CN114276469B - 一种红参均一多糖及其在制备心肌缺血损伤保护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红参均一多糖，主要由Rha、GalA、Glc、Gal组成，Rha、GalA、Glc和Gal的摩尔比为1～10:1～10:1～12:0.5～3，重均分子量为25kDa～45kDa；红参均一多糖以→1)‑α‑D‑Rhap‑(2→，→1)‑α‑D‑GalpA‑(4→为主链，以→1)‑α‑D‑Glcp‑(4→，T‑β‑D‑Glcp，T‑α‑D‑Galp为侧链。红参均一多糖具有良好的清除自由基活性和抗氧化活性，能通过降低心肌酶，升高SOD等各项指标和心肌组织的氧化应激损伤，从而发挥心肌缺血损伤的保护活性。本发明还公开了红参均一多糖在制备抗心肌缺血药物中的应用或在制备抗氧化药物中的应用。

Description

一种红参均一多糖及其在制备心肌缺血损伤保护药物中的 应用

技术领域

本发明涉及一种天然成分及其应用，涉及一种红参均一多糖组分及其在制备心肌缺血损伤保护药物的应用，具体涉及一种红参均一多糖及其在制备氧化应激心肌缺血损伤保护药物中的应用。

背景技术

随着生活水平的提高，心血管疾病呈现年轻化，当前位居我国居民疾病死亡的首位。心肌缺血损伤是由于心脏供血量的减少和供氧不足而导致的心肌能量代谢异常，从而使心肌结构和功能发生病变。大量临床和研究显示氧化应激及炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用。心肌缺血发生时有大量的活性氧(ROS)产生和堆积，从而引发机体发生内源性的氧化应激，细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，进而导致心肌细胞凋亡和心肌组织坏死，并且造成细胞膜的通透性和流动性发生改变，使得细胞内的心肌酶大量外泄，加重心肌缺血损伤。选择合适的方法干预内源性的氧化应激是改善心肌缺血损伤和保护心肌组织的重要途径。

红参(Red Gingseng)是人参(Panax ginsengC.A.Mey.)干燥根和根茎经蒸制后的一种炮制品。在中国、日本和韩国等国家广泛应用，历史悠久。红参的主要药效成分是皂苷和多糖，其中红参皂苷的研究报道较丰富，而红参多糖的结构和功能研究较少。与人参多糖相比，炮制后红参多糖一些活性提升明显，如抗氧化活性、抗疲劳、抗肿瘤活性、免疫活性等。因此将红参多糖用于治疗和缓解氧化应激损伤引起的心肌缺血损伤具有重要的意义，在中药新药开发和应用方面具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红参均一多糖及其在制备心肌缺血损伤保护药物的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种红参均一多糖(记为RGP2-1)，主要由Rha(鼠李糖)、GalA(半乳糖醛酸)、Glc(葡萄糖)、Gal(半乳糖)组成，Rha、GalA、Glc和Gal的摩尔比为(1～10):(1～10):(1～12):(0.5～3)，重均分子量为25kDa～45kDa；红参均一多糖RGP2-1以→1)-α-D-Rhap-(2→，→1)-α-D-GalpA-(4→为主链，以T-β-D-Glcp→1)-α-D-Glcp-(4→，T-α-D-Galp为侧链；红参均一多糖RGP2-1的重复单元为：

优选的，Rha、GalA、Glc和Gal的摩尔比为6.62:6.96:8.86:1.32，重均分子量为37610Da。

本发明所述的红参多糖RGP2-1为RG-Ⅰ型果胶。

本发明的另一个目的是提供所述的红参均一多糖在制备心肌缺血损伤保护药物中的应用。

进一步优选的，本发明的另一个目的是提供所述的红参均一多糖在制备氧化应激心肌缺血损伤保护药物的应用。

本发明的另一个目的是提供所述的红参均一多糖在制备抗氧化药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，以所述的红参均一多糖为有效成分或主要有效成分，并辅以药学可接受的辅料。

所述的药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂或矫味剂的一种或者几种。

所述的药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂或口服液。

本发明的有益效果：

体外实验显示红参均一多糖RGP2-1具有良好的清除自由基活性，具有良好的抗氧化活性。体内实验显示红参均一多糖RGP2-1能通过降低心肌酶，升高SOD等各项指标和心肌组织的氧化应激损伤，从而发挥心肌缺血损伤的保护活性。红参均一多糖可作为开发新药的重要中间体，功能性保健食品的天然原料，在新药及保健品开发方面具有广阔的前景。

