CN117683807A - 一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、***及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效的片段组装方法并应用于快速的植物细胞原生质体瞬时表达***。利用合成生物学的方法在体外构建DNA片段基因表达盒，将纯化后的DNA片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现目的基因瞬时表达。与传统的载体构建及原生质体瞬时表达***相比，本发明避免了构建载体和抽提质粒的繁琐程序，具备耗时短，见效快的特点，并且操作方便，实用性好，可用于高通量高效率基因瞬时表达，是一种非常有应用潜力的基因瞬时表达方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、***及应用。
背景技术
由于能实现基因在生物体内的短时间高效表达，基于原生质体的瞬时表达***(Protoplast-based transient expression system,PTES)在分子生物学研究中表现出巨大的优势，被广泛应用于亚细胞定位、蛋白互作、转录调控和信号转导等方面的研究中。目前，原生质体瞬时表达***在拟南芥、烟草、水稻、玉米和花生等作物研究中得到了完善的建立和发展。近些年，将原生质体瞬时表达与基因组学、蛋白组学和遗传改良等结合的研究使其应用范围得到进一步拓宽。
原生质体瞬时表达***包括原生质体的分离与转化，其中原生质体转化是指通过聚乙二醇或电穿孔的方式将外源核酸引入原生质体中。许多物种的基因瞬时表达依靠质粒作为载体，将基因表达盒与质粒融合递送到原生质体内，DNA不需要整合到植物的基因组中，而能够在细胞中进行快速表达。虽然这种方法能够赋予细胞适当的转基因表达水平，但是在前期需要构建基因表达载体，抽提高质量的质粒，从而增加了实验时间，且通量较低。在研究中，为了获得可靠且可重复的结果，需要较高的转化效率。除了原生质体的活力和数量，PEG的浓度和转化孵育时间外，DNA的数量和质量也是影响转化效率的关键。然而，研究显示随着质粒DNA大小从5kb增加到10kb，转化效率急剧下降。因此，需要使用大量的质粒DNA才能达到一定的转化效率。此外，内毒素是质粒DNA抽提过程中常见的污染物之一，而内毒素的存在会对细胞造成伤害，导致原生质体转化效率大打折扣。
现有的原生质体瞬时表达***的局限性促使我们开发一种简单、快速、高通量的基因瞬时表达方法。通过Golden Gate法在体外构建DNA片段基因表达盒，将纯化后的DNA片段直接进行原生质体转化，不仅避免了构建载体和抽提质粒的繁琐程序，使得实验时间大大缩短，也排除了细菌内毒素污染的可能，有利于提升转化效率。单纯的基因表达盒相比于与质粒融合的表达载体，具有片段小的优势，并且可以通过PCR扩增在短时间内大量制备，为高通量高效率基因瞬时表达提供可能，是一种非常有应用潜力的基因瞬时表达方法。
发明内容
针对现有技术中植物原生质体瞬时表达耗时长、操作复杂繁琐、成本高的问题，本发明提供了一种高效的片段组装方法并应用于快速的植物细胞原生质体瞬时表达***，基于合成生物学的方法制备基因表达盒转化入原生质体内，实现耗时短、见效快、操作简单的基因瞬时表达。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法，包括如下步骤：
S1、以DNA为模板，通过PCR扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列；
S2、利用Golden Gate法将启动子、基因编码区和终止子DNA片段融合为一个完整的基因表达盒；
S3、利用PCR扩增富集完整的基因表达盒；
S4、将富集的DNA片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现基因的瞬时表达。
在本发明中，从模板DNA中扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列。
在本发明中，所述模板DNA可以是包含DNA底物的缓冲液，也可以是包含DNA的微生物、植物组织、动物组织。
在本发明中，所述包含模板DNA的缓冲液包括但不限于线性DNA片段，双链DNA片段，多链(大于等于三链)DNA片段，DNA与RNA杂合的片段，环状DNA序列，正常天然DNA结构，修饰过的DNA结构等。
在本发明中，所述DNA片段来源可以是天然的动植物DNA或微生物DNA，也可以是化学或生物合成DNA，包括正常DNA结构及修饰过的DNA结构。
在本发明中，作为底物的DNA包括反应时直接添加的DNA，也包括反应前未直接添加但在反应过程中出现的DNA，例如RT-PCR反应(Reverse Transcription PolymeraseChain Reaction)，将RNA反转录成DNA，再利用DNA进行后续的扩增。
在本发明所述的一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法中，
