CN117659219A

CN117659219A - 一种河南石斛多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117659219A
Application number: CN202311298690.9A
Authority: CN
Inventors: 解松子; 刘春阳; 吴德玲; 白金波; 许凤清; 曹鹏
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2023-10-09
Filing date: 2023-10-09
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明提供一种河南石斛多糖及其制备方法和应用，涉及植物多糖提取领域。河南石斛多糖的制备方法包括脱脂处理、水提醇沉法提取、除淀粉、脱蛋白、透析、DEAE‑52阴离子交换色谱柱一级纯化和Sephadex‑G凝胶柱二级纯化的步骤。本发明首次提供了一种河南石斛多糖的制备方法，并且意外发现了采用前述方法制备得到的河南石斛多糖具有显著的降血脂和抗氧化作用。本发明提供的河南石斛多糖的制备方法及对其药用价值的探究能够进一步促进河南石斛药材的开发利用，有助于促进当地扶贫产业的可持续发展。本发明提供的河南石斛多糖的制备方法，工艺稳定，操作简便，同时能够获得高纯度、高活性的多糖，具有重要的现实意义。

Description

一种河南石斛多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物多糖提取与应用领域，具体涉及一种河南石斛多糖及其制备方法和应用。

背景技术

石斛，隶属于兰科石斛属，《神农本草经集注》记载：“石斛，味甘性平。主伤中、除痹、下气，补五脏，虚劳羸瘦，强阴，久服厚肠胃，轻身延年”。河南石斛(Dendrobiumhenanense J.L.Liu et L.X.Gao)，茎丛生，圆柱形，回折弯曲，叶矩圆状披针形，近革质，萼片和花瓣白色，蒴果，倒卵状披针形。河南石斛具有益胃生津、滋阴清热的功效。

植物多糖是一种天然的高分子聚合物，对人体毒副作用低，与其他生物大分子相比，空间构型和连接方式高度多样化，显示出多种生物活性。关于石斛的化学成分研究主要集中在多糖等大分子物质的基础上，这提示研究者多糖是石斛的主要活性物质。

目前，国内外对石斛多糖的研究主要集中在霍山石斛、金钗石斛、铁皮石斛或流苏石斛等石斛品种，包括石斛多糖的提取分离、结构表征及活性研究方面，但对于河南石斛活性成分的研究却十分少见。这是因为本领域技术人员公认在石斛药材品种中以霍山石斛的品质为最佳，而河南石斛则是霍山石斛最常见的伪品。并且两者在市场上的价格差异也是非常巨大的，截止目前，霍山石斛市价约2000-4000元/公斤，河南石斛价格在50-100元/公斤。由此更进一步导致了本领域对河南石斛活性成分的研究甚少。而如何能提取出有药用活性的河南石斛多糖，具体有何药用价值，仍有待研究。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种河南石斛多糖及其制备方法和应用，以期推动对于河南石斛药材的开发利用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种河南石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)取河南石斛原药材粉末进行脱脂处理，烘干，得到脱脂药材粉末；

(2)采用水提醇沉法对所述脱脂药材粉末进行提取，得到醇沉物；

(3)取所述醇沉物进行除淀粉、脱蛋白、透析，得到河南石斛粗多糖；

(4)以DEAE-52阴离子交换色谱柱对所述河南石斛粗多糖进行一级纯化，取超纯水洗脱组分多糖进行Sephadex-G凝胶柱二级纯化，收集相应洗脱组分，浓缩、冻干，得到所述河南石斛多糖。

进一步地，步骤(1)中，采用体积浓度50％～90％的乙醇进行脱脂处理，优选体积浓度80％的乙醇；以g/mL计，河南石斛原药材粉末与乙醇的质量体积比为1～1.5：2～6，优选为1：4；向河南石斛原药材粉末中加入乙醇后室温震荡12～48h，优选为24h。

