提出一种如上所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒的应用方法，用于检测待测样品中猪圆环病毒3型抗原的含量，所述应用方法包括以下步骤：
S10、将待测样品稀释后，加入检测孔，得待测样品组；
S20、按浓度梯度稀释标准品，加入检测孔中，得阳性对照组，将稀释液加入检测孔中，得阴性对照组；
S30、将待测样品组、阳性对照组及阴性对照组36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥，再加入兔多抗，36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥，再加入抗兔酶标二抗36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥；
S40、向待测样品组、阳性对照组及阴性对照组的检测孔内分别加入显色液，避光静置8~12分钟后加入终止液，测定待测样品组、阳性对照组及阴性对照组在450nm波长下的光吸收值；
S50、根据光吸收值计算并判定检测结果。
可选地，步骤S10及步骤S20中采用磷酸盐溶液进行稀释；和/或，
步骤S40中，所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺、双氧水及乙酸钠，所述终止液包括硫酸溶液。
可选地，步骤S50中：
检测结果包括定性检测和定量检测；
进行定性检测时，CO值=阴性对照组的光吸收值OD0×2.1，样品值=待测样品组的光吸收值ODX/CO值，样品值＞1时待测样品为阳性，样品值≤1时待测样品为阴性；
进行定量检测时，以各阳性对照组的光吸收值为X轴，以各阳性对照组的光吸收值为Y轴，绘制拟合曲线，得到拟合曲线方程，将待测样品组的光吸收值带入拟合曲线方程计算出待测样品的浓度。
在本发明的技术方案中，通过联用抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体和抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体，以使得在检测过程中，样本中的PCV3 cap蛋白抗原能同时结合单克隆抗体和多克隆抗体，以提高单位抗原结合抗体的数量，从而提高单位抗原结合酶标二抗的数量，进而提高信号强度，使得抗原浓度偏低时信号强度高于空白对照组的信号强度，降低定性检测时的最低检出限，提高检测灵敏度；通过对猪圆环病毒3型蛋白抗原的定量，大大促进了抗原生产在线监测、疫苗工艺优化、疫苗质量评估和疫苗效力检验；本猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒包被抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体制备检测板，加入抗原反应后再加入抗PCV3 cap蛋白，配以抗兔酶标记二抗，从而实现了对双抗夹心法ELISA方法的优化，放大了反应信号，不仅具有ELISA检测方法敏感、特异、操作简单、省时省力、稳定性好和适合于批量检测的优点，还使得检测灵敏性更好。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
ELISA定量方法将已知的抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，然后进行抗原的定量，检测结果准确且稳定。然而现有定量方法的最低检出限仍较高，当检测样本中猪圆环病毒3型的浓度较低时，难以准确检测猪圆环病毒3型的含量。
鉴于此，本发明提出一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，包括检测板、抗原标准品、兔多抗及抗兔酶标二抗；其中，所述检测板包被有抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体；所述兔多抗为抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体；所述抗原标准品为PCV3 cap标准品。
在本发明的技术方案中，通过联用抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体和抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体，以使得在检测过程中，样本中的PCV3 cap蛋白抗原能同时结合单克隆抗体和多克隆抗体，以提高单位抗原结合抗体的数量，从而提高单位抗原结合酶标二抗的数量，进而提高信号强度，使得抗原浓度偏低时信号强度高于空白对照组的信号强度，降低定性检测时的最低检出限，提高检测灵敏度；通过对猪圆环病毒3型蛋白抗原的定量，大大促进了抗原生产在线监测、疫苗工艺优化、疫苗质量评估和疫苗效力检验；本猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒包被抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体制备检测板，加入抗原反应后再加入抗PCV3 cap蛋白，配以抗兔酶标记二抗，从而实现了对双抗夹心法ELISA方法的优化，放大了反应信号，不仅具有ELISA检测方法敏感、特异、操作简单、省时省力、稳定性好和适合于批量检测的优点，还使得检测灵敏性更好。
