CN117660655A - 一种检测微卫星不稳定性的探针、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一种检测微卫星不稳定性的生物标志物组合、试剂盒及应用，属于生物技术领域。通过本发明提供一种检测微卫星不稳定性的诊断试剂，所述的诊断试剂包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.224所示的探针，通过本发明提供一种检测微卫星不稳定性的试剂盒，以及上述探针在在检测微卫星不稳定性的分析方法中的应用。本发明用于检测微卫星不稳定性的生物标志物组合覆盖位点广，检测更准确，检测方法灵敏度和特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测微卫星不稳定性的探针、试剂盒及应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
微卫星不稳定(Microsatellite Instability,MSI)是指与正常组织相比，在肿瘤中微卫星重复单位的***或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。NCCN与CSCO指南都指出，MSI可能是CRC的预后因子，并与CRC患者化疗或免疫治疗效果有关。有研究表明，dMMR/MSI-H的II期结直肠癌患者预后良好，且不会从单药氟尿嘧啶类药物的辅助化疗中获益。dMMR/MSI-H的晚期/转移性结直肠癌患者可能从免疫治疗(PD-1单抗)中获益。同时,MSI还可以用于结直肠癌中林奇综合征的辅助诊断，由于MMR基因的功能失活性改变，林奇综合征患者往往表现为dMMR和(或)MSI-H表型，有研究表明，90％以上的林奇综合征为MSI-H。临床上已将MSI H作为结直肠癌及其他实体瘤预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物：2017年5月23日FDA批准K药用于携带微卫星不稳定性高(MSI H)或错配修复缺陷(dMMR)分子特征，且不可切除或转移性成人和儿童肿瘤；2018年7月11日FDA加速批准纳武利尤单抗联合小剂量伊匹单抗治疗接受氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗后疾病进展的高微卫星不稳定性(MSI H)或错配修复缺陷(dMMR)成人或儿童(≥12岁)转移性结直肠癌(mCRC)患者。
目前常用的MSI检测技术主要有以下两大类：1.免疫组化方法(IHC)：依赖于免疫组化技术的蛋白水平检测，检测肿瘤组织中MMR相关错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表达；免疫组化方法的缺点是检测灵敏度稍低、不同检测试剂盒性能差异较大。2.荧光PCR-毛细管电泳法：该方法使用荧光标记引物和毛细管电泳确定5个位点BAT-25，BAT-26，D2S123，D5S346和D17S250的片段长度多态性；PCR-毛细管电泳法需要同时检测待测样本和正常对照样本，检测成本和工作量较大；检测流程繁琐，样本通量有限，难以快速完成检测。高通量测序技术(NGS)可以精确地检测DNA序列的改变，成为鉴别MSI检测的新工具，但是由于不同检测分析方法差异较大，尚无形成通用检测标准，目前也没有基于高通量测序技术的微卫星不稳定检测试剂盒获NMPA批准上市。
发明内容
本发明的所要解决的问题是：目前微卫星检测中，不同检测分析方法差异较大，尚无形成通用检测标准。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明的第一方面，提供了一种检测微卫星不稳定性的诊断试剂，所述的诊断试剂包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.224所示的探针。探针如下：
/>
/>
本发明的第二方面，提供了一种检测微卫星不稳定性的试剂盒，所述的试剂盒中包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.224所示的探针。
本发明的第三方面，提供了一种上述探针在检测微卫星不稳定性的分析方法中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、从FFPE样本中提取DNA，对基因组DNA进行片段化、末端修复、接头连接及PCR富集制备预文库；
步骤2、将权利要求1或2任一项所述的探针与预文库进行杂交捕获，经磁珠纯化后得到测序文库，测序文库通过基因测序仪测序得到测序数据；
步骤3、使用分析工具计算在全部224个微卫星位点中MSI阳性位点数目。当阳性位点数目总和≥22个(见图1)，则判定为微卫星不稳定；反之为微卫星稳定。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、微卫星不稳定性的生物标志物覆盖广，检测性能提高