进一步地，步骤(2)中，水提过程中，以g/mL计，脱脂药材粉末和水的料液比为1：10～50，优选为1：30；提取温度为60～90℃，优选为80℃；提取时间为1～3h，优选为2h；醇沉过程中，将水提液减压浓缩至原体积的1/4～1/8，优选为1/5；加入乙醇至终浓度60％～80％，优选为80％，静置12～48h，优选为24h。

进一步地，步骤(3)中，

除淀粉过程中，取所述醇沉物复溶后加入α淀粉酶进行酶解，其中，以河南石斛原药材粉末的质量计，所述α淀粉酶加入量为1～3μL/g，优选为1μL/g；酶解温度为30～60℃，优选为60℃；酶解时间为0.5～3h，优选为1h；酶解后将酶解液浓缩至原体积的1/2～1/6，优选为1/3，离心去除淀粉及其他不溶沉淀，得到除淀粉糖液；

脱蛋白过程中，按除淀粉糖液、氯仿、正丁醇体积比20～50：2～10：0.5～2混合后剧烈振摇1～5h，离心除去蛋白层，重复3～10次，减压除去糖液中残留的有机溶剂，优选的，体积比为30：5：1，剧烈振摇2h，重复7次；

透析过程中，采用截留分子量大于3500Da的透析袋流水透析2～3天，优选为2天，续用去离子水透析12～48h，优选为24h，浓缩液真空冷冻干燥，得到所述河南石斛粗多糖。

进一步地，步骤(4)中，

一级纯化过程中，依次用超纯水、浓度由低至高的氯化钠溶液洗脱，洗脱速度为5～8mL/min，优选为5mL/min；

二级纯化过程中，采用Sephadex-G100凝胶柱，用超纯水洗脱，洗脱速度为2～3mL/min，优选为2mL/min。

进一步地，步骤(4)中，

一级纯化过程中，收集超纯水洗脱组分浓缩、透析、冻干得所述超纯水洗脱组分多糖；

二级纯化过程中，收集洗脱曲线吸光度值最高峰及左右两管的洗脱组分。

第二方面，本发明提供所述的制备方法得到的河南石斛多糖。

进一步地，所述河南石斛多糖的分子量为2×10⁴～9×10⁴Da，优选为8×10⁴Da。

进一步地，所述河南石斛多糖的单糖组成为岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，其中，岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的摩尔比为0.221：0.02：0.32：0.403。

第三方面，本发明提供所述的方法制备得到的河南石斛多糖或者所述的河南石斛多糖在制备降血脂药物和/或抗氧化药物中的应用。

第四方面，本发明提供所述的河南石斛多糖在制备治疗非酒精性肝损伤和/或治疗氧化应激的药物中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明首次提供了一种河南石斛多糖的制备方法，包括脱脂处理、水提醇沉法提取、除淀粉、脱蛋白、透析、DEAE-52阴离子交换色谱柱一级纯化和Sephadex-G凝胶柱二级纯化的步骤。采用这种方法制得的河南石斛多糖单糖组成为岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖。并且本发明意外发现了采用前述方法制备得到的河南石斛多糖具有显著的降血脂和抗氧化作用，具体而言，通过体外药效学实验证明本发明制备的河南石斛多糖对DPPH自由基、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(OOH^-)和ABTS自由基均有一定程度的清除作用；饲喂高糖高脂饲料建立非酒精性肝损伤大鼠模型，通过体内药效学实验证明本发明制备的河南石斛多糖具有保肝作用，并且能够降低氧化应激水平；腹腔注射D-半乳糖建立氧化应激小鼠模型，通过体内药效学实验证明本发明制备的河南石斛多糖能改善D-半乳糖诱导的氧化损伤，具有抗氧化应激作用，并且通过和霍山石斛多糖进行对比，发现本发明制备的河南石斛多糖能达到与霍山石斛多糖基本相同的水平，同样具有显著的功效。

本发明打破了本领域对于河南石斛的认识和偏见，并且基于河南石斛在市场价格上具有较大优势，本发明提供的河南石斛多糖的制备方法及对其药用价值的探究能够进一步促进河南石斛药材的开发利用，有助于促进当地产业的可持续发展。