具体地，在本发明的一些实施例中，所述检测板的制备方法包括以下步骤：用磷酸盐缓冲液将抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体稀释至浓度为0.5~1μg/mL，然后以100μL/孔加入酶标板，经孵育，洗涤，拍干，封闭，洗涤，干燥，真空封装，得到包被浓度为0.05~0.1μg/孔的检测板。
进一步地，所述检测板上开有多个检测孔，所述抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体包被于多个检测孔内；和/或，所述抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体的含量为0.05~0.1μg/孔。通过将抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体包被于多个检测孔内，可在检测时，将不同样本加入多个不同检测孔，通过抗原-抗体特异性结合的方式将PCV3 cap蛋白抗原固定在检测孔内，从而根据检测孔内的信号强度确定样本中PCV3 cap蛋白抗原的含量；通过将抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体的含量设置为0.05~0.1μg/孔，提高PCV3 cap蛋白抗原与抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体的结合率，从而提高与酶标二抗的结合率，增强信号强度；若抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体含量低于0.05μg/孔，则抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体与PCV3 cap蛋白抗原的结合率降低，信号强度降低，无法起到提高灵敏度的效果；若抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体含量高于0.1μg/孔，则抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体与PCV3 cap蛋白抗原的结合率无明显进一步的提升。
此外，所述抗原标准品为PCV3 cap标准品，所述PCV3 cap标准品的质量浓度为3~5μg/ml。如此设置，便于贮藏和使用PCV3 cap标准品，若PCV3 cap标准品的浓度高于5μg/ml，则贮藏过程中容易发生蛋白析出或变性的现象，对检测结果产生影响；若PCV3 cap标准品的浓度低于3μg/ml，则在检测过程中，缺少3μg/ml以上的PCV3 cap蛋白抗原标准品对照，降低最高检出限，导致检测范围变小。
进一步地，所述兔多抗为抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体，所述抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体的质量浓度为0.5~1.5μg/ml。通过将抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体的质量浓度设置为0.5~1.5μg/ml，提高PCV3 cap蛋白抗原与抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体的结合率，从而提高与酶标二抗的结合率，增强信号强度；若抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体含量低于0.5μg/ml，则抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体与PCV3 cap蛋白抗原的结合率降低，信号强度降低，无法起到提高灵敏度的效果；若抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体含量高于1.5μg/ml，则抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体与PCV3 cap蛋白抗原的结合率无明显进一步的提升。
具体地，在本发明的一些实施例中，所述抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将纯化的PCV3 cap蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，采血分离血清后纯化，得抗PCV3 cap蛋白多克隆抗体。将新西兰大白兔作为抗原免疫对象，以制备抗PCV3cap蛋白多克隆抗体，新西兰大白兔的来源广泛，有利于降低试剂盒的制备成本。
此外，所述抗兔酶标二抗包括羊抗兔酶标二抗溶液，其中，所述羊抗兔酶标二抗的质量浓度为0.5~1ug/mL。通过将羊抗兔酶标二抗的质量浓度设置为0.5~1μg/ml，提高单克隆抗体与羊抗兔酶标二抗的结合率，以及，多克隆抗体与羊抗兔酶标二抗的结合率，增强信号强度；若羊抗兔酶标二抗含量低于0.5μg/ml，则羊抗兔酶标二抗与一抗（单克隆抗体或多克隆抗体）的结合率降低，信号强度降低，无法起到提高灵敏度的效果；若羊抗兔酶标二抗含量高于1μg/ml，则羊抗兔酶标二抗与一抗的结合率无明显进一步的提升。