优选的，步骤S1的启动子35S和终止子来源于pCAMBIA1301载体，基因编码序列sfGFP为本室合成，序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，步骤S1中以pCAMBIA1301质粒为模板，35S-F和35S-R(序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示)为引物，利用高保真酶(CloneAmp HiFi PCR Premix，Takara)扩增35S启动子(3’端引物带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基)。以sfGFP合成质粒为模板，以sfGFP-F和sfGFP-R(序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)为引物，扩增sfGFP基因(引物两端带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基)。以pCAMBIA1301质粒为模板，NOS-F和NOS-R(序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示)为引物，利用高保真酶(CloneAmp HiFi PCR Premix，Takara)扩增NOS终止子(5’端引物带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基)。
在本发明中，选用的限制性内切酶是BsaⅠ。经验表明即使目标片段(基因)中存在BsaⅠ的识别位点，也不会影响后续片段组装与扩增。
优选的，通过PCR扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列后，利用磁珠法(产品名称：AMPure XP核酸纯化试剂盒，货号：A63882)将PCR产物进行纯化。
在本发明中，利用Golden Gate法将启动子、基因编码区和终止子DNA片段融合为一个完整的基因表达盒。
优选的，在步骤S2中，将启动子、基因编码区和终止子DNA片段与限制性内切酶BsaⅠ、T4DNA连接酶混合进行酶切连接反应，酶切连接反应体系如下：
| 10×T4DNAligaseBuffer(NEB) | 1μL |
| 10×CutsmartBuffer(NEB) | 1μL |
| T4DNAligase(NEB) | 1μL |
| BsaⅠ(NEB) | 0.5μL |
| 每片段 | 100ng |
| 补ddH2O | 至20μL |
优选的，酶切连接反应在室温条件下反应15min。
在本发明中，利用PCR扩增富集完整的基因表达盒。
优选的，在步骤S3中，将步骤S2反应后的组装产物稀释20倍作为PCR反应模板，以35S-F和NOS-R为引物，利用高保真酶扩增完整表达盒，然后利用磁珠法将PCR产物进行纯化。
优选的，完整DNA片段基因表达盒扩增体系如下：
| 2×CloneAmpHiFiPCRPremix(Takara) | 25μL |
| 35S-F | 1μL |
| NOS-R | 1μL |
| 组装产物 | 1μL |
| ddH2O | 22μL |
反应程序：95℃5min，(95℃10s，72℃1min，35cycles)，72℃5min。
因涉及到多片段组装，为了提升表达盒的扩增特异性，在本发明中，特将35S-F和NOS-R两条引物的Tm值设置在68℃以上，采用两步法PCR扩增目标DNA片段，大大提升了DNA片段表达盒的扩增特异性。
在本发明中，优化后的片段组装方法可以实现最多5个片段同时组装，最终长度可达6kb以上。
优选的，将步骤S3富集的DNA片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现基因的瞬时表达。
第二方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达***，所述***包括DNA片段基因表达盒的组装反应体系、原生质体制备体系和原生质体转化体系。
进一步的，所述DNA片段基因表达盒的组装反应体系包括启动子、基因编码区和终止子序列的PCR扩增反应体系、Golden Gate反应体系和基因表达盒的富集反应体系。
第三方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法在非疾病诊断和治疗目的的外源基因表达中的应用。
第四方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达***在非疾病诊断和治疗目的的外源基因表达中的应用。
在本发明中，所述方法和***的应用范围包括但不限于植物细胞、动物细胞。
在本发明中，所述基因瞬时表达方法应用于动植物中基因瞬时表达的相关产品，包括但不限于基因亚细胞定位相关产品、基因的功能类研究相关产品，基因相互作用相关产品，非编码基因功能研究相关产品，启动子序列的功能研究相关产品、终止子序列的功研究相关产品，非翻译区序列的功能研究相关产品。
在本发明中，所述应用的方式优选包括基因亚细胞定位、基因功能预测、基因相互作用中的至少一种；更优选的，所述基因功能预测包括非编码基因功能预测、启动子序列功能预测、终止子序列功能预测、非翻译区序列功能预测中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、片段组装：优化了Golden Gate反应体系，使反应时间从传统的1.5h(MaandLiu,CRISPR/Cas9-Based Multiplex Genome Editing in Monocot andDicotPlants,2016)缩短至15min。
2、提升了DNA片段表达盒的扩增特异性：因涉及到多片段组装，为了提升表达盒的扩增特异性，特将35S-F和NOS-R两条引物的Tm值设置在68℃以上，采用两步法PCR扩增目标DNA片段。
3、优化后的片段组装方法可以实现最多5个片段同时组装，最终长度可达6kb以上。
4、在发明中，选用的限制性内切酶是BsaⅠ。经验表明即使目标片段(基因)中存在BsaⅠ的识别位点，也不会影响后续片段组装与扩增。
5、在相同的摩尔量下，DNA片段表达盒与质粒表达盒表现出同样的转化效率及表达量，最低只需要500ng表达盒就能达到实验目的。