附图说明

图1为红参粗多糖的DEAE-52纤维素柱的洗脱曲线图。

图2为RGP-2红参混合多糖的Sephadex G-100凝胶层析柱的洗脱曲线。

图3为红参均一多糖RGP2-1的分子量测定结果。

图4为红参均一多糖RGP2-1单糖组成分析色谱图(A：混合单糖标准品，B：样品，1：甘露糖，2：核糖，3：鼠李糖，4：葡萄糖醛酸，5：半乳糖醛酸，6：N-乙酰-氨基葡萄糖，7：葡萄糖，8：N-乙酰-氨基半乳糖，9：半乳糖，10：木糖，11：***糖，12：岩藻糖)。

图5为不同浓度红参均一多糖对DPPH·自由基的清除率(

n＝3)。

图6为不同浓度的红参均一多糖对O₂ ^-·自由基的清除率(

n＝3)。

图7为不同浓度的红参均一多糖对·OH自由基的清除率(

n＝3)。

图8为红参均一多糖对小鼠的心脏指数的影响(

n＝6)；阳性组：***组(40mg/kg)，RGP-H：RGP2-1(400mg/kg)，RGP-M：RGP2-1(200mg/kg)，RGP-L：RGP2-1(100mg/kg)；与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

图9为红参均一多糖对ISO诱导心肌缺血小鼠心脏梗死面积的影响(

n＝6)；Blank：空白组，Model：模型组(ISO，60mg/kg)，Positive control：***组(40mg/kg)，RGP-H：RGP2-1(400mg/kg)，RGP-M：RGP2-1(200mg/kg)，RGP-L：RGP2-1(100mg/kg)。

图10为给药组对ISO诱导心肌缺血小鼠心脏梗死面积的影响(

n＝6)；模型组：ISO(60mg/kg)，阳性组：***(40mg/kg)，RGP-H：RGP2-1(400mg/kg)，RGP-M：RGP2-1(200mg/kg)，RGP-L：RGP2-1(100mg/kg)；与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

图11为各组分对心肌缺血模型小鼠血清中CK-MB、cTn-T、cTn-I含量的影响(

n＝6)；模型组:ISO(60mg/kg)，阳性组：***(40mg/kg)，RGP-H：RGP2-1(400mg/kg)，RGP-M：RGP2-1(200mg/kg)，RGP-L：RGP2-1(100mg/kg)；与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

图12为各组分对心肌缺血模型小鼠血清中CK、LDH、AST、SOD、CAT、MDA、Gpx-4含量的影响(

n＝6)；模型组:ISO(60mg/kg)，阳性组：***(40mg/kg)，RGP-H：RGP2-1(400mg/kg)，RGP-M：RGP2-1(200mg/kg)，RGP-L：RGP2-1(100mg/kg)；与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

图13为各组小鼠心肌组织病理切片(×400)；a-空白组，b-模型组(ISO，60mg/kg)，c-阳性组(***，40mg/kg)，d-RGP2-1(400mg/kg，e-RGP2-1(200mg/kg)，f-RGP2-1(100mg/kg)。

图14为各给药组对心肌缺血损伤小鼠心肌细胞凋亡率的影响(

n＝3)，阳性组：***(60mg/kg)，RGP-H：RGP2-1(400mg/kg)，RGP-M：RGP2-1(200mg/kg)，RGP-L：RGP2-1(100mg/kg)。

图15为各组分对小鼠心肌组织中Nrf2、HO-1、NQO-1、Keap-1表达的影响(

n＝3)；阳性组：***(40mg/kg)，RGP-H：RGP2-1(400mg/kg)，RGP-M：RGP2-1(200mg/kg)，RGP-L：RGP2-1(100mg/kg)；与空白组比较，^**P＜0.01，与模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

具体实施方式

实施例1

从红参中提取和分离纯化红参多糖的方法，包括以下步骤：

步骤(1)、原料前处理：按照红参饮片和石油醚(60～90℃)的质量体积比为1:4(m/v,g:mL)，往红参饮片加入石油醚，静置12h进行脱脂处理，除去石油醚，将红参饮片晾干，敲碎至0.1～0.2cm大小的红参颗粒；