具体地，在本发明的一些实施例中，羊抗兔酶标二抗采用的是辣根过氧化物酶（HRP酶），HRP酶广泛分布于植物界，具有比活性高、稳定、分子量小且纯酶容易制备的特点，选用辣根过氧化物酶作为标记的酶，不仅能保证试剂盒的质量，且辣根过氧化物酶制备简单，成本低廉。
进一步地，所述猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒还包括洗涤液、显色液及终止液。通过采用洗涤液，可定量稀释待测样本，以使得稀释后的待测样本检测时的信号强度与对照组接近，提高检测准确性；通过采用显色液和终止液配合使用，使得结合有PCV3 cap蛋白的酶标二抗产生信号，通过检测信号强度间接测得PCV3 cap蛋白的浓度。
此外，所述浓缩洗涤液包括磷酸盐溶液，所述磷酸盐溶液的pH为7.0~7.4；和/或，所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液、双氧水及乙酸钠；和/或，所述终止液包括硫酸溶液。具体地，在本发明的一些实施例中，显色液中的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液单独保存，双氧水及乙酸钠溶液混合保存，检测时临时混合使用，避免显色液混合保存时各成分之间相互反应导致显色液变质。
本发明还提出一种如上所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒的应用方法，用于检测待测样品中猪圆环病毒3型抗原的含量，所述应用方法包括以下步骤：S10、将待测样品稀释后，加入检测孔，得待测样品组；S20、按浓度梯度稀释标准品，加入检测孔中，得阳性对照组，将稀释液加入检测孔中，得阴性对照组；S30、将待测样品组、阳性对照组及阴性对照组36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥，再加入兔多抗，36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥，再加入抗兔酶标二抗36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥；S40、向待测样品组、阳性对照组及阴性对照组的检测孔内分别加入显色液，避光静置8~12分钟后加入终止液，测定待测样品组、阳性对照组及阴性对照组在450nm波长下的光吸收值；S50、根据光吸收值计算并判定检测结果。
通过设置多个阳性对照组及阴性对照组，根据各组的浓度和测得的信号强度绘制信号强度与样品浓度的关系曲线，然后根据测得的待测样品组的信号强度得出待测样品组的样品浓度，从而完成定性或定量的检测。
进一步地，步骤S10及步骤S20中采用磷酸盐溶液进行稀释；和/或，步骤S40中，所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺、双氧水及乙酸钠，所述终止液包括硫酸溶液。通过采用洗涤液，可定量稀释待测样本，以使得稀释后的待测样本检测时的信号强度与对照组接近，提高检测准确性；通过采用显色液和终止液配合使用，使得结合有PCV3 cap蛋白的酶标二抗产生信号，通过检测信号强度间接测得PCV3 cap蛋白的浓度。具体地，在本发明的一些实施例中，显色液中的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液单独保存，双氧水及乙酸钠溶液混合保存，检测时临时混合使用，避免显色液混合保存时各成分之间相互反应导致显色液变质。
此外，步骤S50中：检测结果包括定性检测和定量检测；进行定性检测时，CO值=阴性对照组的光吸收值OD0×2.1，样品值=待测样品组的光吸收值ODX/CO值，样品值＞1时待测样品为阳性，样品值≤1时待测样品为阴性；进行定量检测时，以各阳性对照组的光吸收值为X轴，以各阳性对照组的光吸收值为Y轴，绘制拟合曲线，得到拟合曲线方程，将待测样品组的光吸收值带入拟合曲线方程计算出待测样品的浓度。
所述猪圆环病毒3型抗原ELISA检测试剂盒既可用于定性检测猪圆环病毒3型抗原，又可用于定量检测猪圆环病毒3型抗原，还可以定量检测猪圆环病毒3型蛋白亚单位疫苗中猪圆环病毒3型抗原的含量，从而较快地评估疫苗的质量。需要说明的是，定量检测时需绘制拟合曲线，从而得出待测样品组的样品浓度；定性检测时无需绘制拟合曲线，仅比较待测样品组的光吸收值和2.1倍于阴性对照组的光吸收值的大小关系，即可得出待测样品组中是否含有PCV3 cap蛋白。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
提供一种猪圆环病毒3型抗原ELISA检测试剂盒，包括检测板、抗原标准品、兔多抗、酶标二抗、洗涤液、显色液和终止液；
所述检测板包被有抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体；
所述抗原标准品为PCV3 cap标准品，其质量浓度为4μg/ml；