本发明提供的河南石斛多糖的制备方法，工艺稳定，操作简便，同时能够获得高纯度、高活性的多糖，具有重要的现实意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中以DEAE-52阴离子交换色谱柱对河南石斛粗多糖进行一级纯化时的洗脱曲线；

图2是本发明实施例中将超纯水洗脱组分多糖进行Sephadex-G100凝胶柱二级纯化时的洗脱曲线；

图3是本发明实施例制得的河南石斛多糖DNPW的外观形貌图；

图4是本发明实施例制得的河南石斛多糖DNPW的扫描电镜图；

图5是本发明实施例制得的河南石斛多糖DNPW的紫外光谱图；

图6是本发明实施例制得的河南石斛多糖DNPW的红外光谱图；

图7是本发明实验例3中各组大鼠肝脏组织HE染色切片图；

图8是本发明实验例4中河南石斛多糖和霍山石斛多糖对肝脏组织中SOD、MDA、GSH-PX和T-AOC的影响结果；

图9是本发明实验例4中河南石斛多糖和霍山石斛多糖对脑组织中SOD、MDA、GSH-PX和T-AOC的影响结果；

图10是本发明实验例4中河南石斛多糖和霍山石斛多糖对肾脏组织中SOD、MDA、GSH-PX和T-AOC的影响结果；

图11是本发明实验例4中河南石斛多糖和霍山石斛多糖对血清中SOD、MDA、GSH-PX和T-AOC的影响结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，包括但不限于本申请实施例中采用的原料或仪器。

实施例

本实施例提供一种河南石斛多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)河南石斛原药材脱脂处理

准确称取干燥的河南石斛茎粉末200g，加入体积浓度80％的乙醇800mL，在摇床中室温震荡24h，过滤，将粉末烘干，得到脱脂药材粉末备用；

(2)河南石斛多糖提取

取步骤(1)得到的脱脂药材粉末，加入30倍量水，80℃水浴提取2h，所得提取液减压浓缩至原体积1/5，向浓缩液中加入乙醇至终浓度80％，静置24h醇沉，滤取沉淀，得到醇沉物；

(3)除淀粉、除蛋白、透析

称取醇沉物100g复溶后加入α淀粉酶(以河南石斛茎粉末的质量计，酶添加量为1μL/g)，60℃酶解1h，将酶解液浓缩至原体积1/3，离心(5000rpm/10min)去除淀粉及其他不溶沉淀，得到除淀粉糖液，按除淀粉糖液：氯仿：正丁醇体积比为30:5:1混合，剧烈振摇2h后离心(5000rpm/10min)，除去蛋白层，重复7次，减压除去糖液中残留的有机溶剂，用截留分子量为3500Da的透析袋流水透析48h后，续用去离子水透析24h，浓缩液真空冷冻干燥，得河南石斛粗多糖14g；

(4)河南石斛多糖的分离纯化

以DEAE-52阴离子交换色谱柱对河南石斛粗多糖进行一级纯化，依次用超纯水和浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的氯化钠溶液对其洗脱，上样量200mg，洗脱速度为5mL/min，每洗脱组分收集20管，采用苯酚硫酸法测定各管OD值，绘制洗脱曲线，如图1所示，取超纯水洗脱组分浓缩、透析、冻干得超纯水洗脱组分多糖；将超纯水洗脱组分多糖进行Sephadex-G100凝胶柱二级纯化，用超纯水洗脱，上样量50mg，洗脱速度为2mL/min，收集80管，采用苯酚硫酸法测定各管OD值，绘制洗脱曲线，如图2所示，收集洗脱曲线吸光度值最高峰及左右两管的洗脱组分，浓缩，冻干得河南石斛多糖，命名为DNPW。

