CN117660411A - 基于n-糖基化改造的热稳定性脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于N‑糖基化改造的热稳定性脂肪酶突变体及其应用；该热稳定性脂肪酶突变体，是由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列发生突变得到；所述突变的方式为：A8N、L59N、S227N中的一种。本发明通过人工设计N‑糖基化位点获取得到N‑糖基化突变的米根霉脂肪酶，并在工程菌中进行表达，突变体具有显著提高的酶活和热稳定性。其中最优突变体的酶活相比母本提升29.2％，热稳定性为母本的7.23倍，使其更具工业化应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及酶基因改造技术领域，尤其涉及基于N-糖基化改造的热稳定性脂肪酶突变体及其应用。
背景技术
脂肪酶(EC 3.1.1.3)能催化油脂水\酯合成、转酯化、酸解等多种化学反应,被广泛地应用于化学,食品,制药和洗涤剂或生物能源工业中。米根霉来源的脂肪酶具有良好的1,3-位置特异性和催化活性,在食品、化工及生物能源等方面都有很重要的应用。
米根霉脂肪酶的全基因序列已经在NCBI上公布。完整的米根霉脂肪酶由26个氨基酸残基的信号肽(presequence)、97个氨基酸残基的前导肽(prosequence)以及269个氨基酸残基的成熟肽(mature ROL)构成。目前，米根霉脂肪酶已成功在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等多种异源宿主中实现表达，其中毕赤酵母表达的脂肪酶具有活性高、产量高的特点，具有更好的应用潜力。
糖基化是生物体内蛋白质翻译后修饰的重要步骤，指的是蛋白质在一系列糖基化相关的酶的作用下，在内质网或高尔基体内附加上糖链的过程。巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一种高效的外源蛋白表达工具，其表达效果受基因特性、蛋白翻译、内质网及高尔基体中蛋白质的加工及转运等多种因素影响。N-糖基化是P.pastoris中一种常见的蛋白翻译后处理途径，许多研究表明毕赤酵母中发生的N-糖基化对重组蛋白的活性、稳定性以及分泌功能具有重要的影响。
据研究报道N-糖基化对P.pastoris表达蛋白的稳定性与活性等具有重要影响。Nakajima等(https://doi.org/10.1016/j.bcp.2009.11.020)通过在培养基中添加衣霉素抑制P.pastoris中的N-糖基化的发生，发现异源表达的肌醇六磷酸激酶活力显著下降，Liu等(https://doi.org/10.1007/s00284-013-0460-0)尝试去除了脂肪酶RML中的两个N-糖基化位点，结果使得RML的催化活力得到了明显提高，这些结果表明蛋白质的N-糖基化对其活性具有双向的影响。Tian等(https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.126769)通过在米黑霉脂肪酶RML中人为引入N-糖基化位点获得了酶活、热稳定性和甲醇耐受性都显著提升的突变体，Ye等通过去除白细胞介素-4中的糖基化位点使得获取的重组蛋白热稳定性活力显著提升，这些结果表明N-糖基化对热稳定性和有机溶剂耐受性的提升都具有一定的影响。
在本实验室前期的研究中已经通过二硫键重构的方式获得了热稳定性提高的米根霉脂肪酶突变体proROL-4M(中国专利申请公开号：CN109468301A；以下简称4M)，但该突变体的热稳定性仍处于较低水平，适合的应用领域较为受限，因此通过N-糖基化改造的策略在现有突变体的基础上进一步提升ROL的催化性能从而扩展其应用范围是十分必要的。
发明内容
本发明提供了一种基于N-糖基化改造的热稳定性脂肪酶突变体及其应用，该热稳定性脂肪酶突变体具有显著提高的酶活和热稳定性。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种热稳定性脂肪酶突变体(简称：脂肪酶突变体)，所述热稳定性脂肪酶突变体是由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列发生突变得到；所述突变的方式为：A8N(又称N8)、L59N(又称N95)、S227N(又称N227)中的一种。