6、整个实验过程所需时间从传统的7d缩短到2d。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为PCR扩增获得启动子、sfGFP基因编码区和终止子序列的胶图，其中，四条泳道从左至右分别表示：DNAmarker；PCR扩增35S启动子片段；PCR扩增sfGFP片段；PCR扩增NOS终止子片段。
图2为利用Golden Gate法制备sfGFP基因表达片段的胶图，其中，四条泳道从左至右分别表示：DNA Marker；35S、sfGFP和NOS混合物；Golden Gate片段组装；扩增组装完成的基因表达盒。
图3为激光共聚焦显微镜观察sfGFP荧光结果。A图以DNA片段作为基因表达盒，B图以质粒作为基因表达盒。
图4为两种表达盒进行原生质体瞬时表达的实验时长比较。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。若未特别指明，实例中所用的实验方法均为常规方法；所用的试剂、材料均可从商业途径得到。
实施例一、DNA片段基因表达盒的组装
启动子35S和终止子来源于pCAMBIA1301载体，sfGFP为本室合成，序列如SEQ IDNO.1所示。制备办法如下：
(1)PCR扩增及DNA纯化：以pCAMBIA1301质粒为模板，35S-F和35S-R(序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示)为引物，利用高保真酶(CloneAmp HiFi PCR Premix)扩增35S启动子(3’端引物带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基)。以sfGFP合成质粒为模板，以sfGFP-F和sfGFP-R(序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)为引物，扩增sfGFP基因(引物两端带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基)。以pCAMBIA1301质粒为模板，NOS-F和NOS-R(序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示)为引物，利用高保真酶(CloneAmp HiFi PCR Premix)扩增NOS终止子(5’端引物带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基)，跑胶结果如图1所示。利用磁珠法(产品名称：AMPure XP核酸纯化试剂盒，货号：A63882)将PCR产物进行纯化。该过程耗时约1.5h左右。
(2)Golden Gate法DNA片段融合及DNA纯化：
a)配制20μL酶切连接反应体系：
| 10×T4DNAligaseBuffer(NEB) | 1μL |
| 10×CutsmartBuffer(NEB) | 1μL |
| T4DNAligase(NEB) | 1μL |
| BsaⅠ(NEB) | 0.5μL |
| 每片段 | 100ng |
| 补ddH2O | 至20μL |
b)将上述反应液置于室温反应15min。
c)将组装产物稀释20倍作为PCR反应模板，以35S-F和NOS-R为引物，利用高保真酶扩增完整表达盒。
| 2×CloneAmpHiFiPCRPremix(Takara) | 25μL |
| 35S-F | 1μL |
| NOS-R | 1μL |
| 组装产物 | 1μL |
| ddH2O | 22μL |
反应程序：95℃5min，(95℃10s，72℃1min，35cycles)，72℃5min。
d)利用磁珠法将PCR产物进行纯化。该过程耗时约20min左右。
实施例二、质粒表达盒的制备
(1)TOPO克隆：利用诺唯赞公司的TOPO克隆试剂盒(产品名称：Ultra-UniversalTOPO Cloning Kit，货号：C603)将上述制备的DNA片段基因表达盒构建至pCE3载体上。
(2)克隆产物转化：将存放于-80℃的大肠杆菌感受态细胞(DH5α)于冰上融化，将克隆产物加入50μl感受态细胞中轻轻混匀，于冰上静置30min，随后放入42℃水浴热激45sec后置于冰上静置2min。向离心管中加入适量LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm摇床中复苏1h后，将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃倒置过夜培养。该过程耗时约1d左右。
(3)阳性质粒检测及扩繁：从LB平板培养基上随机挑取8个单菌落至含有氨苄青霉素的LB培养液中培养12h左右，经碱裂解法抽提质粒，用EcoRⅠ酶切验证，挑选阳性质粒进行测序。将测序正确的单菌落加入含有氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养。该过程耗时约3d左右。
(4)瞬时表达质粒提取：利用QIAGEN公司的大提质粒试剂盒(产品名称：QIAGENPlasmid Kits，货号：12123)提取用于瞬时表达的质粒。该过程耗时约3h左右。
实施例三、拟南芥原生质体转化
(1)表达盒浓度设置：DNA片段表达盒大小约为2kb，质粒表达盒大小约为4kb，为了使两种表达盒摩尔量一致，二者按照1：2的比例进行转化。DNA片段表达盒设置梯度为：0.25μg、0.5μg、1.25μg、2.5μg和5μg；质粒表达盒设置梯度为：0.5μg、1.25μg、2.5μg、5μg和10μg。
(2)原生质体制备：取用4-5片拟南芥幼嫩叶片为材料进行原生质体抽提，将叶片置于干净滤纸上，用刀片将其切成细丝放入10mL酶解液中，置于暗处抽真空30min后于40rpm避光酶解3-4h。加入10mL的W5溶液终止酶解反应，80rpm速度释放原生质体10min，将溶液经75μm的滤网过滤到圆底离心管中收集原生质体。100g，4℃离心2min，弃上清，加入预冷的W5溶液重悬原生质体，再次100g，4℃离心2min，弃上清，加入预冷的W5溶液重选原生质体，冰浴静置30min后弃上清，加入适量的MMG溶液重悬原生质体，调节细胞浓度约为2×105/mL。