步骤(2)、回流提取：将红参颗粒放入回流提取设备中，按照料液比(m/v,g:mL)1:15加入纯水，先浸泡2h，再加热回流提取，设置回流提取的温度95℃，每次提取2h，提取2次，每次提取完过滤，合并滤液，得到提取液；

步骤(3)、醇沉：提取液在65℃浓缩得到相对密度为1.15的浓缩液，再加入95％乙醇至醇浓度为80％，静置12h，抽滤，得到红参粗多糖提取物；

步骤(4)、脱蛋白：红参粗多糖提取物加纯化水溶解，按照木瓜蛋白酶(800U/mg)和红参粗多糖提取物的质量比(m/m)为1:5加入木瓜蛋白酶，65℃水浴加热1h，100℃加热灭活10min；然后按照红参粗多糖提取物溶液和Sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇＝4:1v/v)的体积比(v/v)为1:4加入Sevage试剂，震荡，进行脱蛋白处理，离心，取上清液，即得脱蛋白的红参多糖溶液；

步骤(5)、脱色：脱蛋白的红参多糖溶液用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.51)调节pH至8.50，再按照30％过氧化氢为多糖溶液的5％(v/v)加入过氧化氢，在温度45℃脱色30min，得到脱色后的红参多糖溶液；

步骤(6)、透析：将脱色后的红参多糖溶液置于透析袋(截留分子量为1000Da)，在纯水中透析24h，透析液冷冻干燥，得到红参粗多糖；

步骤(7)、离子交换层析：DEAE-52纤维素柱依次用3倍柱体积纯水、2倍柱体积0.5mol/LNaCl溶液平衡，红参粗多糖上样后，依次用纯水，0.10、0.30、0.50、0.70、1.0mol/LNaCl梯度洗脱，每个浓度洗脱1.5个柱体积，每个收集管收集0.03个柱体积洗脱液，采用苯酚-硫酸法监测各管的多糖含量，绘制洗脱曲线(如图1)，合并50-82号收集管、浓缩得到RGP-2红参混合多糖；

步骤(8)、透析除盐：RGP-2红参混合多糖用纯水溶解，置于透析袋(截留分子量为1000Da)，在纯水中透析除盐，透析液冷冻干燥，得到除盐后的RGP-2红参混合多糖；

步骤(8)、凝胶柱柱层析：除盐后的RGP-2红参混合多糖加入Sephardex G-100凝胶层析柱，以纯水洗脱，洗脱2个柱体积，每个收集管收集0.02个柱体积，采用苯酚-硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线(如图2)，合并峰位管，洗脱液浓缩干燥，得到红参均一多糖RGP2-1。

测定红参均一多糖的理化性质：采用HPGPC法测定多糖的纯度和分子量，采用苯酚硫酸法测定糖含量，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，使用PMP柱前衍生-HPLC法分析单糖组成。

采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法测定红参均一多糖的纯度及分子量：

色谱柱：TSK-GEL-4000WXL(7.8mm×300mm,10μm)；流动相：超纯水；柱温：35℃；检测器：Waters 2414型示差折光检测器(RID)；检测器温度：30℃；流速：1mL/min；进样量：20μL。

精密称取不同分子量(3kDa～800kDa)葡聚糖标准品10mg，置于10mL容量瓶，用纯水溶解定容至刻度，即得一系列不同分子量浓度为1mg/mL的葡聚糖标准溶液。分别取各样品注入凝胶渗透色谱(GPC)进行分析，采用GPC Analysis软件计算各标准品的保留时间，建立标准曲线，得到线性回归方程，然后通过多糖的保留时间来计算其相对分子质量。

精密称取红参均一多糖10mg，纯水溶解，用纯水定容于10mL容量瓶中，摇匀，即得样品溶液。取样品于上述条件中进样分析，记录保留时间，将保留时间代入上述回归方程，计算红参多糖的相对分子质量。

用标准品的分子量(Mw)的对数与其相应的保留时间(t_R)绘制标准曲线，线性回归方程为lgMw＝-0.4332t_R+13.45，R²＝0.9934。经过软件分析，获得红参多糖的重均分子量(Mw)，多糖RGP2-1重均分子量为37610Da(图3)。