SEQ ID NO.7：TCTGACGGTGGTAAAGTTGTTGCTGCTACTACTGCTCAAATTCAA GAGTTTACTAAGTACGCTGGTATTGCTGCAACTGCTTACTGTAGATCTGTTGTTCCAGGTAACAAATGGGATTGTGTTCAATGTCAAAAGTGGGTTCCAGATGGTAAGATTATTACTACCTTCACCTCTTTGTTGTCCGATACCAATGGTTACGTTTTGAGATCCGATAAGCAAAAGACCATCTACTTGGTTTTCAGGGGTACAAACTCTTTCAGATCTGCTATTACCGACATCGTGTTCAACTTCTCTGATTACAAACCAGTTAAGGGTGCTAAAGTTCATGCTGGTTTCTTGTCATCTTACGAACAAGTTGTTAACGACTACTTCCCAGTTGTCCAAGAACAATTGACTGCTCATCCAACTTACAAGGTTATCGTTACCGGTCATTCTTTAGGTGGTGCTCAAGCTTTGTTGGCTGGTATGGATCTATATCAAAGAGAGCCAAGATTGTCCCCAAAGAACTTGTCTATTTTTACTGTTGGTGGTCCAAGAGTTGGTAATCCAACTTTCGCTTATTACGTTTGCTCTACCGGTATTCCATTTCAAAGAACCGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCACATTTGCCACCTCAATCTTTCGGTTTCTTACATCCAGGTGTTGAATCCTGGATTAAGTCTGGTACATCTAACGTTCAAATCTGCACCTCTTGCATTGAAACTAAGGATTGCTCTAACTCCATCGTTCCATTCACCTCTATTTTGGATCACTTGTCTTACTTCGGTATCAACGAAGGTTCTTGCTTG
进一步地，所述热稳定性脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.5所示；
或者，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO.1：SDGGKVVNATTAQIQEFTKYAGIAATAYCRSVVPGNKWDCVQCQKW VPDGKIITTFTSLLSDTNGYVLRSDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDIVFNFSDYKPVKGAKVHAGFLSSYEQVVNDYFPVVQEQLTAHPTYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREPRLSPKNLSIFTVGGPRVGNPTFAYYVCSTGIPFQRTVHKRDIVPHLPPQSFGFLHPGVESWIKSGTSNVQICTSCIETKDCSNSIVPFTSILDHLSYFGINEGSCL。
SEQ ID NO.3：SDGGKVVAATTAQIQEFTKYAGIAATAYCRSVVPGNKWDCVQCQK WVPDGKIITTFTSNLSDTNGYVLRSDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDIVFNFSDYKPVKGAKVHAGFLSSYEQVVNDYFPVVQEQLTAHPTYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREPRLSPKNLSIFTVGGPRVGNPTFAYYVCSTGIPFQRTVHKRDIVPHLPPQSFGFLHPGVESWIKSGTSNVQICTSCIETKDCSNSIVPFTSILDHLSYFGINEGSCL。
SEQ ID NO.5：SDGGKVVAATTAQIQEFTKYAGIAATAYCRSVVPGNKWDCVQCQK WVPDGKIITTFTSLLSDTNGYVLRSDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDIVFNFSDYKPVKGAKVHAGFLSSYEQVVNDYFPVVQEQLTAHPTYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREPRLSPKNLSIFTVGGPRVGNPTFAYYVCSTGIPFQRTVHKRDIVPHLPPQSFGFLHPGVESWIKNGTSNVQICTSCIETKDCSNSIVPFTSILDHLSYFGINEGSCL
为了得到经过N-糖基化的米根霉脂肪酶，本发明构建增加N-糖基化位点米根霉脂肪酶毕赤酵母重组表达菌株，构建步骤如下：(1)使用Pymol软件对蛋白质进行了二级结构的显示和分析，结合晶体结构信息和N-糖基化预测网站(NetNGlyc 1.0Server)的结果，选择合适的N-糖基化位点；(2)通过分子生物学手段将携带米根霉脂肪酶基因的表达质粒进行定点突变；(3)将表达质粒到大肠杆菌中进行扩增；(4)从大肠杆菌中提取表达质粒；(5)测序验证表达质粒是否构建成功；(6)将表达质粒线性化并转化进入表达宿主菌；(7)菌落PCR筛选阳性突变子，编号，放入-80℃冰箱保藏备用。
本发明还提供了一种编码所述的热稳定性脂肪酶突变体的基因。
进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示；
或者，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的氨基酸序列。
所述编码热稳定性脂肪酶突变体的基因还可以是在严格条件下与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的基因序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质的DNA分子。