实验例1DNPW理化性质测定

1、形貌特征

用相机拍摄DNPW的外观形貌，如图3所示，DNPW为白色絮状粉末。

通过扫描电镜观察DNPW的微观形貌，如图4所示，DNPW呈表面光滑的不规则片状。

2、紫外光谱图

将DNPW制备成浓度为0.1mg/mL的河南石斛多糖溶液，利用紫外可见分光光度计在190～800nm波长范围内进行扫描获得紫外光谱图。如图5所示，吸收曲线平滑，表明DNPW中蛋白含量低。

3、红外光谱图

称取DNPW 2mg，加入100mg KBr干粉，在玛瑙研钵中混合研磨，压片，置于傅里叶红外光谱扫描仪上在4000cm^-1～400cm^-1范围内进行扫描分析。吸收峰波数分别为3426cm^-1、2938cm^-1、1742cm^-1、1644cm^-1、882cm^-1，从图6中可以看出分子结构中含有羟基、亚甲基、羰基、吡喃糖环存在。

4、分子量

DNPW的分子量测定使用日本岛津2010A高效液相色谱***，配备岛津RID-20A检测器和TSK-gel G4000 PWXL柱(8.0mm×300mm，Borui Saccharide，Biotech.Co.Ltd)，流动相为超纯水，温度40℃，流速为0.6mL/min。经系列葡聚糖标准品制备的标定曲线计算分子量，得到分子量为8×10⁴Da。

5、单糖组成

取DNPW 5mg、0.05M三氟乙酸10mL置于密闭安瓿瓶中，100℃下水解30min，反应混合物用氮气干燥，用甲醇蒸发消除多余的酸；取样品适量，水溶解，微孔滤膜过滤；采用美国Thermo Fisher Scientific公司的HPAEC-PAD体系DionexICS-5000，100mM氢氧化钠水溶液为流动相，流速0.5mL/min，流经美国Dionex公司的carbpac^TMPA20色谱柱(3mm×150mm)分析DNPW的单糖组成，结果见表1。

表1 DNPW单糖组成结果

单糖组成	岩藻糖	半乳糖	葡萄糖	甘露糖
					摩尔比	0.221	0.02	0.32	0.403

实验例2 DNPW的体外药效学实验

1、多糖溶液制备

取DNPW样品适量，精密称定。用蒸馏水分别配制浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的多糖溶液，备用；抗坏血酸(Vc)为阳性对照组。

2、自由基清除率测定

DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基或ABTS自由基清除率测定采用公式(1)计算：

DPPH自由基：分别取不同浓度的多糖溶液1.0mL，加入2.0mL 0.2mM的DPPH(2,2-二苯基-1-吡啶并肼基)-乙醇溶液，室温下避光反应30min，去离子水调零，517nm处测定其OD值(记为A₁)；用去离子水替代多糖溶液，测其OD值(记为A₀)；用去离子水替代DPPH，测定其OD值(记为A₂)。对相同浓度的抗坏血酸采用相同的方法测定其DPPH自由基清除能力作为阳性对照。

羟基自由基：分别取不同浓度的多糖溶液1.0mL，加入1.0mLFeSO₄(6mmol/L)，1.0mL H₂O₂(6mmol/L)混合，37℃孵育10min，再加入1.0mL水杨酸-乙醇溶液(6mmol/L)混匀，37℃孵育30min，去离子水调零，用分光光度计在510nm下测定其OD值(记为A₁)；用去离子水替代多糖溶液，测其OD值(记为A₀)；用去离子水替代H₂O₂，测定其OD值(记为A₂)。对相同浓度的抗坏血酸采用相同的方法测定其羟基自由基清除能力作为阳性对照。