所述兔多抗为抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体，其质量浓度为1μg/ml；
所述酶标二抗为商品化羊抗兔酶标二抗释倍15000倍；
所述洗涤液为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液、双氧水及乙酸钠缓冲溶液，其中3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液的质量浓度为1%，双氧水的质量浓度为0.1%，乙酸钠缓冲溶液的质量浓度为1%；
所述终止液为2mol/L硫酸溶液。
其中，猪圆环病毒3型cap蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）重组表达质粒pCold-PCV3cap的构建
以猪圆环病毒3型核酸为模板，PCR扩增PCV3 ORF2基因片段，经SacI、XhoI双酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pColdI进行连接反应，构建原核表达质粒pCold-PCV3cap，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α，随机挑取多个单菌落接种于5mLLB/Ampr培养液中，37℃振摇过夜，用碱裂解法提取质粒。将PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序确证。
（2）重组蛋白的诱导表达与纯化
将测序正确的重组表达质粒pCold-PCV3cap再次转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落接入5mL LB /Ampr培养液中，37℃振摇培养过夜，次日按1:100将菌液接入LB /Ampr培养液，37℃振摇培养2～4 h至OD600值达到0.4～0.5时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，15℃继续振摇培养24 h进行诱导表达。将诱导表达的样品按His.tag蛋白纯化试剂盒说明书方法进行纯化，分步洗脱并收集目的蛋白洗脱液，得到纯化的重组PCV3 cap蛋白，对纯化的重组PCV3 cap蛋白进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测。
（3）重组蛋白的鉴定
将纯化的重组PCV3 cap蛋白经SDS-PAGE电泳并进行膜转移后，用5%(m/v)的脱脂奶粉4℃封闭过夜。以PCV3阳性血清为一抗，以HRP标记的羊抗猪IgG为二抗，进行Western-blot鉴定。
抗猪圆环病毒3型蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）动物免疫及细胞融合
将实施例1制备的纯化的重组PCV3 cap蛋白免疫B/c小鼠，三免后，取ELISA效价达到1:10000的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以HAT培养基37℃、5%CO2培养融合细胞。
（2）单克隆杂交瘤细胞株筛选及鉴定
融合后第四天开始观察集落，待集落生长至孔底约1/6时半量换HT培养基，用猪圆环病毒3型蛋白包被板进行间接ELISA检测，挑选出阳性孔进行亚克隆。依据有限稀释法进行亚克隆，亚克隆板第10天以猪圆环病毒3型蛋白包被板进行间接ELISA检测，挑选出阳性孔转入24孔板进行第二次亚克隆。二亚第10天，取培养上清同步进行免疫荧光（IFA）和以重组猪圆环病毒3型蛋白包被板的间接ELISA检测。最终筛选出同时满足免疫荧光（IFA）阳性及ELISA检测阳性的抗猪圆环病毒3型蛋白抗体单克隆细胞株，即可识别猪圆环病毒3型蛋白的杂交瘤细胞株。其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株A4，其所分泌的抗猪圆环病毒3型蛋白抗体的质量更好。
（3）细胞株冻存及单克隆抗体制备
将步骤（2）得到的杂交瘤细胞株进行冻存，同时接种20只小鼠制备腹水，每只小鼠腹腔注射细胞量为5×105~1×106个/0.5mL。将制得的小鼠腹水以辛酸硫酸铵盐析法纯化，透析，制得抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体。
抗猪圆环病毒3型蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将实施例1制备的纯化的重组PCV3 cap蛋白对兔进行常规免疫实验，检测兔血清ELISA效价，当兔血清ELISA效价达到1:1000以上时，采集兔血，分离得兔血清；
（2）将步骤（1）制得的兔血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得抗PCV3 cap蛋白多克隆抗体；
（3）在步骤（2）制得的抗PCV3 cap蛋白多克隆抗体中加入0.1~10%(m/v)牛血清白蛋白、0.1~10%(m/v)酪蛋白和50%(m/v)的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。
所述试剂盒可以采用以下方法制得：