SEQ ID NO.2：TCTGACGGTGGTAAAGTTGTTAACGCTACTACTGCTCAAATTCAAG AGTTTACTAAGTACGCTGGTATTGCTGCAACTGCTTACTGTAGATCTGTTGTTCCAGGTAACAAATGGGATTGTGTTCAATGTCAAAAGTGGGTTCCAGATGGTAAGATTATTACTACCTTCACCTCTTTGTTGTCCGATACCAATGGTTACGTTTTGAGATCCGATAAGCAAAAGACCATCTACTTGGTTTTCAGGGGTACAAACTCTTTCAGATCTGCTATTACCGACATCGTGTTCAACTTCTCTGATTACAAACCAGTTAAGGGTGCTAAAGTTCATGCTGGTTTCTTGTCATCTTACGAACAAGTTGTTAACGACTACTTCCCAGTTGTCCAAGAACAATTGACTGCTCATCCAACTTACAAGGTTATCGTTACCGGTCATTCTTTAGGTGGTGCTCAAGCTTTGTTGGCTGGTATGGATCTATATCAAAGAGAGCCAAGATTGTCCCCAAAGAACTTGTCTATTTTTACTGTTGGTGGTCCAAGAGTTGGTAATCCAACTTTCGCTTATTACGTTTGCTCTACCGGTATTCCATTTCAAAGAACCGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCACATTTGCCACCTCAATCTTTCGGTTTCTTACATCCAGGTGTTGAATCCTGGATTAAGTCTGGTACATCTAACGTTCAAATCTGCACCTCTTGCATTGAAACTAAGGATTGCTCTAACTCCATCGTTCCATTCACCTCTATTTTGGATCACTTGTCTTACTTCGGTATCAACGAAGGTTCTTGCTTG。
SEQ ID NO.4：TCTGACGGTGGTAAAGTTGTTGCTGCTACTACTGCTCAAATTCAAG AGTTTACTAAGTACGCTGGTATTGCTGCAACTGCTTACTGTAGATCTGTTGTTCCAGGTAACAAATGGGATTGTGTTCAATGTCAAAAGTGGGTTCCAGATGGTAAGATTATTACTACCTTCACCTCTAACTTGTCCGATACCAATGGTTACGTTTTGAGATCCGATAAGCAAAAGACCATCTACTTGGTTTTCAGGGGTACAAACTCTTTCAGATCTGCTATTACCGACATCGTGTTCAACTTCTCTGATTACAAACCAGTTAAGGGTGCTAAAGTTCATGCTGGTTTCTTGTCATCTTACGAACAAGTTGTTAACGACTACTTCCCAGTTGTCCAAGAACAATTGACTGCTCATCCAACTTACAAGGTTATCGTTACCGGTCATTCTTTAGGTGGTGCTCAAGCTTTGTTGGCTGGTATGGATCTATATCAAAGAGAGCCAAGATTGTCCCCAAAGAACTTGTCTATTTTTACTGTTGGTGGTCCAAGAGTTGGTAATCCAACTTTCGCTTATTACGTTTGCTCTACCGGTATTCCATTTCAAAGAACCGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCACATTTGCCACCTCAATCTTTCGGTTTCTTACATCCAGGTGTTGAATCCTGGATTAAGTCTGGTACATCTAACGTTCAAATCTGCACCTCTTGCATTGAAACTAAGGATTGCTCTAACTCCATCGTTCCATTCACCTCTATTTTGGATCACTTGTCTTACTTCGGTATCAACGAAGGTTCTTGCTTG。
SEQ ID NO.6：TCTGACGGTGGTAAAGTTGTTGCTGCTACTACTGCTCAAATTCAAG AGTTTACTAAGTACGCTGGTATTGCTGCAACTGCTTACTGTAGATCTGTTGTTCCAGGTAACAAATGGGATTGTGTTCAATGTCAAAAGTGGGTTCCAGATGGTAAGATTATTACTACCTTCACCTCTTTGTTGTCCGATACCAATGGTTACGTTTTGAGATCCGATAAGCAAAAGACCATCTACTTGGTTTTCAGGGGTACAAACTCTTTCAGATCTGCTATTACCGACATCGTGTTCAACTTCTCTGATTACAAACCAGTTAAGGGTGCTAAAGTTCATGCTGGTTTCTTGTCATCTTACGAACAAGTTGTTAACGACTACTTCCCAGTTGTCCAAGAACAATTGACTGCTCATCCAACTTACAAGGTTATCGTTACCGGTCATTCTTTAGGTGGTGCTCAAGCTTTGTTGGCTGGTATGGATCTATATCAAAGAGAGCCAAGATTGTCCCCAAAGAACTTGTCTATTTTTACTGTTGGTGGTCCAAGAGTTGGTAATCCAACTTTCGCTTATTACGTTTGCTCTACCGGTATTCCATTTCAAAGAACCGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCACATTTGCCACCTCAATCTTTCGGTTTCTTACATCCAGGTGTTGAATCCTGGATTAAGAACGGTACATCTAACGTTCAAATCTGCACCTCTTGCATTGAAACTAAGGATTGCTCTAACTCCATCGTTCCATTCACCTCTATTTTGGATCACTTGTCTTACTTCGGTATCAACGAAGGTTCTTGCTTG。
本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含所述的基因。
进一步地，所述重组表达载体包括毕赤酵母蛋白表达载体；优选的，所述毕赤酵母蛋白表达载体包括pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3K、pPIC9K、pAO815或pPICZα；更优选的，所述重组表达载体为pPICZα。
本发明还提供了一种基因工程菌，该基因工程菌的宿主细胞包含所述的基因；或者包含所述的重组表达载体。
进一步地，所述宿主细胞为毕赤酵母或酿酒酵母；优选的，所述宿主细胞为毕赤酵母X33。
本发明还提供了一种酶制剂，该酶制剂包括所述的转氨酶突变体。
本发明还提供了所述的热稳定性脂肪酶突变体，或者所述的基因工程菌在油脂加工和生物柴油生产中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过人工设计N-糖基化位点获取得到N-糖基化突变的米根霉脂肪酶,并在工程菌中进行表达,突变体具有显著提高的酶活和热稳定性。其中最优突变体的酶活相比母本提升29.2％,热稳定性为母本的7.23倍，使其更具工业化应用价值。
附图说明
图1为N-糖基化突变位点示意图。
图2为N-糖基化突变前后脂肪酶的催化活力图。
图3为不同基因工程菌表达脂肪酶突变体的SDS-PAGE分析结果；
其中，M为蛋白marker，泳道1-8分别代表4M及A8N、N52、L59、N140、N197和S227N蛋白。
图4为N-糖基化突变体经PNGase F处理后的SDS-PAGE结果；
其中，M为蛋白marker，泳道1-10分别代表未进行改造的4M及A8N、L59N、N197、S227N原蛋白及经PNGase F处理的蛋白；+表明经PNGase F处理，-表明未经PNGase F处理；PNGase F:去糖基化酶；Glycosylated proROL：糖基化ROL蛋白；Deglycosylated proROL：非糖基化ROL蛋白。
图5为不同脂肪酶突变体在45℃下孵育不同时长的残余酶活。
具体实施方式
本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的***性误差。
实施例1引入N-糖基化的突变酶及构建基因工程菌
一、获取脂肪酶模板基因
将保存有重组菌E.coli DH5α/pPICZα-ProROL-4M的甘油管划线至含有LB固体培养基(25μg/mL博莱霉素)的平皿上，37℃静置培养16h。从平皿上挑取单菌落接入含25μg/mL博莱霉素的5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养16h。获得培养液后，根据质粒提取试剂盒的操作说明书进行E.coli DH5α/pPICZα-ProROL-4M质粒的提取。
二、定点突变脂肪酶基因
以提取的E.coli DH5α/pPICZα-ProROL-4M质粒为模版，通过全质粒PCR向ProROL-4M基因引入定点突变，所用引物及PCR反应体系分别见表1、表2。
表1PCR所用引物
表2PCR扩增体系
以ProROL-4M质粒为模板，用表1所示引物进行点突变PCR，PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件：
1)预变性：98℃5min；
2)变性：98℃10s；退火：60℃15s；延伸：72℃1min 30s；共循环35次；
3)延伸：72℃10min；
4)4℃保存2.0h。
PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，目标条带用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收。回收得到的PCR产物用DPN I消化，去除模板。消化体系如表3所示。
表3消化体系
消化条件：
1)37℃：1h；2)75℃：10min；3)4℃保存2.0h。
三、表达突变型脂肪酶的菌株的构建
消化后，产物化转导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后，由北京擎科新业生物技术有限公司测序，将测序结果正确的菌株冻存，获得重组大肠杆菌菌株。