使用PMP柱前衍生-HPLC法分析单糖组成：

混合标准单糖衍生：精密称取各单糖对照品适量，加入纯水制备成每个单糖浓度为0.35mg/mL的混合对照品单糖溶液。精密吸取0.2mL混合单糖溶液于具塞试管中，加入0.1mL 0.3mol/L NaOH溶液和0.1mL 0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)溶液，涡旋混合均匀，置于70℃水浴锅中反应1h。反应结束后，取出试管冷却至室温，加入0.15mL0.2mol/L HCl中和，除去溶剂，然后加入纯化水复溶，加入三氯甲烷萃取除去多余的PMP。分取水相层过0.45μm滤膜，备用。

样品酸水解：精密称取各红参均一多糖样品10mg于水解管中，加入1mL 4mol/L三氟乙酸(TFA)溶液，密封，抽去空气，然后在110℃烘箱中水解8h。水解结束后，放冷至室温，加入甲醇，以除去多余的三氟乙酸，旋蒸发至干燥，然后加入0.1mL纯化水于水解物中，加入3mol/L的NaOH调节至pH 7.0，离心，取上清液，备用。

红参多糖样品衍生：精密吸取0.1mL红参均一多糖酸水解的上清液，按照混合标准单糖衍生的方法进行操作。

色谱条件：色谱柱：Agilent Extend C₁₈(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈(A)-0.05mol/L KH₂PO₄磷酸盐缓冲液(pH6.8,B)；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：250nm。

表1.单糖分析洗脱程序

红参均一多糖RGP2-1的单糖组成分析色谱图见图4。红参均一多糖RGP2-1由Rha、GalA、Glc、Gal组成，Rha、GalA、Glc和Gal的摩尔比为6.62:6.96:8.86:1.32。

表2.红参均一多糖的理化性质

注：Rha-鼠李糖，Glc-葡萄糖，Gal-半乳糖，GalA-半乳糖醛酸。

多糖连接方式分析：通过甲基化分析结合1D和2D NMR测出RGP2-1以→1)-α-D-Rhap-(2→，→1)-α-D-GalpA-(4→为主链，以T-β-D-Glcp→1)-α-D-Glcp-(4→，T-α-D-Galp为侧链。

RGP2-1的重复单元为：

实施例2红参多糖体外抗氧化活性

一、清除DPPH·自由基作用

采用纯水配制不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL)的红参均一多糖样品溶液或不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL)的Vc溶液，准确移取1mL红参均一多糖样品溶液或Vc溶液置于试管中，依次加入4mL浓度为30μg/mL的DPPH乙醇溶液，混匀，室温下避光反应40min，在517nm处测定吸光度，用乙醇作为空白组对照。

计算公式：DPPH·自由基清除率＝[1-(A₁-A₀)/A₂]*100％，A₀：4mL乙醇+1mL红参均一多糖样品溶液或Vc溶液，A₁：4mLDPPH乙醇溶液+1mL红参均一多糖样品溶液或Vc溶液，A₂：4mLDPPH乙醇溶液+1mL乙醇。

结果见图5，红参均一多糖RGP2-1对DPPH·自由基具有明显的清除效果，并且随着浓度增加清除效果增强，呈现剂量依赖性。

二、清除O₂ ^-·自由基的作用

分别取4.5mL Tris-HCl缓冲液和4.2mL纯水置于具塞试管中，摇匀；另取一支试管，加入适量的3mmol/L邻苯三酚；将试管置于25℃水浴锅中孵育20min，吸取0.2mL孵育过的邻苯三酚溶液，迅速加入到上述孵育过的缓冲液中，反应5min后，加入8.0mmol/L盐酸中止反应，以Tris-HCl缓冲溶液进行调零，在325nm波长处测定吸光度A₀。取4.5mLTris-HCl缓冲液于具塞试管中，分别加入3.2mL纯水，1.0mL不同浓度的红参均一多糖溶液(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL)或不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL)的Vc溶液，混匀；另取一支试管，加入适量的邻苯三酚溶液，将试管置于25℃水浴锅中孵育20min，吸取0.2mL孵育过的邻苯三酚溶液，迅速加入到上述孵育过不同浓度的待测红参均一多糖样品缓冲溶液中，反应5min加入8.0mmol/L盐酸中止反应，以Tris-HCl缓冲溶液进行调零，在325nm波长处测定吸光度A。