（1）检测板制备：用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释PCV3 cap蛋白单克隆抗体至浓度为0.5~1μg/mL；以100μL/孔加入酶标板，在4℃条件下包被16~18h，洗涤液洗涤，拍干；用含1%（质量百分浓度）BSA（牛血清白蛋白）的洗涤液在37℃条件下封闭1h，洗涤、干燥、真空封装，得到检测板。其中，所述洗涤液由下述浓缩洗涤液加纯化水稀释10倍制得；
（2）标准品制备：用洗涤液稀释重组PCV3 cap蛋白至4μg/mL而成；
（3）兔多抗的制备：将实施例3所述抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体稀释为1μg/ml即得；
（4）酶标二抗制备：将商品化羊抗兔酶标二抗释倍15000倍即得；
（5）浓缩洗涤液制备：配制NaCl 80g/L、KCl 2g/L、Na2HPO4·12H2O 36g/L、KH2PO42.4g/L的磷酸盐缓冲液，其pH为7.4，再加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5%(v/v)；
（6）显色液制备：A液为10mg/mL的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液，其配制为：称取100mg TMB，加入到10mL二甲基亚砜（DMSO）中，完全溶解后，即得。B液为0.012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/mL，pH5.0，其配制为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μL浓度为30%的H2O2，即得。用B液100倍稀释A液，使A液与B液体积比为1：99，即得底物液；
（7）终止液制备：取108.6mL浓度为98%的浓硫酸，加蒸馏水至1000mL，即得。
实施例2
提供一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒的应用方法，包括以下步骤：
（1）将待检样品用洗涤液1:100稀释，将其加入均匀包被有抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体的检测板的孔中，每孔加100μL，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512稀释的标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL洗涤液，每个样品和对照平行加样3个孔；
（2）加样完成后，将检测板置37℃孵育45分钟后，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯化水稀释10倍制得；
（3）每孔加入100μL抗PCV3 cap蛋白多克隆抗体，37℃孵育45分钟，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯化水稀释10倍制得；
（4）每孔加入100μLHRP标记的抗兔二抗，37℃孵育45分钟，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯化水稀释10倍制得；
（5）每孔加入100μL显色液（A液和B液等体积混合），避光显色10分钟，每孔加入50μL终止液；
（6）将检测板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD450nm；
（7）结果计算与判定：
其中，定性结果的判定：Cut off（CO值）=阴性对照光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值=样品光吸收值OD450nm/CO值，其中，样品值>1为阳性，样品值≤1为阴性；
定量结果的判定：以阳性对照组各系列稀释的标准品OD450nm值为X轴，以阳性对照组各系列稀释的标准品对应浓度值为Y轴， 利用Curve.Expert1.4软件获得拟合曲线及其方程式，将以样品OD450nm值的带入曲线方程式计算出样品的浓度。
对比例1
提供一种猪圆环病毒3型抗原ELISA检测试剂盒，包括检测板、抗原标准品、酶标二抗、洗涤液、显色液和终止液；
所述检测板包被有抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体；
所述抗原标准品为PCV3 cap标准品，其质量浓度为4μg/ml；
所述酶标二抗为抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体进行HRP酶标记所得，其质量浓度为1μg/ml；
所述洗涤液为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液、双氧水及乙酸钠缓冲溶液，其中3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液的质量浓度为1%，双氧水的质量浓度为0.1%，乙酸钠缓冲溶液的质量浓度为1%；
所述终止液为2mol/L硫酸溶液。
特异性检测实验