重组大肠杆菌菌株扩培后提取质粒，用SacⅠ单酶切为线性，总量为0.5-1μg进行电转毕赤酵母X33感受态。电转仪设置为电压1500V，电容25μF，电阻400Ω。电转后加入l mL孵育液(1M山梨醇溶液与YPD培养基1：1混合)，30℃复苏3h后涂布Zeocin浓度为100μg/mL的YPD平板，长出的单菌落接种YPD液体培养基扩培后提取基因组。以基因组为模板，以5’AOX和3’AOX通用引物进行PCR反应，得到同时含有2000bp和1500bp左右条带，即确定为阳性毕赤酵母基因工程菌。
实施例2重组菌株摇瓶发酵以及脂肪酶的分离纯化
一、重组菌株的摇瓶发酵
参考Invitrogen公司操作手册，挑取阳性菌株单菌落接种至40mL BMGY培养基中，30℃、220rpm摇床培养至OD为2-6转接至40mL BMMY培养基中，相同条件培养，每24h添加1mL甲醇诱导，发酵96h，取样测酶活。
脂肪酶活力的测定方法为比色法，以对硝基苯酚棕榈酯为底物，脂肪酶水解对硝基苯酚棕榈酸酯底物产生对硝基苯酚，对硝基苯酚在水溶液中显黄色，在410nm有最大的光吸收，通过测定对硝基苯酚在410nm处的光吸收,可测得脂肪酶的活力。酶活的定义为一定反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。
二、脂肪酶的分离纯化
1、10kDa超滤浓缩
将200mL发酵液4℃4000rpm离心30min后弃掉沉淀，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，微滤后的溶液用10kDa超滤管浓缩至1mL左右。随后，使用50mL 50mM PB缓冲液(pH 8.0)进行置换，离心至5mL左右取出备用。
2、Ni-NTA纯化
将上述5mL浓缩液加入45mL上述PB缓冲液中，上样至已用50mM咪唑溶液(以100mMPB缓冲液配置，含100mM氯化钠，pH 8.0)预平衡的Ni-NTA柱中，使用50mM咪唑溶液(以100mMPB缓冲液配置，含100mM氯化钠，pH 8.0)除杂，使用250mM咪唑溶液(以100mM PB缓冲液配置，含100mM氯化钠，pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱液并使用10kDa超滤管浓缩至1mL，使用上述50mL PB缓冲液置换咪唑溶液，超滤浓缩至1mL，样品冷冻备用。
三、N-糖基化脂肪酶的SDS-PAGE分析
取摇瓶发酵上清进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，突变体N52在非糖基化蛋白和N-糖基化蛋白处均未有蛋白表达，表明引入的糖基化位点对蛋白的表达产生了负面的影响，突变体N140条带与4M一致，表明N140尽管存在N-糖基化位点但并未发生N-糖基化，其余突变体均成功发生N-糖基化。取上述糖基化样品分别进行PNGase F进去去N-糖基化处理，处理后样品与未处理样品共同使用SDS-PAGE进行分析，结果如图4所示。4M蛋白在处理前后大小并未发生改变，而N8、N59、N197及N227蛋白均在PNGase F处理前后蛋白大小发生明显变化，且处理后的蛋白条带与4M一致，表明四个突变体均发生了N-糖基化。
四、脂肪酶的催化活力测定
脂肪酶活力的测定方法为比色法，以对硝基苯酚棕榈酯为底物,脂肪酶水解对硝基苯酚棕榈酸酯底物产生对硝基苯酚,对硝基苯酚在水溶液中显黄色，在410nm有最大的光吸收,通过测定对硝基苯酚在410nm处的光吸收,可测得脂肪酶的活力。酶活的定义为一定反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。
结果如图2所示，引入糖基化后的突变体N8、N59、N197和N227的比活力与未进行糖基化改造的出发株相比分别提高了31.9％、10.5％、37.5％和29.2％。
实施例3脂肪酶的热稳定性分析
脂肪酶热稳定性以脂肪酶在45℃下的半衰期(T1/2(45℃))来表示，所有突变体与出发株在上述PB缓冲液中稀释至相同蛋白浓度，并在45℃下进行孵育，以确定的时间间隔进行取样并测定样品的催化活力，计算残余活力百分比。
结果如图4所示，引入糖基化的突变体N8、N59和N227的T1/2(45℃)分别为75.5h、225.9h和298.8h，为未进行糖基化改造的4M(41.3h)的1.83、5.47和7.23倍，而N197的T1/2(45℃)则降低至9.9h。研究结果表明在脂肪酶中适当位点引入N-糖基化大大增强了脂肪酶的热稳定性，同时对脂肪酶的催化活力也能产生了积极的影响。
Claims (10)
1.热稳定性脂肪酶突变体，其特征在于，所述热稳定性脂肪酶突变体是由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列发生突变得到；所述突变的方式为：A8N、L59N、S227N中的一种。
2.如权利要求1所述的热稳定性脂肪酶突变体，其特征在于，所述热稳定性脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示；