超氧阴离子自由基：利用NADH-NBT-PMS(还原型辅酶Ⅰ—吩嗪硫酸甲酯—氮蓝四唑)体系测定DNPW清除超氧阴离子自由基能力，将1.0mL多糖溶液与1.0mL浓度为557μmol/LNaDH(还原型辅酶I二钠盐)-Na溶液、1.0mL浓度为45μmol/L PMS(N-甲基吩嗪甲基硫酸盐)溶液、1.0mL浓度为108μmol/L NBT(氯化硝基四氮唑蓝)溶液混匀，于25℃下温浴5min，去离子水调零，用分光光度计在510nm下测定其OD值(记为A₁)；用去离子水替代多糖溶液，测其OD值(记为A₀)；用去离子水替代NADH-NBT-PMS反应液，测定其OD值(记为A₂)。对相同浓度的抗坏血酸采用相同的方法测定其超氧阴离子自由基清除能力作为阳性对照。

ABTS自由基：7mmol/LABTS溶液(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)与2.45mmol/L过硫酸铵溶液混合避光氧化12h得到ABTS混合液；ABTS混合液用pH为7.4的PBS溶液稀释至在734nm波长下，吸光值为0.80。取2mL ABTS混合液与1.0mL多糖溶液混合，室温放置6min，去离子水调零，在734nm波长下测定其OD值(记为A₁)；用去离子水替代多糖溶液，测其OD值(记为A₀)；用去离子水替代ABTS混合液，测定其OD值(记为A₂)。对相同浓度的抗坏血酸采用相同的方法测定其ABTS自由基清除能力作为阳性对照。

3、统计分析

采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和IC₅₀(半数抑制浓度)计算，结果以mean±SD表示。自由基清除率测定结果见表2，结果表明DNPW对DPPH自由基、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(OOH^-)和ABTS自由基均有一定程度的清除作用，并呈现剂量依赖性。

表2DNPW体外清除氧化自由基结果

实验例3DNPW的体内药效学实验-非酒精性肝损伤

1、动物分组、模型建立及给药方案

60只SPF级SD雄性大鼠适应性饲养一周，期间喂食普通饲料，自由饮水、觅食。适应期后，检测大鼠空腹血清中的TG和TC含量，并随机等分为正常对照组(C-CON)、正常加多糖高剂量组(C-DNPW-H)、模型组(C-HC)、阳性对照组(C-ST+HC)、多糖低剂量组(C-DNPW-L+HC)、和多糖高剂量组(C-DNPW-H+HC)，每组10只。除了C-CON和C-DNPW-H组全程给予正常饲料，其余各组换成高糖高脂饲料，C-ST+HC组每日灌胃辛伐他汀4mg/kg四周，C-DNPW-L+HC和C-DNPW-H以及C-DNPW-H+HC组每日分别灌胃40mg/kg、160mg/kg、160mg/kg河南石斛多糖DNPW四周。实验结束前一天眼眦取血。最后一次给药前，大鼠禁食不禁水12h。称重，给药后30min，腹主动脉取血，脱臼，处死。取心脏、肝脏、附睾和腹部脂肪组织，称重。

2、指标测定

全血收集于干净的1.5mL离心管中，室温放置2h，再置于4℃冰箱内过夜，待血液凝固血块，以3500×g的离心速度离心10min，分离血清。按试剂盒说明书测定大鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)、AST(谷草转氨酶)、谷丙转氨酶(ALT)含量以及血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)含量。

将大鼠肝脏组织在预冷的生理盐水中漂洗，去除血液，用滤纸吸干表面水分，称重。部分肝脏组织加入9倍0.9％质量浓度预冷的生理盐水，置于玻璃匀浆器中冰水浴迅速研磨制成组织匀浆，4℃下以12000×g的离心速度离心15min，取上清液。按试剂盒说明书测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)水平。

3、肝脏组织学检查

取各大鼠肝脏右叶相同部位约0.5cm×1cm×1cm的肝脏组织，10％***固定、乙醇脱水、石蜡包埋，切片(厚度为4-5cm)，苏木精和伊红染色(HE)，利用日本日本尼康公司生产的Nikon Eclipse E100显微镜观察肝脏组织损伤程度。

4、统计学方法

采用SPSS7.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。结果以mean±SD表示。^##表示p<0.01，与正常对照组相比具有显著性差异；^*表示p<0.05，与模型组相比具有显著性差异，^**表示p<0.01，与模型组C-HC相比具有极显著性差异