按照实施例2的猪圆环病毒3型抗原ELISA检测试剂盒的应用方法，利用实施例1制得的猪圆环病毒3型抗原ELISA检测试剂盒分别检测猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原、猪圆环病毒3型疫苗和猪圆环病毒3型阴性血清。
对各样品和对照平行加样的3个孔测定OD450nm值，计算其OD450nm平均值，结果记录于下表1。
表1 本发明试剂盒特异性测定
序号 检测样品 检测结果（OD450nm平均值） 结果分析
1 猪瘟病毒抗原 0.103 样品值<1，阴性
2 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原 0.084 样品值<1，阴性
3 猪伪狂犬病毒抗原 0.106 样品值<1，阴性
4 猪圆环病毒2型抗原 0.089 样品值<1，阴性
5 猪圆环病毒3型疫苗 1.183 样品值>1，阳性
6 猪圆环病毒3型阴性血清 0.093 样品值<1，阴性
7 阴性对照 0.098
8 空白对照 0.048
由表1可知，猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原和猪圆环病毒3型阴性血清（样品光吸收值OD450nm/CO值）小于1，呈阴性；猪圆环病毒3型疫苗样品值（样品光吸收值OD450nm/CO值）大于1，呈阳性。说明与其他病原抗原无交叉反应的产生，特异性达100%。
灵敏度检测实验
按照实施例2的猪圆环病毒3型抗原ELISA检测试剂盒的应用方法，将标准品用洗涤液1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释，将其加入均匀包被有抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体的检测板的孔中，每孔加100μL，设阴性对照组和空白对照组，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL洗涤液，每个不同稀释度标准品和对照平行加样3个孔。
对不同稀释度标准品和对照平行加样的3个孔测定OD450nm值，计算其OD450nm平均值，结果记录于下表2。
表2 实施例1试剂盒灵敏度测定实验结果
序号 不同稀释度标准品 不同稀释度标准品浓度（μg /mL） 检测结果（OD450nm平均值） 结果分析
1 1:2 2 2.214 样品值>1，阳性
2 1:4 1 2.021 样品值>1，阳性
3 1:8 0.5 1.73 样品值>1，阳性
4 1:16 0.25 1.269 样品值>1，阳性
5 1:32 0.125 0.886 样品值>1，阳性
6 1:64 0.0625 0.561 样品值>1，阳性
7 1:128 0.03125 0.35 样品值>1，阳性
8 1:256 0.015625 0.254 样品值>1，阳性
9 1:512 0.0078125 0.146 样品值<1，阴性
10 阴性对照组 0.098
11 空白对照组 0.048
表3 对比例1试剂盒灵敏度测定实验结果
序号 不同稀释度标准品 不同稀释度标准品浓度（μg /mL） 检测结果（OD450nm平均值） 结果分析
1 1:2 2 0.881 样品值>1，阳性
2 1:4 1 0.597 样品值>1，阳性
3 1:8 0.5 0.479 样品值>1，阳性
4 1:16 0.25 0.362 样品值>1，阳性
5 1:32 0.125 0.213 样品值>1，阳性
6 1:64 0.0625 0.172 样品值<1，阴性
7 1:128 0.03125 0.141 样品值<1，阴性
8 1:256 0.015625 0.123 样品值<1，阴性
9 1:512 0.0078125 0.101 样品值<1，阴性
10 阴性对照组 0.093
11 空白对照组 0.054
表中，Cut off（CO值）=阴性对照光吸收值OD450nm×2.1，样品值=不同稀释度标准品光吸收值OD450nm/CO值。
由表2可知，由纯化的重组PCV3 cap蛋白构成的标准品稀释至浓度为0.0156μg/mL时，本发明试剂盒的样品值大于1，检测结果呈阳性，当稀释浓度为0.0078μg/mL时，本发明试剂盒的样品值小于1，检测结果呈阴性。说明本发明试剂盒的最低检出量达0.0156μg/mL，即15.6ng/mL。
由表3可知，由纯化的重组PCV3 cap蛋白构成的标准品稀释至浓度为0.125μg/mL时，本发明试剂盒的样品值大于1，检测结果呈阳性，当稀释浓度为0.0625μg/mL时，本发明试剂盒的样品值小于1，检测结果呈阴性。说明该试剂盒的灵敏度最低检出量为0.125μg/mL，即125ng/mL。
结合表2及表3不难看出，实施例1中各稀释度标准品的OD450nm平均值明显高于对比例1中各稀释度标准品的OD450nm平均值，对比例1的最低检出量125ng/mL明显高于实施例1的最低检出量15.6ng/mL，说明采用抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体及抗PCV3 cap蛋白兔多克隆抗体作为第一抗体，相较于仅采用抗PCV3 cap蛋白单克隆抗体作为第一抗体能够降低PCV3cap蛋白的最低检出量，从而提高检测灵敏性。
重复性检测实验