根据公式计算不同浓度下红参均一多糖样品对于超氧阴离子(O₂ ^-·)自由基的清除率。

O₂ ^-·自由基清除率＝[(A₀-A)/A₀]×100％

由图6可知，随着浓度增加，红参均一多糖对O₂ ^-·自由基的清除率在上升，说明红参均一多糖对O₂ ^-·自由基的清除效果较好。

三、清除·OH自由基的作用

分别取不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL)的红参多糖样品1.0mL或不同浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL)的Vc溶液1.0mL，依次加入1mL 9mmol/L硫酸亚铁溶液、1.0mL 9mmol/L的水杨酸溶液、0.5mL 0.1％的H₂O₂溶液，混匀，置37℃反应30min，在510nm下测定吸光度值，记为A₁，以纯水作为空白，记为A₀。以同样浓度的维生素C(Vc)作同样处理作为阳性对照，按下述公式计算·OH清除率(％)。

清除率＝(A₀-A₁)/A₀×100％

由图7可知，红参均一多糖对·OH自由基的清除率随着浓度增加而增加，呈现剂量依赖性。

以上结果说明红参均一多糖RGP2-1可以通过提高机体抗氧化酶的活性来产生清除自由基的作用。

实施例3体内药效学实验

动物分组与给药：小鼠按照随机数字表法分为6组：空白组、模型组、阳性组(***，40mg/kg)、红参均一多糖RGP2-1高剂量组(RGP-H，400mg/kg)、红参均一多糖RGP2-1中剂量组(RGP-M，200mg/kg)、红参均一多糖RGP2-1低剂量组(RGP-L，100mg/kg)剂量组，每组10只。灌胃给药，空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每天一次，连续10d，给药期间自由饮水、摄食，给药期间记录体重变化和死亡情况。

动物模型的建立：除空白组外，其余各组在灌胃给药后第8、9、10日，连续3天腹腔注射ISO(异丙肾上腺素，60mg/kg)。

动物处理及样品收集：小鼠造模结束，禁食，24h后称重，眼球取血后，血液自然凝固20min，两次离心取上清液直至没有沉淀，每次离心10min(3000rpm)，离心得到血清，另取心脏，用生理盐水冲洗干净，-20℃下保存。

统计学处理：采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行分析，实验数据用

表示，不同组的数据进行对比采用单因素方差分析和t检验，以P＜0.05表示差异具有显著性。

心脏指数测定：将取出的心脏用滤纸吸干水分，称取心脏重量，计算各组的小鼠心脏指数(cardiac index)。

心脏指数＝心脏重量/小鼠体重×100％

如图8和表3所示，与空白组相比，模型组的小鼠心脏指数极显著升高(P＜0.01)，说明模型组小鼠心肌水肿情况明显；与模型组相比，红参均一多糖高、中、低剂量组小鼠心脏指数均有降低(P＜0.05)，说明红参均一多糖RGP2-1能降低其心脏指数，改善小鼠的心肌病理状态。

表3.红参均一多糖对ISO诱导心肌缺血小鼠心脏指数的影响(

n＝6)

注：与空白组比较，^**P＜0.01；与模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

心肌缺血面积测定：将心脏组织以垂直方向均匀切成5片，放入TTC溶液中，37℃恒温水浴孵育20min，然后用4％的甲醛固定12h后，拍照记录。切片中正常组织被染成红色，缺血组织为白色，使用Image-J进行分析，计算心肌缺血面积(infarct size)。

小鼠的心肌TCC结果如图9、图10和表4所示，正常组的心肌组织红润，基本无明显的白色梗死特征；模型组的心肌组织可见明显的白色梗死区域，梗死比例为51.02±5.15％(P＜0.01)；经过阳性药处理后，其梗死面积减少到16.41±1.37％(P＜0.01)，使用红参均一多糖RGP2-1处理后，其心肌梗死面积也明显减小，红参均一多糖RGP2-1高、中、低给药组的梗死面积分别为，23.54±1.78％、31.54±3.03％、40.09±2.91％。说明红参均一多糖RGP2-1可以显著的改善心肌缺血发病过程血液情况，减少心肌组织梗死，从而发挥其心肌缺血损伤的保护作用。

表4.红参均一多糖对ISO诱导心肌缺血小鼠心脏梗死面积的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