5、结果分析

(1)DNPW对大鼠体重和脏器指数的影响

DNPW对大鼠体重和脏器指数的影响分析结果见表3。从表3中的数据可以看出，与正常对照组比较，模型组的末次体重显著升高(p<0.01)，经不同剂量的河南石斛多糖DNPW治疗后，大鼠末次体重显著降低(p<0.01)；同时，C-DNPW-H组的大鼠体重与模型组相比明显减轻，并趋于正常组。然而，模型组大鼠的肝脏指数较正常组相比有一定程度增加，但结果并不显著，经多糖高剂量组治疗后，大鼠的肝脏指数较模型组显著性增加(p<0.05)，这些结果说明河南石斛多糖DNPW对非酒精性肝损伤大鼠的肝脏具有保护作用。

表3 DNPW对非酒精性肝损伤大鼠的脏器指数和体重的影响

组别	肝脏指数(％)	初始体重(g)	末次体重(g)
				C-CON	2.856±0.21	249.58±5.09	329.64±21.9
C-HC	2.622±0.31	242.60±8.21	323.78±18.8^##
				C-ST+HC	3.306±0.22	245.51±7.22	371.7±22.3**
C-DNPW-H	3.383±0.4	239.23±9.05	327.2±38.4
				C-DNPW-L+HC	3.315±0.3	241.14±9.63	289.2±20.6^##
C-DNPW-H+HC	2.748±0.53*	244.26±8.24	342.7±52.63^##

(2)DNPW对大鼠血清生化指标的影响

为评估河南石斛多糖DNPW对非酒精性肝损伤大鼠模型的影响，检测了大鼠血清中ALT和AST的水平，结果如表4所示，与C-CON组相比，C-HC组大鼠持续给予高糖高脂饲料后ALT(p<0.05)和AST(p<0.01)显著性上升，说明非酒精性肝损伤大鼠模型的肝脏受损；与C-HC组相比，用河南石斛多糖DNPW给药的大鼠ALT和AST水平显著下降(p<0.05、p<0.01)，肝脏受损程度有所改善；同时为考察非酒精性肝损伤大鼠脂质代谢水平，测定了血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，与C-CON组相比，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平显著性升高(p<0.05)，HDL-C水平极显著性降低(p<0.01)。与C-HC组相比，阳性对照组、多糖低剂量组及多糖高剂量组可以显著降低TC、TG、LDL-C水平(p<0.05)，同时多糖高剂量组能极显著的升高HDL-C水平，说明河南石斛多糖DNPW以剂量依赖性的方式保护肝损伤。

表4 DNPW对大鼠血清生化指标的影响

(3)DNPW对大鼠血清中氧化应激指标的影响

表5为DNPW对大鼠血清氧化应激指标的影响分析结果。从表5中可以看出，与C-CON组相比，C-HC组大鼠血清SOD和GSH-Px、T-AOC、CAT活力显著降低(p<0.01)，MDA含量显著增加(p<0.01)，说明模型组大鼠受到氧化损伤；与C-HC组相比，阳性对照组、多糖低剂量组及多糖高剂量组显著性增加T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT水平(p<0.05、p<0.01)，并极显著降低MDA水平(p<0.01)，此外，C-DNPW-H组各个氧化指标酶的含量与正常对照组相近，这提示长期补充河南石斛多糖不影响这些酶的水平。

表5DNPW对大鼠血清中氧化应激指标影响

(4)DNPW对肝组织中氧化应激指标的影响

表6为DNPW对肝组织中氧化应激指标的影响分析结果。从表6中可以看出，与C-CON组比较，C-HC组大鼠肝脏组织中SOD和GSH-Px、T-AOC、CAT活力显著降低(p<0.01、p<0.05)，MDA含量显著增加(p<0.01)；与C-HC组相比，阳性对照组、多糖低剂量组及多糖高剂量组显著性增加T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT水平(p<0.05、p<0.01)，并极显著降低MDA水平(p<0.01)，这提示河南石斛多糖DNPW能改善非酒精性肝损伤大鼠的肝脏损伤。