(3)表达盒转染原生质体：取10μL表达盒与100μL混匀后，加入110μLPEG-CaCl2溶液颠倒混匀，室温放置10-20min。随后加入660μL的W5溶液终止转化。100g，室温离心2-3min后弃上清，用500μL的W5溶液重悬原生质体，20-23℃避光静置培养14h。弃400μL上清富集原生质体，用底液重悬原生质体。
(4)激光共聚焦显微镜观察
取部分原生质体悬液制片，用Nikon激光共聚焦显微镜观察sfGFP蛋白的荧光。本实验观察所有样品统一在20倍物镜下观察，使用的激光类型、强度和增益等设置完全一致。结果如图3所示，图3中的A图为DNA片段基因表达盒转染原生质体结果，B图为质粒表达盒转染原生质体结果。观测到具有荧光的细胞数量随着基因表达盒量的增加而增加，在相同的摩尔量下，转化DNA片段基因表达盒与转化质粒表达盒所产生的荧光细胞几乎一致。更重要的是，转化量只需0.5μg就能观察到荧光细胞。
与传统方法相比，采用本方法进行片段组装非常快速、简单和高效，使反应时间从传统的1.5h缩短至15min，并且可以显著提升DNA片段表达盒的扩增特异性，优化后的片段组装方法可以实现最多5个片段同时组装，最终长度可达6kb以上。使用该方法组装的DNA片段基因表达盒可直接用于原生质体瞬时表达，在相同的摩尔量下，DNA片段表达盒与质粒表达盒表现出同样的转化效率及表达量，最低只需要500ng表达盒就能达到实验目的。优化后的体系使整个实验过程所需时间从传统的7d缩短到2d。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以DNA为模板，通过PCR扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列；
S2、利用Golden Gate法将启动子、基因编码区和终止子DNA片段融合为一个完整的基因表达盒；
S3、利用PCR扩增富集完整的基因表达盒；
S4、将富集的DNA片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现基因的瞬时表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1从模板DNA中扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列，所述模板DNA可以是包含DNA底物的缓冲液，也可以是包含DNA的微生物、植物组织、动物组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1的启动子35S和终止子来源于pCAMBIA1301载体，基因编码序列sfGFP如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1中启动子序列的扩增引物35S-F序列如SEQ ID NO.2，35S-R序列如SEQ ID NO.3所示，3’端引物带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基；基因编码序列sfGFP的扩增引物sfGFP-F序列如SEQ ID NO.4所示，sfGFP-R序列如SEQID NO.5所示，引物两端带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基；终止子序列的扩增引物NOS-F序列如SEQ ID NO.6所示，NOS-R序列如SEQ ID NO.7所示，5’端引物带有BsaⅠ酶切位点和保护碱基。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2的酶切连接反应体系如下：
所述酶切连接反应在室温条件下反应15min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，将步骤S2反应后的组装产物稀释20倍作为PCR反应模板。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，将步骤S2反应后的组装产物稀释20倍作为PCR反应模板，以35S-F和NOS-R为引物，利用高保真酶扩增完整表达盒，然后利用磁珠法将PCR产物进行纯化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中利用PCR扩增富集完整的基因表达盒，反应体系如下：
反应程序：95℃5min，(95℃10s，72℃1min，35cycles)，72℃5min。
9.一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达***，其特征在于，所述***包括DNA片段基因表达盒的组装反应体系、原生质体制备体系和原生质体转化体系，所述DNA片段基因表达盒的组装反应体系包括启动子、基因编码区和终止子序列的PCR扩增反应体系、Golden Gate反应体系和基因表达盒的富集反应体系。
10.权利要求1-8任一项所述的一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法或权利要求9所述的一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达***在非疾病诊断和治疗目的的外源基因表达中的应用，其特征在于，所述应用包括基因亚细胞定位、基因功能预测、基因相互作用中的至少一种。
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