血清中心肌酶CK-MB、cTnT、cTnI指标检测：按照试剂盒的说明书操作，分别测定血清CK-MB、cTnT、cTnI指标。

如图11和表5所示，与空白组相比，模型组的CK-MB(图11a)、cTnT(图11b)、cTnI(图11c)水平均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，说明ISO诱导建立模型成功。与模型组相比，红参均一多糖RGP2-1高、中剂量组中的CK-MB、cTnT、cTnI水平显著降低(P＜0.05)，而红参均一多糖低剂量组无显著性(P＞0.05)，说明红参均一多糖RGP2-1能显著降低心肌组织中的心肌酶，从而发挥保护心肌组织的活性。

表5.红参均一多糖对心肌缺血模型小鼠血清中CK-MB、cTn-T、cTn-I含量的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

生化指标检测：按照试剂盒说明书操作，分别测定血清中CK，LDH，AST，SOD，MDA和GSH-Px等生化指标。

如图12和表6、表7所示，与空白组相比，模型组血清中MDA、CK、LDH、AST的含量明显升高，SOD、CAT和Gpx-4活力显著下降(P＜0.01)，说明模型建立成功，并且说明氧化应激参与了心肌缺血的发病过程；与模型组相比，阳性组血清中的MDA、CK、LDH、AST含量明显下降，并且SOD、CAT和Gpx-4明显提高(P＜0.01)；经过多糖处理后，这些指标与阳性组中的变化趋势一致，红参多糖高中低剂量组中血清MDA、CK、LDH、AST含量降低，SOD、CAT和Gpx-4活力有一定程度的升高(P＜005或P＜0.01)，并呈现剂量趋势，说明红参多糖可以减少心肌酶如CK，LDH，AST等的外泄，降低心肌组织的损伤，并且可以提高血清中的SOD的含量，降低MDA的生成，发挥抗氧化应激损伤的作用。以上结果说明红参均一多糖RGP2-1可以选择性的调节这些指标来改善心肌缺血小鼠病理状态，发挥心肌缺血损伤的保护活性。

表6.各组分对心肌缺血模型小鼠血清中CK、LDH、AST、MDA含量的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

表7.各组分对心肌缺血模型小鼠血清中SOD、CATGpx-4含量的影响(

n＝6)

注：与空白组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

心肌组织病理检测：

HE染色：将小鼠心脏组织在中性***固定液中固定24h后经通过脱水，蜡浸和石蜡包埋制备成石蜡切片，然后进行二甲苯脱蜡，浓度梯度下降的醇水合作用，苏木精和伊红(HE)染色，浓度梯度上升的醇脱水，二甲苯透明和中性树胶固定制作HE染色切片。准备好的HE染色的心肌组织切片于电子显微镜下选择视野，采用Leica Application Suite采集清晰图像，观察切片组织视野内病理变化。

如图13所示，HE染色结果显示，空白组心肌组织内细胞排列规则，未见明显心肌细胞变性及坏死，间质未见明显纤维组织增生和炎症细胞浸润。模型组心肌组织内部分细胞排列紊乱，大部分心肌细胞变性和坏死，间质见较多量的炎症细胞浸润，并有较多量纤维组织增生。阳性组心肌组织内细胞排列尚规则，未见明确心肌细胞变性及坏死，间质未见明显纤维组织增生及炎症细胞浸润，说明给予***后能显著保护心肌组织。给予红参均一多糖处理后，高、中、低剂量组小鼠的心肌组织内细胞排列较为规则，未见明显的细胞变性和坏死，间质未见明显的纤维组织增生和炎症细胞浸润。

Masson染色：将小鼠心脏组织用Bouin氏液固定12h保存，自来水冲洗10min，梯度乙醇溶液脱水，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，乙醇脱水。然后将样品置于0.5％碘溶液中处理10min，用自来水冲洗样品并与5％硫代硫酸钠反应5min。再次用自来水冲洗样品并滴加染色溶液10min。此外，样品用纯水和1％的盐酸酒精分化洗涤。样品用丽春红酸溶液染色10min，滴加1％磷钼酸溶液5min，再用苯胺蓝复染5min，再用1％冰醋酸处理样品1min。将制作好的Masson染色切片置于电子显微镜观察组织病理学的变化，并采集图像。