按照实施例2的猪圆环病毒3型抗原ELISA检测试剂盒的应用方法，分别对3份PCV3cap蛋白样本和3份疫苗样本进行含量测定，重复检测三次。测定结果见下表4。
表4 本发明试剂盒检测猪圆环病毒3型抗原和疫苗重复性检测
样品编号 蛋白含量第一次（μg/mL） 蛋白含量第二次（μg/mL） 蛋白含量第三次（μg/mL） 平均值（μg/mL） 标准差（%）
抗原1 126.6 129.4 128.5 128.2 1.12
抗原2 145.3 149.5 151.4 148.7 2.10
抗原3 189.3 193.4 188.4 190.4 1.40
疫苗1 80.4 79.5 81.8 80.6 1.44
疫苗2 80.8 81.6 82.2 81.5 0.86
疫苗3 81.1 82.5 88.9 84.2 4.94
由表3可知，3批抗原和疫苗的三次检测PCV3 cap蛋白含量的标准差均＜5%，说明本发明试剂盒的检测结果稳定，重复性很好。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，包括检测板、抗原标准品、兔多抗及抗兔酶标二抗；
其中，所述检测板包被有抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体；
所述兔多抗为抗PCV3 cap蛋白的兔多克隆抗体；
所述抗原标准品为PCV3 cap标准品。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，所述检测板上开有多个检测孔，所述抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体包被于多个检测孔内；和/或，
所述抗PCV3 cap蛋白的单克隆抗体的含量为0.05~0.1μg/孔。
3.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，所述PCV3cap标准品的质量浓度为3~5μg/ml。
4.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，所述抗PCV3cap蛋白的兔多克隆抗体的质量浓度为0.5~1.5μg/ml。
5.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，所述抗兔酶标二抗包括羊抗兔酶标二抗溶液，其中，所述羊抗兔酶标二抗的质量浓度为0.5~1ug/mL。
6.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，所述猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒还包括洗涤液、显色液及终止液。
7.如权利要求6所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括磷酸盐溶液，所述磷酸盐溶液的pH为7.0~7.4；和/或，
所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液、双氧水及乙酸钠；和/或，
所述终止液包括硫酸溶液。
8.一种如权利要求1至7任意一项所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒的应用方法，用于检测待测样品中猪圆环病毒3型抗原的含量，其特征在于，包括以下步骤：
S10、将待测样品稀释后，加入检测孔，得待测样品组；
S20、按浓度梯度稀释标准品，加入检测孔中，得阳性对照组，将稀释液加入检测孔中，得阴性对照组；
S30、将待测样品组、阳性对照组及阴性对照组36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥，再加入兔多抗，36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥，再加入抗兔酶标二抗36~38℃下恒温孵育后洗涤干燥；
S40、向待测样品组、阳性对照组及阴性对照组的检测孔内分别加入显色液，避光静置8~12分钟后加入终止液，测定待测样品组、阳性对照组及阴性对照组在450nm波长下的光吸收值；
S50、根据光吸收值计算并判定检测结果。
9.如权利要求8所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒的应用方法，其特征在于，步骤S10及步骤S20中采用磷酸盐溶液进行稀释；和/或，
步骤S40中，所述显色液包括3,3’-5,5’-四甲基联苯胺、双氧水及乙酸钠，所述终止液包括硫酸溶液。
10.如权利要求8所述的猪圆环病毒3型ELISA抗原检测试剂盒的应用方法，其特征在于，步骤S50中：
检测结果包括定性检测和定量检测；
进行定性检测时，CO值=阴性对照组的光吸收值OD0×2.1，样品值=待测样品组的光吸收值ODX/CO值，样品值＞1时待测样品为阳性，样品值≤1时待测样品为阴性；
进行定量检测时，以各阳性对照组的光吸收值为X轴，以各阳性对照组的光吸收值为Y轴，绘制拟合曲线，得到拟合曲线方程，将待测样品组的光吸收值带入拟合曲线方程计算出待测样品的浓度。
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