微卫星不稳定性的生物标志物组合，包含224个微卫星位点，覆盖位点广，检测更准确；通过实验验证，建立MSI-H判断阈值，即MSI阳性位点≥22个，判定为微卫星不稳定MSI-H，反之为微卫星稳定MSS；基于该微卫星不稳定性的生物标志物组合及MSI-H判别，该检测MSI的方法灵敏度和特异性高。
2、检测成本低
单样本检测，只需检测肿瘤组织样本，无需正常样本对照，即可准确检定样本微卫星不稳定性状态，减少检测量，降低了检测成本。
3、生信分析流程简便
从下机数据到MSI检测分析一步即可完成，自动化分析流程，中间过程无需人为干预，分析时间大大缩短，为患者争取宝贵的检测分析时间。
附图说明
图1为365个临床样本MSI检测阳性位点数的分布图；
图2为123个临床样本MSI检测质量评估ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例作详细说明如下：
实施例一MSI-H状态的判别值的确定
在一个肿瘤样本中，从224个微卫星位点上观测到n个阳性位点的概率是呈泊松分布(Poisson distribution)的
其中n＝1,2,3,……,e是Euler常数(e＝2.71828……),n！是n的阶乘，λ是阳性位点发生数变量X的期望值。
使用365个临床样本MSI检测阳性位点数观测值来估计该泊松模型中的λ参数。由于本次观测样本中MSI检测阳性位点离散度较大(图1)，图1中灰色分布图是使用本发明检测MSI检测阳性位点数计算得到的；蓝线是根据公式1计算得到的；红线是泊松分布的理论阈值，k0＝21,Pr(k>k0)＝4.52×10-6。
为获得稳健的λ参数，使用中位数来估计λ参数，中位数是7。因此λ＝7。
依据λ＝7，泊松分布的理论阳性位点数的分布图与365个临床样本上的实际观测值的分布比较吻合。因此理论上设定本发明的检测中MSI-H状态的判别值为阳性位点数≥22个。
实施例二样本DNA提取、文库制备及Panel捕获测序分析
从FFPE样本中提取DNA，对基因组DNA(gDNA)进行片段化、末端修复、接头连接及PCR富集等步骤制备预文库；再采用检测微卫星不稳定性的生物标志物组合的探针与预文库进行杂交捕获，经磁珠纯化后得到测序文库。测序文库通过基因测序仪NextSeq 550Dx/Novaseq 6000测序得到测序数据
采用分析软件对原始下机数据进行分析。生信分析流程可分为以下步骤：
1、数据预处理：使用软件分析数据测序质量参数Q30碱基占比。如果Q30占比≥60％则质量控制通过；否则质量控制不通过。然后使用Illumina公司的软件将测序产生的BCL文件转化为Fastq文件。再使用Trimmomatic-0.36软件去掉建库中引入的接头序列和低质量碱基片段。
2、数据比对：使用bwa Version:0.7.10-r806将片段比对到hg19参考基因组上；
3、数据质量控制：根据样本Q30碱基占比,序列比对到参考基因组比例，目标区域的平均测序深度等参数，决定样本测序质量是否合格。如Q30≥60％,序列比对到参考基因组比例≥90％，平均测序深度≥300X，则样本测序数据质量控制通过；否则不通过，判定检测失败，需要重新测序。
4、突变分析：MSI检测使用软件MSIsensor2分析参数使用默认参数设置。
5、MSI微卫星阳性位点≥22个，则判定为微卫星不稳定(MSI-H)；反之为微卫星稳定(MSS)。
实施例三123例临床样本微卫星不稳定性检测
收集了123个肠癌临床样本，并通过参比方法(多重荧光PCR-毛细管电泳法)确定MSI状态，作为参比分析的金标准。样本通过本试剂盒测序分析得出MSI阳性位点数。验证结果详细情况见表1及图2。
表1.MSI验证实验分析结果
根据上面理论计算得到的阳性位点数阈值，对着123个样本使用本试剂盒测序分析到的阳性位点数进行MSI状态分类，并与金标准进行对比，如表2所示。结果显示，灵敏度为100％(CI 95％:88.41％-100％),特异性为100％(CI 95％:99.12％-100％)。
表2.123个临床样本本试剂盒得出的分数(score)和MSS/MSI状态
/>
/>
/>
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种用于检测微卫星不稳定性的诊断试剂，其特征在于，所述的诊断试剂包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.224所示的探针。
2.一种用于检测微卫星不稳定性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.224所示的探针。
3.一种权利要求1～2中任一项所述的探针在检测微卫星不稳定性的分析方法中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、从FFPE样本中提取DNA，对基因组DNA进行片段化、末端修复、接头连接及PCR富集制备预文库；
步骤2、将权利要求1或2任一项所述的探针与预文库进行杂交捕获，经磁珠纯化后得到测序文库，测序文库通过基因测序仪测序得到测序数据；
步骤3、使用分析工具计算在全部224个微卫星位点中MSI阳性位点。当阳性位点数目总和≥22个，则判定为微卫星不稳定；反之为微卫星稳定。
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