Masson染色结果如图13显示，空白组的心肌细胞及心肌间质血管周见极少量蓝色反应，未见明显纤维化。然而模型组显示心肌细胞及心肌间质内见多量蓝色反应，提示中度纤维组织增生和中度纤维化，并可见多量炎症细胞和中度变性坏死。阳性组显示小鼠心肌细胞及心肌间质血管周见极少量蓝色反应，说明未见明显纤维化，无增生，无炎症，无变性，说明阳性药能明显的保护心肌组织。红参均一多糖给药组显示随着剂量的增加，心肌细胞及心肌间质血管周蓝色反应逐渐减少，提示心肌组织纤维化、增生和变性在逐渐减少，高剂量只有极少量蓝色反应，说明红参均一多糖高剂量能显著保护心肌组织。

心肌细胞凋亡情况观察：取已固定的心肌组织包埋，切片，抗原修复，脱蜡，漂洗。配制Tunel反应液，按照说明书操作，荧光显微镜下(×400)取缺血区视野，采用LeicaApplication Suite记录绿色凋亡细胞情况。

如图14所示，空白组未见明显心肌细胞凋亡，与空白组小鼠相比，模型组小鼠心肌组织的凋亡阳性表达细胞比率显著升高，达到41.45±4.67％(P＜0.01)；***是阳性给药组，能显著减少心肌细胞的凋亡，细胞凋亡率降低至11.51±1.68％(P＜0.01)，经过红参多糖处理后小鼠心肌细胞凋亡比率明显降低，红参高中低剂量组的心肌细胞凋亡比率分别为15.65％±1.24、19.43％±0.96、25.08±2.05％，说明红参均一多糖可以明显抑制心肌缺血造成的心肌细胞凋亡情况，保护心肌细胞。

Western blot法测定心肌Nrf2，NQO-1和HO-1蛋白表达：

取心脏组织提取心肌蛋白，用PMSF的RIPA细胞裂解液(1mmol/L)低温研磨，使组织充***解，然后在冷冻离心机12000rpm/min离心10min，收集上清液，用BCA的蛋白含量检测试剂盒检测蛋白浓度。取等量总蛋白上样，浓缩胶5％，分离胶10％，电压：12V，进行SDS-PAGE进行分离，然后转移至PVDF膜上，将膜封闭在5％的脱脂奶粉封闭液封闭，然后加一抗(Nrf2，NQO-1、HO-1)，4℃过夜，TBST液洗膜3次，每次10min，加入相应的二抗，室温孵育4h，TBST液洗膜3次，每次10min，计入ECL试剂，曝光、显影、定影，然后用凝胶成像***进行扫描，最后用Image-J处理软件进行灰度分析，计算蛋白相对表达量。

如图15所示，空白小鼠心肌组织中Nrf2、NQO-1、HO-1和keap-1蛋白的相对表达值分别为0.96±0.04、0.66±0.04、1.11±0.08、0.95±0.05；模型组中的Nrf2、NQO1、HO-1和keap-1蛋白的相对表达量被显著下调，与空白组相比，具有显著差异(P＜0.01)，说明心肌细胞抗氧化活性下降，可能导致自由基的代谢失衡，从而造成心肌的损伤；阳性组(***)可明显上调这三个蛋白的表达(P＜0.01)；与阳性组一致，红参均一多糖给药组中，红参均一多糖可以显著增高Nrf2、NQO1、HO-1和keap-1蛋白的表达，与模型组相比具有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)，说明红参均一多糖可能通过激活Nrf2，从而促进Nrf2蛋白的合成和核转位，并上调下游的NQO1和HO-1基因的表达和蛋白的合成，产生对心肌缺血损伤的保护作用。以上结果说明红参均一多糖具有心肌缺血损伤保护作用。

实施例4

取红参均一多糖RGP2-15000mg，加适量胶化淀粉、微晶纤维素和羟丙纤维素，按制剂学片剂的常规工艺进行压片，制成500片片剂，每片含10mg红参均一多糖RGP2-1，作为抗心肌缺血作用制剂或保健品。用法用量：口服，每次1片，一日2次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例5

取红参均一多糖RGP2-15000mg，加适量的淀粉、糊精按制剂学胶囊剂的常规工艺制成小颗粒，填入500粒胶囊，每粒含10mg红参均一多糖RGP2-1。用法用量：口服，每次1粒，一日2次，小儿酌减，15天为一个疗程。