表6DNPW对大鼠肝脏组织中氧化应激指标影响

(5)HE染色分析河南石斛对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏损伤的影响

从图7可以看出，图7a C-CON组和图5C-DNPW-H组肝脏组织学特征正常，核结构清晰，肝细胞呈放射状排列在中央静脉周围，呈多角形，细胞核突出，细胞质均匀；图7b C-HC组肝细胞有轻度水肿，轻度脂肪变性和少量炎性浸润，胞质内有大量的脂滴空泡，这些典型的病理特征证实了长期高脂诱导非酒精性肝损伤模型的成功；图7c C-ST+HC组肝细胞基本正常，无明显水肿和脂滴空泡现象；图7e和图7f经河南石斛多糖低、高剂量(DNPW-L和DNPW-H)治疗的肝脏结构清晰，排列较整齐，水肿和脂滴空泡现象均有不同程度的缓解，证实了河南石斛多糖DNPW对非酒精性肝损伤具有一定的改善作用。

实验例4DNPW的体内药效学实验-D-半乳糖诱导的氧化损伤

1.动物分组、模型建立及给药方案

70只雄性KM小鼠适应性饲养一周，期间喂食普通饲料，自由饮水、觅食。适应期后，随机分为正常对照组(Control)、D-半乳糖模型组(Model)、VC阳性对照组(Positive)、河南石斛多糖低剂量组(NL)、河南石斛多糖高剂量组(NH)、霍山石斛多糖低剂量组(HL)、霍山石斛多糖高剂量组(HH)，每组10只。除正常对照组之外，其余各组每天腹腔注射0.2mL的D-半乳糖(150mg/kg)，河南石斛多糖低剂量和高剂量组和霍山石斛低剂量组和高剂量组在腹腔注射D-半乳糖后的同天分别灌胃100mg/kg、400mg/kg多糖水溶液，阳性对照组灌胃100mg/kg VC水溶液，正常对照组和模型组灌喂等体积生理盐水。实验持续30天，在第31天，所有小鼠禁食禁水12h后称重。眼眦取血；脱颈处死后解剖，取脑、肝脏、肾脏，-80℃保存。

本实验所采用的河南石斛多糖即为实施例制备的DNPW。

本实验所采用的霍山石斛多糖DHPW制备方法如下：

称取干燥的霍山石斛茎原药材粉末200g，采用质量浓度为80％的乙醇室温震荡脱脂24h，结束后过滤，保留沉淀，挥干乙醇得到脱脂药材粉末备用；按照料液比1:30(g/mL)向脱脂药材粉末中加入蒸馏水，80℃提取2h，所得糖液浓缩至600mL，加入α-淀粉酶(以霍山石斛茎原药材粉末的质量计，酶添加量为1μL/g)，60℃酶解1h去除淀粉，将除淀粉后的糖液浓缩至原体积的1/3，按照糖液：氯仿：正丁醇＝30：5：1的体积比加入氯仿和正丁醇除蛋白，去除残留的有机试剂后，蒸馏水透析48h(透析袋截流分子量为3500Da)，浓缩至20mL，冷冻干燥，得霍山石斛粗多糖。

称取霍山石斛粗多糖200mg，上样于DEAE-52阴离子交换柱，依次用超纯水和浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱速度为5mL/min，每洗脱组分收集20管，采用苯酚硫酸法测定各管OD值，绘制标准曲线，取超纯水洗脱组分浓缩、透析、冻干得超纯水洗脱组分多糖，命名为DHPW。

经测定，DHPW分子量为2.4×10⁴，是以葡萄糖和甘露糖为主的杂多糖，具体的单糖组成摩尔比为岩藻糖(Fuc)：鼠李糖(Rha)：***糖(Ara)：半乳糖(Gal)：葡萄糖(Glc)：吡喃木糖(Xyl)：甘露糖(Man)：半乳糖醛酸(Gla-UA)：葡萄糖醛酸(Glc-UA)＝1：19.5：25.0：37.0：280.0：6.0：107.5：21.0：3.5。