或者，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的氨基酸序列。
3.一种编码权利要求2所述的热稳定性脂肪酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQID NO.4或SEQ ID NO.6所示；
或者，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的氨基酸序列。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的基因。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括毕赤酵母蛋白表达载体；优选的，所述毕赤酵母蛋白表达载体包括pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3K、pPIC9K、pAO815或pPICZα；更优选的，所述重组表达载体为pPICZα。
7.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主细胞包含如权利要求3所述的基因；或者包含如权利要求4所述的重组表达载体。
8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母或酿酒酵母；优选的，所述宿主细胞为毕赤酵母X33。
9.一种酶制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的转氨酶突变体。
10.如权利要求1或2任一项所述的热稳定性脂肪酶突变体，或者如权利要求7或8任一项所述的基因工程菌在油脂加工和生物柴油生产中的应用。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016169306A1 (zh) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | 江南大学 | 糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用 |
| CN109468301A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-15 | 浙江大学 | 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016169306A1 (zh) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | 江南大学 | 糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用 |
| CN109468301A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-15 | 浙江大学 | 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用 |
| CN111944783A (zh) * | 2018-12-13 | 2020-11-17 | 浙江大学 | 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用 |
| WO2023158372A2 (en) * | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Wilmar International Limited | Engineering of rhizopus oryzae lipase to increase its thermostability for the production of structured triacylglycerols |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JINSHA HUANG等: "Alteration of Chain-Length Selectivity and Thermostability of Rhizopus oryzae Lipase via Virtual Saturation Mutagenesis Coupled with Disulfide Bond Design", APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 89, no. 1, 5 January 2023 (2023-01-05) * |
| 刘燕雅;黄平;司圣乾;陈彦;林琳;: "P197E与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的影响", 微生物学通报, no. 02, 20 February 2010 (2010-02-20) * |
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