实施例6

取红参均一多糖RGP2-15000mg，加适量的蔗糖和糊精，按制剂学颗粒剂的常规工艺进行制备，每袋重0.5g，每袋含红参均一多糖RGP2-110mg。用法用量：口服，每次1袋，一日1次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例7

取红参均一多糖RGP2-15000mg，加适量蔗糖，加水稀释到5000mL，每瓶10mL，1mL含红参均一多糖RGP2-11mg。用法用量：口服，每次1瓶，一日2次，15天一个疗程。

Claims (7)

1.一种红参均一多糖，其特征在于：主要由Rha、GalA、Glc、Gal组成，Rha、GalA、Glc和Gal的摩尔比为6.62:6.96:8.86:1.32，重均分子量为37610Da；红参均一多糖以→1)-α-D-Rhap-(2→，→1)-α-D-GalpA-(4→为主链，以T-β-D-Glcp→1)-α-D-Glcp-(4→，T-α-D-Galp为侧链；红参均一多糖的重复单元为：

红参均一多糖是由以下方法制得的，包括以下步骤：

步骤(1)、原料前处理：按照红参饮片和60～90℃石油醚的质量体积比为1:4g:mL，往红参饮片加入石油醚，静置12h进行脱脂处理，除去石油醚，将红参饮片晾干，敲碎至0.1～0.2cm大小的红参颗粒；

步骤(2)、回流提取：将红参颗粒放入回流提取设备中，按照料液比1:15g:mL加入纯水，先浸泡2h，再加热回流提取，设置回流提取的温度95℃，每次提取2h，提取2次，每次提取完过滤，合并滤液，得到提取液；

步骤(3)、醇沉：提取液在65℃浓缩得到相对密度为1.15的浓缩液，再加入95％乙醇至醇浓度为80％，静置12h，抽滤，得到红参粗多糖提取物；

步骤(4)、脱蛋白：红参粗多糖提取物加纯化水溶解，按照木瓜蛋白酶和红参粗多糖提取物的质量比为1:5加入木瓜蛋白酶，65℃水浴加热1h，100℃加热灭活10min；然后按照红参粗多糖提取物溶液和Sevage试剂的体积比为1:4加入Sevage试剂，震荡，进行脱蛋白处理，离心，取上清液，即得脱蛋白的红参多糖溶液；Sevage试剂为三氯甲烷:正丁醇＝4:1v/v；木瓜蛋白酶酶活力为800U/mg；

步骤(5)、脱色：脱蛋白的红参多糖溶液用pH9.51碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液调节pH至8.50，再按照30％过氧化氢为多糖溶液的5％v/v加入过氧化氢，在温度45℃脱色30min，得到脱色后的红参多糖溶液；

步骤(6)、透析：将脱色后的红参多糖溶液置于截留分子量为1000Da的透析袋，在纯水中透析24h，透析液冷冻干燥，得到红参粗多糖；

步骤(7)、离子交换层析：DEAE-52纤维素柱依次用3倍柱体积纯水、2倍柱体积0.5mol/LNaCl溶液平衡，红参粗多糖上样后，依次用纯水，0.10、0.30、0.50、0.70、1.0mol/L NaCl梯度洗脱，每个浓度洗脱1.5个柱体积，每个收集管收集0.03个柱体积洗脱液，采用苯酚-硫酸法监测各管的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并50-82号收集管、浓缩得到RGP-2红参混合多糖；

步骤(8)、透析除盐：RGP-2红参混合多糖用纯水溶解，置于截留分子量为1000Da的透析袋，在纯水中透析除盐，透析液冷冻干燥，得到除盐后的RGP-2红参混合多糖；

步骤(9)、凝胶柱柱层析：除盐后的RGP-2红参混合多糖加入Sephardex G-100凝胶层析柱，以纯水洗脱，洗脱2个柱体积，每个收集管收集0.02个柱体积，采用苯酚-硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并峰位管，洗脱液浓缩干燥，得到红参均一多糖。

2.权利要求1所述的红参均一多糖在制备心肌缺血损伤保护药物中的应用。

3.权利要求1所述的红参均一多糖在制备氧化应激心肌缺血损伤保护药物的应用。

4.权利要求1所述的红参均一多糖在制备抗氧化药物中的应用。

5.一种药物组合物，其特征在于：以权利要求1所述的红参均一多糖为有效成分或主要有效成分，并辅以药学可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述的药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂或矫味剂的一种或者几种。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂或口服液。

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