2.指标测定

全血收集于干净的1.5mL离心管中，室温放置2h，以3500×g的离心速度离心10min，分离血清。按试剂盒说明书测定小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平、丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)。

小鼠肝脏、脑和肾脏组织并将其在预冷的生理盐水中漂洗，去除血液，用滤纸吸干表面水分，称重。部分肝脏、脑和肾脏组织加入9倍0.9％质量浓度预冷的生理盐水，置于玻璃匀浆器中冰水浴迅速研磨制成组织匀浆，4℃下以12000×g的离心速度离心15min，取上清液。按试剂盒说明书测定SOD、GSH-Px和MDA、T-AOC水平。

3.统计学方法

采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。结果以mean±SD表示；p值小于0.05被认为有统计学意义。^#p<0.05，^##p<0.01分别表示与正常对照组相比具有显著性差异和极显著性差异；*p<0.05，**p<0.01分别表示与模型组相比具有显著性差异和极显著性差异；^&p<0.05，^&&p<0.01分别表示与河南石斛高剂量组相比具有显著性差异和极显著性差异。

4.结果分析

图8～11为两种石斛多糖对肝脏组织、脑组织、肾脏组织以及血清中SOD、MDA、GSH-PX和T-AOC的影响结果。从图中可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏组织、肾脏组织、脑组织以及血清中MDA水平与正常组相比显著提高(p<0.05，p<0.01)，抗氧化酶SOD、GSH-PX活力和总抗氧化能力T-AOC显著降低(p<0.05，p<0.01)。两个多糖组相较于模型组能显著降低MDA的水平，提高抗氧化酶SOD和GSH-PX的活力以及总抗氧化能力，这说明河南石斛多糖和霍山石斛多糖都能改善D-Gal诱导的氧化损伤，其中，河南石斛多糖和霍山石斛多糖在不同脏器/血清中的多数指标结果无显著性差异，这说明河南石斛多糖也同样具有潜在的改善D-Gal诱导的氧化损伤作用，具有抗氧化应激的功效，并且河南石斛所具有的显著的价格优势使其具有更加广阔的应用前景。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种河南石斛多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的河南石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用体积浓度50％～90％的乙醇进行脱脂处理，优选体积浓度80％的乙醇；以g/mL计，河南石斛原药材粉末与乙醇的质量体积比为1～1.5：2～6，优选为1：4；向河南石斛原药材粉末中加入乙醇后室温震荡12～48h，优选为24h。

3.根据权利要求1所述的河南石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，水提过程中，以g/mL计，脱脂药材粉末和水的料液比为1：10～50，优选为1：30；提取温度为60～90℃，优选为80℃；提取时间为1～3h，优选为2h；醇沉过程中，将水提液减压浓缩至原体积的1/4～1/8，优选为1/5；加入乙醇至终浓度60％～80％，优选为80％，静置12～48h，优选为24h。

4.根据权利要求1所述的河南石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，

5.根据权利要求1所述的河南石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，

6.根据权利要求1所述的河南石斛多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，

7.权利要求1～6任一项所述的制备方法得到的河南石斛多糖。

8.根据权利要求7所述的河南石斛多糖，其特征在于，

所述河南石斛多糖的分子量为2×10⁴～9×10⁴Da，优选为8×10⁴Da；

所述河南石斛多糖的单糖组成为岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，其中，岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的摩尔比为0.221：0.02：0.32：0.403。

9.权利要求1～6任一项所述的方法制备得到的河南石斛多糖或者权利要求7或8所述的河南石斛多糖在制备降血脂药物和/或抗氧化药物中的应用。

10.权利要求1～6任一项所述的方法制备得到的河南石斛多糖或者权利要求7或8所述的河南石斛多糖在制备治疗非酒精性肝损伤和/或治疗氧化应激的药物中的应用。